Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Wpływ preparatu Qi-fu-yin na poprawę upośledzenia poznawczego i redukcję starzenia się komórek w mózgach myszy 5xFAD

111 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72118

⸱

8 września 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie ocenia skuteczność leczenia preparatem Qi-fu-yin (QFY) u myszy 5xFAD. Wyniki wskazują, że podawanie QFY wiąże się z poprawą procesów uczenia się i pamięci, zmniejszeniem odkładania się Aβ w mózgu oraz redukcją starzenia się komórek, a także złagodzeniem uszkodzeń strukturalnych synaps w korze mózgowej.

Streszczenie

Choć mechanizm działania Qi-fu-yin (QFY), tradycyjnej receptury medycyny chińskiej, nie jest jeszcze w pełni poznany, wykazano jego potencjał terapeutyczny w chorobie Alzheimera (AD). Celem niniejszego badania było zbadanie związku między leczeniem QFY a upośledzeniem poznawczym u myszy 5xFAD. Wykorzystano pomiar siły chwytu,  analizę chodu, test budowania gniazd, test pudełka wahadłowego, test wodnego labiryntu Morrisa oraz metodę ELISA do oceny poziomów białka Amyloid-β 1-42 (Aβ1-42), Aβ1-40, białka GAP-43 (Growth-associated protein 43), synaptofizyny (SYN) oraz białka gęstości postsynaptycznej 95 (PSD-95) w mózgach myszy 5xFAD. Do ilościowego oznaczenia poziomu fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem (SASP) w korze mózgowej zastosowano analizę cytokin metodą Luminex. Ilość β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-Gal), odkładanie Aβ oraz gęstość kolców dendrytycznych w mózgach zwierząt zmierzono odpowiednio za pomocą barwienia SA-β-Gal, immunohistochemii oraz barwienia metodą Golgiego-Coxa. Testy immunofluorescencyjne wykazały, że leczenie QFY drastycznie zredukowało obciążenie kory blaszkami Aβ oraz zmniejszyło ekspresję p21 u myszy 5xFAD. Terapia QFY znacząco poprawiła zdolność uczenia się i pamięć, złagodziła procesy starzenia oraz zwiększyła zawartość białek GAP-43, PSD-95 i SYN w korze mózgowej myszy. Po zastosowaniu leczenia QFY odnotowano istotny spadek liczby blaszek Aβ i aktywności SA-β-Gal w mózgu, a także obniżenie poziomów Aβ1-42 oraz stosunku Aβ1-42/Aβ1-40 w hipokampie. Poziomy IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A i IFN-γ uległy znacznemu obniżeniu w korze myszy 5xFAD. Analizy PCA i korelacji Pearsona wykazały silną ujemną korelację między cytokinami SASP a poziomami białek synaptycznych. Wyniki te sugerują związek między leczeniem QFY a poprawą w zakresie związanego z wiekiem pogorszenia funkcji poznawczych i fenotypów starzenia komórkowego u myszy 5xFAD, wraz z łagodzeniem uszkodzeń struktury synaptycznej. Otrzymane dane stanowią podstawę do dalszych badań nad QFY jako potencjalnym kandydatem terapeutycznym w leczeniu choroby Alzheimera.

Wprowadzenie

Alzheimer's disease (AD)1 is the most prevalent form of dementia, characterized by amyloid-β protein (Aβ), hyperphosphorylated tau proteins (P-Tau), synaptic loss, and chronic inflammation. Currently available medications for AD have a number of side effects and are unable to stop the disease's progression2,3,4,5.

Senescence, which manifests as organism-wide disruptions across cellular and interstitial microenvironments rather than localized organ-specific alterations, is a key risk factor in AD pathogenesis. This systemic dysregulation distinguishes AD progression from single tissue-pathology models by fundamentally changing homeostatic mechanisms across biological systems6,7. Although cellular senescence initially serves as a homeostatic regulatory mechanism, the accumulation of senescent cells eventually causes progressive tissue degradation and persistent inflammatory cascades, fundamentally disrupting physiological homeostasis8. The ensuing inflammation may harm synapses and impair cognitive function9,10.

Cellular senescence is a complex cellular stress response characterized by telomere shortening, permanent cell-cycle arrest, and altered secretory activity11. Additional hallmarks include enlarged, flattened cell morphology, positive senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining, lipofuscin accumulation, and secretion of SASP factors12. Memory formation is affected by the notable decline in the levels of proteins associated with synaptic plasticity of axons and dendrites, which occurs with cellular senescence13,14. Because synaptic plasticity is essential for learning and memory, disruptions in synaptic proteins contribute to cognitive impairment. These proteins include GAP-43, SYN, and PSD-95. Undoubtedly, synaptic function is affected by reductions in dendritic numbers and functional abnormalities in the brains of the elderly15.

QFY is a traditional Chinese medicine formula derived from Jing Yue Quan Shu. It is composed of Panax ginseng C.A.Mey (Araliaceae), Polygala tenuifolia Willd (Polygalaceae), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Fisch. & C. A. Mey (Orobanchaceae), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Apiaceae), Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. (Fabaceae), Atractylodes macrocephala Koidz (Asteraceae), Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou (Rhamnaceae). Research has demonstrated that QFY significantly ameliorates cognitive dysfunction in rats with diabetes-induced brain injury16. Our previous study found that QFY could improve cognitive learning and memory functions impairment in 5xFAD and APP/PS1 mice. In addition, QFY demonstrated high safety in non-clinical studies, and no obvious acute, subacute, or long-term toxic reactions were observed17,18,19. Analysis of the clinical therapeutic effect of QFY showed that AD patients experienced a significant increase in their capacity for activities of daily living and MMSE scores after QFY treatment20. Following three consecutive days of QFY administration in male Sprague-Dawley rats, ten prototype QFY-derived components, including butylidenephthalide, butylphthalide, 20(S)-ginsenoside Rh1, 20(R)-ginsenoside Rh1, and zingibroside R1, were detected in cerebrospinal fluid21,22. However, the therapeutic mechanism of QFY in AD is still unclear. In this study, we investigated the association between QFY treatment, cellular senescence, and AD-related pathological changes in 5xFAD mice.

Although previous studies have demonstrated the neuroprotective effects of QFY in AD models, the specific involvement of cellular senescence in mediating these effects remains unexplored. Moreover, whether QFY confers cognitive benefits through senescence‑associated synaptic preservation, rather than solely through amyloid‑β reduction, has not been addressed. The present study was therefore designed to investigate whether QFY treatment attenuates cellular senescence and whether this attenuation is associated with improved synaptic plasticity in 5xFAD mice.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Shandong (SDUTCM20221101001).

Leki

Proszek do suchego kremu z granulatem QFY został przygotowany i przetestowany przez Lunan Pharmaceutical Houpu Research and Development Center. Donepezil oraz Memantyna zostały zakupione w Shanghai Yuanye Technology. W badaniu wykorzystano samce myszy 5xFAD o początkowej masie ciała w zakresie 19–27 g. Dawkowanie QFY wyliczono na podstawie klinicznej dawki dla ludzi wynoszącej 43 g/d, co po uwzględnieniu proszku do suchego kremu z granulatem QFY odpowiada 16,297 g/d. Średnią dawkę dla niniejszego eksperymentu obliczono na podstawie klinicznej dawki dla ludzi (16,297 g/70 kg x 9,1 = 2,11861 g/kg/d). Dawkę wysoką ustalono na poziomie dwukrotności dawki średniej (4,24 g/kg/d), a dawkę niską na połowę dawki średniej (1,06 g/kg/d). Wszystkie roztwory leków podawano w objętości 0,1 mL na 10 g masy ciała.

Jako kontrolę pozytywną zastosowano połączoną administrację donepezilu i chlorowodorku memantyny. Dawki określono w odniesieniu do ich aktualnych dawek stosowanych w klinice (odpowiednio 10 mg/d i 20 mg/d) oraz wcześniejszych danych z naszej grupy badawczej, co pozwoliło ustalić schemat podawania donepezilu w dawce 1,0 mg/kg/d oraz memantyny w dawce 2,8 mg/kg/d, co dało łączną dawkę 3,8 mg/kg/d. Końcowe stężenie mieszaniny donepezilu i memantyny przygotowano jako 0,38 mg/mL, obliczone jako 3,8 mg/kg podzielone przez objętość administracji wynoszącą 0,1 mL na 10 g masy ciała.

Roztwory QFY w niskich, średnich i wysokich dawkach przygotowano w następujący sposób: 5,3 g, 10,6 g i 21,2 g suchego proszku QFY umieszczono w oddzielnych zlewkach o pojemności 100 mL, wymieszano z 30 mL wody oczyszczonej przy intensywnym mieszaniu, przeniesiono do cylindrów miarowych i dopełniono wodą oczyszczoną do końcowej objętości 50 mL, co pozwoliło uzyskać końcowe stężenia masowe odpowiednio 0,106 g/mL, 0,212 g/mL i 0,424 g/mL. W celu przygotowania kontroli pozytywnej 5 mg donepezilu oraz 14 mg memantyny rozpuszczono w wodzie oczyszczonej i dopełniono do końcowej objętości 50 mL. Zwierzęta w każdej grupie otrzymywały odpowiedni roztwór leku raz dziennie drogą gavage'ową.

Zwierzęta

Myszy transgeniczne 5xFAD [B6. Cg-Tg (APPSwFlLon, PSEN1* M146L* L286V)6799Vas/Mmjax] były hodowane w laboratorium. Zwierzęta utrzymywano w warunkach SPF na Uniwersytecie Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Shandong, przy temperaturze 22–24 oC, wilgotności 50–60% i 12-godzinnym cyklu światła i ciemności. Zwierzęta miały stały dostęp do pożywienia i wody.

Samce myszy 5xFAD w wieku 2,5 miesiąca zostały losowo przydzielone do pięciu grup: nieleczonych 5xFAD, grupy otrzymującej donepezil z memantyną, grupy otrzymującej niską dawkę QFY, średnią dawkę QFY oraz wysoką dawkę QFY. W roli grupy kontrolnej WT wystąpiły samce myszy typu dzikiego (WT) z tego samego miotu, w tym samym wieku. Leczenie podawano raz dziennie przez 220 dni (Rysunek 1).

Testy behawioralne

Test siły uścisku dłoni

Siłę mięśni szkieletowych przednich kończyn myszy zmierzono za pomocą dynamometru siły chwytu23. Podczas eksperymentu urządzenie pomiarowe ustawiono poziomo, zapewniając, aby mysz pozostawała równolegle do powierzchni stołu. Po włączeniu urządzenia mysz delikatnie umieszczono na płytce chwytnej. Gdy mysz pewnie chwyciła płytkę, jej ogon odciągano do tyłu z równą siłą, aż do momentu puszczenia chwytu przez zwierzę. Odnotowano maksymalną siłę chwytu. Pomiar ten powtórzono trzykrotnie, a średnią z tych wartości wykorzystano do określenia siły chwytu myszy.

Test chodu

Regularność chodu myszy mierzono za pomocą systemu CatWalk XT. Eksperyment podzielono na okres treningowy oraz okres testowy24. Na dzień przed badaniem myszy eksperymentalne przeniesiono do pomieszczenia doświadczalnego, aby umożliwić im adaptację do nowego środowiska. Podczas okresu treningowego myszy umieszczano w punkcie startowym, skąd biegły wzdłuż kanału do punktu końcowego. Każda mysz przechodziła trening trzy razy dziennie. Po 3 dniach treningu (do momentu, gdy każda mysz była w stanie szybko przejść przez kanał), zwierzęta wracały do klatek. Przebieg okresu testowego był analogiczny do okresu treningowego, a oprogramowanie komputerowe automatycznie analizowało trajektorię każdego ruchu. Wyświetlane były zielone kropki w przypadku prawidłowej trajektorii oraz pomarańczowe kropki w przypadku trajektorii nieprawidłowej; dla każdej myszy wymagano co najmniej trzech zielonych kropek, aby dane zostały uznane za kwalifikujące się do analizy w oprogramowaniu CatWalkXT 10.0.

Test skrzynki wahadłowej (shuttle box test)

Do oceny zdolności warunkowego aktywnego unikania u myszy wykorzystano test skrzynki wahadłowej25. Aparatura składała się ze skrzynki wahadłowej (18 cm x 18 cm) umieszczonej w komorze dźwiękochłonnej.  Eksperyment obejmował 4-dniowy okres uczenia się, po którym nastąpił 1-dniowy okres testowy.  Każdego dnia uczenia myszy miały 120-s okres adaptacji w skrzynce wahadłowej przed rozpoczęciem treningu. Każda próba rozpoczynała się od 6-s bodźca warunkowego (ton o natężeniu 70 dB i częstotliwości 1000 Hz połączony ze światłem o natężeniu 500 lux), po którym następował 3-s wstrząs elektryczny o natężeniu 0,3 mA podawany przez kratkę podłogową, a kończyła się 12-s przerwą między próbami. Jeśli mysz przeszła do przeciwległej komory podczas bodźca warunkowego, wstrząs był pomijany, a reakcję zapisywano jako aktywne unikanie. Jeśli mysz nie przeszła podczas bodźca warunkowego, lecz zrobiła to podczas wstrząsu elektrycznego, zapisywano to jako reakcję pasywnego unikania. Jeśli mysz nie przeszła przez cały czas trwania próby, zapisywano to jako brak ucieczki. Trening powtarzano przez 4 kolejne dni, wykonując 30 prób dziennie. W okresie testowym (dzień 5.) pominięto wstrząsy elektryczne, podczas gdy wszystkie pozostałe parametry pozostały takie same jak w okresie uczenia się. Liczbę reakcji aktywnego unikania zapisano jako główny miernik uczenia się i pamięci.

Labirynt wodny Morrisa

Do oceny zdolności uczenia się przestrzennego i pamięci zwierząt doświadczalnych wykorzystano test wodnego labiryntu Morrisa26. Eksperyment przeprowadzono w zbiorniku o średnicy 120 cm i głębokości 50 cm. Zbiornik napełniono mętna białą wodą, a temperaturę utrzymano na poziomie 21 °C. Platformę o średnicy 10 cm zainstalowano 1 cm poniżej powierzchni wody w jednym z kwadrantów. Wokół basenu rozmieszczono wskazówki wizualne służące myszom jako punkty orientacyjne w przestrzeni. Proces uczenia się trwał cztery kolejne dni, a sesje każdego dnia rozpoczynały się w jednym z trzech kwadrantów. Pozycje startowe zmieniały się pseudolosowo pomiędzy czterema kierunkami kardynalnymi. W każdej próbie procedurę kończono w momencie, gdy zwierzę pomyślnie dotarło do platformy. Ustalono maksymalny czas trwania próby wynoszący 60 s; jeśli zwierzę nie zdołało zlokalizować platformy w tym czasie, było ostrożnie do niej prowadzone. Po dotarciu do platformy zwierzę otrzymało krótką, 10 s przerwę przed powrotem do klatki domowej. Po zakończeniu okresu uczenia się, 24 h później rozpoczynał się okres testowy. W dniu 5. myszy umieszczano w kwadrancie przeciwległym do platformy. Odnotowano czas ucieczki w okresie testowym, czas przebywania w kwadrancie docelowym oraz liczbę przekroczeń obszaru, w którym pierwotnie znajdowała się podwodna platforma.

Test gniazdowania kolonii

Dzienną aktywność zwierząt doświadczalnych oceniano za pomocą testu budowy gniazd kolonii27. Eksperyment trwał 24 h, w każdej grupie znajdowały się trzy zwierzęta. Po podaniu leku w tym samym dniu przygotowano nowe klatki, wyścielone 6 g miękkiego papieru do budowy gniazd, a zdjęcia wykonywano po 6 h, 12 h i 24 h. Na koniec eksperymentu przyjęto następującą punktację: papier był rozrzucony po całej klatce i nie wykazano żadnych śladów gryzienia – 1 punkt; kawałki papieru zostały zgromadzone z boku klatki, lecz luźno, bez uformowanego gniazda i bez wyraźnego rozrywania lub składania – 2 punkty; kawałki papieru zostały zebrane i złożone w uformowane, lecz stosunkowo płaskie gniazdo bez wyraźnego rozrywania – 3 punkty; głębokie gniazdo z intensywnie poszarpanym papierem – 4 punkty.  Na koniec eksperymentu pozostałą  nierwaną tkanką (zdefiniowaną jako fragmenty papieru o masie >0,1 g, które nie zostały poszarpane ani włączone do gniazda) starannie zebrano, wysuszono na powietrzu i zważono przy użyciu wagi elektronicznej (precyzja: 0,01 g). 

Próbkowanie i pobieranie próbek

Próbki pobrano wyłącznie z grup WT, 5xFAD oraz QFY (2,12 g/kg/d). Po uduszeniu CO2 odcięto głowy, a następnie szybko otwarto prawą półkulę, aby wyizolować hipokamp i korę, wypłukano je w roztworze soli fosforanowej (PBS) i umieszczono w zamrożonych probówkach o pojemności 1,5 mL w ciekłym azocie. Próbki przechowywano w temperaturze -80 oC do badań biochemicznych. Lewą półkulę utrwalono poprzez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie na 24 h, odwodniono w etanolu absolutnym, zatopiono w parafinie, wykonano skrawki o grubości 5 µm i przeprowadzono deparafinizację w celu detekcji immunohistochemicznej.

Test immunoenzymatyczny (ELISA)

Testy ELISA przeprowadzono w celu ilościowego oznaczenia poziomu białek docelowych w tkankach mózgowych. Zawartość Aβ1–40 i Aβ1–42 w homogenatach hipokampa zmierzono przy użyciu zestawów komercyjnych, natomiast poziomy GAP-43, PSD-95 i SYN w korze określono za pomocą zestawów pochodzących od Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry. Wszystkie procedury przeprowadzono ściśle zgodnie z protokołami producentów. Seria standardów została przygotowana poprzez rozcieńczenia seryjne zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Układ mikropłytki obejmował dołki kontrolne (blank), dołki ze standardami, dołki z próbkami 5xFAD, dołki z próbkami traktowanymi QFY (2,12 g/kg/d) oraz dołki z próbkami typu dzikiego. Przed naniesieniem wszystkie próbki rozcieńczono dwukrotnie w dostarczonym roztworze rozcieńczającym. Odczynniki dodawano, trzymając końcówkę pipety prostopadle do dna dołka, a następnie delikatnie mieszano w celu zapewnienia pełnego połączenia składników.

Po uszczelnieniu płytki przeprowadzono wstępną inkubację w temperaturze 37 °C przez 30 min. W tym czasie przygotowano bufor płuczący poprzez rozcieńczenie stężonego roztworu zapasowego wodą ultrapurystyczną w stosunku 1:29 (1 mL koncentratu na 29 mL wody). Po inkubacji usunięto folię uszczelniającą, odlano ciecz i osuszono płytkę. Każdy dołek napełniono następnie 200 µL buforu płuczącego, pozostawiono na 30 s, a następnie opróżniono; cykl ten powtórzono 5 razy. Do wszystkich dołków, z wyjątkiem próbek ślepych, dodano odczynnik znakowany enzymem (50 µL), po czym płytkę ponownie uszczelniono i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 min, a następnie przeprowadzono identyczny pięciokrotny etap płukania.

W celu wywołania barwy do każdego dołka dodano 50 µL roztworu chromogenu A, a następnie 50 µL roztworu chromogenu B, delikatnie mieszając po każdym dodaniu. Płytkę inkubowano w ciemności w temperaturze 37 °C przez 10 min. Reakcję enzymatyczną przerwano poprzez dodanie 50 µL roztworu stopującego do każdego dołka, co spowodowało natychmiastową zmianę barwy z niebieskiej na żółtą. Absorbancję (gęstość optyczną) zmierzono przy 450 nm przy użyciu czytnika mikro płytek, wykorzystując dołki kontrolne (blank) jako referencję; wszystkie pomiary wykonano w ciągu 15 min od zatrzymania reakcji.

Luminex

Poziomy czynników SASP w korze mózgowej zmierzono przy użyciu zestawu Bio‑Plex Pro Mouse Cytokine 23‑plex Assay, wykonując wszystkie procedury zgodnie z instrukcjami producenta. Odczynniki wyjęto z przechowywania w 4 °C i pozostawiono na 30 min w celu wyrównania temperatury do temperatury pokojowej przed użyciem. Roztwory stokowe standardów rozcieńczano szeregowo w celu wygenerowania siedmiopunktowej krzywej wzorcowej oraz jednego dołka kontrolnego (blank), zgodnie z protokołem zestawu. Kulki magnetyczne wymieszano wstępnie i rozcieńczono do zalecanego stężenia roboczego; przeciwciała detekcyjne przygotowano w formie roztworów roboczych; a koncentrat buforu piorącego rozcieńczono do 1x wodą dejonizowaną. Konjugat PE‑streptawidyny rozcieńczono również do 1x, używając dołączonego buforu do rozcieńczania.

Do analizy, do wyznaczonych dołków zgodnie z układem płytki, dodawano sekwencyjnie 50 µL zawiesiny kuleczek, standardy, kontrole jakości oraz rozcieńczone próbki tkanek (5,6 µg/µL). Następnie płytkę szczelnie zamknięto i inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 800 rpm. Po inkubacji kuleczki przemywano trzykrotnie 200 µL buforu do mycia na dołek. Następnie do każdego dołka dodano 50 µL przygotowanego przeciwciała detekcyjnego, a płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h przy wytrząsaniu z prędkością 800 rpm. Po kolejnych trzech cyklach mycia wprowadzono 50 µL roztworu roboczego PE‑streptawidyny, a płytkę inkubowano przez dodatkowe 30 min w temperaturze pokojowej w tych samych warunkach wytrząsania. Przeprowadzono końcowy etap mycia (trzykrotnie 200 µL buforu do mycia), po czym do każdego dołka dodano 150 µL buforu do mycia i wytrząsano płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 min przy 800 rpm przed odczytem na urządzeniu Bio‑Plex.

Barwienie SA-β-Gal i immunohistochemia

Barwienie SA-β-Gal przeprowadzono zgodnie z instrukcją zestawu Senescence β-Galactosidase Staining Kit. Po barwieniu SA-β-Gal sekcje poddano odsłanianiu antygenów poprzez ogrzewanie w buforze cytrynianowym (pH 6.0). Endogenną aktywność peroksydazy zablokowano, inkubując sekcje w roztworze blokującym peroksydazę przez 10 min w temperaturze pokojowej. Następnie sekcje inkubowano z króliczym przeciwciałem monoklonalnym anty‑Aβ₁-₄₂ (1:400) przez noc w temperaturze 4 °C. Po przemyciu sekcje inkubowano z wtórnym przeciwciałem anty‑króliczym/mysim IgG przez 20 min w temperaturze pokojowej. Po kolejnym przemyciu immunoreaktywność wizualizowano za pomocą DAB przez 2 min. Na koniec sekcje odwodniono, przejrzystowano i zamontowano w żywicy neutralnej do badania mikroskopowego.

Immunofluorescencja

Do barwienia immunofluorescencyjnego wykorzystano skrawki parafinowe, które odparafinowano w ksylenie (3 x 15 min) i rehydratowano w szeregu stężeń etanolu (100%, 95% i 75%; 2 x 5 min dla każdego stężenia). Odmaskowanie antygenów przeprowadzono poprzez zanurzenie skrawków w 1x buforze cytrynianu sodu w temperaturze 95 °C przez 30 min, a następnie stopniowe schładzanie do temperatury pokojowej. Po trzykrotnym płukaniu w soli fizjologicznej z Tween 20 (PBST) (po 5 min każde), skrawki permeabilizowano i blokowano w 10% prawidłowej surowicy koziej zawierającej 0,3% Triton X‑100 przez 90 min w temperaturze pokojowej. Następnie skrawki inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko p21/CIP1/CDKN1A (1:200) oraz Aβ₁‑₄₂ (1:400) w 37 °C przez 2 h. Po czterokrotnym przemyciu w PBST (po 5 min każde), skrawki inkubowano z dopasowanymi gatunkowo przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z Alexa Fluor (1:500) w 37 °C przez 2 h w ciemności. Po dodatkowym przemyciu (4 x 5 min w PBST), skrawki zamontowano w medium montażowym antifade zawierającym DAPI i obrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Barwienie metodą Golgiego-Coxa

Barwienie metodą Golgiego-Coxa przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcją producenta. Roztwory A i B wymieszano 24 h przed eksperymentem. Po uśmierceniu myszy tkanki mózgowe szybko wyjęto, przepłukano w PBS i zanurzono w mieszaninie roztworów A i B. Tkanki przechowywano w temperaturze pokojowej w ciemności przez 6 h, po czym roztwór impregnujący wymieniono na świeży i kontynuowano inkubację przez kolejne 2 tygodnie w temperaturze pokojowej w ciemności (stosując co najmniej 2 mL roztworu impregnującego na jedną tkankę mózgu). Następnie tkanki przeniesiono do roztworu C i inkubowano przez 24 h, po czym wymieniono go na świeży roztwór C i inkubowano przez kolejne 7 dni w temperaturze pokojowej w ciemności. Tkanki mózgowe pocięto na skrawki o grubości 100 µm przy użyciu wibratomu. Skrawki naniesiono na szkiełka pokryte żelatyną i pozostawiono do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 3 dni. Szkiełka przepłukano dwukrotnie wodą destylowaną (po 5 min), a następnie zanurzono w mieszaninie roztworu D, roztworu E i wody destylowanej (w stosunku 1:1:2) na 15 min. Po dwóch dodatkowych płukaniach wodą destylowaną (po 5 min), skrawki odwodniono w szeregu roztworów etanolu o rosnącym stężeniu (50%, 75% i 95%; po 5 min każdy), a następnie przepłukano czterokrotnie w etanolu absolutnym (po 4 min) i trzykrotnie w ksylenie (po 5 min). Na koniec skrawki przykryto szkiełkami dekrywacyjnymi z użyciem medium montażowego. Obrazy zarejestrowano za pomocą mikroskopu, a gęstość kolców dendrytycznych oznaczono ilościowo w programie ImageJ.

Analiza statystyczna

Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnią ± OD. Dane przeanalizowano i przedstawiono na wykresach za pomocą programu GraphPad Prism 8.1.0. Test t-Studenta tdo porównania dwóch grup wykorzystano test t. W przypadku porównań z udziałem wielu grup zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a porównania parowe przeprowadzono za pomocą testu Dunnetta. Istotność statystyczną określono na poziomie p < 0.05.

Analizy wielowymiarowe i korelacyjne

Analizę głównych składowych (PCA) przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism 8.0.1 w celu wizualizacji grupowego klastrowania czynników SASP (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IFN-γ, CCL3, CCL4 i CCL5) w grupach WT, 5xFAD oraz QFY (2,12 g/kg/dobę) (n = 8 na grupę). Wykres wyników (score plot) wygenerowano na podstawie dwóch pierwszych głównych składowych. Przed analizą PCA nie zastosowano żadnej transformacji danych. Analizę korelacji Persona przeprowadzono w celu oceny liniowych zależności między czynnikami SASP a białkami synaptycznymi (PSD-95, GAP-43 i SYN), a także Aβ₁₋₄₀, Aβ₁₋₄₂ i stosunkiem Aβ₁₋₄₂/Aβ₁₋₄₀. Analizę wykonano za pomocą programu GraphPad Prism, przyjmując dwustronny próg istotności p < 0,05. Aby zwizualizować siłę i kierunek powiązań, wygenerowano macierze korelacji oraz mapę ciepła (heatmap).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Administration of QFY enhances learning and memory in 5xFAD mice

After QFY administration, a shuttle box test was conducted to assess the conditional active avoidance response of mice (Figure 2A–C). The results showed the number of active avoidances on days 1-4 (Figure 2A, p < 0.05) and the area under the curve (AUC) of active avoidance (Figure 2B, p ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Plastyczność synaptyczna neuronów odgrywa kluczową rolę w funkcjach poznawczych. W mózgach pacjentów z AD złogi Aβ rozprzestrzeniają się w różnych obszarach, bezpośrednio powodując uszkodzenia strukturalne synaps, utratę synaps pobudzających oraz spadek funkcji poznawczych28. GAP-43 (białko błony presynaptycznej)29, PSD-95 (białko rusztowaniowe zlokalizowane w błonie postsynaptycznej)30 oraz SYN (fosfobiałko związane z pęcherzykami synaptycznymi)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty z National Natural Science Foundation of China (82205078, 82374062), Shandong Provincial Natural Science Foundation (ZR2026MS1293, ZR2021QH157), Shandong Province Traditional Chinese Medicine Science and Technology Project (M20251730), Science and Technology Projects of Xizang Autonomous Region, China (XZ202601ZY0167) oraz Shandong Province Technology Innovation Guidance Program (Central Government-Guided Local Science and Technology Development Fund) (YDZX2023137), w ramach projektu zatytułowanego „Development and Industrialization Research of Tongli Enteric‑Coated Capsules as a Class 1 New Traditional Chinese Medicine”.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Leki
DonepezilShanghai Yuanye Technologylot.J15HB188725
MemantynaShanghai Yuanye Technologypartia J21HB189391
Qi-fu-yinCentrum Badawczo-Rozwojowe Houpu firmy Lunan Pharmaceuticalpartia 2209001
Testy behawioralne
CatWalk XTNoldusoprogramowanie CatWalkXT 10.0
Dynamometr do pomiaru siły uścisku dłoniBiologiaBLD-ZL-20
Labirynt wodny MorrisaShanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd120 cm
Klatka typu shuttle boxShanghai Xinruan Information Technology Co., LtdXR-XC404
Przeciwciała
anty-Aβ1-42 przeciwciałoAbcamKat# ab201061
Przeciwciało anty-p21/CIP1/CDKN1ANovus BiologicalsKat# NBP3-15661
Zestawy do analiz
Aβ1-40 zestaw ELISAThermo Fisher ScientificNr kat. KHB3482
Aβ1-42 zestaw ELISAThermo Fisher ScientificKat# KHB3442
Zestaw do analizy Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex AssayR&Systemy DKat# LXLBM23-1
zestaw ELISA GAP-43Przemysł testów immunoenzymatycznych w prowincji JiangsuKat# MM-47506M1
zestaw do barwienia metodą Golgiego-CoxaBeiJing Biolead Biology Sci & Tech CoNr kat. PK401
Zestaw ELISA do oznaczania PSD-95Przemysł testów immunoenzymatycznych w prowincji JiangsuNr kat. MM-45953M1
Starzenie się komórkowe βzestaw do barwienia na beta-galaktozydazęBeyotimeKat. nr C0602
Zestaw ELISA do oznaczania synaptofizyny (SYN)Przemysł testów immunoenzymatycznych w prowincji JiangsuKat# MM-46504M1
Odczynniki chemiczne & Odczynniki
Przeciwciała wtórne anty-królicze i anty-mysie przeciw IgGStarterKat. nr S0C1001
chromogen DABStarterKat. nr S0C1001
Oprogramowanie
CatWalk XTNoldus Information TechnologyWersja 10.0
ImageJNational Institutes of Health (NIH)Wersja 1.53

Bibliografia

  1. Joe E, Ringman JM. Cognitive symptoms of Alzheimer's disease: clinical management and prevention. BMJ. 2019;367:l6217.
  2. Scheff SW, et al. Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Neurology. 2007;68(18):1501-8.
  3. Muralidar S, et al. Role of tau protein in Alzheimer's disease: the prime pathological player. Int J Biol Macromol. 2020;163:1599-617.
  4. Hardy JA, Higgins GA. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 1992;256(5054):184-5.
  5. Calsolaro V, Edison P. Neuroinflammation in Alzheimer's disease: current evidence and future directions. Alzheimers Dement. 2016;12(6):719-32.
  6. Campisi J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 2005;120(4):513-22.
  7. Yao R. An in-silico assessment suggests the potential effects of goji (fruit of Lycium barbarum L.) against aging-related diseases. Food Med Homol. 2025;2(2):9420036.
  8. Campisi J, d'Adda di Fagagna F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(9):729-40.
  9. Salminen A, Kaarniranta K, Kauppinen A. ER stress activates immunosuppressive network: implications for aging and Alzheimer's disease. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):633-50.
  10. Mirabella F, et al. Prenatal interleukin 6 elevation increases glutamatergic synapse density and disrupts hippocampal connectivity in offspring. Immunity. 2021;54(11):2611-31.e8.
  11. Baker DJ, Petersen RC. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. J Clin Invest. 2018;128(4):1208-16.
  12. Lucas V, Cavadas C, Aveleira CA, Hook V. Cellular senescence: from mechanisms to current biomarkers and senotherapies. Pharmacol Rev. 2023;75(4):675-713.
  13. Bloss EB, et al. Evidence for reduced experience-dependent dendritic spine plasticity in the aging prefrontal cortex. J Neurosci. 2011;31(21):7831-9.
  14. Ye XS, et al. The food and medicine homologous Chinese medicine from Leguminosae species: a comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2025;2(2):9420033.
  15. Dickstein DL, Weaver CM, Luebke JI, Hof PR. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 2013;251:21-32.
  16. Wang SY, et al. Qifu-Yin attenuates AGEs-induced Alzheimer-like pathophysiological changes through the RAGE/NF-kappaB pathway. Chin J Nat Med. 2014;12(12):920-8.
  17. Yang X, et al. Qi-fu-yin attenuated cognitive disorders in 5xFAD mice of Alzheimer's disease animal model by regulating immunity. Front Neurol. 2023;14:1183764.
  18. Xiao QY, et al. Effects of Qi-Fu-Yin on aging of APP/PS1 transgenic mice by regulating the intestinal microbiome. Front Cell Infect Microbiol. 2023;12:1048513.
  19. Chen K, et al. Safety and toxicity of Qi-Fu Yin, a classical traditional Chinese medicine prescription: a nonclinical research. J Appl Toxicol. 2025;45(9):1811-38.
  20. Wang L, Qiao P, Yue L, Sun R. Is Qi Fu Yin effective in clinical treatment of dementia? A meta-analysis of 697 patients. Medicine (Baltimore). 2021;100(5):e24526.
  21. Li H, et al. Identification of chemical components of Qi-Fu-Yin and its prototype components and metabolites in rat plasma and cerebrospinal fluid via UPLC-Q-TOF-MS. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:1995766.
  22. Lei X, et al. Integrating network pharmacology and component analysis to study the potential mechanisms of Qi-Fu-Yin Decoction in treating Alzheimer's disease. Drug Des Devel Ther. 2023;17:2841-58. doi:10.2147/DDDT.S402624.
  23. Takeshita H, et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 2017;7:42323.
  24. Caggiano V, et al. Midbrain circuits that set locomotor speed and gait selection. Nature. 2018;553(7689):455-60.
  25. Ehret B, et al. Population-level coding of avoidance learning in medial prefrontal cortex. Nat Neurosci. 2024;27(9):1805-15.
  26. Curdt N, et al. Search strategy analysis of Tg4-42 Alzheimer mice in the Morris water maze reveals early spatial navigation deficits. Sci Rep. 2022;12:5451.
  27. Deacon RMJ. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 2006;1(3):1117-9.
  28. Tu S, Okamoto SI, Lipton SA, Xu H. Oligomeric Aβ-induced synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 2014;9:48.
  29. Benowitz LI, Routtenberg A. GAP-43: an intrinsic determinant of neuronal development and plasticity. Trends Neurosci. 1997;20(2):84-91.
  30. Dore K, et al. PSD-95 protects synapses from β-amyloid. Cell Rep. 2021;35(9):109194.
  31. Kokotos AC, et al. Synaptophysin sustains presynaptic performance by preserving vesicular synaptobrevin-II levels. J Neurochem. 2019;151(1):28-37.
  32. Martin SB, et al. Synaptophysin and Synaptojanin-1 in Down syndrome are differentially affected by Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 2014;42(3):767-75.
  33. Namioka N, et al. Oxidative stress and inflammation are associated with physical frailty in patients with Alzheimer's disease. Geriatr Gerontol Int. 2016;17(6):913-8.
  34. Kojima G, Liljas A, Iliffe S, Walters K. Prevalence of frailty in mild to moderate Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Curr Alzheimer Res. 2017;14(12):1256-63.
  35. Dimri GP, et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(20):9363-7.
  36. Baker DJ, et al. Naturally occurring p16Ink4a-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 2016;530(7589):184-9.
  37. Zhang P, et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nat Neurosci. 2019;22(5):719-28.
  38. Ota H, Ogawa S, Ouchi Y, Akishita M. Protective effects of NMDA receptor antagonist, memantine, against senescence of PC12 cells: a possible role of nNOS and combined effects with donepezil. Exp Gerontol. 2015;72:109-16.
  39. Herdy JR, et al. Increased post-mitotic senescence in aged human neurons is a pathological feature of Alzheimer's disease. Cell Stem Cell. 2022;29(12):1637-52.e6.
  40. Hu Y, et al. Replicative senescence dictates the emergence of disease-associated microglia and contributes to Abeta pathology. Cell Rep. 2021;35(10):109228.
  41. Tchkonia T, et al. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. J Clin Invest. 2013;123(3):966-72.
  42. Guerrero A, De Strooper B, Arancibia-Cárcamo IL. Cellular senescence at the crossroads of inflammation and Alzheimer's disease. Trends Neurosci. 2021;44(9):714-27.
  43. Acosta JC, et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 2013;15(8):978-90.
  44. Wang B, Han J, Elisseeff JH, Demaria M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2024;25(12):958-78.
  45. Gaikwad S, Senapati S, Haque MA, Kayed R. Senescence, brain inflammation, and oligomeric tau drive cognitive decline in Alzheimer's disease: evidence from clinical and preclinical studies. Alzheimers Dement. 2024;20(1):709-27.
  46. Si Z, Sun L, Wang X. Evidence and perspectives of cell senescence in neurodegenerative diseases. Biomed Pharmacother. 2021;137:111327.
  47. Chen X, et al. Senescence-like changes induced by expression of p21Waf1/Cip1 in NIH3T3 cell line. Cell Res. 2002;12(3-4):229-33.
  48. Engeland K. Cell cycle regulation: p53-p21-RB signaling. Cell Death Differ. 2022;29(5):946-60.
  49. Choi I, et al. Autophagy enables microglia to engage amyloid plaques and prevents microglial senescence. Nat Cell Biol. 2023;25(7):963-74.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Myszy 5xFADchoroba Alzheimerabeta-amyloidbiałka synaptycznewodny labirynt Morrisafenotyp wydzielniczy związany ze starzeniemimmunohistochemia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.