Stabilizowanie białek i kondensatów białko-RNA w żelach hydroksyagatowych o niskiej temperaturze topnienia do ilościowych pomiarów biofizycznych

Podsumowanie

Przedstawiamy tu efektywną metodę fizycznego unieruchamiania kondensatów fazowo rozdzielonych ciekłych-ciekłych w porowatej matrycy hydrożelowej z niskowtopliwego agarozy bez zakłócania ich wewnętrznej dynamiki ciekłej. Podejście to minimalizuje sedymentację kropli, zlewanie się oraz artefakty zwilżania powierzchni, umożliwiające powtarzalne obrazowanie i ilościową analizę biofizyczną przez okresy trwające nawet kilka godzin.

Streszczenie

Kondensaty biomolekularne powstające przez separację fazy ciekłej-ciekłej są coraz częściej rozpoznawane jako podstawowe jednostki organizacyjne komórki, z rolami wahającymi się od przetwarzania RNA po tworzenie się granulej stresowych. In vitro rekonstytucja takich kondensatów przy użyciu oczyszczonych białek i RNA dostarcza modeli systemów, jednakże krople ciekłe ulegają z czasem zgrubnieniu, sedymentacji i rozprzestrzenianiu się na powierzchniach, wprowadzając znaczną zmienność do pomiarów ilościowych w ciągu eksperymentalnych czasów trwania. Osadzanie tych kondensatów w rozrzedzonym, optycznie przezroczystym i chemicznie obojętnym hydrożelu – tutaj przygotowanym z niskotopejącej agarozy (LMA) w stężeniu 0,3–1,0% w/v – stabilizuje krople w trzech wymiarach, umożliwiając stosowanie metodologii z dłuższymi czasami pomiarowymi lub eksperymentalnych setupów z powtarzającymi się pomiarami. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowy, krokowy protokół przygotowania zapasów LMA, formowania kropel i ich osadzania oraz dostarcza się przykładów konkretnych dalszych pomiarów biofizycznych. Pokazano również, że określone właściwości kropel, takie jak dyfuzja molekularna, są zachowane po osadzniu w LMA w reprezentatywnych przetestowanych systemach. Ponieważ metoda jest kompatybilna z mikroskopia konfokalną, szerokokątną lub o nadrozdzielczości, pomiarem odzysku fluorescencji po fotobleachungu, czy spektroskopią rezonansową magnetycznego pola jądrowego, między innymi, może ona wspierać ilościową charakteryzację kondensatów biomolekularnych istotnych w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Separyzacja faza ciekła-ciekła (LLPS) powoduje tworzenie narządków bez błony i kondensatów biomolekularnych w komórkach, w tym ziaren stresowych, ciał P i jąderka^1,2,3,4,5. Kondensaty te koncentrują określone białka i kwasy nukleinowe, zachowując jednocześnie szybkie wymianę z otaczającym cytoplazmą lub nukleoplazmem – charakterystyczną cechę zachowania się jak płyn^1,2,3,4,5. Dysregulacja LLPS została powiązana z różnymi chorobami, takimi jak zaburzenia neurodegeneracyjne^3,6,7 i jest również zaangażowana w replikację kilku wirusów, takich jak SARS-CoV-2^8,9,10,11,12.

Rekonstytucja kondensatów in vitro przy użyciu oczyszczonych białek i RNA w określonych warunkach buforowych stała się podstawowym podejściem do badania mechanizmów LLPS^3,4. Jednakże krople w probówce lub na szklanej powierzchni są podatne na trzy główne artefakty: (i) sedymentację grawitacyjną, powodującą gromadzenie się kropel na dnie; (ii) koalescencję, w której krople łączą się z czasem w mniejsze, większe struktury; i (iii) zwilżanie powierzchni, gdzie krople rozprzestrzeniają się i częściowo adsorbują na szkiełku pokrywnym. Zjawiska te zmniejszają powtarzalność pomiarów ilościowych i utrudniają śledzenie pojedynczych kropel w ich fizjologicznie istotnych wymiarach¹³. Zjawiska te ograniczają również zastosowanie metod, które wymagają dłuższego czasu pomiaru od kilku minut do kilku godzin (np. spektroskopia rezonansu magnetycznego jąder [NMR] lub techniki mikroskopii nadrozdzielczej, takie jak STORM) i zabraniają wielokrotnych pomiarów na dłuższych skalach czasowych.

Fizyczne unieruchomienie w sieci żelu hydrofilowego rozwiązuje wszystkie trzy artefakty jednocześnie. Agaza tworzy fizycznie sieciowany żel w temperaturach poniżej 34–38 °C. W stężeniach 0,3–1,0% w/v wielkość siatki agazy jest na tyle duża, aby uwięzić nienaruszone krople w skali mikrometrów, zachowując jednocześnie wystarczającą porowatość, aby nie przeszkadzać w dynamice molekularnej wewnątrz kropel¹³. Ponadto porowatość matrycy agazy umożliwia dyfuzję makrocząsteczek i małych cząsteczek w i z osadzanych kropel. W przypadku szczególnie wrażliwych na temperaturę systemów obejmujących białka o sfałdowanych domenach lub po fazowym rozdziale typu UCST/LCST (górna/dolna krytyczna temperatura roztworu), można zastosować agazę niskotopliwą (LMA) o temperaturze żelowania 26–30 °C. Alternatywne podejścia przeciwko zwilżaniu, takie jak pasywizacja powierzchni, mogą zmniejszyć przyleganie kondensatów i tym samym zwilżanie, ale często wymagają specjalistycznej przygotowania i nie zapobiegają sedymentacji lub koalescencji kropel. W przeciwieństwie do tego, osadzanie w agazie zapewnia prostą, powszechnie dostępną metodę przestrzennego unieruchomienia kondensatów. Co ważne, potwierdzono, że agaza nie zakłóca stanu konformacyjnego białka zlanego w sarkomie (FUS) i innych białek wiązających RNA podczas tworzenia kropel aż do stężenia agazy 1,0% w/v¹³. Ten protokół standaryzuje podejście do osadzenia agazy do ogólnego użytku z wieloma separującymi fazowo białkami lub systemami białko-RNA o zainteresowaniu, zapewniając krok po kroku wskazówki dotyczące przygotowania reagentów i przygotowania próbki.

Protokół

1. Preparacja żelu agarose

WAŻNE: Preparat agarose należy przygotować w tym samym buforze, w którym wykonano próbki fazowo rozdzielone (zwanym dalej “buforem kropelkowym”) w celu uniknięcia niezgodności buforów¹⁴. Przykład: Próbka nukleokapsydu przygotowywana jest w buforze A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), który powinien być również użyty do przygotowania preparatu agarose.
UWAGA: Ostateczne warunki eksperymentalne, w tym, ale nie ograniczając się do składu buforu, stężenia białka, użycia dodatków i ostatecznych objętości próbek, zależą znacznie od konkretnego układu biologicznego poddawanego badaniom oraz konkretnego zastosowania dalekowzrocznego. Podobnie parametry akwizycji, konfiguracja urządzenia i analiza danych silnie zależą od próbki i konkretnego eksperymentu. Na przykład, przygotowanie nukleokapsydu SARS-CoV-2 z poli(A) opisano na Rysunku 1A (mikroskopia fluorescencyjna konfokalna).

1. Waż odpowiednią ilość agarose LMA lub zwykłej agarose do 1,5 mL probówki zawierającej bufor kropelkowy. Przykład: Dla 2% w/v preparatu, rozpuść 20 mg agarose w 1 mL buforu A.
   UWAGA: Ostateczne stężenie agarose w preparacie powinno wynosić 1–2% w/v, w zależności od żądanego stężenia agarose w próbce. Przekraczanie 2% w/v nie jest zalecane, ponieważ staje się to coraz trudniejsze do pipetowania. Wytnij wąski koniec końcówki pipety, aby ułatwić pipetowanie, szczególnie przy wysokich procentach agarose. Skonsultuj się z sekcją dyskusyjną, aby określić, czy do próbek wymagana jest agarose LMA czy zwykła agarose.
2. Podgrzej preparat agarose do 80–90 °C w bloku grzewczym lub łaźni wodnej i całkowicie rozpuść agarose metodą wirowania (zajmuje to ok. 10 min).
   OSTRZEŻENIE: Topiona agarose jest gorąca. Obsługuj ją ostrożnie.
3. Urównoważyć preparat agarose do 37 °C (LMA) lub 55 °C (zwykła agarose) w bloku grzewczym lub łaźni wodnej. Upewnij się, że roztwór pozostaje klarowny i płynny w tej temperaturze. Jeśli to konieczne, zweryfikuj temperaturę preparatu agarose za pomocą termometru.
   PUNKT PAUZY: Topione preparaty agarose można trzymać w temperaturze 30–60 min.
   Zalecane jest nagrzewanie agarose w łaźni wodnej, aby zapewnić bardziej jednorodne ogrzewanie i utrzymanie docelowej temperatury z wystarczającą precyzją. Jest to szczególnie ważne przy pracy z LMĄ, ponieważ małe odchylenia temperatury mogą powodować przedwczesne żelowanie.
4. Po przygotowaniu próbek (sekcja 2) przechowuj pozostałe preparaty agarose w +4 °C. Przed użyciem postępuj zgodnie z punktami 1.2 i 1.3 powyżej, aby ponownie stopić i uwrównoważyć preparat agarose.
   UWAGA: Zaleca się przechowywanie preparatu agarose maksymalnie przez 2 tygodnie w +4 °C i poddawanie go nie więcej niż 2–3 cyklom utwardzania/stopienia. Stosuj dobre praktyki produkcyjne, aby zapobiec zakażeniu. Odsuń preparaty wcześniej, jeśli nie uda się ich ponownie stopić lub utwardzić, lub jeśli wystąpi widoczna kontaminacja.

2. Przygotowanie próbek

1. Podgrzej wszystkie materiały, które mają bezpośredni kontakt z agarose (np. końcówki pipet, probówki, szlachetki do mikroskopii) do około 37 °C, umieszczając je na bloku grzewczym lub w inkubatorze przez 2–3 min.
2. Przygotuj preparat agarose zgodnie z opisem w sekcji 1.
3. Przygotuj bufor kropelkowy, komponenty fazowo rozdzielające (np. białka lub zasoby RNA) i wszelkie inne dodatki (np. czynniki wypełniające, barwniki) dla próbek zgodnie ze standardowym protokołem. Urównoważyć do temperatury pokojowej (RT). Przykład: Bufor A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), zasób białka nukleokapsydu (60 µM, w buforze A), zasób poli(A) (30 µM, w buforze A).
   UWAGA: W przypadku odzyskiwania fluorescencji po fotobleknięciu (FRAP), mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej lub stochastycznej rekonstrukcji optycznej (STORM), dodaj małą frakcję białka lub RNA z oznaczeniem fluorescencyjnym do zasobów białka lub RNA, odpowiednio (zalecane: mniej niż 5% ułamek oznaczony).
4. Oblicz objętości buforu kropelkowego, preparatu agarose, komponentów fazowo rozdzielających (np. białka lub RNA interesującego) i wszelkich uzupełniających dodatków (np. czynniki wypełniające) potrzebnych dla próbki. Przykład: 6 µL buforu A, 5 µL 2% preparatu agarose (ostatecznie 0,5%), 5 µL białka nukleokapsydu (ostatecznie 15 µM), 4 µL poli(A) (ostatecznie 6 µM). Ostateczna objętość 20 µL.
   UWAGA: Choć to jest silnie zależne od naczynia, probówki, płytki lub innego naczynia użytego w eksperymencie, powszechnie używane objętości to 150 µL dla 3 mm probówki NMR, 20 µL dla eksperymentów mikroskopowych lub FRAP na 6-kanałowym ślizgu mikroskopowym, oraz 20–30 µL dla eksperymentów STORM na 18-dołkowych ślizgach mikroskopowych (patrz Tabela Materiałów).
   1. Jako wartości startowe, używaj ostateczne

Wyniki

Protokół zastosowano do kondensatów tworzonych przez domenę N-końcową FUS (FUS NTD) lub białko nukleokapsydu (N) SARS-CoV-2 z RNA poly(A) lub s2m jako reprezentatywne przykłady kropel składających się wyłącznie z białek oraz kropel białkowo-RNA. Aby ocenić, czy agaroza w sposób wykrywalny wpływa na tworzenie kondensatów w testowanych warunkach, utworzono krople z białka N i poly(A) w obecności i przy braku 0,5% w/v LMA. Ponieważ LMA krzepnie po około 5 min w RT, w tym punkcie czasowym zarejestrowano obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, co wykazało, że krople miały w obu przypadkach zbliżoną wielkość (Rycina 1A,B). Aby zademonstrować zapobiegawczy wpływ agarozy na zwilżanie i fuzję kropel, zarejestrowano kolejny zestaw obrazów 60 min po przygotowaniu próbki. Podczas gdy krople zatopione w agarozie nie zmieniły rozmiaru, kondensaty w próbkach bez LMA wykazały drastyczny wzrost rozmiaru z powodu fuzji i zwilżania powierzchni (Rycina 1A,B). Choć krople zatopiono stosunkowo wcześnie po nukleacji, można zatapiać krople o różnych rozmiarach poprzez zmianę czasu inkubacji przed zatapianiem. Mimo zatopienia kropel w hydrożelu agarowym, zmierzona dynamika kondensatów nie uległa wykrywalnej zmianie. Odzyskiwanie sygnału w FRAP, a tym samym pozorna dyfuzja kropel, były bardzo podobne w próbkach z LMA i bez niego (Rycina 1C). Co więcej, wcześniejsze eksperymenty ze spektroskopii NMR z dyfuzją (DOSY) przy użyciu kondensatów FUS NTD wykazały, że szybkości dyfuzji nie były w sposób wykrywalny modyfikowane przez stężenie agarozy, przynajmniej w zakresie 0,25–1% w/v (Rycina 1D) (zaadaptowano z Emmanouilidis i wsp.¹³). Wyniki te dowodzą, że hydrożel agarowy nadaje się do unieruchamiania w przestrzeni i czasie kondensatów oddzielonych fazowo, umożliwiając wielokrotne pomiary w dłuższych odstępach czasu.

Chociaż pomiary mikroskopowe i FRAP są stosunkowo szybkie do zarejestrowania (od sekund do minut), niektóre eksperymenty wymagają kilku minut (np. STORM, 1D ¹H NMR) lub nawet godzin (np. 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR) na ich przeprowadzenie. W przypadku takich eksperymentów kluczowe jest, aby krople pozostawały nieruchome przez cały czas akwizycji i nie sedymentowały z czasem. Tutaj pokazujemy, że ustabilizowaliśmy krople białka N + s2m RNA w LMA na czas wystarczający do uzyskania obrazów STORM (Rycina 1E). Ponadto widma NMR kropli FUS NTD w obecności i przy braku agarozy wykazały porównywalne szerokości linii, co sugeruje brak wykrywalnej interakcji między hydrożelami agarowymi a białkiem w tych warunkach (Rycina 1F) (na podstawie Emmanouilidis et al.¹³). W przeciwieństwie do tego, widma kondensatów zatopionych w agarozie wykazały wyższą intensywność sygnału, prawdopodobnie dlatego, że niestabilizowane krople sedymentowały w probówce NMR podczas akwizycji i w związku z tym nie były już dostępne do pomiaru (Rycina 1F) (na podstawie Emmanouilidis et al.¹³). Podsumowując, stabilizacja kondensatów w hydrożelach agarowych nie tylko umożliwia przeprowadzanie eksperymentów w serii czasowej, ale także pozwala na stosowanie metodologii o wydłużonym czasie akwizycji, zachowując jednocześnie mierzone właściwości kropli w przetestowanych reprezentatywnych systemach.

Rysunek 1: Stabilizacja kondensatów poprzez zatopienie w agarozie bez wykrywalnego zaburzenia mierzonych właściwości kropel. (A) Mikroskopia fluorescencyjna 15 µM białka nukleokapsydu z 6 µM Cy3-poly(A) (5% znakowanych) w buforze A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2) w obecności (+ agarose) lub w przypadku braku (no agarose) 0,5% w/v LMA. Obrazy pozyskano 5 min lub 60 min po mieszaniu / zatopieniu w agarozie. Obrazy są reprezentatywne dla 7 obrazów pozyskanych w n = 2 niezależnych eksperymentach. Pasek skali = 5 µm. (B) Ilościowe oznaczenie promieni kropel kondensatów pokazanych w (A). Dane przedstawiono na wykresach pudełkowych (pudełko = rozstęp międzykwartylowy, linia środkowa = mediana, wąsy = zakres pozostałych danych, kropka = wartości odstające). Średni promień ± odchylenie standardowe (sd) oraz liczba analizowanych kropel w każdym wariancie są podane bezpośrednio na wykresie. Dane wykazują rozkład normalny. Poszczególne krople nie były traktowane jako niezależne powtórzenia biologiczne do wnioskowania statystycznego. Nie przeprowadzono testów statystycznych; rozkłady przedstawiono opisowo. (C) FRAP kropel pokazanych w (A) w punkcie czasowym 5 min. Fotowybleczanie wykonano za pomocą lasera 561 nm (Cy3). Dane przedstawiają znormalizowaną intensywność (średnia ± sd dla n = 3 niezależnych powtórzeń na wariant), uzyskaną poprzez normalizację sygnału wybleczonego do wartości przed wybleczaniem, nieoznaczonego obszaru tej samej próbki oraz fluorescencji tła. (D) Nieosłabiony sygnał DOSY 200 µM białka FUS NTD w buforze B (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM mocznika, pH 7.3) w obecności 0,25, 0,5 lub 1,0% w/v zwykłej agarozy. N = 1. (E) Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i obrazy STORM 15 µM białka Cy5-nukleokapsydu (5% znakowanych) z 6 µM wirusowego RNA s2m w buforze A zawierającym 0,5% w/v LMA. Reprezentatywne dla n = 3 niezależnych eksperymentów. Pasek skali = 1 µm na obu obrazach. (F) Widma 1D ¹H NMR (lewo) i widma 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR (prawo) 200 µM FUS NTD w buforze B w obecności lub przy braku 0,5% w/v zwykłej agarozy. N = 1. Panele (D) i (F) zostały powielone z Emmanouilidis et al.¹³ Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Sukces osadzania kondensatów biomolekularnych w agarozy zależy od kilku czynników. Po pierwsze, agaroza musi być utrzymywana w temperaturach wystarczająco wysokich, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu, a jednocześnie wystarczająco niskich, aby nie zakłócać struktur lub interakcji biomolekularnych. Agaroza o niskim punkcie topnienia ma punkt żelowania 26–30 °C i punkt topnienia 60–65 °C, podczas gdy regularna agaroza ma punkt żelowania 34–38 °C i punkt topnienia 90–95 °C. Po drugie, szybkie mieszanie i przeniesienie do końcowego naczynia reakcyjnego (np. probówki NMR) są kluczowe, ponieważ małe odchylenia w czasie lub temperaturze mogą prowadzić do nierównomiernego osadzania i tym samym osłabionej powtarzalności.

Mimo tych krytycznych punktów, metodę tę można łatwo dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych. W przypadku układów separujących fazy z białkami o strukturze intrinsycznie chaotycznej lub układów niepodatnych na denaturowanie termiczne, można zastosować regularną agarozę zamiast LMA w celu obniżenia kosztów. Przy przygotowywaniu próbek zawierających białka o złożonych domenach, lub każdego innego wrażliwego na temperaturę (bio-)cząsteczki podatnego na denaturowanie termiczne, należy użyć LMA, aby zapobiec denaturacji. Można przygotować próbkę kontrolną bez agarozy, aby oddzielić wpływ osadzania agarozy od wpływu przejściowego ocieplenia próbki. Aby zmniejszyć ryzyko efektów denaturacji zależnych od temperatury, niskotopliwa agaroza jest szczególnie odpowiednia dla próbek wrażliwych na temperaturę, podczas gdy stężenie agarozy można dostosować, aby modulować wielkość siatki i stopień ograniczeń mechanicznych. W przypadku wysoce wrażliwych pomiarów dyfuzji, takich jak niedawno opracowana metoda NMR zwana LLPS REDIFINE^15,16, najniższe stężenie agarozy, które zapobiega sedymentacji, jest zwykle preferowane, zazwyczaj 0,3–0,5% w/v. Dla eksperymentów dojrzewania wymagających stabilności przez tygodnie do miesięcy, preferowane jest 0,8–1% w/v. Te parametry należy zoptymalizować, aby zapewnić skuteczną stabilizację bez wykrywalnej zmiany morfologii czy dynamiki kondensatów i zawsze należy je dostosować do konkretnego układu. Ta walidacja wymaga porównania próbek z osadzeniem agarozy i bez niego (oraz w innych identycznych warunkach) lub porównania różnych stężeń agarozy (aby wykluczyć efekty zależne od stężenia siatki), na przykład za pomocą mikroskopii do oceny morfologii kropel, FRAP do oceny dyfuzji lub dowolnej innej metody nadającej się do oceny właściwości kropel istotnych dla badacza.

Czas żelowania jest kolejnym ważnym zagadnieniem. Czas potrzebny na żelowanie agarozy zależy od kilku czynników, takich jak rodzaj buforu, pH, końcowe stężenie agarozy, począkowa temperatura i czy użyto niskotopliwej czy regularnej agarozy. Zazwyczaj agaroza żeluje w ciągu 5–10 min. Żelowanie zasobu agarozy może służyć jako wskaźnik żelowania próbki. Podobnie, różne czasy preinkubacji przed osadzanie w agarozie umożliwiają powtarzalne charakteryzowanie różnych wielkości kropel. Wybór bufora jest również krytyczny¹⁴. Istotne jest, aby zasób agarozy był przygotowywany w tym samym buforze, którym przygotowano próbki, aby zapobiec niedopasowaniu buforu. Bufor powinien być taki, w którym wiadomo, że układ separuje fazy.

Czułość na temperaturę należy wziąć pod uwagę dla każdego układu. Wiele układów separujących fazy wykazuje termo-odwracalne zachowanie fazowe, znane jako UCST/LCST-typ LLPS. Dlatego krótkie narażenie na lekko podwyższone temperatury podczas mieszania agarozy powinno być zweryfikowane, aby upewnić się, że nie zakłóca zachowania fazowego ani właściwości kropli pomiarowych. Jeśli pojawią się problemy, zazwyczaj można je rozwiązać poprzez usprawnienie warunków temperaturowych, minimalizowanie czasu obsługi lub dostosowanie stężenia agarozy. Na przykład, chociaż zasób LMA powinien być idealnie podgrzany do 37 °C, zasoby LMA nadal pozostaną w stanie ciekłym w 33–35 °C.

Rozwiązywanie problemów jest ważne, ponieważ mogą pojawić się różne tryby awarii w zależności od próbki i konfiguracji eksperymentalnej. Jeśli krople rozpuszczają się podczas mieszania z agarozą, może to być spowodowane zbyt ciepłym LMA lub niedopasowaniu buforu. W takim przypadku, zasób LMA powinien być utrzymywany dokładnie na docelowej temperaturze lub o kilka stopni poniżej, i przygotowywany w identycznym buforze co białko/RNA interesujące. Jeśli przedwczesne żelowanie występuje w końcówce pipety, może to być spowodowane zbyt zimnym LMA lub niepodgrzanymi końcówkami. Aby tego uniknąć, końcówki i probówki powinny być podgrzewane do 37 °C, operator powinien pracować szybko, a blok grzejny powinien być utrzymywany na docelowej temperaturze. Jeśli z czasem występuje zwilżanie, zlewanie się lub

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1.5 mL tubes	dowolna marka	N/A
18-well chamber slides	ibidi	81816	do STORM
agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	klasa molekularnej biologii
agarose, ultra pure	Invitrogen	16500500
channel slides	ibidi	80606	do mikroskopii
mikroskop konfokalny	Nikon	N/A
Cy5-dye, NHS chemistry	Jena Biosciences	FP-201-CY5	do znaczenia białka
D2O (deuterium oxide)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM buffer	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD protein	N/A	N/A	ekspresowane rekombinantnie w naszym laboratorium, jak opisano w odniesieniu 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
grzałka lub kąpiel wodna	dowolna marka	N/A	każda marka lub model wystarczy
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
oprogramowanie do analizy obrazów	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
spektrometr NMR	Bruker	N/A	750 MHz, PATXI sonda pokojowa, patrz odniesienie 13 dla więcej szczegółów (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR tube	Bruker	N/A	3 mm, szklany
pipety P10, P20, P200 i P1000	dowolna marka	N/A
pCp-Cy3-dye	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	do znaczenia RNA
poly(A) RNA	N/A	N/A	transkrypcja in vitro we własnym zakresie w naszym laboratorium, długość ok. 50 nukleotydów, jak opisano w Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
s2m RNA	N/A	N/A	transkrypcja in vitro we własnym zakresie w naszym laboratorium, długość 45 nukleotydów, sekwencja: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', jak opisano w Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
SARS-CoV-2 nucleocapsid protein	N/A	N/A	ekspresowane rekombinantnie w naszym laboratorium, jak opisano w Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
oprogramowanie do wykreślania (np. R)	R-Project	Wersja 4.2.1	https://www.r-project.org/
mikroskop STORM	Nikon N-STORM	N/A
wtyczka ThunderSTORM	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
najki do stosowanych pipet	dowolna marka	N/A
TopSpin	Bruker	Wersja 3.2 i 4.1
mocznika	Sigma-Aldrich	U5128