Artykuł metodologiczny

Protokół izolacji RNA z wielu gatunków niesiorników

15 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72120

⸱

1 września 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedury izolacji RNA z różnych gatunków niesporczaków przy użyciu kolumnowego zestawu do izolacji RNA, zaprojektowanego do wyodrębniania RNA z niewielkich ilości tkanki w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA i synteza komplementarnego DNA.

Streszczenie

Niesporczaki są mikroskopijnymi zwierzętami znanymi z wyjątkowej tolerancji na stres środowiskowy. Zwierzęta te potrafią przetrwać wysuszenie, ekstremalne ciśnienie, niskie temperatury oraz wysokie poziomy promieniowania jonizującego. Jednakże molekularne mechanizmy leżące u podłoża tych zdolności do ekstremotolerancji nie są jeszcze w pełni poznane. Metody molekularne stosowane do badania tych mechanizmów, obejmujące sekwencjonowanie RNA, interferencję RNA (RNAi) oraz heterologiczną ekspresję genów niesporczaków w systemach takich jak bakterie, wymagają wyizolowania wysokiej jakości matrycowego RNA (mRNA) z ograniczonej ilości materiału biologicznego. W niniejszym badaniu opisujemy powtarzalny protokół izolacji całkowitego RNA z niesporczaków, który (1) jest skuteczny dla wielu gatunków, w tym dla gatunku z grupy heterotardiigradu, (2) wymaga jedynie 25–200 zwierząt, w zależności od wielkości ciała, oraz (3) pozwala uzyskać RNA w ilości i jakości wystarczającej do dalszych zastosowań. Przedstawiony protokół umożliwia efektywne odzyskiwanie RNA z rozsądnej liczby niesporczaków i wspiera badania molekularne nad tolerancją na stres u różnych gatunków tych zwierząt.

Wprowadzenie

Niesporczaki są dobrze znane ze swojej zdolności do przetrwania ekstremalnego stresu, który byłby zabójczy dla innych zwierząt, w tym wysuszenia, ekstremalnego ciśnienia, ekstremalnych temperatur oraz czynników uszkadzających DNA, takich jak leki chemoterapeutyczne i promieniowanie jonizujące1,2,3,4,5,6,7,8. W ostatnich latach naukowcy badali mechanizmy leżące u podstaw ekstremalnej odporności niesporczaków, wykorzystując podejścia molekularne, takie jak sekwencjonowanie RNA, interferencja RNA (RNAi) oraz heterologiczna ekspresja genów niesporczaków w innych systemach, w tym w komórkach ludzkich i bakteriach8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Zastosowanie tych metod stało się potężnym narzędziem, pozwalającym zrozumieć, w jaki dokładnie sposób niesporczaki są zdolne do tak ekstremalnej odporności na stres8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Jednak wszystkie te molekularne podejścia do zrozumienia tolerancji niesporczaków na stres opierają się na możliwości wyizolowania RNA z tych niewielkich zwierząt w wystarczającej ilości i odpowiedniej jakości do zastosowania w dalszych procesach.

Wcześniejsza metoda izolacji RNA z niesiorowców okazała się skuteczna dla badaczy pracujących z Hypsibius exemplaris23. Jednak podczas prób replikacji tego protokołu u H. exemplaris stwierdzono, że jest on niewiarygodny pod względem uzyskanej koncentracji i jakości RNA (dane niepublikowane). Alternatywna metoda izolacji RNA oparta na fenolu okazała się skuteczna dla H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus oraz gatunku heterotardigrada13,21,22,24,25,26. Wykazano, że protokół ten zapewnia RNA o jakości i ilości wystarczającej do dalszych procesów, zarówno w przypadku pojedynczych osobników, jak i pul zwierząt (~50). Protokół ten wymaga jednak od użytkownika pracy z odczynnikami zawierającymi fenol. Fenol jest niebezpieczną substancją chemiczną, która wymaga ostrożnego obchodzenia się, a niewłaściwe wykonanie tego protokołu może doprowadzić do przeniesienia fenolu, co wpłynie na czystość RNA i dalsze zastosowania. Inny wcześniej opublikowany protokół izolacji RNA z niesiorowców skupia się na możliwości izolacji RNA z pojedynczych osobników27. Choć jest to cenny protokół dla zastosowań takich jak ilościowy PCR (qPCR)27, jest on mniej odpowiedni do aplikacji takich jak sekwencjonowanie RNA, gdzie celem jest uzyskanie bardziej holistycznego obrazu reakcji zwierząt na dany stresor lub warunki.

Ograniczenia w dostępnych protokołach izolacji RNA doprowadziły do zbadania alternatywnych metod izolacji RNA z niesporczaków. Zestaw do izolacji RNA oparty na kolumnach, wykorzystany w niniejszym protokole, jest przeznaczony do izolacji RNA z niewielkich ilości tkanek. Zestaw ten był wcześniej stosowany do izolacji RNA z tkanek owadów w celu przeprowadzenia dalszych analiz sekwencjonowania RNA, co sugeruje, że może być on odpowiedni do izolacji z innych małych zwierząt posiadających kutykulę, takich jak niesporczaki.28Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół wykorzystania tego zestawu do izolacji RNA opartego na kolumnach w przypadku niesiorpów, w tym wyjaśnienia konkretnych środków ostrożności, których należy przestrzegać podczas wykonywania tego protokołu z niesiorpami. W artykule tym opisano skuteczność tego protokołu u sześciu gatunków niesiorpów (*H. exemplaris*, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadaboutioraz heterotardigrade *Viridiscus celatus*). Badanie potwierdziło, że RNA o wysokiej jakości i w odpowiedniej ilości można uzyskać z grupy zaledwie 25 zwierząt. Przedstawiono również przykłady danych dotyczących stężenia i jakości otrzymanego RNA, które są odpowiednie do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA (przy minimalnym obciążeniu, z wykładniczą amplifikacją biblioteki) oraz synteza komplementarnego DNA (cDNA). Niniejszy protokół izolacji RNA okazał się już użyteczny w odkrywaniu mechanizmów radiotolerancji w H. exemplaris8Sukces tego protokołu u różnych gatunków niesioruneków sugeruje, że mógłby on znaleźć szersze zastosowanie w badaniu mechanizmów tolerancji na stres, mechanizmów rozwojowych oraz procesów ewolucyjnych.

Protokół

Poniższy protokół nie wymaga instytucjonalnej zgody komisji etyki ds. doświadczeń na zwierzętach, ponieważ zwierzęta bezkręgowe są zwolnione z tego wymogu. Wykorzystane odczynniki i sprzęt zostały wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie sprzętu i obszaru do izolacji RNA

  1. Włącz blok grzejny lub łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 42 °C w przygotowaniu do ekstrakcji RNA.
  2. Przygotuj statyw na probówki do wirówki, pipety (2 µL, 20 µL, 200 µL i 1000 µL) oraz pasujące rozmiarem filtrowane końcówki do pipet.
  3. Oczyść blat laboratoryjny, statyw na probówki, pipety i pudełka z końcówkami za pomocą preparatu RNase Away, rozcieńczonego roztworu wybielacza (10%) lub 70% etanolu, aby zdenaturować wszelkie pozostałości RNazy.
    UWAGA: Nadmierna obecność RNazy na sprzęcie lub w obszarze izolacji RNA może prowadzić do niskiej jakości wyizolowanego RNA z powodu jego degradacji. Aby zminimalizować to ryzyko, należy przeznaczyć odpowiednią ilość czasu na zadziałanie środków denaturujących RNazę oraz pozwolić na całkowite wyschnięcie powierzchni i sprzętu przed kontynuacją pracy.
  4. Przez wszystkie etapy protokołu należy nosić rękawiczki i regularnie traktować je roztworem denaturującym RNazę, aby zapobiec degradacji RNA przez RNazę.

2. Pobieranie zwierząt do izolacji RNA

  1. Używając gruszki do pipety przymocowanej do komory zestawu rurki aspiracyjnej wyposażonej w kapilarę szklaną (Rysunek 1A), pętli Irwina lub mikropipety, przenieś 25–200 zwierząt (w zależności od wielkości gatunku) z naczyń hodowlanych do naczynia z czystą wodą źródlaną, aby zmniejszyć ilość materiału niebędącego niesiorowatymi (glony lub inne źródła pokarmu, takie jak nicienie lub wrotki, w zależności od gatunku).
  2. Przygotuj probówkę 1,5 mL wolną od RNaz oraz tłuczek.
  3. Używając gruszki do pipety przymocowanej do komory zestawu rurki aspiracyjnej wyposażonej w kapilarę szklaną lub pętli Irwina, przenieś zwierzęta na dno probówki 1,5 mL wolnej od RNaz, dbając o to, aby wraz ze zwierzętami przenieść jak najmniejszą ilość wody.
  4. Wiruj z prędkością 4 500 g przez 3 min, aby osadzić niesiorowate na dnie probówki do mikrowirówki.
  5. Obserwując pod mikroskopem stereoskopowym probówkę z osadem niesiorowatych, użyj pipety 20 µL lub gruszki do pipety przymocowanej do komory zestawu rurki aspiracyjnej wyposażonej w kapilarę szklaną o otworze mniejszym niż niesiorowate, z których izolowane jest RNA, aby ostrożnie usunąć jak największą ilość wody, nie naruszając osadu niesiorowatych. Zobacz Rysunek 1B, aby zapoznać się z przykładem dopuszczalnej ilości pozostałej wody.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby pozostawić cienką warstwę wody, tak aby zwierzęta nie wyschły w krótkim czasie między usunięciem wody a dodaniem buforu do ekstrakcji (Extraction Buffer, XB). Wyschnięcie zwierząt może skutkować niską jakością RNA po izolacji.
  6. Dodaj 100 µL buforu do ekstrakcji (XB) do probówki zawierającej niesiorowate.

3. Mechaniczne rozbicie niesporczaków i ekstrakcja RNA

  1. Używając pestle wolnego od RNaz, rozbij niesiorpodobne, delikatnie, ale zdecydowanie wcierając pestle w dno probówki przez ok. 30 s. Łącznie 20–30 ruchów rozcierania powinno być wystarczających do rozbicia zwierząt.
  2. Wyjmij pestle z probówki, dbając o to, aby jak najwięcej cieczy pozostało na dnie probówki.
  3. Sprawdź zawartość probówki do wirówki pod mikroskopem sekcyjnym, aby upewnić się, że nie pozostały żadne widoczne nieuszkodzone zwierzęta.
  4. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 42 °C przez 30 min w termobloku z delikatnym mieszaniem (300 rpm).
    UWAGA: Bufor do ekstrakcji (XB) stabilizuje RNA, aby zapobiec jego degradacji w tej temperaturze.

4. Kondycjonowanie kolumny do izolacji RNA

  1. W ciągu ostatnich 10 min inkubacji podczas ekstrakcji przygotuj kolumnę do zbierania i oczyszczania RNA. Umieść kolumnę oczyszczającą w probówce zbiorczej i odpowiednio ją opisz.
  2. Dodaj 250 µL Buforu Kondycjonującego (CB) bezpośrednio do kolumny.
  3. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  4. Wiruj z prędkością 16,000 × g przez 1 min i odrzuć filtrat. Kolumna jest teraz gotowa do przyjęcia nadpływu RNA z następnego kroku.
  5. Wyjmij z zamrażarki 10x Bufor do Reakcji DNaza I oraz wodę wolną od nukleaz, aby całkowicie je rozmrozić przed przystąpieniem do kroku 6 poniżej.

5. Wiązanie RNA do kolumny

  1. Po inkubacji podczas ekstrakcji odwiruj probówkę zawierającą mechanicznie rozbite niesiorowate i bufor do ekstrakcji (XB) przy 3,000 × g przez 2 min.
  2. Przygotuj nową probówkę wolną od RNaz i odpowiednio ją opisz.
  3. Za pomocą pipety 200 µL z końcówką z filtrem ostrożnie usuń nadsącz znad osadu kutykul niesiorkowatych. Należy uważać, aby nie zaburzyć osadu kutykuli i usunąć wyłącznie nadsącz.
    UWAGA: Przeniesienie kutykuli do kolejnych etapów spowoduje obniżenie wydajności otrzymywania RNA z kolumny z powodu fizycznego zapchania kolumny. Aby uniknąć tego potencjalnego błędu, można sprawdzić końcówkę pipety z nadsączem pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie ma w niej kutykuli. Jeśli kutykula jest obecna, należy przelać nadsącz z powrotem do probówki i powtórzyć etap wirowania.
  4. Przenieś nadsącz do nowo opisanej probówki wolnej od RNaz.
  5. Pipetuj 100 µL 70% etanolu do probówki zawierającej RNA i wymieszaj dokładnie, pipetując wielokrotnie w górę i w dół. Na tym etapie po dodaniu etanolu powinny być widoczne wyraźne, lepkie włókna. Jest to dobry sygnał świadczący o obecności RNA w nadsączu.
  6. Pipetuj całą mieszaninę (200 µL) na przygotowaną w kroku 4 kolumnę.
    UWAGA: Podczas pipetowania roztworów na kolumnę w tym i w kolejnych krokach należy dbać o to, aby dozować ciecz do środka kolumny i unikać fizycznego dotykania kolumny końcówką pipety. Mechaniczne przebicie kolumny spowoduje problemy z jakością i ilością RNA w dalszych etapach.
  7. Aby związać RNA z kolumną, wiruj przez 2 min przy 100 × g, a następnie wiruj przy 16,000 × g przez 30 s, aby usunąć filtrat.

6. Przygotowanie roztworu DNazy I

  1. Pozostaw 10x bufor reakcyjny DNase I oraz wodę wolną od nukleaz do całkowitego rozmrożenia przed przygotowaniem roztworu.
  2. Dla każdej izolacji RNA przygotuj w oddzielnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL roztwór o objętości 40 µL, składający się z 32 µL wody wolnej od nukleaz, 4 µL 10x buforu reakcyjnego DNase I oraz 4 µL enzymu DNase I. Przechowuj roztwór w lodzie do momentu nałożenia go na kolumnę w kroku 7.3.

7. Płukanie RNA i traktowanie DNazą I

  1. Nanieść 100 µL Buforu do płukania 1 (W1) bezpośrednio na kolumnę oczyszczającą zawierającą związane RNA (z kroku 5.7).
  2. Wirirmek przez 1 min w 8,000 × g i usunąć filtrat.
  3. Nanieść 40 µL roztworu DNazy I z Kroku 6 bezpośrednio na kolumnę oczyszczającą i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min w celu usunięcia zanieczyszczeń DNA.
  4. Nanieść 40 µL Buforu do płukania 1 (W1) na kolumnę oczyszczającą i wirować w 8,000 × g przez 30 s.
  5. Nanieść 100 µL Buforu do płukania 2 (W2) na kolumnę oczyszczającą i wirować w 8,000 × g przez 1 min.
  6. Nanieść kolejne 100 µL Buforu do płukania 2 (W2) na kolumnę oczyszczającą i wirować w 16,000 × g przez 2 min. Odrzucić filtrat.
  7. Wirować kolumnę w 16,000 × g przez 1 min, aby osuszyć kolumnę.

8. Elucja RNA

  1. Przygotuj probówkę 0,5 mL (zawartą w zestawie) dla każdej izolacji RNA i odpowiednio ją opisz. Będzie to probówka, w której znajdzie się RNA po izolacji.
  2. Przenieś kolumnę z wiązanym i przemytym RNA do opisanej probówki 0,5 mL. Kolumna powinna stabilnie wskoczyć do wnętrza probówki.
  3. Patrząc na probówkę z boku, ustaw końcówkę pipety bezpośrednio nad membraną kolumny, nanieś 11 µL buforu do elucji (EB) na kolumnę i inkubuj przez 1 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Nierównomierne naniesienie buforu do elucji (EB) bezpośrednio na kolumnę spowoduje obniżenie wydajności izolacji RNA. Obecność kropel cieczy wokół obwodu kolumny sugeruje nieprawidłowe rozprowadzenie buforu do elucji (EB). W takim przypadku zaleca się powtórzenie tego kroku, wykorzystując filtrację z kroku 8.5, dbając o to, aby bufor do elucji (EB) był naniesiony bezpośrednio na środek kolumny.
  4. Umieść probówkę 0,5 mL z kolumną w probówce zbiorczej dostarczonej w zestawie, aby zapewnić prawidłowe dopasowanie podczas wirowania (Rysunek 2).
  5. Wiruj kolumnę przy 1 000 × g przez 1 min w celu rozprowadzenia buforu do elucji (EB), a następnie wiruj przy 16 000 × g przez 1 min, aby eluować RNA.
  6. Natychmiast umieść probówkę 0,5 mL zawierającą RNA na lodzie.

9. Walidacja ilości i jakości RNA za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru

UWAGA: Do oceny ilości i jakości RNA można zastosować inne metody. W tym przypadku wykorzystano metodę z użyciem mikroobjętościowego spektrofotometru. Można również zastosować fluorometr lub urządzenie do mikrofluidycznej elektroforezy żelowej29.

  1. Przetrzeć podstawkę spektrofotometru mikropojemnościowego ściereczką niepozostawiającą włókien, aby upewnić się, że jest ona wolna od innych cieczy.
  2. Wybrać w spektrofotometrze ustawienie RNA do analizy.
  3. Wyzerować spektrofotometr, używając 1 µL buforu elucyjnego (EB) zastosowanego w kroku 8.3.
  4. Po wyzerowaniu przetrzeć podstawkę z buforu elucyjnego (EB) ściereczką niepozostawiającą włókien.
  5. Trzymając probówkę 0,5 mL zawierającą RNA na lodzie, nanieść 1 µL RNA na podstawkę spektrofotometru. Obniżyć ramię spektrofotometru, aby zmierzyć absorbancję próbki w celu określenia ilości i oceny jakości wyizolowanego RNA.
    UWAGA: Szczegóły dotyczące akceptowalnej jakości i ilości dla dalszych zastosowań znajdują się w poniższej sekcji „Wyniki”.

Wyniki

Kluczowym krokiem w tym protokole, jak wspomniano powyżej, jest usunięcie odpowiedniej ilości wody z zebranych niesiorpoci (tardigradów) przed dodaniem buforu do ekstrakcji (XB) w celu izolacji RNA. Pozostawienie zbyt dużej ilości wody doprowadzi do rozcieńczenia buforu ekstrakcyjnego (XB) i nieoptymalnej (tj. RIN < 7, stosunek 260/280 <1,8, stosunek 260/230 <1,8 i/lub stężenie <5 ng/µL) ekstrakcji RNA z organizmów, co skutkuje obniżeniem stężenia i jakości RNA po elucji. Usunięcie zbyt dużej ilości wody spowoduje szybkie wysuszenie zwierząt, co może prowadzić do ich śmierci i pogorszenia jakości RNA z powodu zwiększonej aktywności RNaz po obumarciu. Aby pomóc w prawidłowym przeprowadzeniu tego protokołu, przedstawiono wizualizację wskazującą odpowiednią ilość wody, która powinna pozostać w probówce z niesiorpcami przed dodaniem buforu do ekstrakcji (XB) (Rysunek 1B).

Do tej pory protokół ten był testowany na sześciu różnych gatunkach niesiorni, w tym na heteroniesiorni (V. celatus). Izolacje te pozwoliły uzyskać stężenia RNA w zakresie od 11 ng/µL do 106,6 ng/µL (potwierdzone za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru, Tabela 1) oraz od 9 ng/µL do 113 ng/µL (potwierdzone za pomocą mikrofluidycznej elektroforezy w żelu, Tabela 2). Liczba zwierząt niezbędna do izolacji RNA różni się w zależności od wielkości gatunku, z którego przeprowadzana jest izolacja. Większe niesiornie, takie jak gatunki Paramacrobiotus i Milnesium sp., dają wystarczające stężenia RNA już z 25 osobników (Tabela 1). W przypadku mniejszych gatunków, takich jak H. exemplaris i V. celatus, izolacje są bardziej udane przy użyciu 100 lub więcej osobników (Tabela 1). Większość izolacji wykazuje stosunek 260/280 w okolicach 2, co wskazuje na czystość RNA30. Izolacje z niektórych gatunków (V. celatus, H. exemplaris oraz gatunki Paramacrobiotus) okazjonalnie skutkują niskim stosunkiem 260/230, co sugeruje zanieczyszczenie odczynnikami30. Często działo się tak przy użyciu mniejszej liczby zwierząt (100 dla V. celatus i H. exemplaris oraz 25 dla gatunków Paramacrobiotus), co sugeruje, że zbyt mała liczba osobników może zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia odczynnikami w końcowym eluatcie RNA. Poprzez ocenę jakości RNA za pomocą mikrofluidycznej elektroforezy w żelu można obliczyć wskaźnik integralności RNA (RIN). Wartość RIN między 9 a 10 sugeruje wysoką jakość RNA z niewielką degradacją31; zazwyczaj zaleca się, aby nie przechodzić do dalszych etapów, takich jak sekwencjonowanie RNA, jeśli RIN jest niższy niż 7. Przedstawiono przykładowe wyniki mikrofluidycznej elektroforezy w żelu (Rysunek 3) dla próbek z wysokimi oraz niskimi/niewykrywalnymi wartościami RIN. Niektóre z tych próbek zostały wykluczone z dalszych analiz (Tabela 2, Rysunek 3A,D). Jednakże niektóre próbki z niskim/niewykrywalnym RIN zostały zakwalifikowane do przygotowania bibliotek do sekwencjonowania RNA i mimo to dostarczyły wysokiej jakości wyników sekwencjonowania (Tabela 2, Rysunek 3B,F, dane niepublikowane, szczegóły w sekcji „Dyskusja”).

figure-results-1
Rysunek 1: Konfiguracja izolacji RNA. Zdjęcia przedstawiające gruszkę pipety przymocowaną do komory zespołu rurki aspiracyjnej wyposażonej w kapilarę szklaną do przemieszczania zwierząt i usuwania wody (A) oraz reprezentację dopuszczalnej ilości wody pozostałej przed dodaniem buforu ekstrakcyjnego (Extraction Buffer, XB) do niesiorówek z rodzaju Paramacrobiotus (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Przygotowanie probówki do elucji końcowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki mikrofluidycznej elektroforezy żelowej dla H. exemplaris i P. gadabouti. (A) Żel RNA z H. exemplaris poddanego promieniowaniu jonizującemu. (B) Żel RNA z P. gadabouti i H. exemplaris w warunkach kontrolnych. (C–F) Reprezentatywne profile pików z wysokiej jakości próbki RNA H. exemplaris (C), z próbki H. exemplaris o wątpliwej jakości (D), z dobrej jakości próbki P. gadabouti (E) oraz z próbki H. exemplaris z widoczną degradacją (pik przy 147 bp) (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Reprezentatywne stężenia i informacje o jakości RNA z różnych gatunków niesiorówek, zebrane za pomocą spektrofotometru mikropojemnościowego. *Stężenia poniżej 20 ng/µL, wykryte za pomocą spektrofotometru mikropojemnościowego, mogą prowadzić do niedokładnych stosunków absorbancji. **Niski stosunek 260/230 spowodowany nieprawidłową prędkością wirowania w kroku 5.7. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Reprezentatywne stężenia i informacje o jakości RNA z dwóch gatunków niesioruków, pobrane za pomocą mikrofluidycznego systemu elektroforezy żelowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Celem niniejszego protokołu jest ułatwienie izolacji RNA z niesioruneków w ilości i jakości wystarczającej do zastosowań w dalszych analizach umożliwiających badanie tolerancji niesioruneków na stres. Przedstawiony tutaj protokół wskazuje obszary, w których użytkownicy mogą napotkać trudności, w tym: usunięcie odpowiedniej ilości wody przed dodaniem buforu do ekstrakcji (XB) (Krok 2.5), rozbicie ciał niesioruneków (Krok 3.1–3.3), przeniesienie supernatantu do kolumny w celu oczyszczania (Krok 5.3) oraz elucję RNA (Krok 8.3). Błędy w którymkolwiek z tych etapów mogą skutkować obniżeniem stężenia lub jakości otrzymanego RNA. Jeśli stężenie uzyskanego RNA jest niższe niż 5 ng/µL (co należy zweryfikować za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru), użytkownik może rozważyć powtórzenie izolacji RNA z zastosowaniem (1) większej liczby zwierząt wyjściowych (>100 w przypadku małych gatunków lub >50 w przypadku gatunków większych) lub (2) ponowne wykonanie protokołu, zwracając szczególną uwagę na etapy usuwania wody, rozbijania niesioruneków oraz elucji.

Niniejszy artykuł przedstawia przykłady oceny jakości RNA (RIN, stosunek 260/280, stosunek 260/230), które uznano za odpowiednie lub nieodpowiednie do sekwencjonowania RNA (Tabela 1, Tabela 2, Rycina 3). Sporadycznie w niektórych izolacjach RNA przeprowadzonych zgodnie z tym protokołem obserwuje się niskie (<1,0) wartości stosunku 260/230 (Tabela 1), co sugeruje obecność pozostałości związków organicznych. Zazwyczaj wiązało się to z niską liczbą zwierząt. Jeśli zwiększenie liczby zwierząt nie jest możliwe lub jeśli użytkownicy konsekwentnie napotykają niski stosunek 260/230, zaleca się dodanie dodatkowego etapu płukania buforem do płukania 2 (Wash Buffer 2, W2) (powtórzenie kroku 7.6) i/lub wydłużenie czasu wirowania osuszającego w kroku 7.7, aby zapewnić usunięcie tych zanieczyszczeń. Dodatkowo należy zaznaczyć, że jedna reprezentatywna izolacja H. exemplaris z niskim stosunkiem 260/230 (Tabela 1) została wykonana przez studenta używającego protokołu po raz pierwszy, który z perspektywy czasu zdał sobie sprawę, że krok 5.7 (wirowanie w celu usunięcia etanolu po związaniu RNA z kolumną) został przeprowadzony przy niewłaściwej prędkości wirowania (zbyt niskiej). Prawdopodobnie doprowadziło to do zatrzymania etanolu na kolumnie i jego przeniesienia przez kolejne etapy protokołu, co skutkowało niskim stosunkiem 260/230. Kolejne izolacje wykonane przez tego użytkownika przyniosły wartości 260/230 w rozsądnym zakresie (nie niższe niż 1,5). Dlatego wszyscy użytkownicy, zwłaszcza ci po raz pierwszy, powinni zwracać szczególną uwagę na prędkości wirowania podczas realizacji protokołu, aby uniknąć tych potencjalnych problemów. Mimo sporadycznie niskich wartości stosunku 260/230 lub niskiego RIN u H. exemplaris, RNA o podobnych odczytach jakości mogło być nadal wykorzystane do dalszego sekwencjonowania w celu zbadania różnicowej ekspresji genów po ekspozycji na promieniowanie jonizujące lub inne stresory8 (Tabela 1, Tabela 2 oraz nieopublikowane dane). Podobnie, RNA wyizolowane z P. gadabouti przy użyciu tego protokołu charakteryzowało się wysokim stężeniem i jakością (co potwierdzono za pomocą RIN, Tabela 2, Rycina 3) i dostarczyło istotnych danych z sekwencjonowania RNA (nieopublikowane dane). Według przekazów anegdotycznych w tej badaniu z sukcesem wykorzystano RNA z H. exemplaris o niskich stężeniach (5–9 ng/µL) do syntezy cDNA w celu pomyślnego klonowania genów H. exemplaris8. W przypadku, gdy RNA z H. exemplaris wykazało niskie lub niewykrywalne stężenie i RIN (mierzone za pomocą mikrofluidycznej elektroforezy żelowej), RNA z tej próbki zostało ponownie wyizolowane przed przystąpieniem do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania RNA (Tabela 2, Rycina 3A,D). Decyzja o powtórzeniu izolacji RNA dla tej próbki (Rycina 3A,D), zamiast przejścia do sekwencjonowania, jak zrobiono w przypadku innych próbek H. exemplaris z niewykrywalnym RIN (Rycina 3B,F), została podjęta na podstawie braku wyraźnych prążków na żelu mikrofluidycznym, co może świadczyć o błędzie podczas nakładania, degradacji RNA lub niewystarczającym stężeniu RNA. Z kolei w przypadku RNA wyizolowanego z H. exemplaris, które miało stosunkowo niskie stężenie, niewykrywalny RIN i oznaki pewnej degradacji RNA (wskazane przez wyższy poziom małych cząsteczek RNA), uzyskano użyteczne dane z sekwencjonowania po przygotowaniu biblioteki (nieopublikowane dane, Tabela 2, Rycina 3B,F). Zatem, choć przedstawiono tutaj pewne wytyczne dotyczące oceny przydatności próbek RNA do dalszych zastosowań, użytkownik powinien kierować się własnym uznaniem i wziąć pod uwagę konkretne zastosowanie końcowe przy ocenie, czy jakość i ilość RNA są wystarczające do kontynuowania prac.

Naukowcy chcący wyizolować RNA z niesporczaków muszą wziąć pod uwagę wiele aspektów przy określaniu, który protokół jest najlepiej dostosowany do ich celu. Wszystkie wcześniej opisane metody izolacji RNA (w tym metoda opisana w niniejszej pracy) pozwoliły na uzyskanie RNA w ilości i jakości wystarczającej do przeprowadzenia dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie RNA, synteza cDNA oraz qPCR8,12,13,17,21,22,25,27. Częstym czynnikiem rozważanym jest koszt, szczególnie w przypadku laboratoriów badawczych z niewielkim budżetem lub laboratoriów dydaktycznych. Protokół opisany w niniejszej pracy jest droższy w przeliczeniu na jedną reakcję izolacji niż metody opisane wcześniej. Twierdzimy jednak, że wzrost kosztów wiąże się z korzyściami w porównaniu do wcześniej opisywanych protokołów. W zestawieniu z innymi protokołami izolacji RNA opartymi na kolumienkach23, protokół opisany tutaj pozwala na uzyskanie znacznej ilości RNA o wystarczającej jakości z mniejszej ilości materiału wyjściowego (mniejszej liczby osobników). Dodatkowo, jak wspomniano we wstępie, wcześniej opisany protokół izolacji RNA oparty na kolumienkach działał w naszych rękach niespójnie, często prowadząc do ekstremalnie niskiej wydajności RNA, niewystarczającej do dalszych procesów (dane niepublikowane). Protokół opisany w niniejszej pracy jest również znacznie bezpieczniejszy w porównaniu do podejścia opartego na fenolu, ponieważ nie wymaga od użytkowników pracy z niebezpiecznymi chemikaliami wymagającymi dygestorium. Ponadto częstym problemem użytkowników protokołów ekstrakcji RNA opartych na fenolu jest przeniesienie pozostałości fenolu, co wpływa na czystość RNA i może zaburzać dalsze aplikacje. Problemy te sprawiają, że ekstrakcja RNA oparta na fenolu jest mniej dostępna dla studentów (zarówno w laboratoriach badawczych, jak i w salach lekcyjnych). Niemniej jednak metoda oparta na fenolu jest najbardziej efektywna kosztowo. Protokół opisany tutaj nie nadaje się do izolacji RNA z pojedynczego zwierzęcia w celu oceny odpowiedzi transkryptomicznej pojedynczego osobnika (jak opublikowano w Kirk et al.), lecz jest za to wartościowy do badania wspólnych zmian u wielu osobników w odpowiedzi na czynnik stresogenny, co zapewnia bardziej holistyczny wgląd w odpowiedzi stresowe. Dlatego użytkownicy powinni rozważyć znaczenie kosztów, dostępność zwierząt oraz dostępność istniejących protokołów dla użytkownika, aby określić, który protokół najlepiej odpowiada ich potrzebom.

Niniejszy raport potwierdził, że opisany protokół pozwala na otrzymanie RNA o wystarczającej ilości i jakości z sześciu różnych gatunków niesporczaków, w tym z gatunku reprezentującego Heterotardigrada. Ponadto ta metoda izolacji RNA pozwala na pozyskanie odpowiedniej ilości materiału z rozsądnej liczby zwierząt (od 25 do 200, w zależności od wielkości gatunku). Walidacja tego protokołu izolacji RNA dla wielu gatunków otwiera drogę do zrozumienia fascynujących aspektów biologii niesporczaków. Nie ogranicza się to jedynie do badania tolerancji na stres, ale obejmuje również zrozumienie ewolucji tych zwierząt, w tym ewolucję i rozwój mechanizmów oporności. Protokół ten jest szczególnie użyteczny w przypadku gatunków niesporczaków niebędących organizmami modelowymi oraz tych pobranych z terenu, gdzie biomasa jest ograniczona, a brakuje ustandaryzowanych metod izolacji RNA. Wreszcie, protokół ten jest dostępny dla badaczy i może być powtarzalnie wykonywany przez studentów, co czyni go cennym narzędziem w laboratoriach dydaktycznych lub badawczych w instytucjach kształcących głównie na poziomie licencjackim.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych informacji do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta była wspierana z funduszy startowych UNC Asheville (dla CCH) oraz z grantu NSF 2225683 przyznanego Jasonowi Pienaarowi (opiekunowi postdoktorskiemu PK). Dziękujemy UNC High Throughput Sequencing Facility za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Skaowlone probówki do mikrowirówki 1,5 mL z podziałką, naturalne, polipropylenowe, 500/opakowanie
70% etanolVWR71001-654Do czyszczenia blatów i sprzętu
Zestaw do izolacji RNA Arcturis PicoPure RNA Isolation KitFisherKIT0204Zestaw zawierający komponenty do protokołu izolacji opisanego w niniejszej pracy
WirówkaEppendorf5405000441Centrifuge 5425, pokrętła obrotowe, niewychładzana, z rotorem FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (US)
Woda źródlana Deer Parkdowolny sklep spożywczyN/AMedium do hodowli niesioręków, używane również do płukania osobników przed izolacją RNA
Mikroskop sekcyjnyZeissN/AZeiss Stemi 305, stos zoom 5:1 i całkowite powiększenie 8x-40x, z jednostką doświetlania M LED
DNaza IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, wolna od RNaz (1 U/µL)
불어owane końcówki do pipet 10 µLVWR76322-528Dowolne filtrowane końcówki do pipet
불어owane końcówki do pipet 1000 µLVWR76322-154Dowolne filtrowane końcówki do pipet
불어owane końcówki do pipet 20 µLVWR76322-134Dowolne filtrowane końcówki do pipet
불어owane końcówki do pipet 200 µLVWR76322-150Dowolne filtrowane końcówki do pipet
Kapilary szklaneFisher50-821-811Standardowe kapilary szklane World Precision Instrument - 1B120-6 (6 cali, średnica zewnętrzna 1,2 mm, bez włókna). Są one rozciągane nad płomieniem w celu uzyskania dwóch kapilar szklanych z zwężonymi końcami, a następnie łamane do odpowiedniej średnicy, aby umożliwić pobieranie wybranych gatunków niesioręków za pomocą pipety ustnej.
Blok grzejnyEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, urządzenie podstawowe bez bloku termicznego, 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/Ameryka Południowa/TW)
Marker RNA High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581Marker do analizy całkowitego RNA o wysokiej czułości w systemach TapeStation
Kasetka High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Do analizy całkowitego RNA o wysokiej czułości w systemach TapeStation
Bufor do próbek High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580Bufor do analizy całkowitego RNA o wysokiej czułości w systemach TapeStation
Mikroprzepływowa elektroforeza żelowaAgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation System
Mikroobjętościowy spektrofotometrFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, Typ detektora: 2048-elementowy liniowy czujnik obrazu CMOS, Wyświetlacz: 10-calowy kolorowy wyświetlacz wysokiej rozdzielczości, Języki: chiński, angielski, francuski, japoński, niemiecki, Źródło światła: lampa ksenonowa, Szerokość pasma widmowego: ≤ 1,8 nm (FWHM dla Hg 254 nm), Napięcie: 12 VDC
Pipeta ustnaMillipore SigmaA5177Zespoły rurek aspiracyjnych do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych
Woda wolna od nukleazFisherFERR0581Thermo Scientific Water, nuclease-free
Pipety (2,5 µL, 20 µL, 200 µL i 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, zestaw 4 sztuk
RNase AwayFisher21-402-178Środek do dekontaminacji powierzchni Thermo Scientific RNase AWAY
Probówka i tłuczek wolne od RNazFisher12-141-368Probówki i tłuczki wolne od RNaz do izolacji RNA

Bibliografia

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protok wielogatunkowymessenger RNAsekwencjonowanie RNAinterferencja RNAtolerancja na stresekspresja heterologicznastres rodowiskowymechanizmy molekularne
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.