Niniejsze badanie ma na celu ocenić surowicową miR-215-5p jako biomarker diagnostyczny w artrozie i zbadać jej mechanizm regulacji w chrzęstkach indukowanych przez IL-1β.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Niniejsze badanie ma na celu ocenić surowicową miR-215-5p jako biomarker diagnostyczny w artrozie i zbadać jej mechanizm regulacji w chrzęstkach indukowanych przez IL-1β.
Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest chorobą zwyrodnieniową stawów charakteryzującą się degradacją chrząstki stawowej i zapalnym naciekiem błony maziowej. Celem niniejszego badania była ocena surowicowego miR-215-5p jako biomarkera diagnostycznego OA oraz zbadanie jego mechanizmu regulacji w chondrocytach indukowanych IL-1β. Do badania zapisano 110 pacjentów z OA i 105 zdrowych kontroli. Ekspresję surowicowego miR-215-5p i EREG wyznaczono za pomocą ilościowej odwrotnej transkrypcji reakcji łańcuchowej polimerazy. Wartość diagnostyczną miR-215-5p dla OA oceniano za pomocą krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika. Stymulacja chondrocytów C28/I2 za pomocą IL-1β służyła do zbudowania modelu komórkowego OA. Wyznaczano żywotność komórek, ich zdolność migracyjną i poziomy cytokin zapalnych za pomocą zestawu do liczenia komórek Kit-8, testu Transwell oraz enzymowego testu immunopochłaniania (ELISA). Związek międzi miR-215-5p a EREG potwierdzono za pomocą testu reporterowego z dwoma luciferase oraz testu immunoprecypitacyjnego RNA (RIP). U pacjentów z OA stwierdzono nadekspresję surowicowego miR-215-5p i podekspresję EREG. MiR-215-5p wykazywał dobrą wydajność diagnostyczną w OA (powierzchnia pod krzywą, AUC = 0,883). W komórkach C28/I2 po obróbce interleukiną-1β (IL-1β) zahamowanie miR-215-5p zwiększyło żywotność komórek i ich zdolność migracyjną oraz zmniejszyło poziomy IL-1β, IL-6 i czynnika nekrozującego guzów-α (TNF-α). EREG potwierdzono jako bezpośrednie cele miR-215-5p. Knockdown EREG częściowo odwrócił efekt promocyjny obniżenia ekspresji miR-215-5p na żywotność i zdolność migracyjną komórek C28/I2 po obróbce IL-1β i zmniejszył jego hamujący wpływ na czynniki zapalne. MiR-215-5p przyczynia się do patogenezy OA poprzez regulację EREG i stanowi obiecujący biomarker diagnostyczny oraz potencjalny cel terapeutyczny w OA.
Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest chorobą zwyrodnieniową stawów, a jej patologia charakteryzuje się zwyrodnieniem chrząstki wraz z zapaleniem błony maziowej1,2. Na skalę globalną, częstość występowania OA pozostaje wysoka, a odpowiednie badania wykazały trend wzrostu częstości z roku na rok3,4. Ustalono, że czynniki takie jak otyłość, starzenie się, podatność genetyczna i gęstość kości są związane z rozwojem OA5. Pod względem objawów klinicznych, pacjenci z OA często wykazują ból stawów, obrzęk, ograniczony ruch i sztywność, co poważnie obniża jakość życia pacjentów6,7. Warto zauważyć, że istnieją różne fenotypy OA, a te fenotypy trafnie odzwierciedlają różnorodność patogenezy choroby8. Obecnie leczenie OA nadal koncentruje się na poprawie objawów, a powszechnie stosowanymi lekami klinicznymi są leki przeciwbólowe i niesteroidowe leki przeciwzapalne, które są w stanie tylko złagodzić ból i nie mogą skutecznie odwrócić postępu choroby9. Dlatego też, poszukiwanie nowych biomarkerów OA stało się pilną potrzebą dla obecnych badań.
MikroRNA (miRNA) to kategoria krótkich cząsteczkowych cząstek RNA, które nie biorą udziału w kodowaniu białek10. Służą jako ważne cząsteczki regulacyjne genów w organizmach wielokomórkowych i mogą wpływać na ekspresję licznych kodujących białka genów11. Liczne badania potwierdziły, że miRNA wywierają znaczący wpływ na rozwój OA12. Poprzednie badanie wykazało, że miR-215-5p był wyrażany w przerostowej plazmie i zmniejszał migrację i zdolność inwazyjną trofoblastów poprzez regulację ekspresji CDC613. Przewlekła ekspresja miR-215-5p zmniejszyła uszkodzenie zapalne w komórkach H9c2 w sepsie14. miR-215-5p mogło wywierać efekt ochronny w patogenezie osteoporozy poprzez hamowanie ekspresji XIAP i promowanie różnicowania hBMSCs15. Warto zauważyć, że miR-215-5p zostało znalezione jako ekspresja zwiększona, gdy przeanalizowano profile ekspresji miRNA tkanek błony maziowej pacjentów z OA16. Jednakże, ekspresja miR-215-5p w surowicy i jego potencjalna wartość jako biomarker diagnostyczny OA nie zostały jeszcze zbadane. Rola miR-215-5p w chondrocjach OA, zwłaszcza jego wpływ na żywotność komórek, migrację i reakcję zapalną, pozostaje niejasna. Żadne badania nie poinformowały, czy miR-215-5p wywiera swoją funkcję regulacyjną w OA poprzez określone dolne kanały. Uzupełnienie tych luk dostarczy nowych wglądów w mechanizmy molekularne OA i identyfikuje nowe kandydatów na cele terapeutyczne.
EREG jest członkiem rodziny czynników wzrostu naskórka i zostało udowodnione, że jest zaangażowane w naprawę tkanek i reakcje zapalne17,18. Badanie Chen i wsp. wykazało, że ekspresja EREG była znacznie zmniejszona w chrząstce i tkankach błony maziowej pacjentów z OA w porównaniu z grupą kontrolną19. Jednakże, czy EREG pełni rolę dolnego kanału miR-215-5p w chondrocjach OA i jaka jest rola tej osi regulacyjnej w patogenezie OA, pozostają niejasne obecnie.
Na podstawie powyższego tła, postulujemy, że ekspresja miR-215-5p w surowicy jest zwiększona u pacjentów z OA i prowadzi do dysfunkcji chondrocytów zapalnych poprzez bezpośrednie kierowanie na EREG, podczas gdy hamowanie miR-215-5p łagodzi uszkodzenie chondrocytów wywołane interleukiną-1β (IL-1β). W niniejszym badaniu zastosowano jednolite, mierzalne punkty końcowe i kryteria oceny dla walidacji klinicznej i komórkowej: klinicznie, 110 pacjentów z OA i 105 zdrowych kontroli zostało włączonych; poziomy miR-215-5p i EREG w surowicy zostały zmierzone za pomocą qRT-PCR, a krzywe ROC zostały zastosowane do oceny wydajności diagnostycznej (ważne, jeśli AUC ≥ 0,7, P < 0,05). Korelacje zostały analizowane za pomocą testów Chi-kwadrat pomiędzy miR-215-5p a cechami klinicznymi OA, a wielowymiarowa regresja logistyczna zidentyfikowała niezależne czynniki ryzyka OA (skorygowane P < 0,05). In vitro, chondrocyty C28/I2 były traktowane z 10 ng/mL IL-1β przez 24 h, aby ustanowić model OA, następnie transfekcją z inhibitorem miR-215-5p/mimic i si-EREG. Testy CCK-8, Transwell i ELISA zostały zastosowane do oceny żywotności komórek, migracji i poziomów cytokin zapalnych. Kryteria eksperymentu ratunkowego: inhibitor miR-215-5p przywrócił żywotność i migrację chondrocytów (P < 0,05), a wyciszenie EREG częściowo zniosło ten efekt ochronny (P < 0,05). Bioinformatyczne przewidywania TargetScan, badania reporterowe dual-luciferase i badania RIP dodatkowo potwierdziły ich bezpośred
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie przeprowadzono zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Komisja Etyki Xianyou County General Hospital zatwierdziła badanie przed jego rozpoczęciem (Numer zgody 202514, z dnia 18 czerwca 2025 r.).
Podsumowanie protokołu znajduje się w Dodatkowej Figurze 1.
Próbki
Do badania zgłosiło się łącznie 110 pacjentów z OA leczonych w tym szpitalu oraz 105 zdrowych osób kontrolnych. Kryteria dopuszczenia do grupy OA były następujące: diagnostyka OA potwierdzona zgodnie z kryteriami klasyfikacyjnymi ustanowionymi przez American College of Rheumatology20. Wszyscy pacjenci przeszli zdjęcie rentgenowskie i klasyfikację zdjęciową Kellgren-Lawrence (K-L); brak leczenia antybiotykami w ciągu 3 miesięcy przed przyjęciem; pełne dane kliniczne; i pisemna zgoda świadomie udzielona przez wszystkich pacjentów. Kryteria wykluczenia dla grupy OA obejmowały pacjentów, którzy otrzymali odpowiednią terapię lub byli w terminalnym stadium choroby; osoby cierpiące na inne choroby stawów, takie jak dna, reumatoidalne zapalenie stawów itp.; te z kombinacją guzów, ciężkimi niewydolnościami wątroby i nerek, chorobami autoimmunologicznymi, chorobami zakaźnymi, chorobami neurologicznymi lub ciężkimi chorobami układu krążenia i oddechowego; oraz te z niepełnosprawnościami fizycznymi, które uniemożliwiały im samodzielną opiekę. W momencie zapisu, dane początkowe wszystkich uczestników zostały nagrane, w tym wiek, płeć, wskaźnik masy ciała (BMI), palenie, picie, wywiad rodzinny, przebieg choroby, stopień K-L, wynik Visual Analog Scale (VAS), wynik Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index (WOMAC) oraz miejsce zmian. Odpowiednie dane zostały przeanalizowane i podsumowane w Tabeli 1. Wszystkim badanym wyciągnięto 8 ml krwi żylnej na czczo, pozostawiono do ostania się przez 3 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie wyśrodkowano w temperaturze 4 °C z prędkością 3000 x g przez 15 min w celu izolowaniu surowicy. Surowica była delikatnie pobrana i przechowywana w temperaturze -80 °C aż do dalszych badań.
Krówia krew/surowice (Kategoria B materialu biologicznego zakaźnego) zawierają płyny ustrojowe człowieka, które mogą zawierać nieznane patogeny zakaźne i mogą powodować zakażenia przezskórne lub śluzówkowe poprzez rozbryzgi, nakłucia igiełkami lub kontakt z uszkodzoną skórą. Należy nosić jednorazowe rękawice nitrylowe, jednorazowe kombinezony medyczne, okulary ochronne lub maseczki i maseczki chirurgiczne. Po poddaniu wysokociśnieniowej sterylizacji jest zbierana centralnie i spalana przez certyfikowane instytucje dotyczące usuwania odpadów medycznych.
Hodowla komórek i budowa modelu komórek OA
Komórki chrząstkowe ludzkie C28/I2 były utrzymywane w pożywce DMEM/F12 zawierającej 10% surowicy wołowej (FBS) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze wypełnionym 5% CO₂. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z wykorzystaniem komórek na przedziałach 3-6 w celu utrzymania stabilnego fenotypu komórkowego. Kolejne manipulacje eksperymentalne przeprowadzano po osiągnięciu przez komórki 80% konfluencji. Komórki w grupie doświadczalnej były leczone 10 ng/mL IL-1β w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu stworzenia in vitro modelu OA21, podczas gdy komórki w grupie kontrolnej pozostawiono bez leczenia.
Transfekcja komórek
Negatywny inhibitor kontrolny (inhibitor-NC), miR-215-5p inhibitor, mimic-NC, miR-215-5p mimic, negatywny mały interferencyjny RNA (si-NC) oraz si-EREG zostały syntetyzowane komercyjnie. Testy transfekcji przeprowadzono w 6-dołkowych płytkach za pomocą reagensu transfekcyjnego w fazie wzrostu logarytmicznego komórek. Konkretnie, 50 nM inhibitora/mimika lub negatywnych kontroli było rozcieńczane w 125 µL pożywki Opti-MEM na dołek, łączone z 5 µL reagensu transfekcyjnego rozpuszczonego w 125 µL pożywki Opti-MEM i przechowywane w temperaturze pokojowej przez 15 min, aby utworzyć kompleks. Następnie mieszaninę dodawano do komórek. Komórki były zbierane 48 godzin po transfekcją na potrzeby dalszych eksperymentów.
Ilościowa odwrotna transkrypcja z użyciem polimerazy łańcuchowej reakcji z odwrotnym łączeniem (qRT-PCR)
Całkowite RNA było izolowane za pomocą reagensu TRIzol zgodnie z protokołami producenta, a próbki obejmowały surowicę i komórki. Do odwrotnej transkrypcji, w każdej reakcji stosowano 1 µg całkowitego RNA, zgodnie z protokołami producenta PrimeScript Reverse Transcriptase. Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji, reakcje amplifikacyjne były prowadzone na urządzeniu do rzeczywistej czasowej PCR za pomocą SYBR-Green Real Master mix jako reagensu reakcji. Parametry termiczne cykli były następujące: początkowa denaturacji w 95°C przez 30 sekund, a następnie 40 cykli w 95°C przez 5 sekund i 60°C przez 30 sekund. qRT-PCR był
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Charakterystyka wyjściowa
Do grupy kontrolnej włączono 105 pacjentów, w tym 58 (55,24%) mężczyzn i 47 (44,76%) kobiet, ze średnim wiekiem 52,81 ± 12,57 lat i BMI wynoszącym 24,25 ± 2,71 kg/m2. Grupa z OA obejmowała 110 pacjentów, w tym 69 (62,73%) mężczyzn i 41 (37,27%) kobiet, ze średnim wiekiem 54,42 ± 12,33 lat i BMI wynoszącym 24,88 ± 3,51 kg/m2. Dodatkowe informacje wyjściowe dla grupy z OA przedstawiono w Tabeli 1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
OA, powszechne zaburzenie stawów w środowisku klinicznym, stało się trzecią najważniejszą przyczyną organicznej niepełnosprawności po cukrzycy i demencję22,23. Jednak patogeneza OA jest złożona, a jej rozpoznanie często wymaga kombinacji objawów klinicznych, badań obrazowych i innych środków, a długi cykl diagnostyczny poważnie opóźnia terminowe leczenie pacjentów24. Dlatego klinicznie ważne jest poszukiwanie biomarkerów, które mogą być wy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych ani własnościowych w żadnym materiale omówionym w tym artykule.
Autorzy nie otrzymali żadnego konkretnego finansowania na tę pracę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96-well plates | Corning/USA | 3903 | |
| Anti-Ago2 | Abcam/USA | AB_867543 RRID: ab186733 | |
| Anti-IgG | Abcam/USA | AB_10673832 RRID: ab133470 | |
| C28/I2 chondrocytes | Merck Millipore/USA | SCC043 | |
| CCK-8 Kit | Beyotime/China | C0038 | Zestaw do badania żywotności komórek |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich/USA | V5265 | |
| DMEM/F12 medium | Gibco/USA | 11320033 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | Promega/USA | E1910 | |
| EZ-Magna RIP Kit | Merck Millipore/USA | 17701 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific/USA | 26010074 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich/USA | F8775 | |
| Graphpad Prism 9.0 | GraphPad Software Inc. /USA | https://www.graphpad.com/features | |
| IL-1β | Sigma-Aldrich/USA | SRP3083 | |
| IL-1β ELISA kit | Nanjing Jiancheng/China | H002-1-2 | |
| IL-6 ELISA kit | Nanjing Jiancheng/China | H007-1-2 | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific/USA | BB150-2TCS-L | |
| Inhibitor-NC | GenePharma (custom synthesis) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| Light Cycler 480 | Roche/Switzerland | https://lifescience.roche.com/global/en/article-listing/article/lightcycler-480-system-technology.html | Instrument do badań PCR w czasie rzeczywistym |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen/USA | L3000015 | Reagent do transfekcji komórek |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific/USA | VA000010C | |
| Microscopy | Nikon/Japan | https://www.nikon.com.cn/sc_CN/ | |
| Mimic-NC | GenePharma (custom synthesis) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| MiR-215-5p inhibitor | GenePharma (custom synthesis) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| MiR-215-5p mimic | GenePharma (custom synthesis) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| Opti-MEM | Gibco/USA | 31985070 | |
| pGL3 vector | Promega/USA | E1751 | |
| PrimeScript Reverse Transcriptase | Takara/Japan | 2680 | Zestaw do odwrotnej transkrypcji |
| Si-EREG | GenePharma (custom synthesis) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| Si-NC | GenePharma (custom synthesis) /China | https://www.genepharma.com/ | |
| SPSS 24.0 | IBM Corp/USA | https://spssau.com/index.html | |
| SYBR Green Supermix | Bio-Rad/USA | 1725121 | |
| TNF-α ELISA kit | Nanjing Jiancheng/China | H052-1-2 | |
| Transwell chamber | Corning/USA | 3422 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher Scientific/USA | 15596026 | Reagent do izolacj RNA |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.