Niniejszy artykuł przedstawia protokół kaniulacji komór bocznych i infuzji znacznika, dostosowany do badań dynamicznego wzmocnienia kontrastowego w rezonansie magnetycznym (DCE-MRI) u gryzoni. Protokół ten umożliwia ciągłe podawanie znacznika podczas akwizycji obrazów, co pozwala na mapowanie transportu znacznika w całym mózgu oraz jego usuwania z tkanki mózgowej w ramach jednej, nieprzerwanej sesji obrazowania.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą rezonansu magnetycznego z kontrastem poprzez infuzję dokomorową u gryzoni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kaniulacja domięśniowa (ICV) umożliwia dostarczanie egzogennych znaczników lub środków terapeutycznych bezpośrednio do komory bocznej, która jest miejscem rozpoczęcia drogi krążenia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Wprowadzone cząsteczki są transportowane przez przepływ masowy CSF przez komory do przestrzeni podpajęczynówkowej, a następnie przenikają do miąższu mózgu via przestrzeń okołonaczyniową. Jednak konwencjonalne metody kaniulacji ICV zazwyczaj wykorzystują kaniule ferromagnetyczne, które są niekompatybilne z badaniami MRI, co wymaga przeprowadzania infuzji poza skanerem i usunięcia kaniuli przed obrazowaniem. Czas potrzebny na transport zwierzęcia i przygotowanie do obrazowania często prowadzi do utraty początkowej i prawdopodobnie najważniejszej fazy transportu znacznika. W niniejszej pracy opisujemy protokół kaniulacji i infuzji ICV dla gryzoni, kompatybilny z MRI, który umożliwia ciągłe dostarczanie znacznika wewnątrz skanera podczas dynamicznego obrazowania MRI. Linia infuzyjna jest wykonana w całości z materiałów niemagnetycznych, co pozwala na nieprzerwane pozyskiwanie obrazów w ramach jednej sesji. Podejście to jest odpowiednie do dynamicznych badań MRI z kontrastem w celu analizy dynamiki CSF, transportu glimfatycznego, klirensu substancji rozpuszczonych oraz intratekalnego podawania leków.
Wprowadzenie
Mózg jest jednym z najbardziej aktywnych metabolicznie i dynamicznych organów w organizmie, nieustannie generującym produkty przemiany materii, które muszą być efektywnie usuwane w celu utrzymania prawidłowej funkcji neuronów1. Nagromadzenie odpadów metabolicznych jest cechą charakterystyczną neurodegeneracji i starzenia się mózgu2. Układ glimfatyczny odgrywa centralną rolę w tym procesie oczyszczania, ułatwiając usuwanie produktów ubocznych metabolizmu i toksycznych odpadów poprzez masowy przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) oraz wymianę CSF z płynem śródmiąższowym (ISF)3,4,5, co jest wspomagane przez kanały wodne akwaporyny-4 (AQP4) zlokalizowane na stopkach astrocytów6. Znaczną wiedzę na temat dynamiki CSF uzyskano poprzez badanie transportu różnych znaczników CSF. Dynamiczny rezonans magnetyczny z kontrastem (DCE-MRI) z wykorzystaniem środków kontrastowych opartych na gadolinie (GBCAs) jest szczególnie odpowiedni do oceny transportu znaczników w całym mózgu7,8. Relewantność kliniczna tego podejścia została wykazana w badaniach translacyjnych u ludzi. Do oceny dynamiki CSF w ludzkim mózgu wykorzystano dożylną administrację GBCAs, po której następowały seryjne badania MRI9. Kolejne prace wykazały transport znaczników w całym mózgu, a następnie ich oczyszczenie w ciągu nocy10. Podejście to zastosowano niedawno w celu ujawnienia upośledzonego periarterialnego transportu znaczników u osób z obniżoną rezerwą ciśnieniowo-objętościową wewnątrzczaszkową, a także u pacjentów z idiopatycznym wodogłowiem normotensyjnym11. Badania te ustanawiają DCE-MRI transportu znaczników CSF jako podejście możliwe do przełożenia na praktykę kliniczną i motywują do opracowania rygorystycznych, powtarzalnych metod przedklinicznych do mechanistycznych badań nad regulacją dynamiki CSF i oczyszczaniem z odpadów.
Kaniulacja do cysterny wielkiej (ICM) jest powszechnie stosowana w badaniach nad układem glimfatycznym w celu podania znaczników12Jednakże tylko około 20% dostarczonych GBCAs poprzez droga ta transportuje substancje do miąższu mózgu, przy czym większość z nich odpływa bezpośrednio do kręgosłupa lub naczyń limfatycznych8Podejście to niesie również ryzyko uszkodzenia móżdżku lub pnia mózgu, a unieruchomienie kaniuli na potrzeby badań podłużnych pozostaje wyzwaniem technicznym. Kanulacja dojamochowa (ICV) stała się bardziej niezawodną alternatywą.13,14,15Niedawne badanie wykazało powtarzalność tej metody oraz jej kluczowe zalety w dostarczaniu znaczników fluorescencyjnych, w tym stabilną fiksację kaniuli, która umożliwia swobodne poruszanie się zwierzęcia i pozwala na wielokrotne iniekcje znacznika w badaniach podłużnych.13.
Pomimo tych zalet, istniejące protokoły kaniulacji ICV nie są bezpośrednio kompatybilne z badaniami MRI16. Ponieważ kaniulacja ICV wymaga penetracji miąższu mózgu, zazwyczaj stosuje się kaniule ferromagnetyczne, które powodują występowanie silnych artefaktów podatności w obrazach MRI. W rezultnya infuzja znacznika musi być przeprowadzona poza skanerem, a kaniulę należy usunąć przed przeniesieniem zwierzęcia do obrazowania. Typowy schemat postępowania obejmuje wykonanie skanu bazowego, wyjęcie zwierzęcia w celu kaniulacji i infuzji znacznika, a następnie ponowne ustawienie zwierzęcia do kolejnych skanów dynamicznych. Taki przerwany proces uniemożliwia ciągłą akwizycję z referencją do stanu bazowego i wprowadza błędy w pozycjonowaniu, które mogą zakłócić kinetyczną analizę w skali woksela. Co ważniejsze, ponieważ wczesna faza wychwytu jest zazwyczaj najbardziej dynamicznym, a zarazem przejściowym etapem kinetyki znacznika, przenoszenie zwierzęcia i przygotowanie skanera w tym oknie czasowym skutkuje utratą najbardziej informatywnych danych.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół, który rozwiązuje te ograniczenia poprzez zintegrowanie kompatybilnej z MRI linii infuzyjnej do komór bocznych (ICV) z możliwością podawania środka kontrastowego bezpośrednio w skanerze, co umożliwia ciągłe dynamiczne obrazowanie MRI u gryzoni. Podejście to pozwala na ilościowe mapowanie transportu znacznika w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) w całym mózgu podczas jednej, nieprzerwanej sesji obrazowania. Protokół ten jest odpowiedni do badania dynamiki CSF w całym mózgu, transportu glimfatycznego oraz kinetyki usuwania substancji rozpuszczonych. Choć opisano go tutaj dla dorosłych szczurów, protokół można dostosować do myszy, wprowadzając odpowiednie korekty współrzędnych kaniulacji oraz parametrów infuzji15.
Protokół
Opisany poniżej protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Case Western Reserve (A-3145-01-2023-0015), zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz Polityką Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie linii infuzyjnej
- Za pomocą ząbkowanych nożyczek odciąć 30-mm odcinek miedzianej kaniuli oraz 2-m odcinek rurki polietylenowej (PE).
- Pod mikroskopem delikatnie rozszerzyć jeden koniec rurki PE za pomocą igły 30 G, następnie wsunąć miedzianą kaniulę w rozszerzony koniec i zabezpieczyć połączenie klejem cyjanoakrylowym. Przeciwny koniec rurki PE połączyć z igłą 30 G.
UWAGA: Miedź jest wysoce plastyczna; należy uważać, aby nie zmiażdżyć światła kaniuli podczas cięcia. Podczas montażu należy unikać odkształcania kaniuli lub przebicia rurki. Długość rurki PE powinna umożliwiać umieszczenie pompy strzykawkowej poza polem rozproszonym skanera. - Wypełnić zestaw kaniula-rurka odgazowanym roztworem znacznika i podłączyć go do strzykawki Hamiltona o pojemności 50 µL. Końcówkę strzykawki owinąć taśmą uszczelniającą z politetrafluoroetylenu (PTFE), aby zapobiec wyciekom. Należy zachować ostrożność, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza podczas tego procesu.
- Zamontować strzykawkę Hamiltona w pompie strzykawkowej i pobrać do strzykawki dodatkowe 30 µL roztworu znacznika.
2. Procedura kanulacji
- Zważ szczura i podaj znieczulenie poprzez zastrzyk doszpikowy z ketaminą (90 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg). Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofywania łapy po uciśnięciu palca. W razie potrzeby uzupełnij dawkę o jedną trzecią dawki początkowej i sprawdź ponownie przed kontynuowaniem procedury.
- Wygol głowę i szyję, usuń luźne włosy i zdezynfekuj odsłoniętą skórę wacikami nasączonymi 70% etanolem.
- Ustabilizuj szczura w ramie stereotaktycznej i umieść pod zwierzęciem mata grzewczą przykrytą papierem chłonnym. Nałóż maść oftalmiczną do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
- Dostosuj zacisk do nosa, aby wypoziomować czaszkę. Wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej i odsunąć skórę za pomocą czterech klamer hemostatycznych, aby odsłonić bregma i lambda. Nanieś 3% nadtlenek wodoru na czaszkę, aby usunąć pozostałości okostnej i zwiększyć widoczność punktów orientacyjnych.
UWAGA: Precyzyjne wypoziomowanie czaszki jest kluczowe dla powtarzalnego umieszczenia kaniuli. Jako praktyczny środek kontroli jakości porównaj współrzędne mediolateralne (ML) i dorsoventralne (DV) w punktach bregma i lambda: jeśli czaszka jest prawidłowo wypoziomowana, różnica między tymi dwoma punktami orientacyjnymi nie powinna przekraczać 0.2 mm w osi ML lub DV. - Zamocuj wiertarkę elektryczną z cienkim wiertłem do ramienia stereotaktycznego i upewnij się, że ramię jest mocno zablokowane.
- Ustaw wiertło w punkcie bregma, a następnie przesuń je o 0.7 mm w kierunku tylnym i 1.4 mm bocznie w prawo. Obniż wiertło, aż dotknie powierzchni czaszki, i zapisz współrzędną DV.
- Pod obserwacją mikroskopową przesuwaj wiertło w przyrostach 0.1 mm. Przerwij wiercenie natychmiast po przebiciu czaszki (typowa grubość czaszki u dorosłych szczurów wynosi 0.3–0.4 mm).
- Zastąp wiertło wcześniej załadowaną kaniulą na ramieniu stereotaktycznym. Krótko uruchom pompę infuzyjną, aż płyn zacznie wypływać z końcówki kaniuli, co potwierdzi drożność kanału.
- Upewnij się, że kaniula jest zamontowana prostopadle do powierzchni czaszki, a następnie wyrównaj ją nad otworem wiertniczym. Wprowadź kaniulę z prędkością 0.1 mm/s do końcowej głębokości docelowej 3.5 mm poniżej powierzchni opony twardej.
- Nałóż kroplę kleju tkankowego na miejsce styku kaniuli z czaszką. Po utwardzeniu kleju zamknij nacięcie skóry szwami i delikatnie zegnij miedzianą kaniulę równolegle do powierzchni czaszki, aby uniknąć kontaktu z cewką MRI.
3. Konfiguracja MRI i akwizycja dynamiczna
- Umieść cewkę nadawczą objętościową w izocentrum skanera.
- Przenieś zwierzę do kompatybilnej z MRI podstawki w pozycji brzusznej. Podłącz system monitorowania fizjologicznego, w tym czujnik oddechowy i rektalną sondę temperatury. Włącz cyrkulacyjną kąpiel wodną w celu utrzymania temperatury ciała na poziomie ~37 °C.
- Utrzymuj odpowiednią anestezję przez cały czas trwania sesji skanowania, stosując dodatkowy izofluran podawany przez stożek nosowy. Dostosuj stężenie izofluranu w zakresie od 0,25% do 1,0%, aby utrzymać częstość oddechów na poziomie 50–70 oddechów/min.
UWAGA: Anestezja ketaminą i ksylazyną podana przed zabiegiem kaniulacji zapewni resztkową sedację podczas początkowego przenoszenia do podstawki MRI. Wprowadzaj izofluran stopniowo i stale monitoruj częstość oddechów podczas skanowania.
OSTRZEŻENIE: Izofluran jest substancją lotną, która stwarza zagrożenie przy wdychaniu; stosuj aktywny system odprowadzania gazów i minimalizuj ekspozycję personelu. - Umieść pompę infuzyjną poza polem rozproszonym magnesu, ustaw szybkość infuzji na 1 µL/min, a czas trwania infuzji na 20 min, co odpowiada całkowitej objętości infuzji 20 µL. Ostrożnie ułóż i zabezpiecz linię infuzyjną wzdłuż podstawki, aby zapobiec napięciu i przesunięciu.
OSTRZEŻENIE: Przedmioty ferromagnetyczne mogą stać się niebezpiecznymi pociskami, gdy zostaną umieszczone w pobliżu skanera MRI. Wszystkie urządzenia niekompatybilne z MRI należy trzymać poza polem rozproszonym. - Zamocuj cewkę powierzchniową bezpośrednio nad grzbietową częścią czaszki, centrując ją na mózgu. Umieść mały kawałek papieru chłonnego między cewką a miejscem nacięcia, aby wchłonąć ewentualny wyciek z rany.
- Wsuń podstawkę do magnesu, aż mózg znajdzie się w izocentrum. Upewnij się, że linia infuzyjna i przewody monitorowania fizjologicznego nie są zablokowane.
- Wykonaj wstępną konfigurację skanera i uzyskaj obrazy anatomiczne, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie kaniuli.
- Po uzyskaniu obrazów bazowych, jednocześnie uruchom pompę infuzyjną oraz skan dynamiczny i kontynuuj akwizycję przez łącznie 3 h (szczegóły akwizycji znajdują się w Tabeli 1).
Wyniki
Stanowisko chirurgiczne jest skonfigurowane w sposób umożliwiający precyzyjne ustawienie wiertła w celu skierowania go do komory bocznej (0.7 mm tylnie i 1.4 mm bocznie od bregma; Rycina 1A,D). Linia infuzyjna składa się z 30-mm miedzianej kaniuli, 2-m odcinka rurki PE oraz igły 30 G podłączonej do strzykawki Hamiltona (Rycina 1B). Zwiększona długość rurki pozwala na umieszczenie pompy strzykawkowej poza obszarem pola rozproszonego skanera. Po wywierceniu otworu trepanacyjnego, wstępnie przygotowana linia infuzyjna jest montowana na ramieniu stereotaktycznym, a kaniulę wprowadza się do komory bocznej na głębokość 3.5 mm poniżej powierzchni opony twardej (Rycina 1C). Po unieruchomieniu kaniulę zgina się równolegle do powierzchni czaszki, aby zapobiec kontaktowi z cewką MRI (Rycina 1E).
Prawidłowe wprowadzenie kaniuli do komór bocznych (ICV) można potwierdzić na obrazach anatomicznych, które wyraźnie obrazują układ komorowy i tor kaniuli, umożliwiając bezpośrednią wizualizację końcówki kaniuli w świetle komory zarówno w rzucie strzałkowym (Rycina 2A), jak i osiowym (Rycina 2B). Obrazy te pozwalają również na wykluczenie z badań DCE-MRI zwierząt z nieprawidłowym umiejscowieniem kaniuli, w tym przypadków niedostatecznego wprowadzenia, gdy końcówka kończy się w obrębie ciała modzelowatego, oraz zbyt głębokiego wprowadzenia, gdy końcówka wnika do wzgórza. Rozkład czasowo-przestrzenny znacznika w skanach DCE-MRI może stanowić dodatkowe potwierdzenie prawidłowego umiejscowienia kaniuli, ponieważ błędne pozycjonowanie powoduje podanie znacznika do miąższu mózgu, co skutkuje kinetyką niezgodną z propagacją znacznika w układzie komorowym.
W przypadku skanów DCE-MRI wlew środków kontrastowych do ICV rozpoczyna się po obrazowaniu bazowym, a dynamiczne pozyskiwanie obrazów może trwać do 3 h lub dłużej (Rycina 2C). Rycina 2D przedstawia reprezentatywne obrazy 3D T1-zależne, uzyskane w różnych punktach czasowych po wlewie środka kontrastowego. Pod koniec 20-minutowego wlewu wzmocnienie jest już widoczne w wlewanym (ipsilateralnym) komorze bocznej, komorze trzeciej i czwartej oraz w cysternie wielkiej, co odzwierciedla szybką propagację znacznika poprzez przepływ masowy w drodze komorowo-podpajęczynkowej. Wzmocnienie sygnału obserwuje się również w miąższu otaczającym ipsilateralną komorę boczną, co sugeruje transport znacznika do tkanki okołokomorowej przez błonę nabłonkową (ependymę).
Bardziej ilościową ocenę transportu środka kontrastowego można uzyskać stosując techniki mapowania parametrycznego, takie jak mapowanie T1 i T2 z wykorzystaniem magnetycznego rezonansu fingerprintingu (MRF; Rysunek 3). W przedziałach dokanałowych T1 gwałtownie spada podczas infuzji, rozprzestrzeniając się z bocznej komory po stronie ipsilateralnej do komory trzeciej i czwartej, przy czym w cysternie wielkiej obserwuje się niewielkie opóźnienie w wystąpieniu skrócenia T1. Środki kontrastowe podane do komory bocznej (ICV) wykazują również rozległą penetrację do miąższu mózgu, przy czym w obszarach okołokomorowych (proksymalnych) redukcja T1 jest wcześniejsza i bardziej wyraźna, natomiast w obszarach bardziej dystalnych redukcja T1 jest opóźniona i mniejsza. Przy zastosowaniu 3-godzinnego protokołu skanowania można również ocenić usuwanie środka kontrastowego z miąższu mózgu na podstawie kinetyki powrotu T1. Łącznie protokół ten umożliwia dynamiczne monitorowanie głównych faz transportu znacznika w płynie mózgowo-rdzeniowym, w tym szybkiego rozprzestrzeniania się w komorach, propagacji dokanałowej, wychwytu przez miąższ oraz późniejszego usuwania, podczas jednej ciągłej sesji MRI.
Rysunek 1: Układ chirurgiczny i montaż linii infuzyjnej do kaniulacji ICV kompatybilnej z MRI. (A) Stanowisko chirurgiczne. Wiertarka elektryczna jest ustawiona nad polem operacyjnym do wykonania otworu trepanacyjnego. (B) Zmontowana linia infuzyjna, składająca się z igły 30 G (czerwona strzałka), 2-m odcinka rurki polietylenowej (zielona strzałka) i 30-mm miedzianej kaniuli (niebieska strzałka). (C) Przygotowana linia infuzyjna zamocowana na ramieniu stereotaktycznym do implantacji kaniuli. (D) Współrzędne do implantacji kaniuli. (E) Wygląd końcowy przed zamknięciem; miedziana kaniula jest zgięta równolegle do powierzchni czaszki, aby uniknąć kontaktu z cewką MRI. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Umiejscowienie kaniuli i dynamiczne monitorowanie transportu środka kontrastowego po infuzji ICV. (A,B) Wizualizacja umiejscowienia kaniuli (czerwone strzałki) na obrazach anatomicznych odpowiednio w przekroju strzałkowym i osiowym. (C) Schemat protokołu obrazowania. (D) Reprezentatywne obrazy 3D ważone T1 w wybranych punktach czasowych w przekroju strzałkowym (góra), osiowym (środek) i czołowym (dół). Paski skali, 5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Ilościowa ocena transportu znacznika za pomocą magnetycznego rezonansu fingerprintingowego (MRF). (A) Mapy T1 (góra) i T2 (dół) zrekonstruowane z danych 3D MRF w wybranych punktach czasowych po infuzji do komór mózgu (ICV). Pasek skali, 5 mm. (B) Średnie przebiegi czasowe T1 w przedziałach wewnątrzoponowych, w tym w komorze bocznej (LV) po stronie ipsilateralnej, trzeciej komorze (V3), czwartej komorze (V4) oraz w cysternie wielkiej (CM). Zacieniowany szary obszar oznacza 20-minutowy okres infuzji. (C) Średnie przebiegi czasowe T1 w tkance miąższowej proksymalnie i dystalnie względem V4 oraz ipsilateralnej LV. Lokalizacje obszarów zainteresowania (ROI) dla przebiegów czasowych przedstawiono na (A). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Schematy transportu znacznika CSF po infuzji ICV. (A) Przekrój strzałkowy przedstawiający infuzję znacznika poprzez kaniulę ICV i jego późniejszą dystrybucję w przepływie masowym przez układ komorowy do przestrzeni podpajęczynówkowej (czerwone strzałki), a także jego transport przez błonę ependymalną do sąsiedniego miąższu mózgu (niebieskie strzałki). LV: komora boczna; V3: trzecia komora; V3v: brzuszna część trzeciej komory; V4: czwarta komora; CM: cisterna magna. (B) Powiększony schemat obszaru zaznaczonego ramką w (A) przedstawiający drogę wymiany CSF-ISF. CSF wnika do miąższu wzdłuż przestrzeni okołotętniczej, co jest ułatwione przez kanały wodne akwaporyny-4 (AQP4) ekspresjonowane na stopkach astrocytów, przemieszcza się poprzez przepływ konwekcyjny w przestrzeni śródmiąższowej i opuszcza ją poprzez przestrzeń okołozylną do żyły odpływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
| Parametry | DCE-MRI (3D FLASH) | 3D MRF |
| Typ sekwencji | T1-zależny 3D FLASH | 3D MRF (stos spiral - stack-of-spirals) |
| TR / TE (ms) | 20.0 / 2.7 | 10.0 / 2.0 |
| Kąt odchylenia | 10° | Zmienny (harmonogram zmiennego kąta odchylenia) |
| Przygotowanie magnetyzacji | Brak | Inwersja lub przygotowanie T2 (6 z 8 segmentów) |
| Pole widzenia | 36 × 24 × 24 mm³ | 60 × 60 mm² (w płaszczyźnie); 15 mm (poza płaszczyzną) |
| Rozmiar macierzy | 144 × 96 × 96 | 300 × 300 (w płaszczyźnie); 30 (poza płaszczyzną) |
| Rozdzielczość przestrzenna | 0.25 mm izotropowo | 0.2 × 0.2 mm² (w płaszczyźnie); 0.5 mm (poza płaszczyzną) |
| Rozdzielczość czasowa | 3 min/klatkę | 7 min/klatkę |
| Trajektoria przestrzeni k | Kartezjańska | Trajektorie typu stos spiral; 48 przeplotów dla pełnego próbkowania |
| Akceleracja | Brak (pojedyncza średnia) | 48-krotna (24× w płaszczyźnie, 2× poza płaszczyzną) |
| Uwaga | Wszystkie eksperymenty obrazowe zostały przeprowadzone na systemie Bruker BioSpin 9.4 T pracującym na platformie ParaVision 360 v3.4. Jako nadajnik wykorzystano kwadraturową cewkę wolumetryczną 86 mm, a jako odbiornik 4-kanałową cewkę powierzchniową (surface array coil). | |
Tabela 1: Parametry akwizycji obrazowania MRI.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół integruje kanulację ICV z infuzją w skanerze i dynamicznym obrazowaniem MRI, co umożliwia ilościową ocenę transportu znacznika CSF w całym mózgu podczas jednej sesji obrazowania. Wartość, a także ograniczenia infuzji ICV, najlepiej oceniać w porównaniu z infuzją ICM. Infuzja ICM pozwala uniknąć kanulacji transparenchymalnej i jestTherefore mniej inwazyjna. Jednakże, ponieważ cysterna magna znajduje się w głównym nurcie drogi krążenia CSF, infuzja ICM, zwłaszcza przy wyższych szybkościach infuzji, może wywołać przejściową zmianę kierunku gradientu ciśnienia napędzającego krążenie CSF17. Co ważniejsze, znaczniki podawane drogą ICM są szybko rozprowadzane do położonej niżej przestrzeni podpajęczynówkowej, a następnie do przestrzeni okołonaczyniowej. Chociaż kanały AQP4 w stopkach astrocytów ułatwiają wymianę między CSF a ISF, kanały te nie są przepuszczalne dla GBCAs ze względu na ich dużą wielkość cząsteczkową. W rezultacie znaczniki podawane drogą ICM wykazują znacznie mniejsze wzmocnienie kontrastowe w parenchymie w porównaniu z infuzją ICV15, co czyni infuzję ICM mniej odpowiednią do badania oczyszczania mózgu z substancji rozpuszczonych. Infuzja ICV rozwiązuje te ograniczenia poprzez dostarczanie znaczników w pobliżu endogennych miejsc produkcji CSF13,14. Ponadto gradienty ciśnienia i stężeń podczas infuzji ICV sprzyjają bezpośredniemu transportowi znaczników przez warstwę nabłonka komorowego13,14,15, co umożliwia wykorzystanie tych znaczników jako markerów usuwania produktów przemiany materii (Rycina 4).
Wiele szczegółów technicznych ma krytyczne znaczenie dla uzyskania powtarzalnych wyników. Precyzyjne wypoziomowanie czaszki jest niezbędne do spójnego celowania w komorę boczną, ponieważ margines błędu przy umieszczaniu kaniuli jest bardzo mały ze względu na niewielki rozmiar komory. Równie ważne jest zmontowanie linii infuzyjnej, która jest szczelna i wolna od zatorów. Pęcherzyki powietrza lub częściowe niedrożności mogą zmienić profil infuzji i zaburzyć interpretację kinetyki w fazie wczesnej; w najgorszym przypadku duży pęcherzyk może całkowicie zablokować linię, co doprowadzi do niepowodzenia eksperymentu. Do typowych problemów podczas przygotowania do badania MRI należą wycieki na połączeniu strzykawki z igłą, które można ograniczyć za pomocą taśmy PTFE do uszczelniania gwintów, oraz naprężenia linii infuzyjnej podczas wkładania do uchwytu, czego można uniknąć, mocując rurkę wzdłuż uchwytu, aby zapobiec jej naciąganiu lub zagięciu.
Współrzędne celu i głębokość wprowadzenia przedstawione w niniejszej pracy zostały zoptymalizowane dla 12-tygodniowych szczurów szczepu Wistar i mogą wymagać korekty w przypadku innych grup wiekowych i szczepów. Infuzję ICV można przeprowadzić u myszy, wprowadzając odpowiednie modyfikacje uwzględniające mniejszą masę ciała oraz rozmiar komór mózgu15. Szybkość infuzji i całkowita objętość mogą być dostosowane do właściwości fizykochemicznych znacznika, w tym do jego wielkości cząsteczkowej i relaksywności; jednak ze względu na małą objętość komór mózgu, wyższe szybkości infuzji mogą znacząco zwiększyć ciśnienie w komorach, dlatego należy ich używać z ostrożnością. Dodatkowo miedziana kaniula zastosowana w obecnym badaniu zapewnia wytrzymałość kolumny niezbędną do przebicia opony twardej i przejścia przez miąższ w jednym, prostym ruchu. Jej plastyczność ułatwia również gięcie, co jest korzystne w konfiguracjach cewek o ograniczonej przestrzeni18. Nagrzewanie indukowane przez RF jest minimalne ze względu na krótką długość kaniuli osadzonej w tkance. Jednak nadmierna degradacja miedzi może prowadzić do uwalniania wolnych jonów miedzi, co wywołuje neurotoksyczność; w związku z tym kaniula miedziana jest prawdopodobnie nieodpowiednia do implantacji przewlekłej. W przypadku konfiguracji cewek, które pozwalają na zastosowanie wystającej kaniuli, cewniki krzemionkowe lub PEEK zapewniają odpowiednią wytrzymałość mechaniczną podczas wprowadzania, unikając jednocześnie problemów związanych z toksycznością14,19,20.
Zastosowany tutaj środek kontrastowy (Gd-DOTA) ma masę cząsteczkową 558,65 Da, co jest wartością kilkukrotnie większą niż w przypadku endogennych substancji metabolicznych, takich jak mleczan (90 Da) i glukoza (180 Da), lecz znacznie mniejszą niż w przypadku większych agregatów białkowych istotnych w procesach neurodegeneracji, takich jak monomery amyloidu-β (~4,5 kDa) czy białko tau (~45–65 kDa). Dzięki temu GBCAs stanowią odpowiednie wskaźniki kinetyki usuwania rozpuszczalników małocząsteczkowych, jednak wyniki nie powinny być bezpośrednio ekstrapolowane na usuwanie większych rozpuszczalników makrocząsteczkowych. Ponadto, ponieważ kanały wodne AQP4 nie są przepuszczalne dla GBCAs, wyniki nie mogą być bezpośrednio ekstrapolowane na wymianę CSF-ISF wspomaganą przez AQP4.
W niniejszym badaniu procedurze kaniulacji natychmiast towarzyszyła sesja obrazowania w celu wykazania wykonalności metody. Warto zauważyć, że implantacja kaniuli może wywołać odpowiedź zapalną, która może tłumić funkcję glimfatyczną13, a 24-godzinny okres oczekiwania pozwoliłby na powrót funkcji glimfatycznej do poziomu bazowego21. Badacze powinni wziąć ten czynnik pod uwagę podczas projektowania badań mających na celu badanie funkcji glimfatycznej. Ponadto wcześniejsze badanie wykazało, że napływ CSF jest większy przy znieczuleniu ketaminą/ksylazyną niż przy znieczuleniu izofluranem18. W związku z tym w obecnym protokole do wstępnej indukcji zastosowano ketaminę/ksylazynę. Jednak pojedawcza dawka ketaminy/ksylazyny jest niewystarczająca do utrzymania stabilnego znieczulenia przez cały czas trwania połączonego protokołu kaniulacji i obrazowania. Zastosowany tutaj schemat znieczulenia został zaadaptowany z wcześniejszego badania, w którym wykorzystano deksmedetomidynę z niską dawką izofluranu22. Stanowi on kompromis między utrzymaniem stabilności fizjologicznej podczas przedłużonego protokołu a minimalizacją związanego ze znieczuleniem tłumienia funkcji glimfatycznej.
Pomimo zalet, infuzja ICV posiada pewne ograniczenia. Biorąc pod uwagę małą objętość mózgowego CSF (~300 µL)23, można wprowadzić jedynie ograniczoną objętość znaczników. Ponadto szybkość infuzji (1 µL/min) jest porównywalna z szybkością produkcji CSF (~1,6 µL/min)23,24; w związku z tym podczas infuzji spodziewany jest przejściowy wzrost ciśnienia komorowego. Zmniejszenie objętości lub szybkości infuzji może częściowo złagodzić ten problem; jednak mniejsza objętość znacznika może pogorszyć czułość detekcji, natomiast wolniejsza szybkość infuzji wydłuża całkowity czas procedury, nie niwelując w pełni wzrostu ciśnienia. Dlatego należy zachować ostrożność przy interpretacji dynamiki transportu znacznika w okresie infuzji, choć ograniczenie to nie wyklucza wiarygodnej charakterystyki następujących po niej faz dystrybucji i usuwania. Podsumowując, ten kompatybilny z MRI protokół infuzji ICV stanowi praktyczną i adaptowalną platformę do rejestracji pełnego przebiegu czasowego transportu znacznika CSF in vivo, otwierając nowe możliwości badania dynamiki CSF, usuwania substancji rozpuszczonych oraz zaburzeń tych procesów w stanach chorobowych.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health w ramach grantów o numerach R01NS124206 i RF1AG094791. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko National Institutes of Health. Rycina 4 została stworzona za pomocą BioRender.com.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła hipodermiczna 30 G x 1 cal z plastikowym piastem | Exel | 26439 | |
| 50 µL, strzykawka gazoszczelna, końcówka Luer (LT) | Hamilton | 80901 | |
| Wąskie pęsety anatomiczne | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy | Spis treści | 3525 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Miedziana kapilara o średnicy zewnętrznej 0,32 mm × średnica wewnętrzna 0,16 mm | Nippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd. | C1220-11-109 | |
| Klip miedziany | IEUYO | FEBA 1801 | |
| Patyczek higieniczny | Purytanin | 868-WCS | |
| Dotarem (meglumin gadoteratu) do zastrzyków, 0,5 mmol/ml | Guerbet | NDC 67684-2001-1 | |
| Wiertarka | Foredom | Model SR | |
| Wiertło | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Uchwyt wiertła | Stoelting | 51630 | |
| Pincety medyczne Dumont | Fine Science Tools | 11252-00, 11253-20 | |
| Maść do oczu | Rugby | NDC 0536 | |
| System E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Pinceta Graefego | Fine Science Tools | 11052-10,11152-10 | |
| Podkładka grzewcza | Braintree Scientific | 5381 | |
| Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamina) | Intervet International BV | 511519 | |
| Klej silikonowy KWIK-SIL, o niskiej toksyczności, zestaw | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| Igła 5/8 cala jednorazowa, sterylna, 26 G | BD | 305115 | |
| Przewód polietylenowy o średnicy zewnętrznej 0,61 mm × śr. wewn. 0,28 mm | Scandidact | SKU252 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (ksylazyna) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Ostrza skalpela | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Nożyczki | Fine Science Tools | 91460-11, 14007-14 | |
| Szpatułka | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| Stereotaktyczna rama operacyjna | Stoelting | 51600U | |
| Igłotrzymacz chirurgiczny | AgnTho’s | 12502-12 | |
| Pompa strzykawkowa | System pomp nowej ery | NE-4000 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidokaina) | AstraZeneca | 158543 |
Bibliografia
- Balasubramanian V. Brain power. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118:e2107022118.
- Mattson MP, Arumugam TV. Hallmarks of brain aging: adaptive and pathological modification by metabolic states. Cell Metab. 2018;27:1176-1199.
- Iliff JJ, Wang M, Liao Y, Plogg BA, Peng W, Gundersen GA, et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 2012;4. doi:10.1126/scitranslmed.3003748.
- Nedergaard M. Garbage truck of the brain. Science. 2013;340:1529-1530.
- Benveniste H, Lee H, Volkow ND. The glymphatic pathway: waste removal from the CNS via. cerebrospinal fluid transport. Neuroscientist. 2017;23:454-465.
- Mestre H, Hablitz LM, Xavier AL, Feng W, Zou W, Pu T, et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 2018;7:e40070.
- Iliff JJ, Lee H, Yu M, Feng T, Logan J, Nedergaard M, et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J Clin Invest. 2013;123:1299-1309.
- Benveniste H, Lee H, Ozturk B, Chen X, Koundal S, Vaska P, et al. Glymphatic cerebrospinal fluid and solute transport quantified by MRI and PET imaging. Neuroscience. 2021;474:63-79.
- Eide PK, Ringstad G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: a possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiol Open. 2015;4:2058460115609635.
- Ringstad G, Valnes LM, Dale AM, Pripp AH, Vatnehol SAS, Emblem KE, et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 2018;3:e121537.
- Eide PK, Ringstad G. Functional analysis of the human perivascular subarachnoid space. Nat Commun. 2024;15:2001.
- Xavier ALR, Hauglund NL, von Holstein-Rathlou S, Li Q, Sanggaard S, Lou N, et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. 2018;(135):57378.
- Gahn-Martinez D, Giannetto MJ, Chang E, Beam N, Tobin P, Plá V, et al. Chronic intraventricular cannulation for the study of glymphatic transport. eNeuro. 2025;12:ENEURO.0537-24.2025.
- Decker Y, Müller A, Proulx ST. Contrast agent clearance dynamics and diffusion in the mouse brain after ventricular administration. Adv Sci (Weinh). 2025;12:2501502.
- Zhu Y, Zhu J, Ni C, Chen A, Li L, Gao Y, et al. Impact of infusion conditions and anesthesia on CSF tracer dynamics in mouse brain. Fluids Barriers CNS. 2026;23:23.
- DeVos SL, Miller TM. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. 2013;(75):50326.
- Ding G, Chopp M, Li L, Zhang L, Davoodi-Bojd E, Li Q, et al. MRI investigation of glymphatic responses to Gd-DTPA infusion rates. J Neurosci Res. 2018;96:1876-1886.
- Stanton EH, Persson NDÅ, Gomolka RS, Lilius T, Sigurðsson B, Lee H, et al. Mapping of CSF transport using high spatiotemporal resolution dynamic contrast-enhanced MRI in mice: effect of anesthesia. Magn Reson Med. 2021;85:3326-3342.
- Berger ML, Reither H, Schmid RW, Lassmann H. Manufacture and use of fused silica cannulas for intracerebral injections in freely moving rats. J Neurosci Methods. 1989;27:225-234.
- Zhang J, Tian W, Chen J, Yu J, Zhang J, Chen J. The application of polyetheretherketone (PEEK) implants in cranioplasty. Brain Res Bull. 2019;153:143-149.
- Plá V, Bork P, Harnpramukkul A, Olveda G, Ladrón-de-Guevara A, Giannetto MJ, et al. A real-time in vivo. clearance assay for quantification of glymphatic efflux. Cell Rep. 2022;40:111320.
- Benveniste H, Lee H, Ding F, Sun Q, Al-Bizri E, Makaryus R, et al. Anesthesia with dexmedetomidine and low-dose isoflurane increases solute transport via. the glymphatic pathway in rat brain when compared with high-dose isoflurane. Anesthesiology. 2017;127:976-988.
- Chiu C, Miller MC, Caralopoulos IN, Worden MS, Brinker T, Gordon ZN, et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 2012;9:3.
- Karimy JK, Kahle KT, Kurland DB, Yu E, Gerzanich V, Simard JM. A novel method to study cerebrospinal fluid dynamics in rats. J Neurosci Methods. 2015;241:78-84.
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny