Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Niniejsze badanie przedstawia dwucentrowy schemat ambispektywny służący do pomiaru stężeń antygenu rakowo-embrionalnego, antygenu raka płaskonabłonkowego oraz antygenu węglowodanowego 125 w surowicy oraz walidacji ich łącznej wartości diagnostycznej i prognostycznej w raku płaskonabłonkowym przełyku.
Rak płaskonabłonkowy przełyku wciąż pozostaje trudny do wczesnego zdiagnozowania i dokładnej stratyfikacji przed rozpoczęciem leczenia. Konwencjonalne stadium TNM dostarcza niezbędnych informacji anatomicznych, ale nie odzwierciedla w pełni krążącej heterogeniczności biologicznej. W tym dwuośrodkowym, ambispektywnym badaniu obserwacyjnym opracowano i zewnętrznie zwalidowano łączony panel biomarkerów surowiczych obejmujący antygen karkinoembryonalny, antygen raka płaskonabłonkowego oraz antygen węglowodanowy 125 w celu różnicowania diagnostycznego i oceny ryzyka prognostycznego w raku płaskonabłonkowym przełyku. Do badania zakwalifikowano łącznie 277 uczestników ze szpitala specjalistycznego oraz centrum opieki zdrowotnej, w tym 167 pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym przełyku, 55 pacjentów z łagodnymi chorobami przełyku oraz 55 zdrowych kontroli. Kohorta ze szpitala specjalistycznego została wykorzystana do opracowania modelu i walidacji wewnętrznej, natomiast kohorta z centrum opieki zdrowotnej do walidacji zewnętrznej. Biomarkery surowicze przed leczeniem zmierzono przed rozpoczęciem terapii wstępnej, poddano transformacji logarytmicznej, zestandaryzowano przy użyciu parametrów kohorty treningowej, a następnie wprowadzono do diagnostycznego modelu regresji logistycznej oraz prognostycznego modelu proporcjonalnych hazardów Coxa. Łączny panel wykazał wyższą zdolność różnicowania diagnostycznego niż jakikolwiek pojedynczy marker, z polem pod krzywą ROC wynoszącym 0,869 w kohorcie treningowej i 0,842 w kohorcie walidacji zewnętrznej. Wyższe skumulowane obciążenie biomarkerami wiązało się z długością guza co najmniej 5 cm, chorobą w stadium pT3–4, przerzutami do węzłów chłonnych oraz stadium TNM III–IV. W analizie przeżywalności wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami niezależnie przewidywało gorszą przeżywalność całkowitą oraz przeżywalność wolną od progresji po skorygowaniu o główne czynniki kliniczno-patologiczne. Zintegrowany model prognostyczny, łączący obciążenie biomarkerami ze zmiennymi kliniczno-patologicznymi, okazał się skuteczniejszy niż samo stadium TNM, z indeksem C wynoszącym 0,792 w kohorcie treningowej i 0,761 w walidacji zewnętrznej. Wyniki te wspierają zastosowanie panelu surowiczego antygenu karkinoembryonalnego, antygenu raka płaskonabłonkowego i antygenu węglowodanowego 125 jako praktycznego, nieinwazyjnego narzędzia wspomagającego ocenę przed leczeniem i indywidualną stratyfikację ryzyka w raku płaskonabłonkowym przełyku.
Rak płaskonabłonkowy przełyku jest głównym podtypem histologicznym raka przełyku i pozostaje znacznym obciążeniem klinicznym w Azji Wschodniej, w szczególności w Chinach1. Mimo że diagnostyka endoskopowa, ocena obrazowa, chirurgia, chemioradioterapia i leczenie systemowe poprawiły opiekę kliniczną, rokowania wielu pacjentów nadal pozostają niezadowalające2. Jednym z istotnych powodów jest fakt, że choroba jest często wykrywana po tym, jak doszło już do naciekania miejscowego lub przerzutów do węzłów chłonnych3. Innym powodem jest to, że pacjenci w tym samym stadium TNM mogą nadal różnić się odpowiedzią na leczenie, ryzykiem nawrotu i przeżywalnością4. Różnice te wskazują, że samo stopniowanie anatomiczne nie pozwala w pełni opisać zmienności biologicznej raka płaskonabłonkowego przełyku.
Obecna ocena kliniczna opiera się głównie na endoskopii z biopsją, ocenie radiologicznej stopnia zaawansowania oraz pooperacyjnej ocenie patomorfologicznej. Metody te są niezbędne, jednak posiadają ograniczenia w przypadku powtarzalnego monitorowania, oceny ryzyka przed leczeniem lub szerokiego screeningu. Endoskopia jest inwazyjna i mniej odpowiednia do częstej obserwacji, natomiast tomografia komputerowa i ultrasonografia endoskopowa mogą nie wykryć subtelnej inwazji lub małych zmian przerzutowych5. Modele prognostyczne oparte na obrazowaniu i analizie molekularnej poprawiły przewidywanie ryzyka w obrębie płaskonabłonkowego raka przełyku, lecz wiele z nich wymaga specjalistycznych platform, postprocessingu obrazów, sekwencjonowania tkanek lub przepływów obliczeniowych, które nie są rutynowo dostępne we wszystkich laboratoriach klinicznych6,7. Niskokosztowe i powtarzalne podejście oparte na badaniu krwi może zatem dostarczyć użytecznych informacji uzupełniających, szczególnie gdy klinicyści potrzebują stratyfikacji ryzyka przed rozpoczęciem definitywnej terapii.
Surowicze markery nowotworowe są atrakcyjne w tym kontekście, ponieważ są rutynowo dostępne, małoinwazyjne i łatwe do powtórzenia. Antygen rakowo-płodowy odzwierciedla masę guza oraz nieprawidłowe różnicowanie komórkowe, podczas gdy antygen raka płaskonabłonkowego jest ściślej powiązany ze złośliwą transformacją nabłonka płaskiego8. Antygen węglowodanowy 125 był łączony z ogólnoustrojową aktywnością zapalną, zajęciem błon surowiczych i progresją choroby w kilku typach nowotworów złośliwych9. Markery te nie reprezentują tego samego sygnału biologicznego. Zamiast tego mogą one uchwycić nakładające się, ale odrębne wymiary masy guza, fenotypu płaskonabłonkowego, odpowiedzi ogólnoustrojowej oraz interakcji gospodarz-guz. Z tego powodu połączony panel może wykazywać lepszą skuteczność niż jakikolwiek pojedynczy marker, gdy celem jest zidentyfikowanie raka płaskonabłonkowego przełyku i oszacowanie ryzyka klinicznego10.
Poprzednie badania oceniały surowicze markery nowotworowe, wskaźniki stanu zapalnego, sygnatury obrazowe, profile molekularne oraz złożone modele prognostyczne w raku płaskonabłonkowym przełyku i powiązanych nowotworach przewodu pokarmowego11,12. Jednak wiele opublikowanych modeli koncentruje się albo na diagnostyce, albo na prognozowaniu, wykorzystuje kohorty z jednego ośrodka, nie posiada niezależnej walidacji zewnętrznej lub dostarcza ograniczonych szczegółów dotyczących transformacji markerów, doboru wartości odcięcia, kalibracji oraz powtarzalności modelu. Nowatorstwo niniejszego badania polega na opracowaniu praktycznego trójskładnikowego panelu surowiczego, wykorzystującego rutynowo oznaczany antygen rakowo-embrionalny, antygen raka płaskonabłonkowego oraz antygen węglowodanowy 125, w celu wsparcia zarówno różnicowania diagnostycznego, jak i stratyfikacji ryzyka prognostycznego w ramach jednego dwuośrodkowego schematu postępowania. Model opracowano w kohorcie szpitala trzeciego stopnia referencyjności, a następnie przetestowano bez ponownej optymalizacji w niezależnej kohorcie ośrodka lokalnego, co pozwoliło na ocenę stabilności w różnych warunkach klinicznych.
W niniejszym badaniu opracowano i zwalidowano połączony panel biomarkerów surowiczych oparty na antygenie rakowo-embrionalnym, antygenie raka kolistokomórkowego oraz antygenie węglowodanowym 125. Analiza realizowała dwa powiązane cele. Pierwszym z nich była ocena, czy połączony panel poprawia dyskryminację diagnostyczną pomiędzy rakiem kolistokomórkowym przełyku a kontrolą niemalignologiczną w porównaniu z pojedynczymi markerami surowiczymi. Drugim celem było ustalenie, czy przedlecznicze obciążenie połączonymi biomarkerami dostarcza dodatkowych informacji prognostycznych ponad konwencjonalne zmienne kliniczno-patologiczne i stopień zaawansowania TNM. Taka struktura pozwoliła ocenić, czy rutynowo dostępny panel biomarkerów surowiczych może służyć jako nieinwazyjne uzupełnienie diagnozy patomorfologicznej, oceny obrazowej i stopnia zaawansowania anatomicznego w przedleczniczej ocenie klinicznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Niniejsze badanie z udziałem ludzi, obejmujące dokumentację kliniczną oraz próbki surowicy, zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i wymogami instytucjonalnymi dotyczącymi badań z udziałem ludzi13. Protokół badania został przeanalizowany i zatwierdzony przez Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine pod numerem zatwierdzenia CJ28J12-45. W przypadku retrospektywnie zebranych zanonimizowanych danych klinicznych i pozostałych próbek surowicy, wymóg uzyskania dodatkowej pisemnej zgody świadomej został zniesiony zgodnie z instytucjonalnymi regulacjami etycznymi. W przypadku próbek pobranych prospektywnie, przed włączeniem do badania uzyskano pisemną zgodę świadomą. Wszystkie informacje o uczestnikach oraz próbki surowicy zostały zanonimizowane przed analizą. Do łączenia danych wykorzystano identyfikatory badania; w zbiorze danych analitycznych nie zawarto żadnych informacji umożliwiających identyfikację osób.
Projekt badania i przydział do kohort
W tym dwuczestniczącym, ambispektywnym badaniu obserwacyjnym oceniono wartość diagnostyczną i prognostyczną połączonego panelu biomarkerów surowiczych obejmującego antygen rakowo-embrionalny (CEA), antygen raka płaskonabłonkowego (SCC-Ag) oraz antygen węglowodanowy 125 (CA125) w raku płaskonabłonkowym przełyku (ESCC). Dane retrospektywne uzyskano z kwalifikujących się dokumentacji klinicznych oraz pozostałych próbek surowicy pobranych przed leczeniem, natomiast rekrutację prospektywną wykorzystano do pobrania dodatkowych próbek surowicy przed leczeniem oraz do przeprowadzenia pełnego nadzoru w ramach tego samego schematu badania. Uczestnicy zostali zrekrutowani z jednego szpitala specjalistycznego oraz jednego ośrodka opieki zdrowotnej w społeczności lokalnej w okresie od stycznia 2021 do grudnia 2024 roku, a nadzór kontynuowano do 31 grudnia 2025 roku. Ośrodek A, będący szpitalem specjalistycznym, posłużył jako kohorta treningowa do opracowania modelu, szacowania współczynników, wyboru wartości odcięcia oraz walidacji wewnętrznej. Ośrodek B, będący ośrodkiem opieki zdrowotnej w społeczności lokalnej, posłużył jako kohorta walidacji zewnętrznej. Badanie zostało opisane zgodnie z wytycznymi Transparent Reporting of a multivariable prediction model for Individual Prognosis or Diagnosis (TRIPOD)14.
W badaniu wzięło udział łącznie 277 uczestników, w tym 194 z Ośrodka A i 83 z Ośrodka B. Kohorta treningowa obejmowała 114 pacjentów z ESCC, 40 osób z łagodnymi chorobami przełyku (grupa kontrolna) oraz 40 zdrowych ochotników (grupa kontrolna). Kohorta walidacji zewnętrznej obejmowała 53 pacjentów z ESCC, 15 osób z łagodnymi chorobami przełyku (grupa kontrolna) oraz 15 zdrowych ochotników (grupa kontrolna). Zamiast losowego podziału zastosowano alokację opartą na ośrodkach, aby ograniczyć wyciek informacji i przetestować stabilność modelu w niezależnym środowisku klinicznym. Analiza diagnostyczna polegała na porównaniu stężeń CEA, SCC-Ag oraz CA125 w surowicy u pacjentów z ESCC, pacjentów z łagodnymi chorobami przełyku oraz zdrowych osób z grupy kontrolnej. Analiza prognostyczna została ograniczona do pacjentów z ESCC i miała na celu ocenę, czy połączone obciążenie biomarkerami poprawia stratyfikację ryzyka w odniesieniu do przeżycia całkowitego (OS) oraz przeżycia wolnego od progresji (PFS). Schemat badania, przesiew uczestników, alokacja kohort, procedura analizy biomarkerów w surowicy, opracowanie modelu diagnostycznego, walidacja zewnętrzna oraz porównanie modeli prognostycznych zostały przedstawione na Rysunku 1.
Przepływ uczestników obejmował przesiew, wykluczenia, grupowanie diagnostyczne oraz przydział do ośrodków. Przesiewowi poddano łącznie 326 osób. Wykluczono 49 osób, w tym 12 z powodu leczenia przeciwnowotworowego przed pobraniem krwi, 8 z powodu innego pierwotnego nowotworu złośliwego, 9 z powodu ciężkiej infekcji, choroby autoimmunologicznej lub niekontrolowanych chorób współistniejących, które mogłyby wpłynąć na surowicze markery nowotworowe, 11 z powodu hemolizy, lipemii, interferencji żółtaczkowej, niewystarczającej objętości surowicy lub przedłużonego odstępu czasu przetwarzania oraz 9 osób z powodu braku kluczowych danych klinicznych, patologicznych lub danych z obserwacji. Końcowa populacja analityczna składała się z 277 uczestników: 167 pacjentów z ESCC, 55 osób z łagodnymi schorzeniami przełyku (grupa kontrolna) oraz 55 zdrowych osób (grupa kontrolna).
Uzasadnienie wielkości próby
Wielkość próby została określona na podstawie kolejnej dostępności kwalifikujących się uczestników, próbek surowicy przed leczeniem oraz informacji z obserwacji w zdefiniowanym okresie badania. Model diagnostyczny wykorzystywał trzy ciągłe biomarkery surowicze jako potencjalne predyktory. W kohorcie treningowej dostępnych było 114 przypadków ESCC i 80 kontroli nie-ESCC, co odpowiadało 38,0 przypadkom ESCC i 26,7 kontrolom nie-ESCC na każdy potencjalny biomarker predykcyjny. Wspierało to zastosowanie niskowymiarowej regresji logistycznej i zmniejszyło ryzyko nadmiernego dopasowania. Zewnętrzna kohorta walidacyjna obejmowała 53 przypadki ESCC i 30 kontroli nie-ESCC i została wykorzystana wyłącznie do walidacji, bez ponownej estymacji współczynników. Uzasadnienie wielkości próby było zgodne z aktualnymi zasadami tworzenia modeli predykcyjnych, które kładą nacisk na częstotliwość występowania zdarzeń, liczbę parametrów potencjalnych predyktorów, przewidywaną wydajność modelu oraz niezależną walidację, a nie na losowy podział danych15.
Rekrutacja uczestników, kryteria kwalifikacji i gromadzenie danych
Uczestnicy byli rekrutowani w sposób ciągły przez cały okres badania. W Ośrodku A pacjenci z ESCC zostali zakwalifikowani z oddziałów chirurgii klatki piersiowej, gastroenterologii oraz onkologii. W Ośrodku B pacjentów z ESCC identyfikowano poprzez badania przesiewowe w społeczności, dokumentację obserwacyjną lub ścieżki skierowań; włączano ich do badania wyłącznie w przypadku dostępności potwierdzenia patomorfologicznego oraz próbek surowicy pobranych przed leczeniem. Kontrolę z łagodnymi schorzeniami przełyku stanowiły osoby, u których przeprowadzono gastroskopię z powodu dysfagii, objawów refluksu lub podejrzenia nieprawidłowości w przełyku, a wyniki badań patomorfologicznych nie wykazały zmian nowotworowych. Zdrową grupę kontrolną wybrano spośród osób poddawanych rutynowym badaniom profilaktycznym w tym samym okresie, które nie miały w wywiadzie nowotworów, aktywnych infekcji, ciężkiej niewydolności wątroby lub nerek, a badania obrazowe lub endoskopowe nie wykazały zmian rozrostowych w przełyku.
Pacjenci z ESCC kwalifikowali się do badania, jeśli u nich potwierdzono pierwotnego ESCC za pomocą biopsji gastroskopowej lub badania patomorfologicznego po operacji, nie otrzymali leczenia przeciwnowotworowego przed pobraniem krwi i dysponowano ich pełnymi danymi klinicznymi wyjściowymi, dokumentacją patologiczną oraz próbkami surowicy sprzed rozpoczęcia leczenia. Uczestników wykluczono, jeśli wystąpił u nich inny pierwotny nowotwór złośliwy, zastosowano leczenie przeciwnowotworowe przed pobraniem krwi, stwierdzono ciężką ostrą infekcję, aktywną chorobę autoimmunologiczną, niekontrolowane choroby współistniejące mogące wpływać na poziom markerów nowotworowych w surowicy, widoczną hemolizę, lipemię, interferencję żółtaczkową, niewystarczającą objętość surowicy, brak kluczowych zmiennych klinicznych lub brak dostępnych danych z obserwacji. Analiza prognostyczna została ograniczona do pacjentów z ESCC z dostępnym stopniem zaawansowania TNM (tumor-node-metastasis) oraz mierzalnymi wynikami przeżycia lub progresji. Pacjenci z okresem obserwacji krótszym niż 6 miesięcy zostali uwzględnieni, jeśli w tym czasie nastąpił zgon lub progresja choroby.
Zmienne wyjściowe obejmowały wiek, płeć, historię palenia tytoniu, historię spożycia alkoholu, wskaźnik masy ciała, ośrodek uczestniczący, grupę diagnostyczną, typ zmiany oraz poziomy w surowicy CEA, SCC-Ag i CA125. W przypadku pacjentów z ESCC dodatkowe zmienne obejmowały lokalizację guza, długość guza, stopień zróżnicowania histologicznego, głębokość nacieku, stan węzłów chłonnych, stadium TNM, naciek naczyniowo-limfatyczny, pierwotną metodę leczenia, nawrotowość, progresję, status przeżycia oraz datę ostatniej wizyty kontrolnej. Historię palenia tytoniu zdefiniowano jako obecne palenie lub wcześniejsze regularne palenie co najmniej 100 papierosów w ciągu całego życia. Historię spożycia alkoholu zdefiniowano jako spożywanie alkoholu co najmniej raz w tygodniu przez ponad 6 miesięcy. Stadium TNM określono zgodnie z ósmą edycją systemu klasyfikacji raka przełyku American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control16. Preparaty histopatologiczne z przypadków ESCC i zmian łagodnych zostały niezależnie ocenione przez dwóch doświadczonych patomorfologów, a wszelkie rozbieżności rozstrzygał trzeci patomorfolog.
Dwoje przeszkolonych badaczy niezależnie wyodrębniło informacje kliniczne z elektronicznej dokumentacji medycznej, raportów patomorfologicznych, systemów informacji laboratoryjnej, zapisów leczenia, dokumentacji obserwacyjnej oraz aktów zgonu, korzystając z wcześniej zdefiniowanego słownika danych. Rozbieżności rozstrzygano poprzez weryfikację oryginalnej dokumentacji, a w razie potrzeby ostateczną decyzję podejmował trzeci badacz. Lokalizację guza sklasyfikowano jako górny, środkowy lub dolny odcinek przełyku w obrębie klatki piersiowej. Stopień zróżnicowania histologicznego sklasyfikowano jako wysoki, umiarkowany lub niski. Jednostki zmiennych ciągłych zostały ustandaryzowane w obu uczestniczących ośrodkach przed przeprowadzeniem analizy.
Pobieranie krwi, opracowanie surowicy i pomiar biomarkerów
Wszystkie próbki krwi pobrano przed rozpoczęciem leczenia, w ciągu 7 dni od potwierdzenia patomorfologicznego oraz co najmniej 3 dni przed wdrożeniem terapii. Próbki krwi żylnej z żyły obwodowej o objętości 5–8 mL pobierano między godziną 7:00 a 9:00 rano po nocnym poście, wykorzystując probówki z separatorem surowicy. Pobranie próbek odroczono, jeśli uczestnik otrzymał transfuzję krwi, wlew albuminy w dużej objętości lub przeszedł zabieg inwazyjny w ciągu 72 h przed pobraniem. Próbki pozostawiono do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 min, a następnie wirowano przy 1,500 × g przez 10 min. Surowicę oddzielono i podzielono na 3–5 probówek z kodem kreskowym, w ilości 300–500 µL na alikwot. Alikwoty przechowywano w temperaturze −80°C do czasu przeprowadzenia badań; żadna próbka nie została poddana więcej niż jednemu cyklowi zamrażania i rozmrażania. Wykluczono próbki z widoczną hemolizą, lipemią, interferencją żółtaczkową, niewystarczającą objętością lub w przypadku, gdy odstęp między pobraniem a zamrożeniem przekraczał 2 h.
Poziomy CEA, SCC-Ag i CA125 w surowicy zmierzono za pomocą zautomatyzowanych systemów immunochemicznych zgodnie z instrukcjami producentów. Alikwoty surowicy rozmrażano w temperaturze 4°C przed badaniem, delikatnie mieszano i analizowano w jednej serii, o ile było to możliwe. W przypadku konieczności przeprowadzania badań partiami, kolejność próbek była ustalana w sposób zapobiegający systematycznemu grupowaniu według stanu choroby, ośrodka, stopnia patologicznego lub wyniku obserwacji. Próbki przekraczające zakres pomiaru analitycznego rozcieńczano i badano ponownie zgodnie z instrukcjami do odczynników. Personel laboratoryjny nie był informowany o grupie uczestników, stopniu patologicznym, statusie leczenia ani wyniku obserwacji.
Progi kliniczne wynosiły 5,0 ng/mL dla CEA, 1,5 ng/mL dla SCC-Ag oraz 35 U/mL dla CA125, zgodnie z lokalnymi standardami laboratoryjnymi i zakresami referencyjnymi producentów. Progi te zostały wykorzystane do zdefiniowania podwyższonego poziomu markerów oraz wysokiego skumulowanego obciążenia biomarkerami na potrzeby analiz korelacji kliniczno-patologicznych i stratyfikacji przeżycia. W celu klasyfikacji diagnostycznej, punkty odcięcia oparte na danych zostały wyznaczone wyłącznie w kohorcie treningowej przy użyciu indeksu Youdena, a następnie zastosowane bez zmian w zewnętrznej kohorcie walidacyjnej. Przed wykonaniem testów przeprowadzono kalibrację aparatury oraz wewnętrzną kontrolę jakości. W każdym dniu badań uwzględniano kontrole niskiego i wysokiego poziomu, a testy kontynuowano tylko wtedy, gdy wyniki kontroli jakości mieściły się w akceptowalnym zakresie.
Powtarzalność międzyanalizami i międzyośrodkami została oceniona przed końcową analizą modelu z wykorzystaniem zaślepionych alikwotów surowicy pomostowej oraz rutynowych materiałów do kontroli jakości. Zestaw pomostowy składający się z 30 zaślepionych alikwotów surowicy został przetestowany w dwóch schematach pracy laboratoryjnej. Współczynniki zmienności międzyośrodkami wyniosły 4,8% dla CEA, 5,6% dla SCC-Ag i 5,1% dla CA125. Odpowiadające im współczynniki korelacji wewnątrzklasowej wyniosły 0,94 dla CEA, 0,92 dla SCC-Ag i 0,93 dla CA125. Nie przeprowadzono rekalibracji analiz specyficznych dla ośrodków, ponieważ żadne systematyczne odchylenie nie przekroczyło zdefiniowanego zakresu kontroli jakości laboratorium. Końcowe wartości biomarkerów zostały zharmonizowane poprzez standaryzację jednostek oraz statystyczną standaryzację opartą na kohorcie treningowej przed konstrukcją modelu.
Zintegrowana definicja biomarkerów i konstrukcja modelu
Zestaw połączonych biomarkerów surowiczych składał się z CEA, SCC-Ag oraz CA125. Do analizy korelacji kliniczno-patologicznych i stratyfikacji przeżywalności metodą Kaplana-Meiera każdy marker sklasyfikowano jako podwyższony lub niepodwyższony zgodnie z predefiniowanym progiem klinicznym. Wysokie obciążenie połączonymi biomarkerami zdefiniowano jako podwyższenie co najmniej dwóch z trzech markerów. W celu modelowania diagnostycznego i prognostycznego trzy biomarkery zachowano jako zmienne ciągłe, przekształcone za pomocą logarytmu naturalnego i zestandaryzowane przy użyciu średniej oraz odchylenia standardowego z kohorty treningowej. Te same parametry przekształcenia zastosowano do zewnętrznej kohorty walidacyjnej.
Znormalizowane biomarkery poddane transformacji logarytmicznej obliczono przy użyciu następujących parametrów kohorty treningowej:
zlnCEA = (lnCEA - 1.42)/0.71
zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0.28)/0.57
zlnCA125 = (lnCA125 - 3.05)/0.62
Kombinowany panel diagnostyczny został opracowany przy użyciu wieloczynnikowej regresji logistycznej w kohorcie treningowej. Diagnostyczny predyktor liniowy obliczono w następujący sposób:
LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag+0,42 × zlnCA125
Indywidualne prawdopodobieństwo wystąpienia ESCC obliczono w następujący sposób:
PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)
Optymalny punkt odcięcia diagnostycznego dla panelu połączonego wyniósł 0.57; został on wybrany w kohorcie treningowej przy użyciu indeksu Youdena i zastosowany bez zmian w walidacji zewnętrznej.
Wynik prognostycznego biomarkera opracowano z wykorzystaniem modelu proporcjonalnych hazardów Coxa. Jako punkt odniesienia dla stopnia zaawansowania anatomicznego wykorzystano model oparty wyłącznie na stopniu TNM. Model biomarkera oparto na skumulowanym obciążeniu biomarkerami. Model kliniczno-patologiczny uwzględniał wiek, długość guza, stopień zróżnicowania histologicznego, stopień pT, stan węzłów chłonnych oraz początkową metodę leczenia. Model zintegrowany uzupełnił model kliniczno-patologiczny o wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami. Dla OS obliczono zintegrowany liniowy predyktor prognostyczny w następujący sposób:
LPOS = 0,33 × wiek ≥65 lat +0,36 × długość guza ≥5cm + 0,25 × słabe zróżnicowanie + 0,31 × pT3
- 4stopień + 0,66 × przerzuty do węzłów chłonnych
-0.58 × leczenie oparte na chirurgii radykalnej
+0,81 × wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami
W przypadku PFS zintegrowany liniowy predyktor prognostyczny obliczono w następujący sposób:
LPPFS = 0,27 × wiek ≥ 65lat + 0,31 × długość guza ≥ 5cm + 0,24 × słabe różnicowanie + 0,25 × pT3
-4stadium + 0,55 × przerzuty do węzłów chłonnych
- 0,46 × leczenie oparte na chirurgii radykalnej
+0,71 × wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami
Wszystkie zmienne binarne w równaniach prognostycznych zakodowano jako 1 w przypadku ich wystąpienia i 0 w przypadku ich braku. Wszystkie współczynniki, parametry standaryzacji oraz wartości progowe zostały oszacowane w kohorcie treningowej i zastosowane bezpośrednio do zewnętrznej kohorty walidacyjnej bez ponownej optymalizacji.
Punkty końcowe diagnostyczne i prognostyczne
Jako referencyjny standard diagnostyczny zastosowano diagnozę patomorfologiczną. Głównym punktem końcowym diagnostyki była dyskryminacja między ESCC a grupami kontrolnymi non-ESCC, obejmującymi łagodne choroby przełyku oraz zdrowych ochotników. Wtórne punkty końcowe diagnostyki obejmowały dyskryminację między ESCC a łagodnymi chorobami przełyku, ESCC a zdrowymi ochotnikami oraz wczesnym stadium ESCC a kontrolami niezłośliwymi. Wczesne stadium ESCC zdefiniowano jako chorobę w stopniu TNM I–II. Skuteczność diagnostyczną oceniono za pomocą krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), pola pod krzywą (AUC), czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej, ujemnej wartości predykcyjnej, dokładności, wyniku F1, krzywych precyzji-przypomnienia, krzywych kalibracji, wyników Briera, punktów przecięcia kalibracji, nachyleń kalibracji oraz analizy krzywej decyzyjnej.
Analizę prognostyczną przeprowadzono wyłącznie u pacjentów z ESCC. Pierwszorzędowym punktem końcowym analizy prognostycznej był OS, zdefiniowany jako odstęp czasu od daty rozpoczęcia pierwszego definitywnego leczenia przeciwnowotworowego do zgonu z jakiejkolwiek przyczyny. Drugorzędowym punktem końcowym analizy prognostycznej był PFS, zdefiniowany jako odstęp czasu od rozpoczęcia pierwszego leczenia do udokumentowanej progresji choroby, nawrotu lub zgonu. W przypadku pacjentów poddanych radykalnej operacji, nawrót miejscowy, przerzuty odległe lub zgon z powodu nowotworu uznawano za zdarzenie PFS, jeśli po operacji nie stwierdzono zmian resztkowych. W przypadku pacjentów otrzymujących definitywną chemioradioterapię lub leczenie paliatywne, progresję określano na podstawie wyników badań obrazowych, oceny endoskopowej oraz oceny klinicznej.
Dane z obserwacji pozyskiwano podczas wizyt ambulatoryjnych, na podstawie dokumentacji szpitalnej, zapisów z obserwacji środowiskowej, dokumentacji skierowań oraz kontaktów telefonicznych. Pacjentów monitorowano co 3 miesiące w ciągu pierwszych 2 lat po leczeniu, co 6 miesięcy od 3. do 5. roku, a następnie corocznie. Pacjentów, u których do daty końcowej obserwacji nie wystąpił zgon, nawrót ani progresja, cenzurowano w dacie ostatniego potwierdzonego kontaktu. Zdarzenia końcowe były niezależnie weryfikowane przez dwóch badaczy. W przypadku rozbieżności w datach zdarzeń między różnymi źródłami, w celu ustalenia ostatecznej daty zdarzenia sprawdzano raporty z badań obrazowych, karty wypisowe, raporty endoskopowe, dokumentację skierowań oraz akty zgonu. Datą graniczną obserwacji dla obu uczestniczących ośrodków był 31 grudnia 2025 r.
Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programów R 4.3.2 oraz SPSS 27.0. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe lub mediana (rozstęp międzykwartylny), w zależności od rozkładu. Zmienne kategoryczne przedstawiono w formie liczebności i procentów. Porównania międzygrupowe przeprowadzono za pomocą testu t dla prób niezależnych, testu U Manna–Whitneya, jednoczynnikowej analizy wariancji, testu Kruskala–Wallisa, testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera, w zależności od potrzeb. Przed zbudowaniem modelu oceniono brakujące dane. Zgodnie z predefiniowanymi kryteriami kwalifikacji wykluczono uczestników, u których brakowało kluczowych danych dotyczących statusu diagnostycznego, wartości biomarkerów przed leczeniem, stopnia TNM lub danych o przeżyciu/progresji. W przypadku niekluczowych współzmiennych z odsetkiem braków poniżej 5.0% zastosowano wielokrotną imputację za pomocą łańcuchowych równań z wykorzystaniem 20 imputowanych zbiorów danych i 20 iteracji17. Modele imputacji obejmowały grupę diagnostyczną, ośrodek, wiek, płeć, historię palenia tytoniu, spożycie alkoholu, wartości biomarkerów, stopień TNM, metodę leczenia, status OS, status PFS oraz czas obserwacji. Analizy przypadków kompletnych przeprowadzono jako analizy wrażliwości.
Model diagnostyczny opracowano w kohorcie treningowej. Do obliczenia pola pod krzywą, czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej, ujemnej wartości predykcyjnej, dokładności oraz wyniku F1 wykorzystano krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Pola pod krzywymi porównano za pomocą testu DeLonga18. Jako uzupełniającą ocenę diagnostyczną zastosowano krzywe precyzji-pełności (precision-recall). Kalibrację oceniono za pomocą krzywych kalibracyjnych, wyników Briera, punktów przecięcia oraz nachyleń kalibracji. Użyteczność kliniczną oceniono za pomocą analizy krzywych decyzyjnych19. Walidację wewnętrzną przeprowadzono z wykorzystaniem 1 000 prób bootstrapowych w celu oszacowania dyskryminacji i kalibracji skorygowanych o optymizm. Walidację zewnętrzną przeprowadzono poprzez bezpośrednie zastosowanie równania z kohorty treningowej, parametrów standaryzacji oraz wartości odcięcia do Ośrodka B bez ponownego dopasowania modelu.
Do analizy prognostycznej wygenerowano krzywe Kaplana-Meiera w celu porównania OS i PFS pomiędzy grupami obciążonymi biomarkerami, a do oceny różnic w przeżywalności zastosowano test log-rank. Do oszacowania współczynników hazardu i 95% przedziałów ufności wykorzystano regresję proporcjonalnego hazardu Coxa. Do modeli wieloczynnikowych włączono zmienne o znaczeniu klinicznym oraz zmienne powiązane z wynikami w analizie jednoczynnikowej. Wydajność modelu oceniono za pomocą indeksu C Harrella, zależnych od czasu krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), krzywych kalibracyjnych, wyników Briera oraz analizy krzywej decyzyjnej20. Kalibrację prognostyczną oceniano po 1, 3 i 5 latach. Założenie proporcjonalności hazardu zweryfikowano za pomocą reszt Schoenfelda i wykresów log-minus-log przeżywalności21. Wartości P w globalnym teście Schoenfelda wynosiły 0,42 dla modelu OS i 0,37 dla modelu PFS. Przed ostateczną interpretacją modelu oceniono współliniowość za pomocą czynników inflacji wariancji (VIF); wszystkie zmienne kandydujące w końcowych modelach diagnostycznych i prognostycznych miały współczynniki VIF poniżej 2,1. Przyrostową wartość prognostyczną ponad stopień TNM i konwencjonalne modele kliniczno-patologiczne oceniono za pomocą wskaźników net reclassification improvement oraz integrated discrimination improvement. Parametry modelu oszacowane w kohorcie treningowej zastosowano do zewnętrznej kohorty walidacyjnej bez ponownego dopasowania22. Wszystkie testy były dwustronne, a wartość P < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przepływ uczestników i powtarzalność testu
Przesiewowo przebadano łącznie 326 osób, z czego 49 wykluczono: 12 osób otrzymało leczenie przeciwnowotworowe przed pobraniem krwi, 8 osób miało inny nowotwór pierwotny, 9 osób cierpiało na ciężką infekcję, chorobę autoimmunologiczną lub niekontrolowane choroby współistniejące, które mogły wpłynąć na poziom markerów nowotworowych w surowicy, 1 osób wykazywało hemolizę, lipemię, interferencję z żółtaczką, miało niewystarczającą objętoś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu przeprowadzonym w dwóch ośrodkach opracowano i zwalidowano zewnętrznie łączony panel biomarkerów surowiczych obejmujący CEA, SCC-Ag oraz CA125 w celu oceny diagnostycznej i prognostycznej w ESCC. Panel łączony wykazał wyższą skuteczność niż każdy z poszczególnych biomarkerów w różnicowaniu ESCC od kontroli nieзлоśliwych i zachował akceptowalną zdolność dyskryminacji w kohorcie walidacji zewnętrznej. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi badaniami nad ESCC, które wykazały, że surowicze markery nowotw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Autorzy dziękują personelowi Wydziału Medycyny Laboratoryjnej w Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, szpitalu klinicznym Nanjing University of Chinese Medicine oraz Nanhu Community Health Service Center w Nanjing za wsparcie w zakresie pobierania próbek, badań laboratoryjnych i zarządzania danymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Access CEA Calibrators | Beckman Coulter | 33205 | Kalibracja do oznaczania CEA w surowicy |
| Access CEA Quality Control | Beckman Coulter | 33029 | Codzienna wewnętrzna kontrola jakości dla oznaczania CEA w surowicy |
| Access CEA Reagent Pack | Beckman Coulter | 33200 | Pomiar CEA w surowicy na systemie do analiz immunoenzymatycznych UniCel DxI 800 Access |
| Mikropipeta regulowana, 100–1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Aliquotowanie surowicy po wirowaniu |
| ARCHITECT CA 125 II Calibrators | Abbott Diagnostics | 02K4502 | Kalibracja do oznaczania CA125 w surowicy |
| ARCHITECT CA 125 II Controls | Abbott Diagnostics | 02K4511 | Codzienna wewnętrzna kontrola jakości dla oznaczania CA125 w surowicy |
| ARCHITECT CA 125 II Reagent Kit | Abbott Diagnostics | 02K4529 | Pomiar CA125 w surowicy na analizatorze immunoenzymatycznym ARCHITECT i2000SR |
| ARCHITECT i2000SR Immunoassay Analyzer | Abbott Diagnostics | i2000SR | Zautomatyzowana platforma do mikrocząsteczkowych analiz immunoenzymatycznych z chemiluminescencją do oznaczania SCC-Ag i CA125 |
| ARCHITECT SCC Calibrator | Abbott Diagnostics | 8D1801 | Kalibracja do oznaczania SCC-Ag w surowicy |
| ARCHITECT SCC Controls | Abbott Diagnostics | 8D1810 | Codzienna wewnętrzna kontrola jakości dla oznaczania SCC-Ag w surowicy |
| ARCHITECT SCC Reagent Kit | Abbott Diagnostics | 8D1828 | Pomiar SCC-Ag w surowicy na analizatorze immunoenzymatycznym ARCHITECT i2000SR |
| Drukarka etykiet kodów kreskowych | Brady | BMP51 | Oznakowanie kodami kreskowymi alikwotów surowicy i probówek kriogenicznych |
| Igła do pobierania krwi | BD Biosciences | 367286 | Obwodowe pobieranie krwi żylnej |
| Pojemnik do przechowywania kriogenicznego | Corning | 431131 | Zorganizowane przechowywanie zamrożonych alikwotów surowicy |
| Probówka kriogeniczna, 2,0 mL, gwint zewnętrzny, samostojąca | Corning | 430659 | Przechowywanie alikwotów surowicy z etykietami kodów kreskowych w temperaturze −80 °C |
| Formularz ekstrakcji danych i zdefiniowany słownik danych | Zespół badawczy | Not applicable | Ustandaryzowana ekstrakcja zmiennych klinicznych, patologicznych, laboratoryjnych oraz danych z obserwacji |
| Pakiet dcurves | R package | Version 0.4.0 | Analiza krzywych decyzyjnych i szacowanie klinicznej korzyści netto |
| System elektronicznej dokumentacji medycznej | Szpitale uczestniczące | Not applicable | Ekstrakcja danych demograficznych, klinicznych, dotyczących leczenia i obserwacji |
| Końcówki do pipet z filtrem, 100–1000 µL | Eppendorf | 30073594 | Aliquotowanie surowicy z kontrolą zanieczyszczeń |
| Pakiet ggplot2 | R package | Version 3.5.1 | Wizualizacja statystyczna i przygotowanie rycin |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 27.0 | Porównania bazowe i uzupełniająca weryfikacja statystyczna |
| Laboratoryjny system zarządzania informacją (LIMS) | Laboratorium szpitala uczestniczącego | Not applicable | Pobieranie i łączenie zapisów z testów biomarkerów w surowicy |
| Pakiet mice | R package | Version 3.16.0 | Wielokrotna imputacja za pomocą równań łańcuchowych |
| Pakiet nricens | R package | Version 1.6 | Analiza poprawy reklasyfikacji netto (NRI) |
| System raportowania patomorfologicznego | Szpitale uczestniczące | Not applicable | Potwierdzenie diagnozy ESCC, zmian łagodnych, cech guza oraz zmiennych związanych ze stopniem zaawansowania |
| Pakiet pROC | R package | Version 1.18.5 | Analiza krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) i porównanie metodą DeLonga |
| Oprogramowanie statystyczne R | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.2 | Analiza statystyczna, konstrukcja i walidacja modeli oraz generowanie rycin |
| Wirówka chłodząca | Eppendorf | 5810 R | Rozdział surowicy przez wirowanie przy 1,500 x g przez 10 min |
| Pakiet rms | R package | Version 6.8-1 | Analiza kalibracji, konstrukcja nomogramów i wsparcie dla modeli regresji |
| Probówka do pobierania krwi z żelem rozdzielającym, 5 mL | BD Biosciences | 367955 | Pobieranie obwodowej krwi żylnej na czczo do oznaczania biomarkerów w surowicy |
| Pakiet survival | R package | Version 3.5-7 | Regresja proporcjonalnego hazardu Coxa i analiza przeżycia |
| Pakiet survminer | R package | Version 0.4.9 | Wizualizacja krzywych Kaplana–Meiera |
| Formularz rejestracji telefonicznej obserwacji | Zespół badawczy | Not applicable | Gromadzenie i weryfikacja informacji o przeżyciu, nawrocie, progresji i ostatnim kontakcie |
| Pakiet timeROC | R package | Version 0.4 | Analiza zależnej od czasu krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) |
| Zamrażarka ultra-niskotemperaturowa | Thermo Fisher Scientific | TSX60086A | Przechowywanie alikwotów surowicy w temperaturze −80 °C |
| UniCel DxI 800 Access Immunoassay System | Beckman Coulter | DxI 800 | Zautomatyzowana platforma do analiz immunoenzymatycznych z chemiluminescencją do oznaczania CEA w surowicy |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.