Artykuł metodologiczny

Kierowanie Cas9 w celu przeprowadzenia eksperymentów ratunkowych w stabilnie przetransdukowanych komórkach HEK293 z nokautem genu

93 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72172

⸱

28 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół umożliwia usunięcie białka Cas9 po edycji genomu, aby ułatwić przeprowadzanie wiarygodnych eksperymentów ratunkowych (rescue experiments) w stabilnie transdukowanych liniach komórkowych z nokautem.

Streszczenie

Technologia edycji genów CRISPR-Cas9 zrewolucjonizowała biologię molekularną. Często technologia ta jest wykorzystywana do usunięcia genu kodującego interesujące białko. Powstały fenotyp dostarcza cennych informacji na temat funkcji białka. Funkcjonalne znaczenie docelowego białka można potwierdzić poprzez ponowne wprowadzenie białka w celu przywrócenia utraconej funkcji (rescue). Zazwyczaj osiąga się to poprzez wprowadzenie cDNA kodującego białko w trans za pomocą wektora ekspresyjnego. Jednak w liniach komórkowych z nokautem, które stabilnie ekspresują system CRISPR-Cas9, nowo wprowadzony plazmid ekspresyjny może zostać również przecięty przez Cas9. Protokół przedstawiony w niniejszym opracowaniu oferuje strategię pozwalającą obejść tę potencjalną barierę w eksperymentach typu rescue. Podejście to zademonstrowano na komórkach HEK293, w których gen kodujący białko rusztowania ligazy ubikwityno E3 CUL4B został zaburzony przez CRISPR-Cas9. Transdukcja tych komórek za pomocą gRNA (guide RNA) celującego w zintegrowany transgen Cas9 doprowadziła do utraty wykrywalnego białka Cas9. Ablacja Cas9 umożliwiła przywrócenie ekspresji i funkcji CUL4B po wprowadzeniu plazmidu ekspresyjnego CUL4B. Wyniki te stanowią dowód koncepcji szeroko stosowalnego podejścia do badania funkcji białek za pomocą eksperymentów typu rescue.

Wprowadzenie

CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, pochodzące z naturalnie występującego adaptacyjnego układu odpornościowego wykorzystywanego przez prokarioty do obrony przed infekcją bakteriofagami. Dzięki niskim kosztom, wysokiej skuteczności i łatwości zastosowania, technologia CRISPR-Cas9 wyprzedziła inne narzędzia do edycji genomu, takie jak nukleazy z palcem cynkowym (ZFNs) oraz nukleazy TALEN (transcription activator-like effector nucleases), w zakresie precyzyjnej modyfikacji genetycznej, szczególnie w hodowlach komórkowych. System dwuskładnikowy składa się z nukleazy Cas9 oraz przewodzącego RNA (gRNA). Poprzez parowanie zasad według reguły Watsona-Cricka, gRNA kieruje Cas9 do celu genomowego sąsiadującego z motywem PAM (protospacer adjacent motif). Sekwencja PAM służy jako krytyczny miejsce rozpoznawania, które umożliwia aktywność nukleazy. W tym miejscu Cas9 generuje pęknięcie obu nici DNA (DSB). W przypadku braku homologicznej matrycy naprawczej, komórka naprawia DSB poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). Ten mechanizm naprawy może wprowadzić insercje lub delecje (indels), co prowadzi do mutacji z przesunięciem ramki odczytu i funkcjonalnym wyłączeniem (knockout) genu docelowego. Przerwanie genu docelowego osiąga się zatem poprzez wprowadzenie Cas9 wraz z zaprojektowanym gRNA. 20-nukleotydowa sekwencja gRNA jest komplementarna do miejsca w genomie bezpośrednio sąsiadującego z PAM. Wynikająca z tego utrata funkcji genu docelowego pozwala ujawnić specyficzną rolę tego genu w procesach komórkowych1.

Eksperyment ratunkowy, czyli test komplementacji, polega na przywróceniu brakującego białka w celu wykazania odwrócenia obserwowanego fenotypu. Podejście to służy jako rygorystyczna kontrola pozwalająca wykluczyć niezamierzone efekty eksperymentalne, takie jak te wynikające z delecji CRISPR-Cas9 w miejscach poza docelowych („off-target”). Najczęstszą metodą ponownego wprowadzenia białka zainteresowania jest transfekcja lub transdukcja egzogennego wektora ekspresyjnego. Jednakże wprowadzone w ten sposób DNA jest podatne na to samo celowanie CRISPR-Cas9, co locus endogenny. Ryzyko to jest szczególnie wysokie w stabilnie transdukowanych liniach komórkowych, w których konstytutywna ekspresja Cas9 jest powiązana z selekcją antybiotykową w celu zapewnienia homogennej i spójnej populacji z nokautem; jest to strategia często wymagana w liniach komórkowych trudnych do transfekcji lub transdukcji, takich jak linie pochodzące z linii odpornościowych, krwiotwórczych lub neuronalnych.

Jedną z metod pozwalających uniknąć celowania w wektor jest wprowadzenie egzogennego mRNA kodującego białko zainteresowania, co pozwala ominąć cięcie zapośredniczone przez Cas9 oraz potrzebę transkrypcji jądrowej. Jednak w porównaniu z plazmidowym DNA, syntetyczne mRNA jest kosztowniejsze w produkcji, z natury mniej stabilne i zapewnia wysoce przejściową ekspresję. Ponadto wymaga ono specyficznych modyfikacji chemicznych, aby uniknąć wywołania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi odporności wrodzonej2.

Aby uniknąć celowania kompleksu Cas9/gRNA w plazmidy ekspresyjne, można zastosować inżynierię zasad wobble w sekwencji kodującej. Wykorzystując degenerację kodu genetycznego, można wprowadzić mutacje synonimiczne w celu wyeliminowania wymaganej sekwencji PAM i/lub zakłócenia komplementarności gRNA bez zmiany sekwencji aminokwasowej kodowanego białka. Jednak stosowanie mutacji synonimicznych nie jest pozbawione ryzyka. Zmiany te mogą wprowadzić suboptymalne wykorzystanie kodonów, co może zaburzyć kinetykę translacji i prowadzić do błędnego zwijania białek, zmniejszonej stabilności mRNA lub szkodliwych zmian w strukturze drugorzędowej RNA3,4. Choć rzadziej, inne potencjalne konsekwencje obejmują wprowadzenie kryptycznych sygnałów poliadenylacji, zakłócenie motywów regulacyjnych potranskrypcyjnych oraz zwiększenie gęstości wysp CpG5,6. Ponadto zmodyfikowane sekwencje mogą nieumyślnie wywołać odpowiedzi stresowe komórki, jeśli wynikająca struktura mRNA utrudnia progresję rybosomów7,8.

Poza wyzwaniami związanymi z zastosowaniem syntetycznych mRNA lub inżynierią zasad wobble, konstytutywna ekspresja Cas9 po edycji wprowadza szereg zakłócających zmiennych w analizach typu downstream. Ze względu na to, że specyficzność Cas9 może być niedoskonała, trwała ekspresja zwiększa prawdopodobieństwo cięć poza docelowych (off-target), co prowadzi do kumulatywnego gromadzenia niezamierzonych mutacji w czasie9,10,11. Ponadto chroniczny nadzór genomiczny i powtarzające się pęknięcia obu nici DNA (DSB) mogą wywołać trwałą odpowiedź na uszkodzenia DNA, co w konsekwencji prowadzi komórki do zatrzymania cyklu komórkowego, senescencji lub apoptozy12,13. Konstytutywna produkcja ta nakłada również obciążenie metaboliczne, co potęguje dryf klonalny, w którym komórki o niskiej ekspresji wypierają komórki o wysokiej ekspresji, skutkując niespójnymi poziomami transgenu w kolejnych pasażach. Wreszcie, jako duże białko prokariotyczne, Cas9 może wywołać stres poprzez wrodzoną sygnalizację immunologiczną lub przeciążyć mechanizmy proteostazy gospodarza, indukując odpowiedź na białka nieprawidłowo sfałdowane (UPR)14,15,16.

Aby złagodzić te komplikacje, opracowano kilka strategii przejściowego hamowania Cas9, w tym białka Anti-CRISPR (Acrs) pochodzenia fagowego17,18, inhibitory małocząsteczkowe lub systemy z fuzją degronów, takie jak PROTAC-i19,20, oraz mechanizmy kontroli optogenetycznej19,21. Jednak podejścia te wprowadzają praktyczne trudności, które ograniczają ich użyteczność w testach ratunkowych. Acrs hamują aktywność poprzez mimikrę molekularną, co wymaga optymalizacji stechiometrycznej dla uzyskania precyzji. Acrs mogą również potęgować stres proteostatyczny i immunogenny związany z nadekspresją Cas9. Modulacja chemiczna wprowadza komplikacje farmakokinetyczne, potencjalną cytotoksyczność oraz związane z PROTAC-ami „efekty haczyka” (hook effects), w których nadmierne stężenia liganda paradoksalnie zapobiegają produktywnemu tworzeniu kompleksów trójskładnikowych22. Platformy optogenetyczne są ograniczone przez fototoksyczność komórkową i wymóg stosowania specjalistycznego sprzętu w celu zapewnienia stałej dostawy światła19,21. Co istotne, ponieważ metody te zapewniają jedynie tymczasowe lub odwracalne hamowanie, są one często niewystarczające w zastosowaniach, w których Cas9 jest ekspresowany konstytutywnie.

W przeciwieństwie do nich, samoinaktywujące się systemy CRISPR oferują trwałe rozwiązanie poprzez autonomiczne i permanentne przerwanie transgenu Cas9 bezpośrednio po pomyślnej edycji genu docelowego. Poprzez wyeliminowanie resztkowej aktywności nukleazy, podejście to trwale chroni kolejne wektory ratunkowe przed cięciem, jednocześnie redukując długoterminowy stres proteostatyczny i genomiczny dryf poza docelowy (off-target). Chociaż samokierowane gRNA mogą być dostarczane za pomocą przejściowych transfekcji rybonukleoproteinowych lub opartych na lipidach23,24, metody te są podatne na rozcieńczenie i zmienność stochastyczną, co prowadzi do powstania populacji „mozaikowej”, w której niektóre komórki unikają inaktywacji25,26,27.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opisany w niniejszym dokumencie protokół wykorzystuje lentiwirusowy system dostarczania do samoinaktywacji Cas9, co oferuje istotne zalety praktyczne w zakresie modyfikacji stabilnych linii komórkowych. Dostarczanie lentiwirusowe zapewnia powiązane dziedziczenie transgenu Cas9 oraz jego autoregulatora, skutecznie zapobiegając zjawisku „ucieczki przez rozcieńczenie” (dilution escape), typowemu dla szybko dzielących się populacji. Ponadto zwiększona pojemność ładunkowa wektorów lentiwirusowych umożliwia koekspresję markerów selekcyjnych w celu zapewnienia homogenicznej populacji z usuniętym genem Cas9, natomiast ich szeroki tropizm, nadawany przez pseudotypowanie VSV-G, ułatwia wysokowydajne dostarczanie do typów komórek trudnych do transfekcji25,28,29.

Jako dowód koncepcji tej metody, niniejszy protokół szczegółowo opisuje samoinaktywację Cas9 w celu ułatwienia ratowania fenotypowego białka rusztowania ligazy ubikwityny E3 CUL4B w komórkach HEK293 z knockoutem CUL4B30.

Protokół

W badaniu tym wykorzystano uznane uniezśmiertelnione linie komórkowe człowieka (HEK293 i HEK293FT), a procedura nie obejmowała udziału ludzi, pierwotnych tkanek ludzkich ani eksperymentów na zwierzętach. W związku z tym zgoda instytucjonalnej komisji etycznej nie była wymagana.

1. Generowanie lentiwirusowego konstruktu gRNA-specyficznego dla Cas9

  1. Wprowadź sekwencję gRNA specyficzną dla Cas9 (Tabela 1) do lentiwirulowego wektora pLentiGuide-Puro.
  2. Zastąp gen oporności na antybiotyk genem, który różni się od markera oporności użytego do selekcji stabilnie transdukowanej linii komórkowej CRISPR-Cas9.
  3. Potwierdź poprawność insercji oraz wierność sekwencji zarówno specyficznego dla Cas9 gRNA, jak i zastępującego genu oporności na antybiotyk za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera z użyciem starterów specyficznych dla wektora.
    UWAGA: W niniejszym protokole gen oporności na puromycynę (PuroR) zastąpiono genem oporności na hygromycynę B (HygroR) w celu wygenerowania wektora Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro. Alternatywne geny oporności na antybiotyki obejmują blastycydynę S (BlastR), G418/Geneticynę (NeoR) oraz zeocynę (ZeoR).

2. Produkcja lentiwirusa kodującego gRNA specyficzne dla Cas9

  1. Zasiaj 2,5 × 106  komórek HEK293FT w 10 cm naczyniu do hodowli tkanek traktowanym w celu poprawy adhezji.
    UWAGA: Komórki należy utrzymywać w zmodyfikowanym przez Dulbecco Medium Eagle (DMEM; wysoka zawartość glukozy) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (dalej określanym jako cDMEM) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO2. Komórki HEK293FT są stosowane, ponieważ generują wyższe miana lentiwirusów niż inne linie komórkowe pochodne od HEK29331.
  2. Inkubuj komórki przez 12 h, aż osiągną co najmniej 60% konfluencji przed transfekcją.
    OSTRZEŻENIE: Wszystkie procedury z użyciem lentiwirusowych wektorów trzeciej generacji należy przeprowadzać w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE) oraz zatwierdzone procedury dekontaminacji (np. komorę z laminarnym przepływem powietrza klasy II, wtórną powłokę zabezpieczającą oraz 70% etanol), zgodnie z opisem Pauwels i wsp.32.
  3. Przygotuj standardową mieszaninę do transfekcji fosforanem wapnia (CaPhos). Rozcieńcz 20 µg całkowitej ilości plazmidowego DNA w sterylnej wodzie klasy biologii molekularnej do końcowej objętości 450 µL. Dodaj 50 µL 2,5 M CaCl2, a następnie 500 µL 2× soli w buforze HEPES (HBS; pH 7,05), aby uzyskać końcową objętość 1 mL w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
    UWAGA: Należy użyć plazmidowego DNA o zweryfikowanej sekwencji, w formie głównie superzwiniętej, spełniającego następujące kryteria jakościowe: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 oraz poziom endotoksyn <0,1 EU/µg. Mieszaninę do transfekcji przygotuj w przybliżonym stosunku ekvimolarnym, składającą się z 5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5,6 µg pLP1 (Gag/Pol), 3,8 µg pLP2 (Rev) oraz 5,6 µg pLP/VSVG (glikoproteina wirusa zapalenia jamowego).
  4. Dokładnie wymieszaj roztwór do transfekcji CaPhos poprzez delikatne pipetowanie.
  5. Dodaj kroplami 1 mL mieszaniny do transfekcji CaPhos do hodowli komórek HEK293FT.
  6. Delikatnie kołysz naczynie z hodowlą, aby równomiernie rozprowadzić kompleksy transfekcyjne.
  7. Inkubuj komórki przez 12 h.
    UWAGA: Transfekcja fosforanem wapnia jest zazwyczaj niezakłócana przez standardowe antybiotyki stosowane do utrzymania hodowli33. Zaleca się jednak stosowanie pożywki bezantybiotykowej w przypadku bardziej wrażliwych metod transfekcji, takich jak lipofekcja, ponieważ antybiotyki polianionowe mogą zakłócać tworzenie kompleksów DNA-lipid34.
  8. Odsuń i usuń pożywkę hodowlaną.
  9. Przemyj komórki raz 10 mL sterylnej 1× soli w buforze fosforanowym (PBS) o temperaturze pokojowej.
  10. Odsuń i usuń PBS.
  11. Dodaj 10 mL świeżego cDMEM o temperaturze pokojowej.
  12. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora i pozwól cząstkom lentiwirusowym gromadzić się w pożywce hodowlanej przez 36 h.
    UWAGA: W tych warunkach szacuje się, że niekoncentrowany supernatant lentiwirusowy po 48 h daje wydajność około 1,0 × 106 jednostek transdukcyjnych (TU)/mL, choć rzeczywiste miano należy oznaczyć eksperymentalnie zgodnie z opisem Kutnera i wsp.35 lub Barde i wsp.36. Przechowuj supernatant lentiwirusowy w temperaturze −80 °C do 2 lat. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ mogą one obniżyć miano wirusa o około 55%37,38,39,40.

3. Pozyskiwanie lentiwirusa kodującego specyficzne dla Cas9 gRNA oraz transdukcja komórek docelowych

  1. Seed 1.0 × 106 adhézyjne komórki docelowe w 10-centymetrowej płytce hodowlanej z odpowiednią obróbką powierzchni**.
  2. Inkubować komórki docelowe przez 12 h przed transdukcją lentiwirusową.
    UWAGA: Komórkami docelowymi są komórki HEK293 stabilnie eksponujące Streptococcus pyogenes Cas9, a CUL4B-celujący gRNA (Tabela 1), oraz gen oporności na puromycynę (PuroR). Hodować komórki w pożywce cDMEM zawierającej 10 µg/mL puromycyną i zweryfikuj zaburzenie funkcji CUL4B za pomocą analizy western blot przed samoinaktywacją Cas9. Wszystkie kolejne eksperymenty przeprowadź z wykorzystaniem komórek HEK293 o niskim numerze pasażu.ΔCUL4B komórki
  3. Zebrać medium zawierające lentiwirusy, ostrożnie przenosząc nadsącz z komórek producenta HEK293FT do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml, dbając o to, aby nie naruszyć warstwy komórkowej.
    UWAGA: Komórki producenta HEK293FT należy zutylizować zgodnie z obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego32.
  4. Wirować zebrany nadsącz przy 1 000 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT), aby z pelletu usunąć pozostałe komórki producenta HEK293FT.
  5. Odssać i usunąć pożywkę hodowlaną z wcześniej wysianych komórek HEK293ΔCUL4B komórki
  6. Przenieś 7 ml oczyszczonego supernatantu lentiwirusowego do szalki 10 cm zawierającej komórki HEK293ΔCUL4B komórki. Należy unikać naruszania osadu na dnie probówki do wirowania i pozostawić co najmniej 1 ml pozostałego supernatantu, aby zminimalizować przeniesienie komórek producenta.
    UWAGA: Przefiltrować nadpław przez 0.45 µm opcjonalnie przefiltrować, aby dodatkowo usunąć pozostałe komórki producenta. Pozostały nadosad odrzucić zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego32Przy szacowanym mianie wynoszącym 1,0 × 106 TU/ml, oczekuje się, że inokulum o objętości 7 ml zapewni wielokrotność zakażenia (MOI) w zakresie od 3,5 do 5,541.
  7. Inkubuj przetransdukowane komórki HEK293ΔCUL4B komórki przez 24 h, aby umożliwić całkowitą transdukcję i integrację lentiwirusową.
  8. Odessać i usunąć supernatant wirusowy.
  9. Przemyj komórki raz 10 ml sterylnego roztworu 1 o temperaturze pokojowej× PBS.
  10. Odssać i usunąć PBS.
  11. Dodać 10 ml świeżego cDMEM o temperaturze pokojowej.
  12. Przenieś komórki z powrotem do inkubatora i hoduj je przez cztery dni, aby umożliwić ekspresję transgenu oraz przecinanie przez Cas9.
    UWAGA: Jeśli lentiwirusowy wektor Cas9 gRNA nie koduje fluorescencyjnego reportera, należy przeprowadzić transdukcję równoległej hodowli kontrolnej (sentinel culture) za pomocą analogicznie wytworzonego wektora lentiwirusowego wykazującego ekspresję reportera fluorescencyjnego. Hodowlę kontrolną należy wykorzystać do oszacowania wydajności transdukcji oraz czasu wyczerpania genu docelowego za pomocą jakościowej mikroskopii fluorescencyjnej lub ilościowej cytometrii przepływowej. W niniejszym badaniu ekspresję GFP łatwo było wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej cztery dni po transdukcji.

4. Selekcja antybiotykowa transduktantów z gRNA specyficznym dla Cas9

UWAGA: Cztery dni po transdukcji komórki docelowe powinny osiągnąć lub być bliskie konfluencji i wymagają przeniesienia do większego naczynia hodowlanego. Przeniesienie komórek należy przeprowadzić równocześnie z rozpoczęciem selekcji antybiotykowej.

  1. Odssać i usunąć pożywkę hodowlaną z komórek HEK293ΔCUL4B .
  2. Przemyć komórki raz 10 mL sterylnego 1× roztworu soli fosforanowej w buforze (PBS) o temperaturze pokojowej.
  3. Odssać i usunąć PBS.
  4. Dodać 2 mL sterylnego roztworu trypsyny-EDTA o temperaturze pokojowej do naczynia hodowlanego.
  5. Inkubować komórki przez 5 min w celu wspomagania odrywania.
  6. Dodać 8 mL cDMEM o temperaturze pokojowej, aby zneutralizować trypsynę.
  7. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 mL.
  8. Triturować zawiesinę komórkową 15–20 razy, aby dokładnie rozbić agregaty komórkowe.
  9. Wirować komórki przy 200 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  10. Podczas wirowania komórek przygotować kolbę T150 do hodowli tkanek zawierającą 20 mL cDMEM uzupełnionego o 250 µg/mL hygromyciny B.
    UWAGA: Stężenie hygromycyny B wymagane do selekcji może się różnić w zależności od typu komórek. Należy przeprowadzić krzywą przeżywalności (kill curve) przy użyciu 50–500 µg/mL hygromycyny B, aby określić minimalne stężenie niezbędne do wyeliminowania wszystkich komórek nietransdukowanych w ciągu 7–10 dni. Jeśli w wektorze Cas9 gRNA zastosowano alternatywny marker oporności na antybiotyk, należy przeprowadzić krzywą przeżywalności przy użyciu 2–10 µg/mL blastycydyny S, 400–800 µg/mL G418/Geneticiny lub 50–400 µg/mL zeocyny.
  11. Odssać i usunąć nadosad nad bez zakłócania osadu komórkowego.
  12. Resuspender osad komórkowy w 10 mL cDMEM uzupełnionego o 250 µg/mL hygromycyny B.
  13. Przenieść 10 mL zawiesiny komórkowej do przygotowanej kolby T150 zawierającej 20 mL pożywki selekcyjnej.
  14. Delikatnie kołysać kolbą, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  15. Inkubować komórki w warunkach selekcji przez trzy dni.
  16. W 3. dniu selekcji odessać pożywkę selekcyjną i zastąpić ją 30 mL świeżego cDMEM uzupełnionego o 250 µg/mL hygromycyny B.
    UWAGA: Wymiana pożywki selekcyjnej usuwa nieprzylegające martwe komórki, uzupełnia składniki odżywcze i utrzymuje aktywność antybiotyku.
  17. Kontynuować inkubację, aż przetrwała monowarstwa komórek osiągnie około 90% konfluencji, zazwyczaj po dodatkowych czterech dniach.

5. Walidacja usuwania Cas9 oraz in trans ratowania CUL4B

UWAGA: Gdy komórki osiągną około 90% konfluencji, należy potwierdzić ablację Cas9 w pierwszych eksperymentach i niezwłocznie kriokonserwować pozostałą populację komórek42. Takie podejście minimalizuje rozwój wtórnych mechanizmów kompensacyjnych.

  1. Wysiać komórki HEK293ΔCUL4B o niskim pasażu, stabilnie wykazujące ekspresję gRNA celującego w Cas9 (dalej nazywane HEK293ΔCUL4BΔcas9), do czterech studni płytki 6-dołkowej traktowanej do hodowli tkankowej z gęstością 2,5 × 105 komórek na studnię.
  2. Wysiać komórki HEK293ΔCUL4B do czterech studni oddzielnej płytki 6-dołkowej. Wysiać macierzyste komórki HEK293 do co najmniej jednej dodatkowej studni w celu uzyskania kontroli.
    UWAGA: Hodowle HEK293ΔCUL4B oraz macierzyste komórki HEK293 należy wykorzystać odpowiednio jako kontrole ekspresji Cas9 i CUL4B.
  3. Inkubować wszystkie hodowle przez 12 h, aby umożliwić całkowite przytwierdzenie komórek i ich aktywną proliferację.
  4. Przygotować mieszaniny do transfekcji fosforanem wapnia (CaPhos) zawierające 0, 0,5, 1,0 lub 2,0 µg pCMV-FLAG-CUL4B. Dopasować każdą mieszaninę do stałej całkowitej ilości 10 µg DNA plazmidowego poprzez dodanie pustego wektora pCMV.
  5. Rozcieńczyć każdą mieszaninę DNA w sterylnej wodzie klasy molecular biology do objętości końcowej 180 µL, dodać 20 µL 2,5 M CaCl2, a następnie dodać 200 µL 2× soli buforowanej HEPES (HBS; pH 7,05), aby uzyskać objętość końcową 400 µL w probówce do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL.
    UWAGA: W przypadku stosowania plazmidów ekspresyjnych sterowanych przez silne promotory (np. CMV), przeprowadzić miareczkowanie DNA w celu uzyskania poziomu ekspresji białka porównywalnego z ekspresją endogenną. Należy używać zweryfikowanego sekwencyjnie, głównie superzwiniętego DNA plazmidowego z wartościami A260/A280 od 1,8 do 2,0, A260/A230 od 2,0 do 2,2 oraz poziomem endotoksyn <0,1 EU/µg.
  6. Dokładnie wymieszać każdą roztwór do transfekcji CaPhos za pomocą delikatnego pipetowania.
  7. Dodać kroplami 200 µL każdej mieszaniny do transfekcji do odpowiedniej studni zawierającej komórki HEK293ΔCUL4BΔcas9. Zmieniać końcówki pipety między próbkami, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
  8. Dodać kroplami pozostałe 200 µL każdej odpowiadającej mieszaniny do transfekcji do odpowiedniej studni zawierającej komórki HEK293ΔCUL4B.
  9. Inkubować transfektowane hodowle przez 12 h.
  10. Odssać pożywkę hodowlaną z każdej studni.
  11. Przemyć komórki raz 1 mL sterylnego 1× PBS o temperaturze pokojowej.
  12. Odssać i usunąć PBS.
  13. Dodać 2 mL świeżego cDMEM o temperaturze pokojowej do każdej studni.
  14. Inkubować hodowle przez kolejne 24 h, aby umożliwić ekspresję CUL4B i następujące po niej odpowiedzi funkcjonalne.
  15. zebrać komórki stosując standardowe procedury trypsynizacji.
  16. Przenieść każdą zawiesinę komórkową do oddzielnej probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL.
  17. Przemyć każdą zawiesinę komórkową raz 1× PBS.
  18. Krótko wirować próbki przy 14 000 × g w temperaturze pokojowej, aby uzyskać pellet komórek.
  19. Odssać i usunąć nadsącz PBS.
    OSTRZEŻENIE: β-merkaptoetanol jest lotną substancją drażniącą skórę i drogi oddechowe o silnym zapachu. Roztwory stokowe należy przygotowywać w certyfikowanym dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice odporne na chemikalia, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne. Zanieczyszczone końcówki, probówki i odpady należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.
  20. Zlizować każdy pellet komórek bezpośrednio w 200 µL buforu do próbek Laemmliego uzupełnionego o 5% (v/v) β-merkaptoetanolu.
  21. Zdenaturować białka poprzez ogrzewanie próbek w temperaturze 95 °C przez 15 min.
  22. Rozdzielić 20–40 µg całkowitego białka na każdą ścieżkę za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).
  23. Przenieść rozdzielone białka na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF).
  24. Blokować membranę przez 30 min w temperaturze pokojowej, używając buforu blokującego.
    UWAGA: Bufor blokujący przygotować, używając 5% (w/v) odtłuszczonego mleka w proszku lub 5% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczonej w standardowym buforze do mycia (0,1% Tween 20 w 1× soli buforowanej Tris lub 1× PBS).
  25. Przemyć membranę trzy razy po 10 min za każdym razem, używając standardowego buforu do mycia.
  26. Inkubować membranę z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6 lub α-TUBULINIE przez 12 h w temperaturze 4 °C przy delikatnym kołysaniu.
    UWAGA: Przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczyć 1:1 000 w standardowym buforze do mycia.
  27. Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i przemyć membranę trzy razy po 10 min za każdym razem, używając standardowego buforu do mycia.
  28. Inkubować membranę z odpowiednim przeciwciałem wtórnym anty-mysim lub anty-króliczym IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 12 h w temperaturze 4 °C przy delikatnym kołysaniu.
    UWAGA: Przeciwciała wtórne rozcieńczyć 1:3 000 w buforze blokującym.
  29. Usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i przemyć membranę trzy razy po 10 min za każdym razem, używając standardowego buforu do mycia.
  30. Nanieść równomiernie na membranę substrat do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i inkubować przez 1 min.
  31. Przechwycić sygnały chemiluminescencyjne za pomocą cyfrowego systemu obrazowania.
    UWAGA: Jeśli jest to pożądane, potwierdzić skuteczną dysrupcję genu poprzez sekwencjonowanie metodą Sangera docelowego regionu genomowego po amplifikacji PCR wyizolowanego DNA genomowego43.

Wyniki

Aby wygenerować linie z knockoutem Cas9 do eksperymentalnej rekonstytucji, w komórkach HEK293FT przy użyciu standardowych plazmidów pakujących (pLP1, pLP2 i pLP/VSVG) wytworzono lentiwirus kodujący gRNA celujący w Cas9 (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro). Uzyskany nadsącz wirusowy zebrano i wykorzystano do transdukcji komórek docelowych. Przeżycie podczas selekcji higromycyną B potwierdziło udaną transdukcję lentiwirusową, a późniejsza analiza western blot zweryfikowała ablację Cas9 (Rysunek 1).

Białko CUL4B zostało łatwo wykryte w macierzystych komórkach HEK293, lecz nie występowało w komórkach HEK293ΔCUL4B oraz HEK293ΔCUL4BΔcas9 transfekowanych pustym wektorem. Zgodnie z utratą CUL4B, białka WDR5 i CDC6 wykazały odpowiednio oczekiwane wzrosty i spadki ekspresji w stanie stacjonarnym, co potwierdziło zaburzenie funkcji CUL4B. Białko Cas9 zostało wykryte w komórkach HEK293ΔCUL4B, lecz było niewykrywalne w macierzystych komórkach HEK293 oraz komórkach HEK293ΔCUL4BΔcas9 , co potwierdziło skuteczną ablację Cas9. Zgodnie z oczekiwaniami, transfekcja plazmidu ekspresyjnego CUL4B do komórek HEK293ΔCUL4B doprowadziła jedynie do minimalnego przywrócenia ekspresji białka CUL4B. W przeciwieństwie do tego, silna ekspresja CUL4B została zaobserwowana po transfekcji komórek HEK293ΔCUL4BΔcas9, której towarzyszyło przywrócenie ekspresji białek downstream, o czym świadczyły obniżone poziomy WDR5 i podwyższone poziomy CDC6. Wspólnie wyniki te dowodzą, że ablacja Cas9 umożliwia efektywne przywrócenie ekspresji i funkcji CUL4B poprzez zapobieganie zależnemu od Cas9 cięciu plazmidu ratowniczego (Rysunek 2).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat eksperymentalny strategicznej ablacji Cas9 i walidacji ratowania funkcji CUL4B. W tym schemacie przedstawiono proces generowania komórek z nokautem CRISPR z ablacją Cas9 poprzez ko-transfekcję komórek producenta HEK293FT konstruktami pLP1, pLP2, pLP/VSVG oraz Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro za pomocą transfekcji fosforanem wapnia. Otrzymany nadsącz lentiwirusowy jest zbierany, wirowany w celu usunięcia pozostałych komórek producenta, a następnie wykorzystywany do transdukcji komórek docelowych. Po selekcji potwierdzono pomyślną ablację Cas9 za pomocą analizy western blot, aby uzyskać czystą linię komórkową z nokautem, gotową do eksperymentalnej rekonstytucji CUL4B. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Przywrócenie ekspresji i funkcji CUL4B w komórkach HEK293 edytowanych za pomocą CRISPR-Cas9. (A) Schemat eksperymentalny procesu transfekcji. Komórki HEK293ΔCUL4B   oraz HEK293ΔCUL4BΔcas9 poddano transfekcji pustym wektorem lub rosnącymi ilościami pCMV-FLAG-CUL4B. Komórki zebrano 36 h po transfekcji, a białka z lizatów rozdzielono metodą SDS-PAGE. (B) Analiza Western blot wydajności przywrócenia ekspresji oraz funkcjonalnych kontroli efektora. Wskazane białka zwizualizowano za pomocą Western blot. WDR5 i CDC6 posłużyły jako kontrole funkcji CUL4B. α-TUBULIN posłużyła jako kontrola ładowania. Macierzyste komórki HEK293 posłużyły jako kontrola podstawowej ekspresji. Bloty są reprezentatywne dla powtórzonych eksperymentów (n = 2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Gen docelowySekwencja gRNA (5′→3′)PAM (5′→3′)Lokalizacja docelowaOpis celu
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Ekson 3Region N-końcowy ludzkiej ramki odczytu (ORF) CUL4B dla nokautu z przesunięciem ramki odczytu
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)Zakonserwowany wewnętrzny region transgenu cas9 w celu wywołania samoinaktywujących insercji i delecji (indels)

Tabela 1: Sekwencje gRNA CRISPR-Cas9 i specyfikacje celów genomicznych.

Dyskusja

Niniejszy protokół umożliwił skuteczne przywrócenie ekspresji i funkcji białka docelowego w liniach komórkowych z knockoutem wykonanym za pomocą CRISPR-Cas9, w których Cas9 został usunięty po edycji. Ważną obserwacją wynikającą z tych prac jest znaczny stopień, w jakim konstytutywna ekspresja Cas9 tłumi ekspresję transgenu napędzaną przez plazmid. Atutem tego protokołu jest zdolność do odzyskania zarówno utraconego białka, jak i powiązanego z nim fenotypu. Metoda ta tworzy również ramy dla analizy fenotypowej szerokiego spektrum zmian białkowych. Na przykład wprowadzenie wariantu fosfomimetycznego (np. zamiana seryny na kwas asparaginowy) może dostarczyć cennych informacji na temat roli danej modyfikacji potranslacyjnej bez zakłóceń wynikających z obecności białka natywnego.

W konsekwencji protokół ten ma szerokie zastosowanie w standardowych liniach komórkowych adherentnych (np. HeLa, A549) oraz zawiesinowych (np. Jurkat, THP-1). Jednak ten sekwencyjny model selekcji może okazać się niepraktyczny w przypadku komórek pierwotnych lub niedzielących się (np. pierwotnych neuronów lub makrofagów). W tych wrażliwych systemach szybkie usuwanie nietransdukowanych komórek postronnych powoduje uwalnianie cytotoksycznych szczątków i proapoptotycznych sygnałów stresu do wspólnego mikrośrodowiska, co prowadzi do toksyczności pośredniej46,47. Metoda ta może również zawieść w przypadku wysoce adaptacyjnych aneuploidalnych linii nowotworowych (np. glejaka U87 lub czerniaka A375), które są podatne na ucieczkę przed fenotypami indukowanymi przez CRISPR poprzez szybkie reorganizacje chromosomowe lub szybką selekcję istniejących klonów opornych48,49. Ostatecznie przydatność metody zależy od zdolności linii komórkowej do tolerowania obciążenia metabolicznego związanego z ekspresją dwóch wektorów, wytrzymania tych pośrednich presji selekcyjnych oraz utrzymania stabilnej kinetyki wzrostu przez cały wielotygodniowy protokół.

Choć podejście to służy jako wszechstronny dowód koncepcji dla większości linii komórkowych, jego wdrożenie wymaga zachowania starannej równowagi między wydajnością dostarczania a integralnością genomu. Jak wskazano, zastosowanie dostarczania lentiwirusowego dla gRNA skierowanego przeciwko „siebiemu” zapewnia jednorodną populację z ablacją Cas9, szczególnie w komórkach trudnych do transfekcji. Jednakże ryzyko mutogenezy insercyjnej wynikającej z półlosowej integracji pozostaje kwestią problematyczną. Ryzyka te można kontrolować poprzez optymalizację MOI. W liniach podatnych, takich jak HEK293, MOI rzędu 1–5 pozwala na osiągnięcie wysokiego nasycenia przy jednoczesnej minimalizacji cytotoksyczności i mutogenezy indukowanej integracją41. W przeciwieństwie do nich, oporne komórki odpornościowe lub neuronalne zazwyczaj wymagają MOI od 10 do 50, co często wiąże się z koniecznością zastosowania wzmacniaczy, takich jak polybrene i/lub spinokulacja, aby osiągnąć podobną wydajność50,51,52,53,54,55.

Ten techniczny kompromis obejmuje również wybór pomiędzy populacjami poliklonalnymi a monoklonalnymi. Komórki HEK293ΔCUL4BΔcas9 wygenerowane w tej pracy są poliklonalne, co pozwala przyspieszyć harmonogram eksperymentów poprzez pominięcie wielotygodniowej ekspansji niezbędnej do subklonowania pojedynczych komórek. Ponadto pula poliklonalna oddaje średni fenotyp hodowli, skutecznie niwelując wpływ artefaktów klonalnych lub problemów związanych z integracją w konkretnych miejscach. Chociaż linie monoklonalne z większym prawdopodobieństwem dają spójne wyniki ze względu na homogeniczność genetyczną, przedstawione tutaj wyniki sugerują, że selekcja poliklonalna jest wykonalną i często lepszą alternatywą w sytuacjach, gdy priorytetem jest szybkość i reprezentatywność populacji.

Kluczową zmienną może być również stabilność czasowa otrzymanego fenotypu. W prezentowanym tutaj systemie wpływ regulacyjny CUL4B na WDR5 i CDC6 malał w kolejnych pasażach linii komórkowych z nokautem, co korelowało z kompensacyjną nadróbką ekspresji paralogu CUL4A (dane nie pokazano). Odzwierciedla to wyniki badań Nakagawy i współpracowników, którzy wykazali, że CUL4A może częściowo przywrócić funkcję CUL4B w komórkach z deficytem CUL4B44. Taka kompensacja homeostatyczna jest częsta w biologii komórkowej, szczególnie w przypadku celowania w białko o wysokiej homologii strukturalnej i redundancji funkcjonalnej względem innych białek komórkowych.

Aby zaradzić tym wtórnym mechanizmom kompensacyjnym, można zastosować dwa odmienne podejścia strategiczne, w zależności od celów eksperymentalnych i użytej linii komórkowej. Dla badaczy priorytetowo traktujących wydajność lub pracujących z wysoce adaptacyjnymi liniami komórkowymi niezbędny jest skrócony harmonogram eksperymentalny. Strategia ta obejmuje natychmiastową walidację utraty białka docelowego, najlepiej po osiągnięciu przez kulturę 90% konfluencji po selekcji, a następnie niezwłoczne zastosowanie samoinaktywującego Cas9 oraz przeprowadzenie testów funkcjonalnych. Przyjęcie takiego przyspieszonego schematu pracy zwiększa prawdopodobieństwo uchwycenia pierwotnych skutków biologicznych nokautu, zanim mechanizmy homeostazy komórkowej zyskają wystarczająco dużo czasu na upregulację redundantnych paralogów lub inne zakłócenie wynikowego fenotypu.

Alternatywnie, w badaniach wymagających długoterminowej stabilności lub wysokoprecyzyjnych eksperymentów typu „rescue”, szczególnie w modelach opornych na transfekcję, takich jak komórki odpornościowe i neuronalne, rozwiązaniem jest zastosowanie systemu kontrolowanego tetracykliną (Tet-On/Off)56,57. Choć wdrożenie tego indukcyjnego mechanizmu wymaga dodatkowych rund transdukcji lentiwirusem oraz zastosowania odrębnych markerów oporności na antybiotyki, umożliwia ono trwałe przywrócenie białka docelowego w celu stabilizacji środowiska komórkowego przed wywołaniem przejściowych, zależnych od doksycyliny zdarzeń typu „loss and rescue”57.

Oświadczenia

Autorzy wykorzystali Google Gemini w celu doprecyzowania terminologii technicznej oraz redakcji manuskryptu. Sztuczna inteligencja została użyta jako narzędzie do poprawy językowej i nie przyczyniła się do pierwotnej syntezy danych, konceptualizacji badania ani do głównego przygotowania tekstu. Autorzy sprawdzili i zedytowali wygenerowane treści i biorą pełną odpowiedzialność za zawartość końcowego manuskryptu. Autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez fundusze startowe przekazane przez Le Moyne College, Komitet Badawczo-Rozwojowy Le Moyne College, Studencki Komitet Badawczy Le Moyne College, Fundusz Centrum Innowacji w Badaniach i Nauczaniu jezuitów im. Waltera L. '66 i MaryAnne Poland oraz Wydział Nauk Biologicznych i Środowiskowych Le Moyne College. Autorzy potwierdzają wykorzystanie serwisu BioRender.com przy przygotowaniu ilustracji graficznych. Rysunek 1 został stworzony w BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3), a górny panel Rysunku 2 został stworzony w BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciało anty-Cas9Cell Signaling65832To mysie przeciwciało monoklonalne zapewnia specyficzne wykrywanie Cas9 z S. pyogenes w lizatach ludzkich, co czyni je idealnym do weryfikacji usuwania Cas9 za pośrednictwem gRNA skierowanego przeciwko niej samej.
przeciwciało anty-CDC6Cell Signaling3387To królicze przeciwciało monoklonalne zapewnia specyficzne wykrywanie ludzkiego CDC6, co czyni je idealnym do monitorowania funkcjonalnych skutków działania CUL4B w dalszych etapach.
przeciwciało anty-CUL4BSigma-AldrichC9995To oczyszczone powinowactwem królicze przeciwciało poliklonalne zapewnia specyficzne wykrywanie ludzkiego CUL4B bez reaktywności krzyżowej z jego blisko spokrewnionym paralogiem CUL4A.
przeciwciało wtórne anty-mouse IgG sprzężone z HRPCell Signaling7076To końskie przeciwciało anty-mouse IgG jest sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) i zoptymalizowane do chemiluminescencyjnego wykrywania mysich monoklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych.
przeciwciało wtórne anty-rabbit IgG sprzężone z HRPCell Signaling7074To kozie przeciwciało anty-rabbit IgG jest sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) i zoptymalizowane do chemiluminescencyjnego wykrywania króliczych poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych.
przeciwciało anty-WDR5Cell Signaling13105To królicze przeciwciało monoklonalne zapewnia specyficzne wykrywanie ludzkiego WDR5, co czyni je idealnym do monitorowania funkcjonalnych skutków działania CUL4B w dalszych etapach.
przeciwciało anty-α-TUBULINCell Signaling3873To mysie przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko ludzkiej alfa-tubulinie i jest idealne jako jednolita kontrola ładowania do normalizacji w analizie western blot.
Zestaw do transfekcji fosforanem wapniaThermoFisher ScientificK278001Zestaw ten zawiera wydajne odczynniki do transfekcji przejściowej, zoptymalizowane pod kątem skalowalnej i kosztowo efektywnej produkcji wektorów lentiwirusowych w adherentnych komórkach producentach HEK293FT.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation synteza na zamówieniesekwencja cas9 gRNA: CGTGATCACCGACGAGTACA, sekwencja PAM: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation synteza na zamówieniesekwencja cas9 gRNA: CGTGATCACCGACGAGTACA, sekwencja PAM: AGG
Podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium GibcoD5796To podłoże o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnione L-glutaminą i pirogronianem sodu, jest zoptymalizowane do utrzymania wzrostu, żywotności i stabilności metabolicznej w szybko proliferujących liniach komórek ssaków (np. HEK293FT).
Surowica z płodu cielęcego, Premium (inaktywowana ciepłem)Corning35-016-CVTa surowica klasy premium, inaktywowana ciepłem, dostarcza niezbędnych czynników wzrostu i hormonów, minimalizując jednocześnie cytotoksyczność zależną od dopełniacza w liniach komórek ssaków.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573Ta dobrze scharakteryzowana linia ludzkich komórek embrionalnej nerki jest łatwa do transfekcji i służy jako solidny, standardowy model do badania fenotypów knockoutu genów oraz schematów ratowania białek.
komórki HEK293FT ThermoFisher ScientificR70007Ten szybko rosnący, łatwy do transfekcji wariant linii ludzkich komórek embrionalnej nerki stabilnie ekspresuje antygen T SV40, co optymalizuje go do maksymalizacji miana wirusów podczas produkcji wektorów lentiwirusowych.
Hygromycyna BsigmaaldrichH7772Ten antybiotyk aminonukleozydowy jest wykorzystywany jako czynnik selekcyjny w hodowlach komórek ssaków do izolacji stabilnych transduktantów ekspresujących marker oporności na hygromycynę.
plazmid pCLIP-All-hCMV-Puro (CUL4B gRNA)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bsekwencja CUL4B gRNA: ATCAAACCCTACAAACTCCA, sekwencja PAM: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/ATen plazmid ekspresyjny dla ssaków wykorzystuje promotor cytomegalowirusa (CMV) do konstytutywnej ekspresji białka Cullin 4B (CUL4B) z tagiem FLAG; plazmid otrzymany jako dar od Jianping Jin.
Wektor ekspresyjny pCMV-M1 dla ssakówAddgene23007Kontrolny pusty wektor ekspresyjny (dar od Lindy Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Ten lentiwirusowy wektor transferowy steruje ekspresją konfigurowalnego gRNA pod promotorem ludzkim U6 wraz z markerem oporności na puromycynę pod promotorem EF-alpha do celowania CRISPR w komórkach ekspresujących Cas9; plazmid otrzymany jako dar od Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 Lentiwirusowy wektor kodujący GFP do oceny wydajności transdukcji (dar od Kevina Janesa)
PuromycynaSigma-AldrichP8833Ten antybiotyk aminonukleozydowy jest wykorzystywany jako czynnik selekcyjny w hodowlach komórek ssaków do izolacji stabilnych transduktantów ekspresujących marker oporności na puromycynę.
Sterylny roztwór soli fosforanowej (PBS)Corning21-040-CVTen standardowy zrównoważony roztwór soli jest wykorzystywany do przemywania monowarstw komórkowych w celu skutecznego usunięcia śladowych ilości pożywki hodowlanej, białek surowicy lub enzymów bez zaburzania ciśnienia osmotycznego lub żywotności komórek.
Trypsyna EDTA 1XCorning25-051-CITen standardowy roztwór dysocjacji enzymatycznej jest wykorzystywany do odrywania adherentnych komórek ssaków od naczyń hodowlanych poprzez rozrywanie wiązań peptydowych, podczas gdy EDTA chelatuje kationy dwuwartościowe, aby zniszczyć adhezję międzykomórkową.
Mieszanka do pakowania lentiwirusów ViraPowerThermoFisher ScientificK497500Ta zoptymalizowana mieszanka plazmidów pakujących (pLP1, pLP2 i pLP/VSVG) jest wykorzystywana do kotransfekcji do komórek producentów, aby ułatwić montaż lentiwirusowych wektorów ekspresyjnych o wysokim mianie, które są niezdolne do replikacji.

Bibliografia

  1. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Leonhardt C, et al. Single-cell mRNA transfection studies: Delivery, kinetics and statistics by numbers. Nanomedicine. 2014;10(4):679-688.
  3. Liu Y, Yang Q, Zhao F. Synonymous but not silent: The codon usage code for gene expression and protein folding. Annu Rev Biochem. 2021;90:375-401.
  4. Chamary JV, Hurst LD. Evidence for selection on synonymous mutations affecting stability of mRNA secondary structure in mammals. Genome Biol. 2005;6(9):R75.
  5. Mauro VP, Chappell SA. A critical analysis of codon optimization in human therapeutics. Trends Mol Med. 2014;20(11):604-613.
  6. Bauer AP, et al. The impact of intragenic CpG content on gene expression. Nucleic Acids Res. 2010;38(12):3891-3908.
  7. Kudla G, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science. 2009;324(5924):255-258.
  8. Simms CL, Yan LL, Zaher HS. Ribosome collision is critical for quality control during no-go decay. Mol Cell. 2017;68(2):361-373.e5.
  9. Fu Y, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-826.
  10. Babu K, et al. Bridge helix of Cas9 modulates target DNA cleavage and mismatch tolerance. Biochemistry. 2019;58(14):1905-1917.
  11. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013;31(9):827-832.
  12. Ihry RJ, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med. 2018;24(7):939-946.
  13. Haapaniemi E, Botla S, Persson J, Schmierer B, Taipale J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med. 2018;24(7):927-930.
  14. Yang S, Li S, Li XJ. Shortening the half-life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Rep. 2018;25(10):2653-2659.e3.
  15. Kafri M, Metzl-Raz E, Jona G, Barkai N. The cost of protein production. Cell Rep. 2016;14(1):22-31.
  16. Mehta A, Merkel OM. Immunogenicity of Cas9 protein. J Pharm Sci. 2020;109(1):62-67.
  17. Liu Q, Zhang H, Huang X. Anti-CRISPR proteins targeting the CRISPR-Cas system enrich the toolkit for genetic engineering. FEBS J. 2020;287(4):626-644.
  18. Marino ND, Pinilla-Redondo R, Csörgő B, Bondy-Denomy J. Anti-CRISPR protein applications: Natural brakes for CRISPR-Cas technologies. Nat Methods. 2020;17(5):471-479.
  19. Gangopadhyay SA, et al. Precision control of CRISPR-Cas9 using small molecules and light. Biochemistry. 2019;58(4):234-244.
  20. Pandit B, et al. Bio-orthogonal chemistry-based strategy to turn off CRISPR-Cas9 activity in solution and live cells. NAR Mol Med. 2026;3(1):ugag008. Available from: https://doi.org/10.1093/narmme/ugag008
  21. Bubeck F, et al. Engineered anti-CRISPR proteins for optogenetic control of CRISPR-Cas9. Nat Methods. 2018;15(11):924-927.
  22. Kostic M, Jones LH. Critical assessment of targeted protein degradation as a research tool and pharmacological modality. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(5):305-317.
  23. Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-1019.
  24. Hendel A, et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015;33(9):985-989.
  25. Merienne N, et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Rep. 2017;20(12):2980-2991.
  26. Kelkar A, et al. Doxycycline-dependent self-inactivation of CRISPR-Cas9 to temporally regulate on- and off-target editing. Mol Ther. 2020;28(1):29-41.
  27. Dai Y, et al. Self-inactivating AAV-CRISPR at different ages enables sustained amelioration of Huntington's disease deficits in BAC226Q mice. Sci Adv. 2026;12(12):eaea8052.
  28. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014;11:783-784.
  29. Parr-Brownlie LC, et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 2015;8:14.
  30. Dobransky A, Root M, Hafner N, Marcum M, Sharifi HJ. CRL4-DCAF1 ubiquitin ligase-dependent functions of HIV viral protein R and viral protein X. Viruses. 2024;16(8)1313.
  31. Thermo Fisher Scientific. ViraPower Lentiviral Expression Systems User Guide. 2026. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/virapower_lentiviral_system_man.pdf
  32. Pauwels K, et al. State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr Gene Ther. 2009;9(6):459-474.
  33. Guo L, et al. Optimizing conditions for calcium phosphate-mediated transient transfection. Saudi J Biol Sci. 2017;24(3):622-629.
  34. Thermo Fisher Scientific. Cationic Lipid Transfection. 2026. Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/methods/cationic-lipid-transfection.html
  35. Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495-505. Available from: https://doi.org/10.1038/nprot.2009.22
  36. Barde I, Salmon P, Trono D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 2010;53(1):4.21.1-4.21.23. Available from: https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142301.ns0421s53
  37. Kumru OS, et al. Physical characterization and stabilization of a lentiviral vector against adsorption and freeze-thaw. J Pharm Sci. 2018;107(11):2764-2774.
  38. American Type Culture Collection. Lentiviral Vector Reference Material Information Sheet. 2026. Available from: https://www.atcc.org/-/media/product-assets/documents/protocols/virology/lentiviral-vector-reference-material-information-sheet.pdf?rev=a934bd06c07f4969b0aafec16506cd44
  39. Higashikawa F, Chang L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 2001;280(1):124-131.
  40. Kowolik CM, Yee JK. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 2002;5(6):762-769.
  41. Pichavant C, Tremblay JP. Generation of lentiviral vectors for use in skeletal muscle research. In: DiMario JX, editor. Myogenesis: Methods and Protocols. Humana Press; Totowa, NJ; 2012. p. 285-295.
  42. Stacey GN, Masters JR. Cryopreservation and banking of mammalian cell lines. Nat Protoc. 2008;3(12):1981-1989.
  43. Bauer DE, Canver MC, Orkin SH. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. J Vis Exp. 2015;(95):e52118.
  44. Nakagawa T, Xiong Y. X-linked mental retardation gene CUL4B targets ubiquitylation of H3K4 methyltransferase component WDR5 and regulates neuronal gene expression. Mol Cell. 2011;43(3):381-391.
  45. Zou Y, et al. CUL4B promotes replication licensing by up-regulating the CDK2-CDC6 cascade. J Cell Biol. 2013;200(6):743-756.
  46. Dachs GU, Hunt MA, Syddall S, Singleton DC, Patterson AV. Bystander or no bystander for gene-directed enzyme prodrug therapy. Molecules. 2009;14(11):4517-4545.
  47. Prise KM, O'Sullivan JM. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2009;9(5):351-360.
  48. Clark MJ, et al. U87MG decoded: The genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 2010;6(1):e1000832.
  49. Cormier JN, et al. Heterogeneous expression of melanoma-associated antigens and HLA-A2 in metastatic melanoma in vivo. Int J Cancer. 1998;75(4):517-524.
  50. Sigma-Aldrich. Successful Transduction Using Lentivirus. Darmstadt, Germany; 2023. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/genomics/advanced-gene-editing/successful-transduction-lentivirus
  51. Swainson L, Mongellaz C, Adjali O, Vicente R, Taylor N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol. 2008;415:301-320.
  52. Davis HE, Morgan JR, Yarmush ML. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 2002;97(2-3):159-172.
  53. Denning W, et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: Effect of sera and polycations. Mol Biotechnol. 2013;53(3):308-314.
  54. O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 2000;74(21):10074-10080.
  55. Sano S, et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. 2019;(152):e59977.
  56. Gossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(12):5547-5551.
  57. Gossen M, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995;268(5218):1766-1769.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

BiologyCRISPRCas9KnockoutLentivirusTransductionStableSelectionRescueRestorationTransgeneTransfectionPlasmid
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.