Protokół badania został przeanalizowany i zatwierdzony przez Komisję Etyczną Pierwszego Szpitala Powiązanego z Uniwersytetem Medycznym w Chongqing (nr 2024-020-01). Badanie zostało zarejestrowane prospektywnie w Narodowym Rejestrze Badań Medycznych w Chinach (numer rejestracyjny: MR-50-24-036087; data rejestracji: 6 września 2024 r.). Przed włączeniem do badania od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę, w tym zgodę na publikację zanonimizowanych zdjęć twarzy. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.
Projekt badania
Było to 12-tygodniowe, prospektywne, randomizowane badanie kliniczne z podziałem na połowy twarzy (split-face). Złożony peeling kwasowy zastosowany w tym badaniu składał się z AHA (4%), kwasu salicylowego (2%) i kwasu azelainowego (1,5%), przy całkowitym stężeniu kwasów wynoszącym około 7,5%. pH preparatu wynosiło 3,6. Przed rozpoczęciem badania przydział uczestników do grupy leczonej i kontrolnej został określony za pomocą losowej sekwencji wygenerowanej w arkuszu kalkulacyjnym przez oślepionego statystyka i wdrożonej przez oślepionego lekarza. Strona leczona była poddawana złożonemu peelingowi kwasowemu dwa razy w tygodniu przez 3 tygodnie (łącznie sześć sesji). Obszar zabiegowy był delikatnie oczyszczany łagodnym, nietłustym środkiem myjącym i całkowicie osuszany, a następnie nakładano peeling cienką, równomierną warstwą (~2 mL na połowę twarzy). Preparat nakładano w ustandaryzowanej kolejności: od czoła i skroni, przez policzki, nos, obszar okojoustny, aż po brodę, unikając powiek, warg, błon śluzowych i uszkodzonej skóry. Produkt pozostawiano w kontakcie ze skórą przez 15 min, a następnie neutralizowano wodą. Punktem końcowym badania klinicznego był łagodny, równomierny rumień z tolerowalnym mrowieniem lub uczuciem ciepła, bez nadmiernego pieczenia, obrzęku, pęcherzy lub rozległego efektu szronienia (frosting). Po usunięciu peelingu przez 15 min stosowano kojącą i nawilżającą maskę.
Uczestnicy zostali poinstruowani, aby unikać drażniących produktów do stosowania miejscowego, peelingów, mechanicznego usuwania zmian oraz bezpośredniej ekspozycji na słońce, a w ciągu dnia stosować krem z filtrem o szerokim spektrum działania. Po 3‑tygodniowej fazie leczenia nastąpił 9‑tygodniowy okres obserwacji. Strona kontrolna nie była poddawana żadnej interwencji podczas pierwszych 3 tygodni. Po tym wstępnym okresie oczekiwania na stronie kontrolnej przeprowadzono ten sam 3‑tygodniowy cykl peelingu kwasami złożonymi, po którym nastąpiło 6‑tygodniowe obserwowanie. Pięć sesji na każdą połowę twarzy zostało przeprowadzonych przez przeszkolony personel medyczny w szpitalu, natomiast jedną sesję na każdą połowę twarzy uczestnik wykonał w domu zgodnie ze zstandaryzowanymi instrukcjami przekazanymi przez badaczy. Uczestnik otrzymał zstandaryzowane instrukcje pisemne i ustne dotyczące ilości i rozmieszczenia produktu, kolejności aplikacji i obszaru zabiegu, wyznaczonego czasu ekspozycji oraz procedury usuwania produktu. Schematyczny przegląd projektu badania i przebiegu doświadczenia przedstawiono na Rysunku 1.
Rekrutacja pacjentów
Do badania zakwalifikowano trzydziestu pacjentów w wieku 18–60 lat z kliniczną diagnozą umiarkowanego trądziku pospolitego (AV). Kryteria włączenia obejmowały osoby każdej płci spełniające diagnostyczne kryteria umiarkowanego AV, odpowiadające stopniowi 2 (31–50 zmian, w tym zaskórniki, grudki i krostki) lub stopniowi 3 (51–100 zmian, w tym liczne grudki i krostki, sporadyczne duże zmiany zapalne oraz mniej niż trzy guzki). Wykluczono pacjentów, którzy mieli skórę światłoczułą lub stosowali leki uwrażliwiające na światło w ciągu poprzednich 4 tygodni; mieli w wywiadzie intensywną ekspozycję na słońce w ciągu ostatniego miesiąca lub przewidywali znaczną ekspozycję na słońce w ciągu 1 miesiąca po leczeniu; mieli blizny, aktywną infekcję lub niezagojone rany w miejscu leczenia; zdiagnozowany zespół niedoboru odporności; ciężką niewydolność serca, wątroby lub nerek; lub udokumentowaną chorobę psychiatryczną. Wszystkich 30 zakwalifikowanych uczestników ukończyło badanie i zostało uwzględnionych w analizie końcowej.
Ocena wyników
Obiektywne oceny
Analiza rumienia i porfiryn
W zestandaryzowanych warunkach środowiskowych (stała temperatura, wilgotność i oświetlenie) zastosowano system obrazowania twarzy do przechwytywania obrazów obustronnego czoła, policzków, linii żuchwy oraz innych obszarów objętych zmianami w punkcie wyjścia oraz podczas każdej wizyty kontrolnej. System ten umożliwił obiektywną kwantyfikację intensywności rumienia oraz poziomu porfiryn.
Pobieranie próbek mikrobioty i immunohistochemia
Profilowanie mikrobiomu skóry wykonano na podstawie wymazów mikrobiologicznych pobranych ze strony leczonej przed rozpoczęciem terapii oraz w 3. tygodniu. DNA mikrobiologiczne wyekstrahowano z wymazów przy użyciu określonego zestawu do ekstrakcji, zgodnie z protokołem producenta, a następnie określono ilość odzyskanego DNA. Region 16S rRNA bakterii amplifikowano z użyciem uniwersalnych starterów 341F (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’) i 805R (5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’). Amplifikację rozpoczęto od denaturacji w 98 °C przez 30 s, po czym przeprowadzono 32 cykle: 98 °C przez 10 s, 54 °C przez 30 s oraz 72 °C przez 45 s. Końcową elongację przeprowadzono w 72 °C przez 10 min.
Amplikony PCR oczyszczono przy użyciu określonych kulek i poddano kwantyfikacji przed oceną biblioteki. Jakość produktu oceniono za pomocą bioanalizatora oraz zestawu do ilościowej PCR, po czym zakwalifikowane amplikony połączono w celu sekwencjonowania. Zdemultipleksowane surowe odczyty przetworzono, usuwając najpierw sekwencje starterów programem Cutadapt. Odczyty parne (paired-end) zmontowano w programie FLASH, a za pomocą fqtrim wyeliminowano odczyty o wartościach jakości poniżej 20, długości poniżej 100 bp lub z zasadami niejednoznacznymi stanowiącymi więcej niż 5% sekwencji. Czyste tagi, które przeszły filtrowanie jakości, zachowano do dalszych analiz. Chimery usunięto programem Vsearch, a do odszumiania pozostałych odczytów i generowania wariantów sekwencji amplikonów (ASV) wykorzystano DADA2.
Adnotacja gatunków została przeprowadzona w programie QIIME2 za pomocą wtyczki feature-classifier w oparciu o bazy danych SILVA oraz NT-16S. Program QIIME2 posłużył również do obliczenia różnorodności alfa i beta. Skład bakterii oceniono na podstawie profili względnej liczebności. Różnice w liczebności na poziomie rodzaju badano za pomocą testu Wilcoxona, przyjmując poziom istotności P < 0,05. Analizę efektu wielkości dyskryminantu liniowego (LDA) wykonano przy użyciu nsegata-lefse, przyjmując progi LDA ≥3,0 oraz P < 0,05.
Spośród zakwalifikowanych uczestników 10 pacjentów wybrano losowo do analizy immunohistochemicznej mediatorów zapalnych, w tym IL-1α, IL-6, IL-17, TGF-β i TLR2. Próbki biopsji skóry (2 mm) pobrano z aktywnych zmian trądzikowych w punkcie wyjścia (tydzień 0) oraz w 3. tygodniu po dezynfekcji jodoforem. Próbki utrwalono w 4% paraformaldehydzie, zatopiono w parafinie i pocięto na sekcje o grubości 4 μm. Sekcje zatopione w parafinie (4 μm) poddano deparafinizacji i rehydratacji. Odzyskiwanie antygenów przeprowadzono z użyciem buforu EDTA (pH 9,0) przy pomocy podgrzewania w mikrofalach. Endogenną peroksydazę zneutralizowano 3% H2O2, po czym sekcje potraktowano 3% surowicą kozią w celu ograniczenia niespecyficznego wiązania przeciwciał. Następnie sekcje inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi: IL-1α (1:400), IL-6 (1:400), IL-17A (1:400), TGF-β (1:400) i TLR2 (1:300). W następnym kroku sekcje inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej z zestawem przeciwciał wtórnych Polymer-HRP, a następnie przeprowadzono detekcję z użyciem chromogenu DAB i barwienie kontrastowe hematoksyliną. Kontrole negatywne inkubowano z PBS zamiast przeciwciał pierwszorzędowych. Obrazy wykonano za pomocą skanera cyfrowego przy powiększeniu 400×. Na każdą sekcję losowo wybrano pięć pól, a ocenę przeprowadzili dwaj dermatolodzy w ślepej próbie.
Oceny subiektywne
Globalna ocena badacza
W punkcie wyjścia oraz w 12. tygodniu dermatolog, nieznający przydziału do grup terapeutycznych, ocenił stopień nasilenia trądziku na całej twarzy, stosując Globalny System Stopniowania Trądziku (GAGS).
Samoocena pacjenta
Pod koniec okresu leczenia i obserwacji uczestnicy ocenili postrzeganą poprawę kliniczną przy użyciu czterostopniowej skali samooceny. Wyniki zdefiniowano następująco: 0 – brak poprawy lub pogorszenie; 1 – lekka poprawa; 2 – umiarkowana poprawa; oraz 3 – wyraźna poprawa.
Ślepa ocena wyników
Aby zmniejszyć błąd oceny, dermatolog nieznający przydziału do grup terapeutycznych niezależnie ocenił poprawę kliniczną na podstawie zdjęć wyjściowych.
Monitorowanie bezpieczeństwa
W każdej wizycie kontrolnej oceniano zdarzenia niepożądane w celu oceny bezpieczeństwa leczenia.
Analiza statystyczna
Przed rozpoczęciem badania oszacowano wielkość próby niezbędną do wykrycia zmiany w ogólnym wyniku GAGS dla całej twarzy od poziomu wyjściowego do 12. tygodnia. Obliczenie wielkości próby oparto na badaniu pilotażowym dotyczącym peelingu kwasami złożonymi; przy założeniu ustandaryzowanej wielkości efektu wewnątrz grupy uczestników równej 0.60, dwustronnego poziomu istotności 0.05 oraz mocy 80%, wymaganych było 24 ocenialnych uczestników. Uwzględniając 20% ubytek osób, docelowa liczba rekrutowanych uczestników wyniosła 30.
Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego oraz oprogramowania do tworzenia wykresów (patrz Tabela materiałów). Dane ciągłe opisano zgodnie z ich rozkładem. Zmienne o rozkładzie zbliżonym do normalnego przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe, natomiast zmienne o rozkładzie innym niż normalny przedstawiono jako medianę z rozstępem międzykwartylowym lub zakresem, w zależności od kontekstu. Dane kategoryczne wyrażono jako liczebność i wartości procentowe.
Rozkład danych oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka, co potwierdzono poprzez wizualną analizę histogramów i wykresów Q-Q. Ze względu na małą liczebność próby oraz fakt, że kilka zmiennych nie wykazywało rozkładu normalnego, analizy główne przeprowadzono z wykorzystaniem testów nieparametrycznych. Główne wyniki, w tym wyniki GAGS, powierzchnię obszarów czerwonych oraz poziomy porfiryn, analizowano za pomocą znakowego testu Wilcoxona dla par.
Wielkości efektu oraz 95% przedziały ufności obliczono dla głównych wyników klinicznych. W przypadku sparowanych porównań nieparametrycznych jako miary wielkości efektu zastosowano korelację rangowo-biseryjną dla par dopasowanych. Korelację rang Spearmana wykorzystano do oceny zależności między zmiennymi ciągłymi lub porządkowymi. Testy statystyczne były dwustronne, a wyniki uznano za istotne przy P < 0.05.
Analizy mikrobiomu przeprowadzono na próbkach pobranych od tych samych uczestników z grupy leczonej. Różnorodność alfa oceniano przy użyciu indeksów Shannona i Simpsona. Zmiany w indeksach różnorodności alfa pomiędzy próbkami wyjściowymi a próbkami po leczeniu oceniano za pomocą powiązanego testu znaków Wilcoxona.
Skład społeczności bakteryjnej podsumowano za pomocą względnej liczności na poziomach typu, rodziny i rodzaju. Taksony o niskiej liczności lub niskim rozpowszechnieniu zachowano do analizy opisowej. Różnice we względnej liczności określonych taksonów między próbkami wyjściowymi a próbkami po leczeniu oceniano za pomocą parowych testów nieparametrycznych. W analizach mikrobiomu testy na poziomie taksonów miały charakter eksploracyjny i raportowane są niepoprawione wartości P. Wszystkie testy były obustronne, z progiem istotności P < 0.05.