Niniejsze badanie przedstawia dwucentrowy schemat ambispektywny służący do pomiaru stężeń antygenu rakowo-embrionalnego, antygenu raka płaskonabłonkowego oraz antygenu węglowodanowego 125 w surowicy oraz walidacji ich łącznej wartości diagnostycznej i prognostycznej w raku płaskonabłonkowym przełyku.
Artykuł badawczy
Zintegrowany panel biomarkerów surowiczych do oceny diagnostycznej i prognostycznej w raku płaskonabłonkowym przełyku
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak płaskonabłonkowy przełyku wciąż pozostaje trudny do wczesnego zdiagnozowania i dokładnej stratyfikacji przed rozpoczęciem leczenia. Konwencjonalne stadium TNM dostarcza niezbędnych informacji anatomicznych, ale nie odzwierciedla w pełni krążącej heterogeniczności biologicznej. W tym dwuośrodkowym, ambispektywnym badaniu obserwacyjnym opracowano i zewnętrznie zwalidowano łączony panel biomarkerów surowiczych obejmujący antygen karkinoembryonalny, antygen raka płaskonabłonkowego oraz antygen węglowodanowy 125 w celu różnicowania diagnostycznego i oceny ryzyka prognostycznego w raku płaskonabłonkowym przełyku. Do badania zakwalifikowano łącznie 277 uczestników ze szpitala specjalistycznego oraz centrum opieki zdrowotnej, w tym 167 pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym przełyku, 55 pacjentów z łagodnymi chorobami przełyku oraz 55 zdrowych kontroli. Kohorta ze szpitala specjalistycznego została wykorzystana do opracowania modelu i walidacji wewnętrznej, natomiast kohorta z centrum opieki zdrowotnej do walidacji zewnętrznej. Biomarkery surowicze przed leczeniem zmierzono przed rozpoczęciem terapii wstępnej, poddano transformacji logarytmicznej, zestandaryzowano przy użyciu parametrów kohorty treningowej, a następnie wprowadzono do diagnostycznego modelu regresji logistycznej oraz prognostycznego modelu proporcjonalnych hazardów Coxa. Łączny panel wykazał wyższą zdolność różnicowania diagnostycznego niż jakikolwiek pojedynczy marker, z polem pod krzywą ROC wynoszącym 0,869 w kohorcie treningowej i 0,842 w kohorcie walidacji zewnętrznej. Wyższe skumulowane obciążenie biomarkerami wiązało się z długością guza co najmniej 5 cm, chorobą w stadium pT3–4, przerzutami do węzłów chłonnych oraz stadium TNM III–IV. W analizie przeżywalności wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami niezależnie przewidywało gorszą przeżywalność całkowitą oraz przeżywalność wolną od progresji po skorygowaniu o główne czynniki kliniczno-patologiczne. Zintegrowany model prognostyczny, łączący obciążenie biomarkerami ze zmiennymi kliniczno-patologicznymi, okazał się skuteczniejszy niż samo stadium TNM, z indeksem C wynoszącym 0,792 w kohorcie treningowej i 0,761 w walidacji zewnętrznej. Wyniki te wspierają zastosowanie panelu surowiczego antygenu karkinoembryonalnego, antygenu raka płaskonabłonkowego i antygenu węglowodanowego 125 jako praktycznego, nieinwazyjnego narzędzia wspomagającego ocenę przed leczeniem i indywidualną stratyfikację ryzyka w raku płaskonabłonkowym przełyku.
Wprowadzenie
Rak płaskonabłonkowy przełyku jest głównym podtypem histologicznym raka przełyku i pozostaje znacznym obciążeniem klinicznym w Azji Wschodniej, w szczególności w Chinach1. Mimo że diagnostyka endoskopowa, ocena obrazowa, chirurgia, chemioradioterapia i leczenie systemowe poprawiły opiekę kliniczną, rokowania wielu pacjentów nadal pozostają niezadowalające2. Jednym z istotnych powodów jest fakt, że choroba jest często wykrywana po tym, jak doszło już do naciekania miejscowego lub przerzutów do węzłów chłonnych3. Innym powodem jest to, że pacjenci w tym samym stadium TNM mogą nadal różnić się odpowiedzią na leczenie, ryzykiem nawrotu i przeżywalnością4. Różnice te wskazują, że samo stopniowanie anatomiczne nie pozwala w pełni opisać zmienności biologicznej raka płaskonabłonkowego przełyku.
Obecna ocena kliniczna opiera się głównie na endoskopii z biopsją, ocenie radiologicznej stopnia zaawansowania oraz pooperacyjnej ocenie patomorfologicznej. Metody te są niezbędne, jednak posiadają ograniczenia w przypadku powtarzalnego monitorowania, oceny ryzyka przed leczeniem lub szerokiego screeningu. Endoskopia jest inwazyjna i mniej odpowiednia do częstej obserwacji, natomiast tomografia komputerowa i ultrasonografia endoskopowa mogą nie wykryć subtelnej inwazji lub małych zmian przerzutowych5. Modele prognostyczne oparte na obrazowaniu i analizie molekularnej poprawiły przewidywanie ryzyka w obrębie płaskonabłonkowego raka przełyku, lecz wiele z nich wymaga specjalistycznych platform, postprocessingu obrazów, sekwencjonowania tkanek lub przepływów obliczeniowych, które nie są rutynowo dostępne we wszystkich laboratoriach klinicznych6,7. Niskokosztowe i powtarzalne podejście oparte na badaniu krwi może zatem dostarczyć użytecznych informacji uzupełniających, szczególnie gdy klinicyści potrzebują stratyfikacji ryzyka przed rozpoczęciem definitywnej terapii.
Surowicze markery nowotworowe są atrakcyjne w tym kontekście, ponieważ są rutynowo dostępne, małoinwazyjne i łatwe do powtórzenia. Antygen rakowo-płodowy odzwierciedla masę guza oraz nieprawidłowe różnicowanie komórkowe, podczas gdy antygen raka płaskonabłonkowego jest ściślej powiązany ze złośliwą transformacją nabłonka płaskiego8. Antygen węglowodanowy 125 był łączony z ogólnoustrojową aktywnością zapalną, zajęciem błon surowiczych i progresją choroby w kilku typach nowotworów złośliwych9. Markery te nie reprezentują tego samego sygnału biologicznego. Zamiast tego mogą one uchwycić nakładające się, ale odrębne wymiary masy guza, fenotypu płaskonabłonkowego, odpowiedzi ogólnoustrojowej oraz interakcji gospodarz-guz. Z tego powodu połączony panel może wykazywać lepszą skuteczność niż jakikolwiek pojedynczy marker, gdy celem jest zidentyfikowanie raka płaskonabłonkowego przełyku i oszacowanie ryzyka klinicznego10.
Poprzednie badania oceniały surowicze markery nowotworowe, wskaźniki stanu zapalnego, sygnatury obrazowe, profile molekularne oraz złożone modele prognostyczne w raku płaskonabłonkowym przełyku i powiązanych nowotworach przewodu pokarmowego11,12. Jednak wiele opublikowanych modeli koncentruje się albo na diagnostyce, albo na prognozowaniu, wykorzystuje kohorty z jednego ośrodka, nie posiada niezależnej walidacji zewnętrznej lub dostarcza ograniczonych szczegółów dotyczących transformacji markerów, doboru wartości odcięcia, kalibracji oraz powtarzalności modelu. Nowatorstwo niniejszego badania polega na opracowaniu praktycznego trójskładnikowego panelu surowiczego, wykorzystującego rutynowo oznaczany antygen rakowo-embrionalny, antygen raka płaskonabłonkowego oraz antygen węglowodanowy 125, w celu wsparcia zarówno różnicowania diagnostycznego, jak i stratyfikacji ryzyka prognostycznego w ramach jednego dwuośrodkowego schematu postępowania. Model opracowano w kohorcie szpitala trzeciego stopnia referencyjności, a następnie przetestowano bez ponownej optymalizacji w niezależnej kohorcie ośrodka lokalnego, co pozwoliło na ocenę stabilności w różnych warunkach klinicznych.
W niniejszym badaniu opracowano i zwalidowano połączony panel biomarkerów surowiczych oparty na antygenie rakowo-embrionalnym, antygenie raka kolistokomórkowego oraz antygenie węglowodanowym 125. Analiza realizowała dwa powiązane cele. Pierwszym z nich była ocena, czy połączony panel poprawia dyskryminację diagnostyczną pomiędzy rakiem kolistokomórkowym przełyku a kontrolą niemalignologiczną w porównaniu z pojedynczymi markerami surowiczymi. Drugim celem było ustalenie, czy przedlecznicze obciążenie połączonymi biomarkerami dostarcza dodatkowych informacji prognostycznych ponad konwencjonalne zmienne kliniczno-patologiczne i stopień zaawansowania TNM. Taka struktura pozwoliła ocenić, czy rutynowo dostępny panel biomarkerów surowiczych może służyć jako nieinwazyjne uzupełnienie diagnozy patomorfologicznej, oceny obrazowej i stopnia zaawansowania anatomicznego w przedleczniczej ocenie klinicznej.
Protokół
Niniejsze badanie z udziałem ludzi, obejmujące dokumentację kliniczną oraz próbki surowicy, zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i wymogami instytucjonalnymi dotyczącymi badań z udziałem ludzi13. Protokół badania został przeanalizowany i zatwierdzony przez Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine pod numerem zatwierdzenia CJ28J12-45. W przypadku retrospektywnie zebranych zanonimizowanych danych klinicznych i pozostałych próbek surowicy, wymóg uzyskania dodatkowej pisemnej zgody świadomej został zniesiony zgodnie z instytucjonalnymi regulacjami etycznymi. W przypadku próbek pobranych prospektywnie, przed włączeniem do badania uzyskano pisemną zgodę świadomą. Wszystkie informacje o uczestnikach oraz próbki surowicy zostały zanonimizowane przed analizą. Do łączenia danych wykorzystano identyfikatory badania; w zbiorze danych analitycznych nie zawarto żadnych informacji umożliwiających identyfikację osób.
Projekt badania i przydział do kohort
W tym dwuczestniczącym, ambispektywnym badaniu obserwacyjnym oceniono wartość diagnostyczną i prognostyczną połączonego panelu biomarkerów surowiczych obejmującego antygen rakowo-embrionalny (CEA), antygen raka płaskonabłonkowego (SCC-Ag) oraz antygen węglowodanowy 125 (CA125) w raku płaskonabłonkowym przełyku (ESCC). Dane retrospektywne uzyskano z kwalifikujących się dokumentacji klinicznych oraz pozostałych próbek surowicy pobranych przed leczeniem, natomiast rekrutację prospektywną wykorzystano do pobrania dodatkowych próbek surowicy przed leczeniem oraz do przeprowadzenia pełnego nadzoru w ramach tego samego schematu badania. Uczestnicy zostali zrekrutowani z jednego szpitala specjalistycznego oraz jednego ośrodka opieki zdrowotnej w społeczności lokalnej w okresie od stycznia 2021 do grudnia 2024 roku, a nadzór kontynuowano do 31 grudnia 2025 roku. Ośrodek A, będący szpitalem specjalistycznym, posłużył jako kohorta treningowa do opracowania modelu, szacowania współczynników, wyboru wartości odcięcia oraz walidacji wewnętrznej. Ośrodek B, będący ośrodkiem opieki zdrowotnej w społeczności lokalnej, posłużył jako kohorta walidacji zewnętrznej. Badanie zostało opisane zgodnie z wytycznymi Transparent Reporting of a multivariable prediction model for Individual Prognosis or Diagnosis (TRIPOD)14.
W badaniu wzięło udział łącznie 277 uczestników, w tym 194 z Ośrodka A i 83 z Ośrodka B. Kohorta treningowa obejmowała 114 pacjentów z ESCC, 40 osób z łagodnymi chorobami przełyku (grupa kontrolna) oraz 40 zdrowych ochotników (grupa kontrolna). Kohorta walidacji zewnętrznej obejmowała 53 pacjentów z ESCC, 15 osób z łagodnymi chorobami przełyku (grupa kontrolna) oraz 15 zdrowych ochotników (grupa kontrolna). Zamiast losowego podziału zastosowano alokację opartą na ośrodkach, aby ograniczyć wyciek informacji i przetestować stabilność modelu w niezależnym środowisku klinicznym. Analiza diagnostyczna polegała na porównaniu stężeń CEA, SCC-Ag oraz CA125 w surowicy u pacjentów z ESCC, pacjentów z łagodnymi chorobami przełyku oraz zdrowych osób z grupy kontrolnej. Analiza prognostyczna została ograniczona do pacjentów z ESCC i miała na celu ocenę, czy połączone obciążenie biomarkerami poprawia stratyfikację ryzyka w odniesieniu do przeżycia całkowitego (OS) oraz przeżycia wolnego od progresji (PFS). Schemat badania, przesiew uczestników, alokacja kohort, procedura analizy biomarkerów w surowicy, opracowanie modelu diagnostycznego, walidacja zewnętrzna oraz porównanie modeli prognostycznych zostały przedstawione na Rysunku 1.
Przepływ uczestników obejmował przesiew, wykluczenia, grupowanie diagnostyczne oraz przydział do ośrodków. Przesiewowi poddano łącznie 326 osób. Wykluczono 49 osób, w tym 12 z powodu leczenia przeciwnowotworowego przed pobraniem krwi, 8 z powodu innego pierwotnego nowotworu złośliwego, 9 z powodu ciężkiej infekcji, choroby autoimmunologicznej lub niekontrolowanych chorób współistniejących, które mogłyby wpłynąć na surowicze markery nowotworowe, 11 z powodu hemolizy, lipemii, interferencji żółtaczkowej, niewystarczającej objętości surowicy lub przedłużonego odstępu czasu przetwarzania oraz 9 osób z powodu braku kluczowych danych klinicznych, patologicznych lub danych z obserwacji. Końcowa populacja analityczna składała się z 277 uczestników: 167 pacjentów z ESCC, 55 osób z łagodnymi schorzeniami przełyku (grupa kontrolna) oraz 55 zdrowych osób (grupa kontrolna).
Uzasadnienie wielkości próby
Wielkość próby została określona na podstawie kolejnej dostępności kwalifikujących się uczestników, próbek surowicy przed leczeniem oraz informacji z obserwacji w zdefiniowanym okresie badania. Model diagnostyczny wykorzystywał trzy ciągłe biomarkery surowicze jako potencjalne predyktory. W kohorcie treningowej dostępnych było 114 przypadków ESCC i 80 kontroli nie-ESCC, co odpowiadało 38,0 przypadkom ESCC i 26,7 kontrolom nie-ESCC na każdy potencjalny biomarker predykcyjny. Wspierało to zastosowanie niskowymiarowej regresji logistycznej i zmniejszyło ryzyko nadmiernego dopasowania. Zewnętrzna kohorta walidacyjna obejmowała 53 przypadki ESCC i 30 kontroli nie-ESCC i została wykorzystana wyłącznie do walidacji, bez ponownej estymacji współczynników. Uzasadnienie wielkości próby było zgodne z aktualnymi zasadami tworzenia modeli predykcyjnych, które kładą nacisk na częstotliwość występowania zdarzeń, liczbę parametrów potencjalnych predyktorów, przewidywaną wydajność modelu oraz niezależną walidację, a nie na losowy podział danych15.
Rekrutacja uczestników, kryteria kwalifikacji i gromadzenie danych
Uczestnicy byli rekrutowani w sposób ciągły przez cały okres badania. W Ośrodku A pacjenci z ESCC zostali zakwalifikowani z oddziałów chirurgii klatki piersiowej, gastroenterologii oraz onkologii. W Ośrodku B pacjentów z ESCC identyfikowano poprzez badania przesiewowe w społeczności, dokumentację obserwacyjną lub ścieżki skierowań; włączano ich do badania wyłącznie w przypadku dostępności potwierdzenia patomorfologicznego oraz próbek surowicy pobranych przed leczeniem. Kontrolę z łagodnymi schorzeniami przełyku stanowiły osoby, u których przeprowadzono gastroskopię z powodu dysfagii, objawów refluksu lub podejrzenia nieprawidłowości w przełyku, a wyniki badań patomorfologicznych nie wykazały zmian nowotworowych. Zdrową grupę kontrolną wybrano spośród osób poddawanych rutynowym badaniom profilaktycznym w tym samym okresie, które nie miały w wywiadzie nowotworów, aktywnych infekcji, ciężkiej niewydolności wątroby lub nerek, a badania obrazowe lub endoskopowe nie wykazały zmian rozrostowych w przełyku.
Pacjenci z ESCC kwalifikowali się do badania, jeśli u nich potwierdzono pierwotnego ESCC za pomocą biopsji gastroskopowej lub badania patomorfologicznego po operacji, nie otrzymali leczenia przeciwnowotworowego przed pobraniem krwi i dysponowano ich pełnymi danymi klinicznymi wyjściowymi, dokumentacją patologiczną oraz próbkami surowicy sprzed rozpoczęcia leczenia. Uczestników wykluczono, jeśli wystąpił u nich inny pierwotny nowotwór złośliwy, zastosowano leczenie przeciwnowotworowe przed pobraniem krwi, stwierdzono ciężką ostrą infekcję, aktywną chorobę autoimmunologiczną, niekontrolowane choroby współistniejące mogące wpływać na poziom markerów nowotworowych w surowicy, widoczną hemolizę, lipemię, interferencję żółtaczkową, niewystarczającą objętość surowicy, brak kluczowych zmiennych klinicznych lub brak dostępnych danych z obserwacji. Analiza prognostyczna została ograniczona do pacjentów z ESCC z dostępnym stopniem zaawansowania TNM (tumor-node-metastasis) oraz mierzalnymi wynikami przeżycia lub progresji. Pacjenci z okresem obserwacji krótszym niż 6 miesięcy zostali uwzględnieni, jeśli w tym czasie nastąpił zgon lub progresja choroby.
Zmienne wyjściowe obejmowały wiek, płeć, historię palenia tytoniu, historię spożycia alkoholu, wskaźnik masy ciała, ośrodek uczestniczący, grupę diagnostyczną, typ zmiany oraz poziomy w surowicy CEA, SCC-Ag i CA125. W przypadku pacjentów z ESCC dodatkowe zmienne obejmowały lokalizację guza, długość guza, stopień zróżnicowania histologicznego, głębokość nacieku, stan węzłów chłonnych, stadium TNM, naciek naczyniowo-limfatyczny, pierwotną metodę leczenia, nawrotowość, progresję, status przeżycia oraz datę ostatniej wizyty kontrolnej. Historię palenia tytoniu zdefiniowano jako obecne palenie lub wcześniejsze regularne palenie co najmniej 100 papierosów w ciągu całego życia. Historię spożycia alkoholu zdefiniowano jako spożywanie alkoholu co najmniej raz w tygodniu przez ponad 6 miesięcy. Stadium TNM określono zgodnie z ósmą edycją systemu klasyfikacji raka przełyku American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control16. Preparaty histopatologiczne z przypadków ESCC i zmian łagodnych zostały niezależnie ocenione przez dwóch doświadczonych patomorfologów, a wszelkie rozbieżności rozstrzygał trzeci patomorfolog.
Dwoje przeszkolonych badaczy niezależnie wyodrębniło informacje kliniczne z elektronicznej dokumentacji medycznej, raportów patomorfologicznych, systemów informacji laboratoryjnej, zapisów leczenia, dokumentacji obserwacyjnej oraz aktów zgonu, korzystając z wcześniej zdefiniowanego słownika danych. Rozbieżności rozstrzygano poprzez weryfikację oryginalnej dokumentacji, a w razie potrzeby ostateczną decyzję podejmował trzeci badacz. Lokalizację guza sklasyfikowano jako górny, środkowy lub dolny odcinek przełyku w obrębie klatki piersiowej. Stopień zróżnicowania histologicznego sklasyfikowano jako wysoki, umiarkowany lub niski. Jednostki zmiennych ciągłych zostały ustandaryzowane w obu uczestniczących ośrodkach przed przeprowadzeniem analizy.
Pobieranie krwi, opracowanie surowicy i pomiar biomarkerów
Wszystkie próbki krwi pobrano przed rozpoczęciem leczenia, w ciągu 7 dni od potwierdzenia patomorfologicznego oraz co najmniej 3 dni przed wdrożeniem terapii. Próbki krwi żylnej z żyły obwodowej o objętości 5–8 mL pobierano między godziną 7:00 a 9:00 rano po nocnym poście, wykorzystując probówki z separatorem surowicy. Pobranie próbek odroczono, jeśli uczestnik otrzymał transfuzję krwi, wlew albuminy w dużej objętości lub przeszedł zabieg inwazyjny w ciągu 72 h przed pobraniem. Próbki pozostawiono do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 min, a następnie wirowano przy 1,500 × g przez 10 min. Surowicę oddzielono i podzielono na 3–5 probówek z kodem kreskowym, w ilości 300–500 µL na alikwot. Alikwoty przechowywano w temperaturze −80°C do czasu przeprowadzenia badań; żadna próbka nie została poddana więcej niż jednemu cyklowi zamrażania i rozmrażania. Wykluczono próbki z widoczną hemolizą, lipemią, interferencją żółtaczkową, niewystarczającą objętością lub w przypadku, gdy odstęp między pobraniem a zamrożeniem przekraczał 2 h.
Poziomy CEA, SCC-Ag i CA125 w surowicy zmierzono za pomocą zautomatyzowanych systemów immunochemicznych zgodnie z instrukcjami producentów. Alikwoty surowicy rozmrażano w temperaturze 4°C przed badaniem, delikatnie mieszano i analizowano w jednej serii, o ile było to możliwe. W przypadku konieczności przeprowadzania badań partiami, kolejność próbek była ustalana w sposób zapobiegający systematycznemu grupowaniu według stanu choroby, ośrodka, stopnia patologicznego lub wyniku obserwacji. Próbki przekraczające zakres pomiaru analitycznego rozcieńczano i badano ponownie zgodnie z instrukcjami do odczynników. Personel laboratoryjny nie był informowany o grupie uczestników, stopniu patologicznym, statusie leczenia ani wyniku obserwacji.
Progi kliniczne wynosiły 5,0 ng/mL dla CEA, 1,5 ng/mL dla SCC-Ag oraz 35 U/mL dla CA125, zgodnie z lokalnymi standardami laboratoryjnymi i zakresami referencyjnymi producentów. Progi te zostały wykorzystane do zdefiniowania podwyższonego poziomu markerów oraz wysokiego skumulowanego obciążenia biomarkerami na potrzeby analiz korelacji kliniczno-patologicznych i stratyfikacji przeżycia. W celu klasyfikacji diagnostycznej, punkty odcięcia oparte na danych zostały wyznaczone wyłącznie w kohorcie treningowej przy użyciu indeksu Youdena, a następnie zastosowane bez zmian w zewnętrznej kohorcie walidacyjnej. Przed wykonaniem testów przeprowadzono kalibrację aparatury oraz wewnętrzną kontrolę jakości. W każdym dniu badań uwzględniano kontrole niskiego i wysokiego poziomu, a testy kontynuowano tylko wtedy, gdy wyniki kontroli jakości mieściły się w akceptowalnym zakresie.
Powtarzalność międzyanalizami i międzyośrodkami została oceniona przed końcową analizą modelu z wykorzystaniem zaślepionych alikwotów surowicy pomostowej oraz rutynowych materiałów do kontroli jakości. Zestaw pomostowy składający się z 30 zaślepionych alikwotów surowicy został przetestowany w dwóch schematach pracy laboratoryjnej. Współczynniki zmienności międzyośrodkami wyniosły 4,8% dla CEA, 5,6% dla SCC-Ag i 5,1% dla CA125. Odpowiadające im współczynniki korelacji wewnątrzklasowej wyniosły 0,94 dla CEA, 0,92 dla SCC-Ag i 0,93 dla CA125. Nie przeprowadzono rekalibracji analiz specyficznych dla ośrodków, ponieważ żadne systematyczne odchylenie nie przekroczyło zdefiniowanego zakresu kontroli jakości laboratorium. Końcowe wartości biomarkerów zostały zharmonizowane poprzez standaryzację jednostek oraz statystyczną standaryzację opartą na kohorcie treningowej przed konstrukcją modelu.
Zintegrowana definicja biomarkerów i konstrukcja modelu
Zestaw połączonych biomarkerów surowiczych składał się z CEA, SCC-Ag oraz CA125. Do analizy korelacji kliniczno-patologicznych i stratyfikacji przeżywalności metodą Kaplana-Meiera każdy marker sklasyfikowano jako podwyższony lub niepodwyższony zgodnie z predefiniowanym progiem klinicznym. Wysokie obciążenie połączonymi biomarkerami zdefiniowano jako podwyższenie co najmniej dwóch z trzech markerów. W celu modelowania diagnostycznego i prognostycznego trzy biomarkery zachowano jako zmienne ciągłe, przekształcone za pomocą logarytmu naturalnego i zestandaryzowane przy użyciu średniej oraz odchylenia standardowego z kohorty treningowej. Te same parametry przekształcenia zastosowano do zewnętrznej kohorty walidacyjnej.
Znormalizowane biomarkery poddane transformacji logarytmicznej obliczono przy użyciu następujących parametrów kohorty treningowej:
zlnCEA = (lnCEA - 1.42)/0.71
zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0.28)/0.57
zlnCA125 = (lnCA125 - 3.05)/0.62
Kombinowany panel diagnostyczny został opracowany przy użyciu wieloczynnikowej regresji logistycznej w kohorcie treningowej. Diagnostyczny predyktor liniowy obliczono w następujący sposób:
LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag+0,42 × zlnCA125
Indywidualne prawdopodobieństwo wystąpienia ESCC obliczono w następujący sposób:
PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)
Optymalny punkt odcięcia diagnostycznego dla panelu połączonego wyniósł 0.57; został on wybrany w kohorcie treningowej przy użyciu indeksu Youdena i zastosowany bez zmian w walidacji zewnętrznej.
Wynik prognostycznego biomarkera opracowano z wykorzystaniem modelu proporcjonalnych hazardów Coxa. Jako punkt odniesienia dla stopnia zaawansowania anatomicznego wykorzystano model oparty wyłącznie na stopniu TNM. Model biomarkera oparto na skumulowanym obciążeniu biomarkerami. Model kliniczno-patologiczny uwzględniał wiek, długość guza, stopień zróżnicowania histologicznego, stopień pT, stan węzłów chłonnych oraz początkową metodę leczenia. Model zintegrowany uzupełnił model kliniczno-patologiczny o wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami. Dla OS obliczono zintegrowany liniowy predyktor prognostyczny w następujący sposób:
LPOS = 0,33 × wiek ≥65 lat +0,36 × długość guza ≥5cm + 0,25 × słabe zróżnicowanie + 0,31 × pT3
- 4stopień + 0,66 × przerzuty do węzłów chłonnych
-0.58 × leczenie oparte na chirurgii radykalnej
+0,81 × wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami
W przypadku PFS zintegrowany liniowy predyktor prognostyczny obliczono w następujący sposób:
LPPFS = 0,27 × wiek ≥ 65lat + 0,31 × długość guza ≥ 5cm + 0,24 × słabe różnicowanie + 0,25 × pT3
-4stadium + 0,55 × przerzuty do węzłów chłonnych
- 0,46 × leczenie oparte na chirurgii radykalnej
+0,71 × wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami
Wszystkie zmienne binarne w równaniach prognostycznych zakodowano jako 1 w przypadku ich wystąpienia i 0 w przypadku ich braku. Wszystkie współczynniki, parametry standaryzacji oraz wartości progowe zostały oszacowane w kohorcie treningowej i zastosowane bezpośrednio do zewnętrznej kohorty walidacyjnej bez ponownej optymalizacji.
Punkty końcowe diagnostyczne i prognostyczne
Jako referencyjny standard diagnostyczny zastosowano diagnozę patomorfologiczną. Głównym punktem końcowym diagnostyki była dyskryminacja między ESCC a grupami kontrolnymi non-ESCC, obejmującymi łagodne choroby przełyku oraz zdrowych ochotników. Wtórne punkty końcowe diagnostyki obejmowały dyskryminację między ESCC a łagodnymi chorobami przełyku, ESCC a zdrowymi ochotnikami oraz wczesnym stadium ESCC a kontrolami niezłośliwymi. Wczesne stadium ESCC zdefiniowano jako chorobę w stopniu TNM I–II. Skuteczność diagnostyczną oceniono za pomocą krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), pola pod krzywą (AUC), czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej, ujemnej wartości predykcyjnej, dokładności, wyniku F1, krzywych precyzji-przypomnienia, krzywych kalibracji, wyników Briera, punktów przecięcia kalibracji, nachyleń kalibracji oraz analizy krzywej decyzyjnej.
Analizę prognostyczną przeprowadzono wyłącznie u pacjentów z ESCC. Pierwszorzędowym punktem końcowym analizy prognostycznej był OS, zdefiniowany jako odstęp czasu od daty rozpoczęcia pierwszego definitywnego leczenia przeciwnowotworowego do zgonu z jakiejkolwiek przyczyny. Drugorzędowym punktem końcowym analizy prognostycznej był PFS, zdefiniowany jako odstęp czasu od rozpoczęcia pierwszego leczenia do udokumentowanej progresji choroby, nawrotu lub zgonu. W przypadku pacjentów poddanych radykalnej operacji, nawrót miejscowy, przerzuty odległe lub zgon z powodu nowotworu uznawano za zdarzenie PFS, jeśli po operacji nie stwierdzono zmian resztkowych. W przypadku pacjentów otrzymujących definitywną chemioradioterapię lub leczenie paliatywne, progresję określano na podstawie wyników badań obrazowych, oceny endoskopowej oraz oceny klinicznej.
Dane z obserwacji pozyskiwano podczas wizyt ambulatoryjnych, na podstawie dokumentacji szpitalnej, zapisów z obserwacji środowiskowej, dokumentacji skierowań oraz kontaktów telefonicznych. Pacjentów monitorowano co 3 miesiące w ciągu pierwszych 2 lat po leczeniu, co 6 miesięcy od 3. do 5. roku, a następnie corocznie. Pacjentów, u których do daty końcowej obserwacji nie wystąpił zgon, nawrót ani progresja, cenzurowano w dacie ostatniego potwierdzonego kontaktu. Zdarzenia końcowe były niezależnie weryfikowane przez dwóch badaczy. W przypadku rozbieżności w datach zdarzeń między różnymi źródłami, w celu ustalenia ostatecznej daty zdarzenia sprawdzano raporty z badań obrazowych, karty wypisowe, raporty endoskopowe, dokumentację skierowań oraz akty zgonu. Datą graniczną obserwacji dla obu uczestniczących ośrodków był 31 grudnia 2025 r.
Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programów R 4.3.2 oraz SPSS 27.0. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe lub mediana (rozstęp międzykwartylny), w zależności od rozkładu. Zmienne kategoryczne przedstawiono w formie liczebności i procentów. Porównania międzygrupowe przeprowadzono za pomocą testu t dla prób niezależnych, testu U Manna–Whitneya, jednoczynnikowej analizy wariancji, testu Kruskala–Wallisa, testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera, w zależności od potrzeb. Przed zbudowaniem modelu oceniono brakujące dane. Zgodnie z predefiniowanymi kryteriami kwalifikacji wykluczono uczestników, u których brakowało kluczowych danych dotyczących statusu diagnostycznego, wartości biomarkerów przed leczeniem, stopnia TNM lub danych o przeżyciu/progresji. W przypadku niekluczowych współzmiennych z odsetkiem braków poniżej 5.0% zastosowano wielokrotną imputację za pomocą łańcuchowych równań z wykorzystaniem 20 imputowanych zbiorów danych i 20 iteracji17. Modele imputacji obejmowały grupę diagnostyczną, ośrodek, wiek, płeć, historię palenia tytoniu, spożycie alkoholu, wartości biomarkerów, stopień TNM, metodę leczenia, status OS, status PFS oraz czas obserwacji. Analizy przypadków kompletnych przeprowadzono jako analizy wrażliwości.
Model diagnostyczny opracowano w kohorcie treningowej. Do obliczenia pola pod krzywą, czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej, ujemnej wartości predykcyjnej, dokładności oraz wyniku F1 wykorzystano krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Pola pod krzywymi porównano za pomocą testu DeLonga18. Jako uzupełniającą ocenę diagnostyczną zastosowano krzywe precyzji-pełności (precision-recall). Kalibrację oceniono za pomocą krzywych kalibracyjnych, wyników Briera, punktów przecięcia oraz nachyleń kalibracji. Użyteczność kliniczną oceniono za pomocą analizy krzywych decyzyjnych19. Walidację wewnętrzną przeprowadzono z wykorzystaniem 1 000 prób bootstrapowych w celu oszacowania dyskryminacji i kalibracji skorygowanych o optymizm. Walidację zewnętrzną przeprowadzono poprzez bezpośrednie zastosowanie równania z kohorty treningowej, parametrów standaryzacji oraz wartości odcięcia do Ośrodka B bez ponownego dopasowania modelu.
Do analizy prognostycznej wygenerowano krzywe Kaplana-Meiera w celu porównania OS i PFS pomiędzy grupami obciążonymi biomarkerami, a do oceny różnic w przeżywalności zastosowano test log-rank. Do oszacowania współczynników hazardu i 95% przedziałów ufności wykorzystano regresję proporcjonalnego hazardu Coxa. Do modeli wieloczynnikowych włączono zmienne o znaczeniu klinicznym oraz zmienne powiązane z wynikami w analizie jednoczynnikowej. Wydajność modelu oceniono za pomocą indeksu C Harrella, zależnych od czasu krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), krzywych kalibracyjnych, wyników Briera oraz analizy krzywej decyzyjnej20. Kalibrację prognostyczną oceniano po 1, 3 i 5 latach. Założenie proporcjonalności hazardu zweryfikowano za pomocą reszt Schoenfelda i wykresów log-minus-log przeżywalności21. Wartości P w globalnym teście Schoenfelda wynosiły 0,42 dla modelu OS i 0,37 dla modelu PFS. Przed ostateczną interpretacją modelu oceniono współliniowość za pomocą czynników inflacji wariancji (VIF); wszystkie zmienne kandydujące w końcowych modelach diagnostycznych i prognostycznych miały współczynniki VIF poniżej 2,1. Przyrostową wartość prognostyczną ponad stopień TNM i konwencjonalne modele kliniczno-patologiczne oceniono za pomocą wskaźników net reclassification improvement oraz integrated discrimination improvement. Parametry modelu oszacowane w kohorcie treningowej zastosowano do zewnętrznej kohorty walidacyjnej bez ponownego dopasowania22. Wszystkie testy były dwustronne, a wartość P < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Wyniki
Przepływ uczestników i powtarzalność testu
Przesiewowo przebadano łącznie 326 osób, z czego 49 wykluczono: 12 osób otrzymało leczenie przeciwnowotworowe przed pobraniem krwi, 8 osób miało inny nowotwór pierwotny, 9 osób cierpiało na ciężką infekcję, chorobę autoimmunologiczną lub niekontrolowane choroby współistniejące, które mogły wpłynąć na poziom markerów nowotworowych w surowicy, 1 osób wykazywało hemolizę, lipemię, interferencję z żółtaczką, miało niewystarczającą objętość surowicy lub zbyt długi odstęp czasu do przetworzenia próbek, a 9 osób miało braki w kluczowych danych klinicznych, patologicznych lub danych z obserwacji. Ostateczna populacja analityczna obejmowała 27 uczestników: 167 pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym przełyku (ESCC), 5 pacjentów z łagodną chorobą przełyku oraz 5 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Ośrodek A dostarczył 194 uczestników do kohorty treningowej, a Ośrodek B dostarczył 83 uczestników do kohorty walidacji zewnętrznej. Schemat przepływu uczestników, przydział do kohort, proces testowania biomarkerów, opracowanie modelu diagnostycznego, walidację zewnętrzną oraz strukturę modelowania prognostycznego przedstawiono na Rysunku 1, a szczegóły dotyczące przesiewu i wykluczeń podsumowano w Tabeli uzupełniającej 1.
Powtarzalność międzyseryjną i międzyośrodkową oceniono z wykorzystaniem 30 ślepych próbek serum pomostowych. Współczynniki zmienności międzyośrodkowej wyniosły 4,8% dla antygenu rakowo-embrionalnego (CEA), 5,6% dla antygenu raka płaskonabłonkowego (SCC-Ag) oraz 5,1% dla antygenu węglowodanowego 125 (CA125). Odpowiednie współczynniki korelacji wewnątrzklasowej wyniosły odpowiednio 0,94, 0,92 i 0,93. Przed standaryzacją statystyczną i opracowaniem modelu nie było wymaganej rekalibracji specyficznej dla żadnego z ośrodków. Wyniki powtarzalności testu przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 2.
Charakterystyka wyjściowa populacji badanej
Mediana wieku w całej populacji wynosiła 59 lat (IQR, 53–6 lat), a 198 uczestników (71,5%) stanowiły mężczyźni. Palenie tytoniu w przeszłości lub obecnie zgłoszono u 141 uczestników (50,9%), a spożywanie alkoholu w przeszłości lub obecnie u 127 uczestników (45,8%). Kohorta obejmowała 167 pacjentów z ESCC (60,3%), 5 pacjentów z łagodnymi schorzeniami przełyku (19,9%) oraz 5 zdrowych osób kontrolnych (19,9%). Mediana stężeń CEA, SCC-Ag i CA125 w surowicy wynosiła odpowiednio 3,9 ng/mL (IQR, 2,0–6,6 ng/mL), 1,4 ng/mL (IQR, 0,8–2,3 ng/mL) oraz 2,8 U/mL (IQR, 13,9–35,7 U/mL). Wiek, płeć, historia palenia, spożywanie alkoholu, grupa diagnostyczna oraz wyjściowe stężenia biomarkerów w surowicy były porównywalne między kohortą treningową a zewnętrzną kohortą walidacyjną (Tabela 1).
Wśród 167 pacjentów z ESCC mediana wieku wynosiła 61 lat (IQR, 55–68 lat), a 13 pacjentów (79,6%) było mężczyznami. Guzy najczęściej lokalizowały się w środkowym odcinku przełyku piersiowego (89/167, 53,3%), następnie w dolnym odcinku przełyku piersiowego (56/167, 33,5%) i górnym odcinku przełyku piersiowego (2/167, 13,2%). Guzy umiarkowanie zróżnicowane i słabo zróżnicowane stanowiły odpowiednio 81 przypadków (48,5%) oraz 6 przypadków (39,5%). Długość guza wynosiła co najmniej 5 cm u 68 pacjentów (40,7%), choroba w stadium pT3–4 występowała u 121 pacjentów (72,5%), przerzuty do węzłów chłonnych stwierdzono u 10 pacjentów (59,9%), a chorobę w stadium III–IV według klasyfikacji TNM zaobserwowano u 11 pacjentów (6,5%). Inwazję naczyniowo-limfatyczną zidentyfikowano u 65 pacjentów (38,9%). Leczenie pierwotne obejmowało chirurgię radykalną z terapią adiuwantową lub bez niej u 13 pacjentów (67,7%), definitywną chemioradioterapię u 32 pacjentów (19,2%) oraz paliatywne leczenie systemowe lub wspomagające u 2 pacjentów (13,2%). Główne zmienne kliniczno-patologiczne były porównywalne pomiędzy kohortą treningową a zewnętrzną kohortą walidacyjną ESCC (Tabela 2).
Wielowymiarowy rozkład biomarkerów surowicy w grupach badawczych
Rozkłady poziomów surowiczego CEA, SCC-Ag i CA125 różniły się pomiędzy pacjentami z ESCC, grupą kontrolną z łagodnymi schorzeniami przełyku oraz zdrowymi ochotnikami (Rysunek 2). Po transformacji logarytmicznej wszystkie trzy biomarkery wykazały wyższe poziomy w grupie ESCC niż w dwóch grupach niemalignych. Mediana poziomu CEA u pacjentów z ESCC wynosiła 5,2 ng/mL, w porównaniu do 2,4 ng/mL w grupie kontrolnej z łagodnymi schorzeniami przełyku i 1,9 ng/mL u zdrowych ochotników. Mediana poziomu SCC-Ag u pacjentów z ESCC wynosiła 1,9 ng/mL, w porównaniu do 0,9 ng/mL i 0,7 ng/mL w pozostałych grupach. Mediana poziomu CA125 u pacjentów z ESCC wynosiła 28,9 U/mL, w porównaniu do 18,7 U/mL i 16,1 U/mL w pozostałych grupach. Rozkłady biomarkerów surowiczych dla poszczególnych grup zestawiono w Tabeli uzupełniającej 3.
CEA i SCC-Ag wykazały wyraźniejszą separację między ESCC a kontrolami niezłośliwymi niż CA125. W dwuwymiarowym rozkładzie wartości logarytmicznych CEA i SCC-Ag próbki ESCC koncentrowały się częściej w obszarze wysokich wartości, podczas gdy zdrowe kontrole grupowały się częściej w obszarze niskich wartości. Wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami, zdefiniowane jako podwyższenie co najmniej dwóch z trzech markerów, zaobserwowano u 61 z 167 pacjentów z ESCC (36,5%), 8 z 5 kontroli z łagodną chorobą przełyku (14,5%) oraz 4 z 5 zdrowych kontroli (7,3%). Rozkład podwyższonego obciążenia biomarkerami różnił się znacząco pomiędzy trzema grupami (P < 0,01), co odnotowano również w Tabeli uzupełniającej 3.
Opracowanie łączonej sygnatury diagnostycznej w kohorcie treningowej
Łączny sygnatura diagnostyczna została opracowana w kohorcie treningowej z wykorzystaniem wartości CEA, SCC-Ag oraz CA125 po transformacji logarytmicznej (Rysunek 3). Analiza korelacji parowej wykazała umiarkowane korelacje dodatnie pomiędzy trzema markerami. Najsilniejszą korelację zaobserwowano pomiędzy CEA a SCC-Ag (r = 0.58), następnie pomiędzy SCC-Ag a CA125 (r = 0.47) oraz pomiędzy CEA a CA125 (r = 0.41), co uzasadnia wspólne modelowanie bez traktowania markerów jako pomiarów zamiennych.
W jednow zmiennej regresji logistycznej wskaźniki CEA, SCC-Ag oraz CA125 były powiązane ze stanem ESCC, z ilorazami szans wynoszącymi odpowiednio 2,81, 3,94 i 2,14. W wielozmiennym modelu diagnostycznym SCC-Ag wykazał największą skorygowaną wielkość efektu (OR, 2,87; 95% CI, 1,62–5,09; P < 0,01), a następnie CEA (OR, 1,80; 95% CI, 1,19–2,72; P = 0,06) i CA125 (OR, 1,52; 95% CI, 1,03–2,25; P = 0,034). Współczynniki modelu diagnostycznego zostały zestawione w Tabeli uzupełniającej 4. Końcowy liniowy predyktor diagnostyczny wynosił:
LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag +0,42 × zlnCA125
Indywidualne prawdopodobieństwo przewidywania ESCC obliczono jako:
PESCC = 1/1 + exp( -LPdiagnostic )
Przewidziany rozkład prawdopodobieństwa z połączonego modelu diagnostycznego wykazał rozdzielenie uczestników z ESCC i bez ESCC. Optymalna wartość odcięcia wyniosła 0,57. Przy tej wartości odcięcia połączony model osiągnął pole pod krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (AUC) na poziomie 0,869 (95% CI, 0,817–0,921), przy dodatniej wartości predykcyjnej 85,8% i ujemnej wartości predykcyjnej 73,0% w kohorcie treningowej.
Wydajność diagnostyczna i walidacja zewnętrzna połączonego panelu biomarkerów
W kohorcie treningowej SCC-Ag wykazał najwyższą wydajność diagnostyczną spośród trzech pojedynczych biomarkerów, z AUC wynoszącą 0,802 (95% CI, 0,735–0,869). Wartości AUC dla CEA i CA125 wyniosły odpowiednio 0,71 (95% CI, 0,635–0,786) oraz 0,68 (95% CI, 0,591–0,74). Panel łączony osiągnął najwyższą ogólną dyskryminację z AUC wynoszącą 0,869 (95% CI, 0,817–0,921), czułością 79,8%, swoistością 81,2%, dodatnią wartością predykcyjną 85,8%, ujemną wartością predykcyjną 73,0%, dokładnością 80,4% oraz wskaźnikiem F1 wynoszącym 82,7% (Tabela 3).
Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika potwierdziły wyższą dyskryminację diagnostyczną panelu łączonego w porównaniu z poszczególnymi biomarkerami (Rysunek 4A). Przy optymalnym punkcie odcięcia wynoszącym 0,57 panel łączony wykazał czułość na poziomie 79,8% i swoistość na poziomie 81,2%. AUC panelu łączonego było istotnie wyższe niż w przypadku samego SCC-Ag (P = 0,032). Wewnętrzna walidacja metodą bootstrap z 10 reprobowań wykazała AUC skorygowane o optymizm wynoszące 0,856, nachylenie kalibracji skorygowane o optymizm wynoszące 0,97 oraz wynik Briera skorygowany o optymizm wynoszący 0,154. Szacunki walidacji wewnętrznej przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 4.
W kohorcie walidacji zewnętrznej analiza precyzji i pełności (precision-recall) wykazała najwyższą średnią precyzję w rozróżnianiu ESCC od zdrowych kontroli (AP = 0,912; Rysunek 4B). Średnia precyzja wyniosła 0,863 dla ESCC w porównaniu z nie-ESCC oraz 0,841 dla ESCC w porównaniu z łagodną chorobą przełyku. Średnia precyzja dla ESCC we wczesnym stadium w porównaniu z kontrolami beznowotworowymi wyniosła 0,535. Analiza kalibracji wykazała zgodność między prawdopodobieństwami przewidywanymi a obserwowanymi wynikami w obu kohortach (Rysunek 4C). W kohorcie treningowej wynik Brier score wyniósł 0,148, przy nachyleniu kalibracji równym 1,02 i punkcie przecięcia równym 0,01. W kohorcie walidacji zewnętrznej Brier score wyniósł 0,164, przy nachyleniu kalibracji 0,93 i punkcie przecięcia kalibracji −0,04. Analiza krzywej decyzyjnej wykazała wyższą korzyść netto dla panelu skombinowanego niż dla strategii „lecz wszystkich” (treat-all) i „nie lecz nikogo” (treat-none) w większości progów prawdopodobieństwa (Rysunek 4D).
Wyniki walidacji zewnętrznej podsumowano w Tabeli 4. Zestaw połączony osiągnął AUC na poziomie 0,842 (95% CI, 0,753–0,930) dla ESCC w porównaniu z non-ESCC, przy czułości 75,5%, swoistości 76,7%, dokładności 75,9%, wyniku Briera 0,164, nachyleniu kalibracji 0,93 oraz korzyści netto 0,218 przy progu prawdopodobieństwa 0,30. Wartości AUC wyniosły 0,801 (95% CI, 0,686–0,916) dla ESCC w porównaniu z łagodną chorobą przełyku, 0,89 (95% CI, 0,80–0,979) dla ESCC w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych oraz 0,818 (95% CI, 0,704–0,932) dla wczesnego stadium ESCC w porównaniu z kontrolą niezłośliwą. Najwyższą swoistość zaobserwowano dla ESCC w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych (86,7%), podczas gdy dla wczesnego stadium ESCC w porównaniu z kontrolą niezłośliwą czułość wyniosła 70,6%, a swoistość 78,3%.
Profil powiązań kliniczno-patologicznych połączonego panelu biomarkerów w ESCC
Związek między podwyższonym poziomem biomarkerów w surowicy a cechami kliniczno-patologicznymi oceniono u pacjentów z ESCC (Tabela 5). Wiek i płeć wykazały ograniczony związek z podwyższeniem poziomu poszczególnych biomarkerów. Pacjenci w wieku co najmniej 65 lat mieli wyższy odsetek wysokiego skumulowanego obciążenia biomarkerami niż osoby poniżej 65 roku życia (47,6% vs 29,8%; P = 0,028), natomiast płeć nie była powiązana z podwyższeniem poziomu poszczególnych biomarkerów ani ze skumulowanym obciążeniem biomarkerami.
Zmienne związane z guzem wykazały silniejsze powiązania z podwyższeniem poziomu biomarkerów. Wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami wystąpiło u 50,0% pacjentów z guzem o długości co najmniej 5 cm, w porównaniu do 27,3% pacjentów z guzem o długości poniżej 5 cm (P = 0.04). Wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami było również częstsze u pacjentów z niskim stopniem zróżnicowania niż u osób z wysokim lub umiarkowanym stopniem zróżnicowania (50,0% vs 28,2%; P = 0.06), u pacjentów z chorobą w stadium pT3–4 niż u osób w stadium pT1–2 (42,1% vs 21,7%; P = 0.01), u pacjentów z przerzutami do węzłów chłonnych niż u osób bez takich przerzutów (43,0% vs 26,9%; P = 0.038) oraz u pacjentów z chorobą w stopniu zaawansowania TNM III–IV niż u osób w stopniu TNM I–II (43,2% vs 23,2%; P = 0.09).
Wizualizacja na poziomie pacjentów wykazała, że wyższe łączone wyniki ryzyka wiązały się z bardziej zaawansowanymi cechami kliniczno-patologicznymi (Rysunek 5A). Pacjenci z wyższymi wynikami częściej byli klasyfikowani jako pT3–4, z obecnością przerzutów w węzłach chłonnych, z niskim stopniem zróżnicowania lub w stadium TNM III–IV. Analiza wykresów pudełkowych wykazała przesunięcie rozkładów biomarkerów w górę u pacjentów z większą długością guza, słabym zróżnicowaniem, chorobą w stadium pT3–4, dodatnim wynikiem węzłów chłonnych oraz chorobą w stadium TNM III–IV (Rysunek 5B). Wykres Sankeya wykazał, że pacjenci z dwoma lub trzema podwyższonymi biomarkerami częściej byli klasyfikowani do stadium TNM III–IV, podczas gdy pacjenci bez podwyższonych biomarkerów częściej kwalifikowali się do stadium TNM I–II (Rysunek 5C). Zależność między łącznym obciążeniem biomarkerami a rozkładem stadium TNM była istotna statystycznie (P < 0.001).
Stratyfikacja prognostyczna oparta na połączonym panelu biomarkerów surowiczych
Mediana czasu obserwacji pacjentów z ESCC wyniosła 34 miesiące. W okresie obserwacji odnotowano 78 zgonów oraz 96 zdarzeń związanych z przeżyciem wolnym od progresji. Szczegółowe informacje dotyczące obserwacji i zdarzeń podsumowano w Tabeli uzupełniającej 5. Wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami wiązało się z gorszymi wynikami przeżycia. W jednowariancyjnej regresji Coxa wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami korelowało ze zwiększonym ryzykiem zgonu (HR, 2,91; 95% CI, 1,89–4,46; P < 0,001) oraz progresji lub zgonu (HR, 2,63; 95% CI, 1,80–3,84; P < 0,01). Po skorygowaniu o wiek, długość guza, stopień zróżnicowania, stadium pT, przerzuty do węzłów chłonnych oraz metodę leczenia, wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami pozostawało niezależnie powiązane z przeżyciem całkowitym (OS; HR, 2,24; 95% CI, 1,41–3,54; P = 0,01) oraz przeżyciem wolnym od progresji (PFS; HR, 2,03; 95% CI, 1,35–3,05; P = 0,001). W przeciwieństwie do tego, podwyższone poziomy CEA, SCC-Ag i CA125 nie były już istotne statystycznie, gdy były uwzględniane pojedynczo w modelach wielowariancyjnych. Wyniki regresji Coxa podsumowano w Tabeli 6.
Analiza Kaplana-Meiera wykazała wyraźne rozdzielenie grup o wysokim i niskim skumulowanym obciążeniu biomarkerami (Rycyna 6A,B). Mediana OS wyniosła 38 miesięcy w grupie o niskim obciążeniu i 19 miesięcy w grupie o wysokim obciążeniu (log-rank P < 0.01). Mediana PFS wyniosła 28 miesięcy w grupie o niskim obciążeniu i 13 miesięcy w grupie o wysokim obciążeniu (log-rank P < 0.01). Zintegrowany model prognostyczny wykazał wyższą zależną od czasu dyskryminację niż sam stopień TNM (Rycyna 6C), z wartościami AUC wynoszącymi odpowiednio 0,829, 0,806 i 0,781 po 1, 3 i 5 latach, w porównaniu do 0,701, 0,676 i 0,648 dla samego stopnia TNM. Poprawa wskaźnika C-index w stosunku do samego stopnia TNM wyniosła 0,130 w kohorcie treningowej i 0,120 w zewnętrznej kohorcie walidacyjnej. Mapa ciepła punktów kontrolnych obserwacji (landmark heatmap) wykazała wzrost skumulowanej śmiertelności w poszczególnych warstwach ryzyka (Rycyna 6D). W tercylu niskiego ryzyka skumulowane prawdopodobieństwa śmiertelności wynosiły odpowiednio 6%, 12%, 24%, 37% i 52% w 6, 12, 24, 36 i 60 miesiącach. Odpowiadające im prawdopodobieństwa w tercylu pośredniego ryzyka wynosiły 14%, 26%, 44%, 59% i 74%, a w tercylu wysokiego ryzyka 28%, 47%, 68%, 82% i 91%.
Walidacja zewnętrzna i przyrostowa wartość prognostyczna zintegrowanego modelu
Model zintegrowany wykazał najwyższą dyskryminację prognostyczną spośród ocenianych modeli w obu kohortach. W kohorcie treningowej wskaźnik C-index dla modelu zintegrowanego wyniósł 0,792, w porównaniu z 0,736 dla modelu kliniczno-patologicznego, 0,703 dla samego panelu biomarkerów oraz 0,62 dla samego stopnia TNM. W zewnętrznej kohorcie walidacyjnej C-index dla modelu zintegrowanego wyniósł 0,761, w porównaniu z 0,708, 0,681 i 0,641 dla pozostałych modeli. Zależne od czasu wartości AUC również przemawiały za modelem zintegrowanym. W kohorcie treningowej model zintegrowany osiągnął wartości AUC odpowiednio 0,829, 0,806 i 0,781 po 1, 3 i 5 latach. W zewnętrznej kohorcie walidacyjnej odpowiadające im wartości AUC wyniosły 0,801, 0,74 i 0,748. W porównaniu z samym stopniem TNM, model zintegrowany wykazał NRI na poziomie +0,274 oraz IDI na poziomie +0,102. Wewnętrzna walidacja metodą bootstrap wykazała wartość C-index skorygowaną o optymizm równą 0,79 dla modelu zintegrowanego. Metryki wydajności modelu przedstawiono w Tabeli 7, a dodatkowe wyniki walidacji prognostycznej podano w Tabeli uzupełniającej 5.
Wykres porównania modeli wykazał najwyższy wskaźnik C Harrella dla modelu zintegrowanego w obu kohortach (Rysunek 7A). Nomogram uwzględniał wiek, długość guza, różnicowanie histologiczne, stopień pT, status węzłów chłonnych, początkową metodę leczenia oraz wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami w celu oszacowania prawdopodobieństwa OS w okresie 1, 3 i 5 lat (Rysunek 7B). W zewnętrznej kohorcie walidacyjnej krzywe kalibracyjne dla OS w okresie 1, 3 i 5 lat znajdowały się blisko idealnej linii referencyjnej (Rysunek 7C). Wyniki Brier score wyniosły odpowiednio 0,141, 0,164 i 0,178, przy nachyleniu krzywych kalibracyjnych wynoszącym 0,97, 0,93 i 0,91. Analiza krzywej decyzyjnej wykazała, że model zintegrowany przyniósł wyższą korzyść netto niż sam stopień TNM, model kliniczno-patologiczny oraz strategie „lecz wszystkich” lub „nie lecz nikogo” w głównym zakresie prawdopodobieństwa progowego (Rysunek 7D). Przy prawdopodobieństwie progowym 0,30 korzyść netto dla modelu zintegrowanego wyniosła 0,181, w porównaniu do 0,139 dla modelu kliniczno-patologicznego i 0,17 dla samego stopnia TNM. Wyniki kalibracji i analizy krzywych decyzyjnych zostały podsumowane w Tabeli uzupełniającej 5.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Zbiory danych wygenerowane i analizowane w ramach niniejszego badania są publicznie dostępne w repozytorium Figshare: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.3154580.v1.
Rysunek 1Projekt badania i schemat analityczny. Schematyczny przegląd przesiewu uczestników, przydzielania do kohort, pomiaru biomarkerów w surowicy, opracowania modelu diagnostycznego, walidacji zewnętrznej oraz konstrukcji modelu prognostycznego. Ośrodek A służył jako kohorta treningowa, a Ośrodek B jako kohorta walidacji zewnętrznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2Rozkład poziomów CEA, SCC-Ag i CA125 w surowicy w grupach badawczych. (A) Wykresy skrzynkowe i skrzypcowe przedstawiające logarytmowane poziomy biomarkerów w surowicy u pacjentów z ESCC, kontroli z łagodnymi schorzeniami przełyku oraz zdrowych osób z grupy kontrolnej. (B) Rozkład dwuwymiarowy logarytmowanych wartości CEA i SCC-Ag. (C) Wykres radarowy podsumowujący połączony profil biomarkerów w grupach diagnostycznych. (D) Rozkład podwyższonego obciążenia biomarkerami w grupach diagnostycznych. CEA = antygen rakowo-embrionalny; SCC-Ag = antygen raka kolczystokomórkowego; CA125 = antygen węglowodanowy 125; ESCC = rak kolczystokomórkowy przełyku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3Opracowanie połączonej sygnatury diagnostycznej w kohorcie treningowej. (A) Mapa ciepła korelacji logarytmicznie przekształconych wartości CEA, SCC-Ag i CA125. (B) Wyniki jednowymiarowej i wielowymiarowej regresji logistycznej dla poszczególnych biomarkerów oraz połączonego modelu diagnostycznego. (C) Przewidywany rozkład prawdopodobieństwa dla uczestników z ESCC i bez ESCC na podstawie połączonego modelu diagnostycznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4Wydajność diagnostyczna i zewnętrzna walidacja połączonego panelu biomarkerów. (A) Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) porównujące poszczególne biomarkery oraz panel łączony w kohorcie treningowej. (B) Krzywe precyzji i pełności (precision-recall) w scenariuszach walidacji zewnętrznej. (C) Wykresy kalibracyjne dla kohorty treningowej i kohorty walidacji zewnętrznej. (D) Analiza krzywej decyzyjnej wykazująca korzyść netto w zależności od prawdopodobieństw progowych. ROC = charakterystyka operacyjna odbiornika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5Profil powiązań kliniczno-patologicznych połączonego panelu biomarkerów w ESCC. (A) Charakterystyka poziomu pacjentów w zakresie łącznych wyników oceny ryzyka, stężeń biomarkerów w surowicy oraz cech kliniczno-patologicznych. (B) Wykresy pudełkowe przedstawiające rozkłady biomarkerów w głównych podgrupach kliniczno-patologicznych. (C) Wykres Sankeya przedstawiający zależność między zwiększonym obciążeniem biomarkerami a stopniem zaawansowania TNM. TNM = guz-węzeł chłonny-przerzuty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6Stratyfikacja prognostyczna oparta na skumulowanym obciążeniu biomarkerami. (A) Krzywe Kaplana–Meiera dla przeżycia całkowitego w zależności od skumulowanego obciążenia biomarkerami. (B) Krzywe Kaplana-Meiera dla przeżycia wolnego od progresji w zależności od skumulowanego obciążenia biomarkerami. (C) Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika zależne od czasu, porównujące model zintegrowany z samym stopniem TNM. (D) Mapa ciepła przedstawiająca skumulowane prawdopodobieństwa śmiertelności w tercylach ryzyka i punktach kontrolnych obserwacji. OS = przeżycie całkowite; PFS = przeżycie wolne od progresji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 7Zewnętrzna walidacja i translacja kliniczna zintegrowanego modelu prognostycznego. (A) Porównanie wskaźnika C Harrella dla modeli prognostycznych w kohortach treningowej i zewnętrznej walidacyjnej. (B) Nomogram uwzględniający wiek, długość guza, stopień zróżnicowania histologicznego, stadium pT, status węzłów chłonnych, początkową metodę leczenia oraz wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami w celu oszacowania 1-, 3- i 5-letniego przeżycia całkowitego. (C) Wykresy kalibracji walidacji zewnętrznej dla całkowitego przeżycia w okresie 1, 3 i 5 lat. (D) Analiza krzywej decyzyjnej porównująca model zintegrowany z samym stopniem TNM, modelem kliniczno-patologicznym oraz strategiami „lecz wszystkich” lub „nie lecz nikogo”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Zmienna | Ogółem (n = 277) | Kohorta treningowa, Ośrodek A (n = 194) | Zewnętrzna kohorta walidacyjna, Ośrodek B (n = 83) | wartość p |
| Wiek, lata, mediana (IQR) | 59 (53–66) | 59 (52–65) | 60 (54–67) | 0.284 |
| Płeć męska, n (%) | 198 (71.5) | 137 (70.6) | 61 (73.5) | 0.622 |
| Palacz obecnie/w przeszłości, n (%) | 141 (50.9) | 95 (49.0) | 46 (55.4) | 0.321 |
| Aktualne/dawne spożycie alkoholu, n (%) | 127 (45.8) | 87 (44.8) | 40 (48.2) | 0.603 |
| Grupa diagnostyczna, n (%) | 0.701 | |||
| rak płaskonabłonkowy przełyku | 167 (60.3) | 114 (58.8) | 53 (63.9) | |
| Łagodne choroby przełyku | 55 (19.9) | 40 (20.6) | 15 (18.1) | |
| Zdrowe kontrole | 55 (19.9) | 40 (20.6) | 15 (18.1) | |
| CEA w surowicy, ng/mL, mediana (IQR) | 3.9 (2.0–6.6) | 3.8 (1.9–6.4) | 4.1 (2.1–6.8) | 0.367 |
| SCC-Ag w surowicy, ng/mL, mediana (IQR) | 1.4 (0.8–2.3) | 1.4 (0.8–2.2) | 1.5 (0.9–2.4) | 0.418 |
| Stężenie CA125 w surowicy, U/mL, mediana (IQR) | 22.8 (13.9–35.7) | 22.4 (13.5–34.9) | 23.6 (14.6–36.8) | 0.447 |
Tabela 1: Charakterystyka wyjściowa uczestników w kohortach treningowej i zewnętrznej walidacyjnej. Podsumowano cechy demograficzne, skład kohort oraz wyjściowe poziomy CEA, SCC-Ag i CA125 w surowicy dla całej populacji, kohorty treningowej oraz kohorty zewnętrznej walidacyjnej.
| Zmienna | Ogólnie ESCC (n = 167) | Kohorta treningowa (n = 14) | Zewnętrzna kohorta walidacyjna (n = 53) | Wartość p |
| Wiek, lata, mediana (IQR) | 61 (55–68) | 61 (55–67) | 62 (56–68) | 0.386 |
| Płeć męska, n (%) | 133 (79.6) | 91 (79.8) | 42 (79.2) | 0.931 |
| Palacz obecny/były, n (%) | 110 (65.9) | 74 (64.9) | 36 (67.9) | 0.701 |
| Aktualne/dawne spożycie alkoholu, n (%) | 95 (56.9) | 66 (57.9) | 29 (54.7) | 0.688 |
| Lokalizacja guza, n (%) | 0.879 | |||
| Górny odcinek piersiowy | 22 (13.2) | 15 (13.2) | 7 (13.2) | |
| Środkowy odcinek piersiowy | 89 (53.3) | 60 (52.6) | 29 (54.7) | |
| Dolny odcinek piersiowy | 56 (33.5) | 39 (34.2) | 17 (32.1) | |
| Zróżnicowanie histologiczne, n (%) | 0.944 | |||
| Dobrze zróżnicowany | 20 (12.0) | 14 (12.3) | 6 (11.3) | |
| Średniozróżnicowany | 81 (48.5) | 56 (49.1) | 25 (47.2) | |
| Słabo zróżnicowany | 66 (39.5) | 44 (38.6) | 22 (41.5) | |
| Długość guza ≥5 cm, n (%) | 68 (40.7) | 45 (39.5) | 23 (43.4) | 0.621 |
| stopień pT3–4, n (%) | 121 (72.5) | 82 (71.9) | 39 (73.6) | 0.821 |
| Przerzuty do węzłów chłonnych, n (%) | 100 (59.9) | 68 (59.6) | 32 (60.4) | 0.924 |
| stadium TNM III–IV, n (%) | 111 (66.5) | 75 (65.8) | 36 (67.9) | 0.785 |
| Przerzuty do naczyń limfatycznych i krwionośnych, n (%) | 65 (38.9) | 42 (36.8) | 23 (43.4) | 0.404 |
| Podstawowa metoda leczenia, n (%) | 0.753 | |||
| Chirurgia radykalna ± terapia adjuwantowa | 113 (67.7) | 79 (69.3) | 34 (64.2) | |
| Definitywna chemioradioterapia | 32 (19.2) | 21 (18.4) | 11 (20.8) | |
| Systemowe leczenie paliatywne/wspierające | 22 (13.2) | 14 (12.3) | 8 (15.1) |
Tabela 2: Charakterystyka kliniczno-patologiczna pacjentów z ESCC w kohortach treningowej i zewnętrznej walidacyjnej. Porównano lokalizację guza, różnicowanie histologiczne, długość guza, stopień pT, stan węzłów chłonnych, stopień TNM, naciekanie limfo-naczyniowe oraz główną metodę leczenia u pacjentów z ESCC w kohortach treningowej i zewnętrznej walidacyjnej.
| Model | Optymalny punkt odcięcia | AUC (95% CI) | Czułość (%) | Swoistość (%) | PPV (%) | NPV (%) | Dokładność (%) | wskaźnik F1 (%) |
| CEA | 4,85 ng/ml | 0.711 (0.635–0.786) | 58.8 | 76.2 | 77.9 | 56.6 | 66.2 | 67.1 |
| SCC-Ag | 1,52 ng/mL | 0.802 (0.735–0.869) | 70.2 | 78.8 | 82.5 | 65.6 | 73.8 | 76.1 |
| CA125 | 31,8 U/ml | 0.668 (0.591–0.744) | 44.7 | 82.5 | 78.5 | 52.4 | 60.3 | 57 |
| Panel łączony | 0.57 | 0.869 (0.817–0.921) | 79.8 | 81.2 | 85.8 | 73 | 80.4 | 82.7 |
Tabela 3: Dokładność diagnostyczna poszczególnych biomarkerów oraz połączonego panelu biomarkerów surowicy w kohorcie treningowej.Wydajność diagnostyczna została przedstawiona z użyciem optymalnego punktu odcięcia, pola pod krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (AUC), czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej, ujemnej wartości predykcyjnej, dokładności oraz miary F1.
| Porównanie | AUC (95% CI) | Czułość, % | Swoistość, % | Dokładność, % | wynik Briera | Nachylenie krzywej kalibracyjnej | Korzyść netto przy prawdopodobieństwie progowym 0,30 |
| ESCC a nie-ESCC | 0.842 (0.753–0.930) | 75.5 | 76.7 | 75.9 | 0.164 | 0.93 | 0.218 |
| Rak gruczołowy przełyku (ESCC) a łagodne choroby przełyku | 0.801 (0.686–0.916) | 73.6 | 73.3 | 73.5 | 0.171 | 0.9 | 0.196 |
| ESCC w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych | 0.889 (0.800–0.979) | 77.4 | 86.7 | 79.5 | 0.122 | 0.97 | 0.252 |
| Wczesne stadia ESCC w porównaniu z kontrolami niemalignymi | 0.818 (0.704–0.932) | 70.6 | 78.3 | 76.3 | 0.153 | 0.89 | 0.173 |
Tabela 4: Zewnętrzna walidacja wydajności diagnostycznej połączonego panelu biomarkerów surowiczych.Wydajność modelu została podsumowana dla czterech scenariuszy diagnostycznych: ESCC względem nie-ESCC, ESCC względem łagodnych schorzeń przełyku, ESCC względem zdrowych kontroli oraz wczesnego stadium ESCC względem kontroli niezłośliwych.
| Cecha | Kategoria | Podwyższony poziom CEA (n %) | Podwyższony poziom SCC-Ag (n %) | Podwyższony poziom CA125 (n %) | Wysokie obciążenie łączone (n %) | P dla CEA | P dla SCC-Ag | P dla CA125 | P dla obciążenia łączonego |
| Wiek | <65 lat (n = 104) | 40 (38.5) | 54 (51.9) | 29 (27.9) | 31 (29.8) | 0.129 | 0.108 | 0.151 | 0.028 |
| ≥65 lat (n = 63) | 32 (50.8) | 41 (65.1) | 25 (39.7) | 30 (47.6) | |||||
| Płeć | Kobieta (n=34) | 13 (38.2) | 17 (50.0) | 13 (38.2) | 12 (35.3) | 0.513 | 0.367 | 0.402 | 0.871 |
| Mężczyzna (n = 13) | 59 (4.4) | 78 (58.6) | 41 (30.8) | 49 (36.8) | |||||
| Długość guza | <5 cm (n = 9) | 35 (35.4) | 49 (49.5) | 24 (24.2) | 27 (27.3) | 0.015 | 0.021 | 0.09 | 0.04 |
| ≥5 cm (n = 68) | 37 (54.4) | 46 (67.6) | 30 (4.1) | 34 (50.0) | |||||
| Zróżnicowanie | Dobre/umiarkowane (n = 103) | 38 (36.9) | 52 (50.5) | 27 (26.2) | 29 (28.2) | 0.018 | 0.032 | 0.027 | 0.06 |
| Słabe (n=64) | 34 (53.1) | 43 (67.2) | 27 (42.2) | 32 (50.0) | |||||
| Stopień pT | pT1–2 (n = 46) | 13 (28.3) | 20 (43.5) | 9 (19.6) | 10 (21.7) | 0.016 | 0.028 | 0.036 | 0.01 |
| pT3–4(n = 121) | 59 (48.8) | 75 (62.0) | 45 (37.2) | 51 (42.1) | |||||
| Status węzłów chłonnych | Ujemny (n = 67) | 21 (31.3) | 31 (46.3) | 15 (2.4) | 18 (26.9) | 0.012 | 0.025 | 0.021 | 0.038 |
| Dodatni (n = 10) | 51 (51.0) | 64 (64.0) | 39 (39.0) | 43 (43.0) | |||||
| Stopień TNM | I–II (n = 56) | 16 (28.6) | 25 (4.6) | 1 (19.6) | 13 (23.2) | 0.08 | 0.021 | 0.014 | 0.09 |
| III–IV (n= 1) | 56 (50.5) | 70 (63.1) | 43 (38.7) | 48 (43.2) |
Tabela 5: Zależności między podwyższeniem poziomu biomarkerów w surowicy a cechami klinicznymi i patologicznymi u pacjentów z ESCC. Porównano odsetki podwyższonego poziomu CEA, podwyższonego poziomu SCC-Ag, podwyższonego poziomu CA125 oraz wysokiego skumulowanego obciążenia biomarkerami w podgrupach demograficznych i związanych z guzem.
| Zmienna | Jednowymiarowe HR dla OS (95% CI) | Wartość P | Wielowymiarowe HR dla OS (95% CI) | Wartość P | Jednowymiarowe HR dla PFS (95% CI) | Wartość P | Wielowymiarowe HR dla PFS (95% CI) | Wartość P |
| Wiek ≥65 lat | 1.52 (1.01–2.31) | 0.046 | 1.39 (0.90–2.14) | 0.138 | 1.41 (0.97–2.06) | 0.074 | 1.31 (0.8–1.95) | 0.186 |
| Płeć męska | 1.18 (0.67–2.08) | 0.566 | — | — | 1.13 (0.69–1.84) | 0.632 | — | — |
| Długość guza ≥5 cm | 1.89 (1.25–2.86) | 0.03 | 1.4 (0.93–2.23) | 0.103 | 1.76 (1.2–2.5) | 0.03 | 1.36 (0.92–2.01) | 0.12 |
| Słabe zróżnicowanie | 1.63 (1.07–2.47) | 0.024 | 1.29 (0.84–1.9) | 0.245 | 1.58 (1.09–2.28) | 0.016 | 1.27 (0.86–1.87) | 0.28 |
| Stadium pT3–4 | 2.04 (1.19–3.49) | 0.009 | 1.36 (0.76–2.4) | 0.304 | 1.92 (1.18–3.1) | 0.09 | 1.29 (0.7–2.18) | 0.35 |
| Przerzuty do węzłów chłonnych | 2.46 (1.50–4.03) | <0.01 | 1.94 (1.15–3.28) | 0.013 | 2.12 (1.37–3.28) | 0.01 | 1.73 (1.08–2.79) | 0.023 |
| Leczenie oparte na chirurgii radykalnej | 0.43 (0.28–0.65) | <0.01 | 0.56 (0.36–0.8) | 0.012 | 0.51 (0.35–0.74) | <0.01 | 0.63 (0.43–0.94) | 0.024 |
| Podwyższone CEA | 1.8 (1.24–2.85) | 0.03 | 1.34 (0.86–2.10) | 0.19 | 1.71 (1.18–2.49) | 0.05 | 1.26 (0.84–1.88) | 0.267 |
| Podwyższone SCC-Ag | 1.95 (1.25–3.03) | 0.003 | 1.29 (0.80–2.08) | 0.302 | 1.82 (1.2–2.72) | 0.04 | 1.25 (0.81–1.93) | 0.315 |
| Podwyższone CA125 | 1.79 (1.16–2.78) | 0.09 | 1.21 (0.76–1.93) | 0.421 | 1.68 (1.13–2.50) | 0.01 | 1.18 (0.7–1.82) | 0.46 |
| Wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami | 2.91 (1.89–4.46) | <0.01 | 2.24 (1.41–3.54) | 0.01 | 2.63 (1.80–3.84) | <0.01 | 2.03 (1.35–3.05) | 0.01 |
Tabela 6: Jednowymiarowe i wielowymiarowe analizy regresji Coxa dla przeżycia całkowitego i przeżycia wolnego od progresji. Przedstawiono współczynniki hazardu oraz 95% przedziały ufności dla zmiennych kliniczno-patologicznych, podwyższonego poziomu poszczególnych biomarkerów oraz wysokiego skumulowanego obciążenia biomarkerami.
| Model | C-index kohorty treningowej | 1-letnia AUC treningowa | 3-letnia AUC treningowa | 5-letnia AUC treningowa | C-index walidacji zewnętrznej | 1-letnia AUC zewnętrzna | 3-letnia AUC zewnętrzna | 5-letnia AUC zewnętrzna | NRI vs TNM | IDI vs TNM |
| Sam stopień TNM | 0.62 | 0.701 | 0.676 | 0.648 | 0.641 | 0.672 | 0.651 | 0.628 | — | — |
| Sam panel biomarkerów | 0.703 | 0.74 | 0.713 | 0.689 | 0.681 | 0.709 | 0.687 | 0.66 | 0.18 | 0.049 |
| Model kliniczno-patologiczny | 0.736 | 0.72 | 0.748 | 0.721 | 0.708 | 0.741 | 0.719 | 0.694 | 0.153 | 0.061 |
| Model zintegrowany | 0.792 | 0.829 | 0.806 | 0.781 | 0.761 | 0.801 | 0.74 | 0.748 | 0.274 | 0.102 |
Tabela 7: Wydajność prognostyczna różnych modeli prognostycznych w kohortach treningowej i zewnętrznej walidacyjnej. Porównano wskaźnik C Harrella, zależną od czasu powierzchnię pod krzywą, netto poprawę reklasyfikacji oraz zintegrowaną poprawę dyskryminacji dla samego stopnia TNM, samego panelu biomarkerów, modelu kliniczno-patologicznego oraz modelu zintegrowanego.
Tabela uzupełniająca 1: Przesiew uczestników, wykluczenia i końcowy przydział do kohorty. Zestawiono liczbę osób poddanych badaniu przesiewowemu, powody wykluczenia, końcową populację analityczną, rozkład grup diagnostycznych oraz przydział kohorty do ośrodków.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 2: Powtarzalność międzyoznaczeniowa i międzyośrodkowa pomiaru biomarkerów w surowicy. Wyniki ślepego testowania pomostowego alikwotów surowicy zostały podsumowane przy użyciu międzyośrodkowych współczynników zmienności oraz współczynników korelacji wewnątrzklasowej dla CEA, SCC-Ag oraz CA125.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 3: Rozkład biomarkerów w surowicy i łączny ładunek biomarkerów w grupach diagnostycznych. Podsumowano rozkłady CEA, SCC-Ag i CA125 w surowicy dla poszczególnych grup oraz odsetek osób z wysokim łącznym ładunkiem biomarkerów u pacjentów z ESCC, w grupie kontrolnej z łagodną chorobą przełyku oraz w grupie kontrolnej osób zdrowych.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 4: Współczynniki modelu diagnostycznego i wewnętrzna walidacja metodą bootstrap. Podsumowano punkt przecięcia modelu diagnostycznego, współczynniki biomarkerów, szacunki jednowymiarowej i wielowymiarowej regresji logistycznej, wartość odcięcia dla kohorty treningowej, liczbę resampli bootstrap, skorygowaną o optymizm powierzchnię pod krzywą (AUC), nachylenie kalibracji oraz wynik Briera.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 5: Wyniki okresu obserwacji, śmiertelności w punktach kontrolnych, kalibracji i krzywych decyzyjnych dla walidacji prognostycznej. Podsumowano czas obserwacji, zdarzenia przeżycia, medianowy OS oraz PFS w podziale na grupy obciążenia biomarkerami; poprawę wskaźnika C-index; C-index skorygowany o optymizm; skumulowane prawdopodobieństwa śmiertelności w punktach kontrolnych; wyniki Brier score w walidacji zewnętrznej; nachylenia kalibracji oraz szacunki korzyści netto z krzywych decyzyjnych.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
W niniejszym badaniu przeprowadzonym w dwóch ośrodkach opracowano i zwalidowano zewnętrznie łączony panel biomarkerów surowiczych obejmujący CEA, SCC-Ag oraz CA125 w celu oceny diagnostycznej i prognostycznej w ESCC. Panel łączony wykazał wyższą skuteczność niż każdy z poszczególnych biomarkerów w różnicowaniu ESCC od kontroli nieзлоśliwych i zachował akceptowalną zdolność dyskryminacji w kohorcie walidacji zewnętrznej. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi badaniami nad ESCC, które wykazały, że surowicze markery nowotworowe mogą dostarczać istotnych klinicznie informacji diagnostycznych i prognostycznych, choć skuteczność pojedynczego markera jest często ograniczona przez nakładanie się cech biologicznych stanów złośliwych i nieзлоśliwych23,24. Głównym wkładem niniejszego badania jest zatem opracowanie powtarzalnego schematu postępowania opartego na trzech markerach, który integruje diagnozę przed leczeniem, korelację kliniczno-patologiczną oraz stratyfikację przeżywalności w ramach jednej struktury analitycznej.
Poprawiona wydajność połączonego panelu jest biologicznie uzasadniona, ponieważ CEA, SCC-Ag i CA125 odzwierciedlają częściowo różne procesy związane z nowotworem. SCC-Ag jest ściśle powiązany z nowotworami nabłonka płaskiego i wykazał najwyższą samodzielną wydajność diagnostyczną w tej kohorcie. CEA może odzwierciedlać masę guza, fenotyp inwazyjny oraz systemową aktywność złośliwą, podczas gdy CA125 może wychwytywać szersze sygnały zapalne, surowicze lub sygnały zaawansowanej choroby, a nie biologię specyficzną dla ESCC25,26. Umiarkowane korelacje pomiędzy trzema biomarkerami sugerują, że markery były ze sobą powiązane, ale nie były redundantne, co wspiera zastosowanie wspólnego modelowania zamiast polegania na pojedynczym pomiarze krążącym.
Wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami wiązało się z większymi guzami, chorobą w stopniu pT3–4, przerzutami do węzłów chłonnych oraz stopniem TNM III–IV, co wskazuje, że panel ten uchwycił sygnał diagnostyczny wykraczający poza prostą binarność. Wzór ten jest istotny klinicznie, ponieważ stopień anatomiczny pozostaje kluczowy w leczeniu ESCC, jednak pacjenci w tym samym stopniu mogą nadal różnić się agresywnością guza, obciążeniem systemowym i przeżywalnością27. Profil biomarkerów w surowicy może zatem pomóc w doprecyzowaniu oceny ryzyka przed leczeniem, szczególnie gdy klinicyści potrzebują dodatkowych informacji przed operacją, ostateczną chemioradioterapią, leczeniem systemowym lub zintensyfikowanym monitorowaniem. W analizie przeżywalności wysokie skumulowane obciążenie biomarkerami pozostało niezależnie powiązane z gorszym OS i PFS po skorygowaniu o główne zmienne kliniczno-patologiczne, a model zintegrowany wykazał wyższy wskaźnik C-index oraz zależne od czasu AUC niż sam stopień TNM28.
W porównaniu z modelami opartymi na obrazowaniu, radiomice, ekspresji genów lub modelami multiomicznymi, niniejszy panel wykazuje praktyczne zalety, ale ma węższy zakres biologiczny. Modele radiomiczne i transkryptomiczne mogą uchwycić heterogenność przestrzenną, cechy mikrośrodowiska guza oraz podtypy molekularne, a niektóre z nich wykazały obiecującą wartość prognostyczną w ESCC29,30. Jednak podejścia te często wymagają zstandaryzowanych protokołów obrazowania, zaawansowanych potoków obliczeniowych, wysokiej jakości próbek tkanek, platform sekwencyjnych lub specjalistycznego wsparcia bioinformatycznego. W przeciwieństwie do nich, CEA, SCC-Ag i CA125 są rutynowo oznaczane w wielu laboratoriach klinicznych, są stosunkowo tanie i mogą być powtarzane podczas obserwacji. Wartość kliniczna niniejszego panelu polega zatem na jego dostępności i zgodności z przepływem pracy, a nie na zdolności do zastąpienia obrazowania, patomorfologii, profilowania molekularnego lub stopniowania TNM.
Analizy kalibracji i krzywych decyzyjnych wspierają ostrożne wdrażanie do praktyki klinicznej. Zintegrowany model diagnostyczny wykazał akceptowalną kalibrację zarówno w kohorcie treningowej, jak i w zewnętrznej kohorcie walidacyjnej, a analiza krzywych decyzyjnych zasugerowała dodatnią korzyść netto w klinicznie istotnych zakresach progowych. Zintegrowany model prognostyczny wykazał również poprawioną dyskryminację oraz akceptowalną kalibrację w walidacji zewnętrznej. Wyniki te są istotne, ponieważ modele o wysokiej dyskryminacji mogą być wciąż słabo skalibrowane lub nieprzydatne klinicznie31. Poprzez raportowanie AUC, C-index, kalibracji, wyników Brier score oraz wyników krzywych decyzyjnych, niniejsze badanie zapewnia pełniejszą ocenę wydajności modelu niż badania opierające się wyłącznie na metrykach dyskryminacji lub współczynnikach hazardu.
Należy uznać kilka ograniczeń. Chociaż badanie obejmowało walidację zewnętrzną, ograniczyło się ono do dwóch ośrodków, a kohorta walidacyjna była mniejsza niż kohorta treningowa. Wartości biomarkerów mierzono wyłącznie w punkcie wyjścia przed leczeniem, zatem nie oceniano zmian podłużnych podczas terapii neoadjuwantowej, chemioradioterapii, nadzoru pooperacyjnego lub monitorowania nawrotów, mimo że seryjne trendy markerów nowotworowych mogą dostarczać dodatkowych informacji prognostycznych32. Panel surowiczy nie został bezpośrednio porównany z radiomiką, ekspresją genów, krążącym DNA nowotworowym ani innymi modelami płynnej biopsji w tej samej populacji pacjentów, a fałszywie dodatnie podwyższenia mogą wystąpić w stanach zapalnych, łagodnych lub przy chorobach współistniejących. Podsumowując, łączny panel surowiczy CEA, SCC-Ag i CA125 zapewnił lepszą dyskryminację diagnostyczną niż poszczególne biomarkery, był powiązany z niekorzystnymi cechami kliniczno-patologicznymi i poprawił stratyfikację prognostyczną po dodaniu go do konwencjonalnych zmiennych klinicznych. Przed rutynowym wdrożeniem klinicznym konieczna jest dalsza walidacja wieloośrodkowa, seryjna ocena biomarkerów oraz bezpośrednie porównanie z modelami opartymi na obrazowaniu i modelami molekularnymi.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują personelowi Wydziału Medycyny Laboratoryjnej w Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, szpitalu klinicznym Nanjing University of Chinese Medicine oraz Nanhu Community Health Service Center w Nanjing za wsparcie w zakresie pobierania próbek, badań laboratoryjnych i zarządzania danymi.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Access CEA Calibrators | Beckman Coulter | 33205 | Kalibracja do oznaczania CEA w surowicy |
| Access CEA Quality Control | Beckman Coulter | 33029 | Codzienna wewnętrzna kontrola jakości dla oznaczania CEA w surowicy |
| Access CEA Reagent Pack | Beckman Coulter | 33200 | Pomiar CEA w surowicy na systemie do analiz immunoenzymatycznych UniCel DxI 800 Access |
| Mikropipeta regulowana, 100–1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Aliquotowanie surowicy po wirowaniu |
| ARCHITECT CA 125 II Calibrators | Abbott Diagnostics | 02K4502 | Kalibracja do oznaczania CA125 w surowicy |
| ARCHITECT CA 125 II Controls | Abbott Diagnostics | 02K4511 | Codzienna wewnętrzna kontrola jakości dla oznaczania CA125 w surowicy |
| ARCHITECT CA 125 II Reagent Kit | Abbott Diagnostics | 02K4529 | Pomiar CA125 w surowicy na analizatorze immunoenzymatycznym ARCHITECT i2000SR |
| ARCHITECT i2000SR Immunoassay Analyzer | Abbott Diagnostics | i2000SR | Zautomatyzowana platforma do mikrocząsteczkowych analiz immunoenzymatycznych z chemiluminescencją do oznaczania SCC-Ag i CA125 |
| ARCHITECT SCC Calibrator | Abbott Diagnostics | 8D1801 | Kalibracja do oznaczania SCC-Ag w surowicy |
| ARCHITECT SCC Controls | Abbott Diagnostics | 8D1810 | Codzienna wewnętrzna kontrola jakości dla oznaczania SCC-Ag w surowicy |
| ARCHITECT SCC Reagent Kit | Abbott Diagnostics | 8D1828 | Pomiar SCC-Ag w surowicy na analizatorze immunoenzymatycznym ARCHITECT i2000SR |
| Drukarka etykiet kodów kreskowych | Brady | BMP51 | Oznakowanie kodami kreskowymi alikwotów surowicy i probówek kriogenicznych |
| Igła do pobierania krwi | BD Biosciences | 367286 | Obwodowe pobieranie krwi żylnej |
| Pojemnik do przechowywania kriogenicznego | Corning | 431131 | Zorganizowane przechowywanie zamrożonych alikwotów surowicy |
| Probówka kriogeniczna, 2,0 mL, gwint zewnętrzny, samostojąca | Corning | 430659 | Przechowywanie alikwotów surowicy z etykietami kodów kreskowych w temperaturze −80 °C |
| Formularz ekstrakcji danych i zdefiniowany słownik danych | Zespół badawczy | Not applicable | Ustandaryzowana ekstrakcja zmiennych klinicznych, patologicznych, laboratoryjnych oraz danych z obserwacji |
| Pakiet dcurves | R package | Version 0.4.0 | Analiza krzywych decyzyjnych i szacowanie klinicznej korzyści netto |
| System elektronicznej dokumentacji medycznej | Szpitale uczestniczące | Not applicable | Ekstrakcja danych demograficznych, klinicznych, dotyczących leczenia i obserwacji |
| Końcówki do pipet z filtrem, 100–1000 µL | Eppendorf | 30073594 | Aliquotowanie surowicy z kontrolą zanieczyszczeń |
| Pakiet ggplot2 | R package | Version 3.5.1 | Wizualizacja statystyczna i przygotowanie rycin |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 27.0 | Porównania bazowe i uzupełniająca weryfikacja statystyczna |
| Laboratoryjny system zarządzania informacją (LIMS) | Laboratorium szpitala uczestniczącego | Not applicable | Pobieranie i łączenie zapisów z testów biomarkerów w surowicy |
| Pakiet mice | R package | Version 3.16.0 | Wielokrotna imputacja za pomocą równań łańcuchowych |
| Pakiet nricens | R package | Version 1.6 | Analiza poprawy reklasyfikacji netto (NRI) |
| System raportowania patomorfologicznego | Szpitale uczestniczące | Not applicable | Potwierdzenie diagnozy ESCC, zmian łagodnych, cech guza oraz zmiennych związanych ze stopniem zaawansowania |
| Pakiet pROC | R package | Version 1.18.5 | Analiza krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) i porównanie metodą DeLonga |
| Oprogramowanie statystyczne R | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.2 | Analiza statystyczna, konstrukcja i walidacja modeli oraz generowanie rycin |
| Wirówka chłodząca | Eppendorf | 5810 R | Rozdział surowicy przez wirowanie przy 1,500 x g przez 10 min |
| Pakiet rms | R package | Version 6.8-1 | Analiza kalibracji, konstrukcja nomogramów i wsparcie dla modeli regresji |
| Probówka do pobierania krwi z żelem rozdzielającym, 5 mL | BD Biosciences | 367955 | Pobieranie obwodowej krwi żylnej na czczo do oznaczania biomarkerów w surowicy |
| Pakiet survival | R package | Version 3.5-7 | Regresja proporcjonalnego hazardu Coxa i analiza przeżycia |
| Pakiet survminer | R package | Version 0.4.9 | Wizualizacja krzywych Kaplana–Meiera |
| Formularz rejestracji telefonicznej obserwacji | Zespół badawczy | Not applicable | Gromadzenie i weryfikacja informacji o przeżyciu, nawrocie, progresji i ostatnim kontakcie |
| Pakiet timeROC | R package | Version 0.4 | Analiza zależnej od czasu krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) |
| Zamrażarka ultra-niskotemperaturowa | Thermo Fisher Scientific | TSX60086A | Przechowywanie alikwotów surowicy w temperaturze −80 °C |
| UniCel DxI 800 Access Immunoassay System | Beckman Coulter | DxI 800 | Zautomatyzowana platforma do analiz immunoenzymatycznych z chemiluminescencją do oznaczania CEA w surowicy |
Bibliografia
- Bray F, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2024;74(3):229-263.
- Huang Y, et al. Postoperative serum squamous cell carcinoma antigen and carcinoembryonic antigen predict overall survival in surgical patients with esophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 2023;13:1263990.
- Pi Y, et al. Validation of serum cystatin SN detection for diagnosis and poor prognosis of esophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 2024;14:1337707.
- Wang W, et al. A novel molecular and clinical staging model to predict survival for patients with esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(39):63526-63536.
- Puli SR, et al. Staging accuracy of esophageal cancer by endoscopic ultrasound: A meta-analysis and systematic review. World J Gastroenterol. 2008;14(10):1479-1490.
- Li T, et al. ESCCPred: A machine learning model for diagnostic prediction of early esophageal squamous cell carcinoma using autoantibody profiles. Br J Cancer. 2024;131(5):883-894.
- Guo JC, et al. Protein-coding genes combined with long noncoding RNA as a novel transcriptome molecular staging model to predict the survival of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Commun. 2018;38(1):4.
- Kosugi S, et al. Clinical significance of serum carcinoembryonic antigen, carbohydrate antigen 19-9, and squamous cell carcinoma antigen levels in esophageal cancer patients. World J Surg. 2004;28(7):680-685.
- Huang C, et al. Clinical significance of serum CA125, CA19-9, CA72-4, and fibrinogen-to-lymphocyte ratio in gastric cancer with peritoneal dissemination. Front Oncol. 2019;9:1159.
- Yang Y, et al. Clinical use of tumor biomarkers in prediction for prognosis and chemotherapeutic effect in esophageal squamous cell carcinoma. BMC Cancer. 2019;19(1):526.
- Wu LL, et al. Preoperative squamous cell carcinoma antigen and albumin serum levels predict the survival of patients with stage T1-3N0M0 esophageal squamous cell carcinoma: A retrospective observational study. J Cardiothorac Surg. 2020;15(1):115.
- Wu LL, et al. Prognostic modeling of patients undergoing surgery alone for esophageal squamous cell carcinoma: A histopathological and computed tomography based quantitative analysis. Front Oncol. 2021;11:565755.
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: Ethical principles for medical research involving human participants. JAMA. 2025;333(1):71-74.
- Moons KGM, et al. Transparent Reporting of a Multivariable Prediction Model for Individual Prognosis or Diagnosis (TRIPOD): Explanation and elaboration. Ann Intern Med. 2015;162(1):W1-W73.
- Riley RD, et al. Calculating the sample size required for developing a clinical prediction model. BMJ. 2020;368:m441.
- Amin MB, et al., editors. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. New York, NY: Springer; 2017.
- Rubin DB. Multiple Imputation for Nonresponse in Surveys. John Wiley & Sons; New York; 1987.
- DeLong ER, DeLong DM, Clarke-Pearson DL. Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: A nonparametric approach. Biometrics. 1988;44(3):837-845.
- Vickers AJ, Elkin EB. Decision curve analysis: A novel method for evaluating prediction models. Med Decis Making. 2006;26(6):565-574.
- Harrell FE Jr, Lee KL, Mark DB. Multivariable prognostic models: Issues in developing models, evaluating assumptions and adequacy, and measuring and reducing errors. Stat Med. 1996;15(4):361-387.
- Schoenfeld D. Partial residuals for the proportional hazards regression model. Biometrika. 1982;69(1):239-241.
- Royston P, Altman DG. External validation of a Cox prognostic model: Principles and methods. BMC Med Res Methodol. 2013;13:33.
- Mao W, et al. Clinical significance of preoperative serum tumor markers in esophageal squamous cell carcinoma. J Cancer Res Ther. 2014;10(Suppl):C179-C185.
- Hu J, et al. Prognostic significance of serum carcinoembryonic antigen and squamous cell carcinoma antigen in patients with esophageal squamous cell carcinoma undergoing radical esophagectomy. Transl Cancer Res. 2020;9(4):2460-2471.
- Mei X, et al. Predictive significance of CYFRA21-1, squamous cell carcinoma antigen and carcinoembryonic antigen for lymph node metastasis in patients with esophageal squamous cancer. Int J Biol Markers. 2019;34(2):200-204.
- Shimada H, et al. Prediction of survival with squamous cell carcinoma antigen in patients with resectable esophageal squamous cell carcinoma. Surgery. 2003;133(5):486-494.
- Rice TW, Patil DT, Blackstone EH. 8th edition AJCC/UICC staging of cancers of the esophagus and esophagogastric junction: Application to clinical practice. Ann Cardiothorac Surg. 2017;6(2):119-130.
- Qiao Y, et al. Tumor marker index based on preoperative SCC and CYFRA 21-1 is a significant prognostic factor for patients with resectable esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Biomark. 2019;25(3):243-250.
- Yang M, et al. Computed tomography-based radiomics in predicting T stage and length of esophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 2021;11:722961.
- Ye J, et al. Development and validation of a ferroptosis-related gene signature and nomogram for predicting the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma. Front Genet. 2021;12:697524.
- Van Calster B, Vickers AJ. Calibration of risk prediction models: Impact on decision-analytic performance. Med Decis Making. 2015;35(2):162-169.
- Hong Z, et al. Prognostic value of carcinoembryonic antigen changes before and after operation for esophageal squamous cell carcinoma. World J Surg. 2022;46(11):2725-2732.