Wykrywanie antygenów komórek odpornościowych wewnątrzguza w immunokompetentnym modelu komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego z wykorzystaniem immunohistochemii opartej na substracie

Sourav Chakraborty; Connor Howard; Checo J. Rorie; Robert H. Newman; Samuel D. Rabkin; Dipongkor Saha

doi:10.3791/72193

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie antygenów komórek odpornościowych wewnątrzguza w immunokompetentnym modelu komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego z wykorzystaniem immunohistochemii opartej na substracie

70 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72193

⸱

21 sierpnia 2026

Sourav Chakraborty¹ , Connor Howard¹ , Checo J. Rorie¹ , Robert H. Newman¹ , Samuel D. Rabkin² , Dipongkor Saha¹

¹Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, ²Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy, powtarzalny schemat immunohistochemii na podłożu, umożliwiający spójną detekcję pojedynczych i podwójnych antygenów w sekcjach tkanki nowotworowej pochodzącej z glejaka wielopostaciowego z komórek macierzystych, utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE). Protokół ten wspiera identyfikację różnych markerów immunologicznych i nowotworowych, rozwiązując jednocześnie problemy techniczne, z potencjalnym zastosowaniem w innych modelach nowotworowych.

Streszczenie

Glioblastoma (GBM) jest najczęstszym i najbardziej śmiertelnym pierwotnym nowotworem złośliwym mózgu, dla którego brakuje skutecznych terapii. Charakteryzuje się ono głęboko immunosupresywnym mikrośrodowiskiem guza, napędzanym częściowo przez oporne na leczenie komórki macierzystopodobne GBM (GSCs). W niniejszej pracy opisujemy powtarzalne protokoły immunohistochemii (IHC) jednobarwnej i dwubarwnej oparte na podłożu, służące do wykrywania antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych związanych z naciekającymi guz immunokomórkami w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) przekrojach guza mózgu. Guzy mózgu pochodziły z mysich GSCs, które zostały wszczepione ortotopowo immunokompetentnym myszom. Procedura IHC jednobarwnej wykorzystuje chromogenny system detekcji oparty na peroksydazie chrzanowej (HRP) do wizualizacji pojedynczych antygenów komórek odpornościowych, natomiast procedura IHC dwubarwnej wykorzystuje sekwencyjną strategię barwienia opartą na fosfatazie zasadowej (AP) do jednoczesnego wykrywania dwóch antygenów komórek odpornościowych w tym samym przekroju tkanki, w tym procedury wykorzystujące przeciwciała pierwotne pochodzące od tego samego gatunku gospodarza. Metody te stanowią praktyczne i powtarzalne ramy dla analizy chromogennej antygenów związanych z naciekającymi guz komórkami odpornościowymi w tkankach GBM i mogą być dostosowane do innych przedklinicznych modeli nowotworowych, a potencjalnie również do ludzkich preparatów FFPE.

Wprowadzenie

Glioblastoma (GBM) jest agresywnym, silnie inwazyjnym i heterogennym pierwotnym złośliwym nowotworem mózgu, wiążącym się ze słabymi rokowaniami przeżycia pacjentów mimo stosowania obecnych standardowych terapii¹. Charakterystyczną cechą GBM jest głęboko immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME), które przyczynia się do oporności na strategie immunoterapeutyczne²^,³. Immunosupresję w GBM napędza wiele mechanizmów, w tym ograniczona infiltracja efektorowych limfocytów T oraz indukcja dysfunkcji i wyczerpania limfocytów T⁴. Ponadto komórki macierzystopodobne GBM (GSCs), będące subpopulacją komórek GBM, dodatkowo wspomagają unikanie odpowiedzi immunologicznej poprzez utrzymywanie immunologicznie „zimnego” TME, charakteryzującego się ograniczoną aktywnością cytotoksyczną układu odpornościowego⁵. Cechy te podkreślają znaczenie dokładnej charakterystyki populacji infiltrujących guz komórek odpornościowych oraz ich stanów funkcjonalnych w TME GBM.

Immunohistochemia (IHC) pozostaje jedną z najpowszechniej stosowanych metod oceny nacieku komórek odpornościowych w tkankach nowotworowych, ponieważ pozwala na zachowanie architektury tkanki, umożliwiając jednocześnie wizualizację, lokalizację i półilościową ocenę markerów komórkowych in situ⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Poprzednie badania immunohistochemiczne i immunoprofilowania znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat krajobrazu immunologicznego GBM i pozwoliły zidentyfikować populacje komórek odpornościowych związanych z progresją nowotworu oraz odpowiedzią terapeutyczną¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Jednobarwna chromogenna IHC jest szczególnie użyteczna w wykrywaniu pojedynczych markerów odpornościowych w przekrojach tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE)¹²^,¹³^,¹⁵^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Z kolei dwubarwna chromogenna IHC umożliwia jednoczesną wizualizację dwóch markerów w tym samym przekroju tkanki, co ułatwia ocenę fenotypu komórkowego, proliferacji lub stanu aktywacji¹²^,¹⁹^,²¹.

Pomimo tych postępów, praktyczne i zstandaryzowane protokoły chromogennej IHC oparte na substratach, które można zastosować w immunokompetentnych modelach GBM pochodzących z GSC, pozostają ograniczone. Co więcej, chromogenna IHC w przypadku GBM jest trudniejsza niż w wielu innych guzach litych ze względu na rzadką i heterogenną infiltrację komórek odpornościowych, rozległą heterogenność wewnątrznowotworową oraz silnie immunosupresywne i złożone TME, co utrudnia dokładną wizualizację i interpretację wielu populacji komórkowych w obrębie tego samego skrawka tkanki²^,³^,⁴. Podwójna chromogenna IHC stwarza dodatkowe wyzwania techniczne, szczególnie gdy oba przeciwciała pierwszorzędowe zostały wytworzone u tego samego gatunku gospodarza, co wymaga starnej optymalizacji kompatybilności przeciwciał, strategii sekwencyjnego barwienia w celu jednoczesnej detekcji dwóch antygenów w obrębie jednego skrawka tkanki oraz wyboru substratu chromogennego, aby zapewnić wyraźne rozróżnienie markerów w mikroskopii świetlnej.

W niniejszej pracy opisujemy powtarzalne protokoły IHC oparte na substratach, w wersji jednobarwnej i dwubarwnej, które skutecznie wykrywają reprezentatywne antygeny powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe związane z naciekającymi guz immunokompetentnymi komórkami w ortotopowym modelu GBM pochodzącym z 005 GSC²²^,²³^,²⁴. Te chromogenne protokoły IHC oparte na substratach mogą zostać zaadaptowane do innych przedklinicznych modeli nowotworowych, a potencjalnie również do ludzkich próbek nowotworowych utrwalonych w FFPE. Pobrane tkanki mózgu myszy utrwalano w 10% neutralnie buforowanej formalinie przez noc (~12 h) przed rutynowym przygotowaniem tkanek i zatopieniem w parafinie, zgodnie z wcześniejszymi opisami¹⁹. Bloki FFPE przecinano (grubość 5 µm¹⁹) na dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe i przechowywano w temperaturze pokojowej do momentu użycia. Jednobarwna IHC wykorzystuje chromogenny system detekcji oparty na peroksydazie chrzanowej (HRP) z wykorzystaniem 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) jako substratu w celu wygenerowania brązowego sygnału umożliwiającego wizualizację poszczególnych antygenów pod mikroskopem świetlnym. Ten schemat postępowania jest odpowiedni do wykrywania zarówno antygenów związanych z błoną komórkową, jak i antygenów wewnątrzkomórkowych w sekcjach tkanek FFPE.

Dwukolorowa IHC umożliwia jednoczesne wykrywanie dwóch antygenów w tym samym przekroju tkanki, lecz wymaga dodatkowej optymalizacji w celu zapewnienia kompatybilności przeciwciał i wyraźnej separacji sygnałów chromogennych. Barwienie dwukolorowe IHC jest stosunkowo proste, gdy przeciwciała pierwszorzędowe zostały wytworzone u różnych gatunków gospodarzy, co pozwala na zastosowanie gatunkowo specyficznych przeciwciał wtórnych. Jednakże jednoczesne wykrywanie staje się bardziej wymagające technicznie, gdy oba przeciwciała pierwszorzędowe pochodzą od tego samego gatunku gospodarza. Aby rozwiązać ten problem, opisany tutaj schemat pracy dwukolorowej IHC wykorzystuje strategię sekwencyjnego barwienia chromogennego opartego na fosfatazie zasadowej (AP) z użyciem odrębnych substratów, co pozwala na wyraźne rozróżnienie wizualne sygnałów dwóch antygenów w mikroskopii świetlnej.

Oba schematy obejmują etapy deparafinowania tkanek, rehydratacji, odsłaniania antygenów, blokowania, barwienia, odwodnienia, przejaśniania i montowania. Przygotowanie odczynników ma kluczowe znaczenie dla jakości barwienia i powtarzalności wyników (patrz Supplementary File 1). Podobnie, odpowiednie rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych są krytyczne dla sukcesu protokołu barwienia; rozcieńczanie wykonuje się bezpośrednio przed użyciem w 2,5% normalnym surowicy konia lub kozy, w zależności od gatunku gospodarza odpowiadającego przeciwciała wtórnego (patrz Table 1). W Table 2 przedstawiono również listę gatunkowo specyficznych przeciwciał wtórnych stosowanych do barwienia jednobarwnego i dwubarwnego. IHC jednobarwne wykorzystuje odczynniki do przejaśniania i montowania na bazie ksylenu, natomiast IHC dwubarwne wymaga alternatyw wolnych od ksylenu (np. Histo-Clear), ponieważ substrat jest częściowo rozpuszczalny w ksylenie (patrz lista substratów w Table 3).

Protokół

Niniejszy protokół został przeprowadzony zgodnie ze wszystkimi właściwymi wytycznymi regulacyjnymi i instytucjonalnymi, w tym wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) (numery protokołów IACUC: 2004N000067 oraz LA24-0045).

UWAGA: Kilka etapów w protokołach IHC jednobarwnej i dwubarwnej obejmuje odczynniki łatwopalne, w tym etanol i środki do przejaśniania tkanek. W związku z tym procedury z wykorzystaniem chemikaliów łatwopalnych, w tym deparafinizacja, rehydratacja, dehydratacja, przejaśnianie i montowanie, powinny być wykonywane w certyfikowanej szafce z wyciągiem chemicznym z zachowaniem odpowiednich zasad bezpieczeństwa laboratoryjnego. Odczynniki łatwopalne należy przygotowywać i przechowywać w prawidłowo oznakowanych, szklanych pojemnikach z nakrętką w wyznaczonych szafach do przechowywania materiałów łatwopalnych, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa. Materiały i objętości odczynników są dostosowane do przetwarzania partii do 48 szkiełek przedmiotowych (dwie kasetki do barwienia, po 24 szkiełka na kasetkę), choć schemat pracy można łatwo przeskalować w zależności od potrzeb doświadczalnych.

1. Jednobarwna IHC dla przekrojów guza mózgu utrwalonych w FFPE

UWAGA: Poniższy protokół opisuje substratową immunohistochemię (IHC) jednobarwną do wykrywania reprezentatywnych antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w preparatach FFPE guza mózgu pochodzących z ortotopowego modelu 005 GSC.

Deparafinizacja (20 min):
1. Umieść preparaty w statywie do szkiełek wykonanym z polioksymetylenu (POM), a następnie zanurz statyw w pojemnikach do barwienia – najpierw w ksylenie I, a potem w ksylenie II, po 10 min w każdym z nich, pracując w dygestorium. Upewnij się, że podczas deparafinizacji skrawki tkanek pozostają całkowicie zanurzone w ksylenie.
  UWAGA: Ten etap należy przeprowadzić w komorze z wyciągiem chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI), w tym fartuch laboratoryjny, gogle ochronne, maskę ochronną i rękawice. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków na tym etapie ani w żadnym z kolejnych kroków, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki i utratę skrawków. Roztwory ksylenu należy przechowywać w szczelnych szklanych pojemnikach i wykorzystywać ponownie, jeśli wyglądają na czyste.
Stopniowa rehydratacja (15 min):
1. Rehydratyzuj skrawki sekwencyjnie w etanolu o stężeniach 100%, 90% i 70% przez 5 min w każdym roztworze. W tym celu zanurz preparaty w 100% etanolu w pojemniku do barwienia na 5 min (następnie przelej 100% etanol z powrotem do szklanej butelki w celu ponownego użycia), następnie w 90% etanolu przez 5 min (następnie przelej go do butelki) i na koniec w 70% etanolu przez 5 min (następnie przelej go do butelki).
  UWAGA: Ten krok należy przeprowadzić pod dygestorium chemicznym, stosując środki ochrony indywidualnej (PPE) zgodnie z opisem w kroku 1.1. Roztwory etanolu można wykorzystywać wielokrotnie w różnych eksperymentach, pod warunkiem że są przechowywane w szczelnych szklanych pojemnikach i wyglądają na czyste.
Płukanie wodą (5 min):
1. Przenieś preparaty do wody destylowanej na 5 min, co kończy proces rehydratacji.
  UWAGA: Podczas wykonywania tego kroku należy przygotować od 600 ml (dla 1 statywy do slajdów) do 800 ml (dla 2 statyw do slajdów) 1× roztwór buforu do odmaskowywania antygenów (bufor cytrynian sodu 10 mM) w zlewce szklanej o pojemności 2 l nadającej się do użycia w kuchence mikrofalowej, zgodnie z wymienionymi instrukcjami w pliku uzupełniającym 1.
Odmaskowanie antygenów (~20 min):
1. Zlewkę o pojemności 2 l zawierającą świeżo przygotowany bufor do odzyskiwania antygenu z 10 mM cytrynianu sodu należy przykryć folią spożywczą, aby zapobiec nadmiernemu odparowaniu podczas wstępnego podgrzewania oraz przedłużonego ogrzewania w kuchence mikrofalowej.
2. W folii spożywczej należy wykonać kilka otworów, aby zapobiec wyrzuceniu buforu na zewnątrz w wyniku nadmiernego ciśnienia powstającego podczas gotowania skrawków tkanki.
  UWAGA: Stosować ŚOI zgodnie z opisem w kroku 1.1.
3. Podgrzewać świeżo przygotowany 10 mM bufor cytrynianowy do odmaskowania antygenów przez 3 min. Umieścić statyw z kasetkami zawierającymi rehydratyzowane skrawki tkanek w uprzednio podgrzanym roztworze do odmaskowania antygenów.
4. Następnie poddać przekroje tkanek działaniu mikrofal przez 15 min przy najwyższej mocy mikrofalowej (np. P10), uważnie monitorując zlewkę, aby upewnić się, że przekroje pozostają zanurzone i nie wysychają w wyniku odparowania.
  UWAGA: Alternatywnie można przeprowadzić odsłanianie antygenów w plastikowej kuwecie do barwienia umieszczonej w parowarze przez około 15 min, co zapewnia łagodniejszą metodę ogrzewania wymagającą mniejszego nadzoru. Bufor cytrynian sodu (10 mM, pH 6,0) został pomyślnie zwalidowany i zastosowany jako bufor do odsłaniania antygenów dla wszystkich wymienionych przeciwciał pierwszorzędowych w Tabela 1. W zależności od przeciwciała pierwszorzędowego oraz zaleceń producenta, w przypadku przeciwciał niewykorzystanych w niniejszym badaniu mogą być wymagane inne bufory, takie jak EDTA lub Tris-EDTA.
Chłodzenie (10–20 min):
1. Wyjąć zlewkę z kuchenki mikrofalowej, ustawić ją na blacie roboczym i pozostawić do ochłodzenia do temperatury pokojowej przez 20 min. Aby przyspieszyć chłodzenie, można umieścić zlewkę w lodowatej wodzie z kranu na ok. 10 min.
  OSTRZEŻENIE: Przedmiot będzie bardzo gorący; należy użyć odpowiednich rękawic odpornych na wysoką temperaturę lub kleszczy do chwytania zlewkowych. Stosować Środki Ochrony Indywidualnej (ŚOI), zgodnie z opisem w kroku 1.1.
Płukanie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) (~10 min):
1. Wyjmij statyw z przedmiotami z zlewki i zanurz preparaty w 1× roztwór DPBS w pojemniku do barwienia.
2. Przepłucz skrawki dwukrotnie w 1× DPBS przez 5 min każdorazowo, stosując delikatne, statyczne płukanie, aby uniknąć odklejenia się tkanki.
Bariera hydrofobowa (<1 min/preparat):
1. Podczas płukania w DPBS (krok 1.6) należy ostrożnie wyjmować pojedynczo każde szkiełko i delikatnie przecierać obszar wokół skrawka tkanki chusteczkami bezpyłowymi (np. Kim Wipes), unikając kontaktu z samą tkanką.
2. Należy użyć bariery hydrofobowej, takiej jak pisak PAP (peroksydaza-antyperoksydaza), aby obrysować każdą sekcję tkanki barierą odpychającą ciecz, a następnie umieścić preparat ponownie w roztworze płuczącym DPBS w pojemniku do barwienia. Powtórzyć te kroki dla wszystkich szkiełek.
  UWAGA: Hydrofobowa bariera wokół tkanki zapobiega przedostawaniu się odczynników między sekcjami i pomaga w zatrzymaniu przeciwciał na tkance.
Blokowanie endogennej peroksydazy (5 min):
1. Odrzuć 1× DPBS z pojemnika do barwienia, a następnie dodać 3% H₂O₂ roztwór, zapewniając całkowite zanurzenie preparatów lub skrawków tkanek przez 5 min.
  UWAGA: Przedłużona inkubacja w 3% H₂O₂ może uszkodzić tkankę. Blokowanie endogennej aktywności peroksydazy jest kluczowym etapem w celu zapobieżenia wystąpieniu tła spowodowanego przez peroksydazę endogenną podczas procesu utrwalania barwy. Należy stosować Środki Ochrony Indywidualnej (PPE), zgodnie z opisem w punkcie 1.1.
Przemywanie w DPBS (~12 min):
1. Odlać 3% H2O2₂O₂ roztworze, a następnie ponownie wypłukać preparaty w 1× DPBS dwukrotnie po 5 min każdorazowo.
2. Po drugim płukaniu należy wyjąć preparaty z koszyczka, ułożyć je płasko w komorze nawilżającej i dodać wodę destylowaną na krawędzie komory.
3. Nie dopuścić do wyschnięcia przekrojów i niezwłocznie przejść do blokowania w kroku 1.10.
  UWAGA: Każda z wymienionych komór nawilżania w Tabela materiałów posiada miejsce na 30 slajdów i może pomieścić taką liczbę preparatów.
Blokowanie surowicą (~70 min):
1. Dodaj 50 µL roztworu 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na każdy przekrój i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, pozostawiając zamkniętą pokrywę komory nawilżonej, aby zapobiec odparowywaniu buforu blokującego z przekrojów tkankowych.
2. Po 30 min delikatnie ostukaj preparaty o bezpyłowe chusteczki położone na blacie, aby usunąć BSA.
3. Następnie dodać 2,5% normalnego surowicy konia lub kozy (jedna kropla na przekrój), dopasowanej do gatunku gospodarza przeciwciała wtórnego, i inkubować przekroje przez kolejne 30 min w temperaturze pokojowej z zamkniętą pokrywą komory nawilżającej, delikatnie osuszyć preparaty na papierze chłonnym lub ściereczkach beztkaninowych, aby usunąć surowicę, i niezwłocznie przejść do kroku 1.11.
  UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia przekrojów. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w odpowiednim buforze blokującym (patrz Tabela 1) pod koniec etapu blokowania, aby były gotowe do użycia w kroku 1.11 po zakończeniu blokowania.
Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (~16 h):
1. Nanieść ~50 µl przeciwciał pierwszorzędowych, optymalnie rozcieńczonych w odpowiednim buforze blokującym (patrz Tabela 1), do skrawków tkanek i inkubować przez noc (~16 h) w temperaturze 4 °w komorze z nawilżeniem.
  UWAGA: Należy upewnić się, że wyznaczone obszary komory nawilżającej są wypełnione wodą destylowaną, aby utrzymać wilgotność komory przez noc. Ponadto należy podjąć środki ostrożności, aby upewnić się, że wyznaczone obszary/komory na preparaty tkankowe nie są wypełnione wodą destylowaną, ponieważ może to doprowadzić do zalania skrawków tkanek.
Płukanie w DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Umieść statyw na szkiełka w pojemniku do barwienia i wypełnij go buforem płuczącym (1× DPBS, 0,1% Tween 20).
2. Po inkubacji przez noc wyjmij preparaty z komory wilgotnościowej, usuń przeciwciała pierwszorzędowe, delikatnie stukając preparatami o papier chłonny, a następnie umieść preparaty w statywie zanurzonym w buforze do płukania (1× (DPBS, 0,1% Tween 20) w pojemniku do barwienia, a następnie usunąć bufor do płukania.
3. Następnie należy przemyć skrawki w 1× płuczyć w DPBS (0,1% Tween 20) trzykrotnie przez 5 min za każdym razem, a następnie wyjąć preparaty z koszyczka i ułożyć je płasko w komorze nawilżanej i niezwłocznie przejść do kroku 1.13.
  UWAGA: Czas każdego płukania można wydłużyć do 10–15 min, jeśli po rozwinięciu barwy w kroku 1.15 zaobserwowano wysokie zabarwienie tła. Płukanie powinno być delikatne i statyczne (bez kołysania lub wstrząsania), aby zapobiec odklejeniu się tkanki od szkiełek.
Inkubacja z przeciwciałem wtórnym (~32–35 min):
1. Dodaj jedną kroplę/sekcję odpowiedniego przeciwciała wtórnego sprzężonego z HRP (anty-króliczego lub anty-szczurzego IgG, zależnie od potrzeb; zobacz Tabela 2) i inkubować skrawki tkanek przez 30 min w temperaturze pokojowej z zamkniętą pokrywą komory nawilżanej.
  UWAGA: Przeciwciało wtórne można rozcieńczyć w stosunku 1:1 w PBS, aby zmniejszyć tło w kroku 1.15.
Płukanie w DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym należy wyjąć preparaty z komory nawilżającej i delikatnie odstukać je o papier chłonny, aby usunąć nadmiar przeciwciał wtórnych.
2. Następnie umieść preparaty na szkiełkach w statywie do szkiełek zanurzonym w buforze płuczącym (1× (DPBS z 0,1% Tween 20) do pojemnika do barwienia w celu krótkiego przemycia, a następnie odrzucić bufor do przemywania.
3. Następnie należy trzykrotnie przemyć skrawki tkanek w 1× DPBS (0,1% Tween 20) przez 5 min każdorazowo.
  1. Przed rozpoczęciem etapu ujawniania chromogenu (tj. kroku 1.15), umieść oddzielny koszyczek na szkiełka w pojemniku do barwienia wypełnionym wodą destylowaną; jest to krok przygotowawczy do etapu 1.16, służący zatrzymaniu reakcji chromogenicznej.
  2. Podczas ostatniego płukania należy przygotować świeży roztwór roboczy DAB (1 kropla chromogenu na 1 ml substratu; patrz Plik uzupełniający 1).
Wywoływanie chromogenu (30 s–5 min):
1. Po trzecim płukaniu w kroku 1.14 należy wyjąć slajdy z kasety i położyć je płasko na blacie roboczym z białym tłem.
2. Nanieść 50 µL roztworu roboczego DAB do każdego skrawka i wizualnie monitorować pojawienie się brunatnego zabarwienia na białym tle lub pod mikroskopem świetlnym.
  UWAGA: Należy stosować Środki Ochrony Indywidualnej (PPE) zgodnie z krokiem 1.1. Użycie białego papieru chłonnego ułatwia wizualizację powstawania brązowego zabarwienia podczas etapu stosowania chromogenu DAB. Rozwój barwy może trwać od 20 do 60 s w przypadku niektórych markerów i od 2 do 5 min w przypadku innych (szczegóły w kroku 1.16).
Zatrzymanie reakcji (1–2 min):
1. Gdy tylko w kroku 1.15 pojawi się pożądany brązowy sygnał barwny, należy natychmiast przerwać reakcję, zanurzając preparat na szkiełku w pojemniku z wodą destylowaną przygotowanym w kroku 1.14.3.1.
2. Płucz preparaty na szkiełkach w wodzie destylowanej przez 1 min. Odlej wodę destylowaną, a następnie przejdź do kroku 1.17 (barwienie kontrastowe).
  UWAGA: Preparaty na szkiełkach mogą pozostawać w wodzie destylowanej do 1 h bez wpływu na barwienie. Czas wymagany do wybarwienia determinuje moment rozpoczęcia etapu zatrzymania reakcji. Ponadto, w przypadku obecności 2–3 markerów (takich jak CD3, CD4, CD8 lub innych) na tym samym szkiełku (co ma miejsce w niniejszym badaniu), czas reakcji może być różny; na przykład w opisanym tutaj układzie wybarwienie trwa zazwyczaj około 30 s dla CD8⁺ komórki, 1–3 min dla CD3⁺ lub CD4⁺ komórek, lub dłużej (3–5 min) w przypadku granzymu B⁺ oraz Ki67⁺ komórek. Ze względu na różnice w czasie rozwoju barwy nie można zanurzyć całego preparatu w wodzie destylowanej w celu zatrzymania reakcji. Zamiast tego należy zatrzymać każdą reakcję oddzielnie dla każdego wycinka, dodając 200–300 µL wody destylowanej bezpośrednio na każdą sekcję.
Kontrastowanie (<1 min):
1. Aby zwiększyć kontrast w stosunku do brązowego barwienia, należy dodać do pojemnika z barwnikiem rozcieńczoną hematoksylinę (1:3 w wodzie destylowanej), dbając o to, aby preparaty pozostawały zanurzone w rozcieńczonej hematoksylinie przez około 10–20 s.
  UWAGA: Jeśli tło DAB jest intensywne, należy wydłużyć czas barwienia kontrastowego (do 1 min) lub krótko zastosować niebezpieczoną hematoksylinę.
Płukanie wodą z kranu (6 min):
1. Wylać hematoksylinę z pojemnika do barwienia i przelać ją z powrotem do szklanej butelki w celu ponownego wykorzystania.
2. Płukać preparaty w wodzie z kranu przez 1 min, a następnie płukać w wolno płynącej wodzie z kranu przez 5 min, kierując skrawki w stronę przeciwną do bezpośredniego strumienia wody. Odlać wodę z kranu i przejść do kroku 1.19.
  UWAGA: Pozostałe etapy aż do momentu montowania preparatu należy przeprowadzać w dygestorium.
Stopniowe odwadnianie (15–17 min):
1. Zanurzyć preparaty w 70% etanolu w pojemniku do barwienia na 5 min (następnie przelać 70% etanol z powrotem do szklanej butelki w celu ponownego użycia), następnie w 90% etanolu przez 5 min (następnie przelać go do butelki) i na koniec w 100% etanolu przez 5 min (następnie przelać go do butelki).
2. Przejdź do kroku 1.20.
  UWAGA: Ten etap należy przeprowadzić w dygestorium. W procesie odwadniania stosuje się te same roztwory etanolu, co w kroku 1.2; można je wykorzystać wielokrotnie, o ile pozostają czyste.
Przejaśnianie:
1. Do oczyszczenia przekrojów tkankowych/preparatów należy użyć tych samych roztworów ksylenu I i II, które zostały wykorzystane do deparafinizacji (krok 1.1).
2. Najpierw zanurzcie preparaty na szkiełkach w roztworze ksylenu I w pojemniku do barwienia na 10 min (następnie przelejcie ksylen I z powrotem do szklanej butelki w celu ponownego użycia), a następnie w roztworze ksylenu II przez kolejne 10 min.
3. Przechowywać preparaty w ksylenie II do momentu zakończenia montowania (tj. kroku 1.21).
  UWAGA: Na tym etapie nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków, ponieważ stają się one wtedy kruche; w związku z tym, w razie potrzeby, skrawki mogą pozostać w ksylenie II dłużej w celu przygotowania do montażu.
Montowanie:
1. Wyjmujaj slajdy pojedynczo z ksylenu II i układaj je płasko w dygestorium. Nanieś jedną kroplę medium montażowego na bazie ksylenu na szkiełko zakrywo we właściwej wielkości, a następnie połóż szkiełko zakrywo na slajdzie, tak aby medium montażowe stykało się z przekrojami tkanek.
2. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe kciukiem, aby równomiernie rozprowadzić medium montażowe na wszystkich trzech przekrojach i usunąć pęcherzyki powietrza.
  UWAGA: 24 × do przykrycia trzech skrawków na szkiełku przedmiotowym wymagane jest szkiełko nakrywkowe o wymiarach 50 mm; 24 × szkiełko zakrywkowe 40 mm dla dwóch przekrojów; oraz 24 × szkiełko zakryjące 24 mm dla jednego przekroju. Ważne jest, aby montaż każdego preparatu zakończyć w ciągu 30 s, ponieważ medium montażowe może szybko wysychać z powodu stałego przepływu powietrza w dygestorium, co powoduje szybkie odparowanie ksylenu II z preparatu i sprawia, że przekroje stają się kruche.
Suszenie na powietrzu i mikroskopia świetlna:
1. Osuszit preparaty na powietrzu w dygestorium przez co najmniej 2 h przed oceną i obrazowaniem przy użyciu mikroskopu świetlnego. Po wyschnięciu przechowywać zamontowane preparaty w kasetkach na szkiełka w temperaturze pokojowej przez lata.

2. Dwukolorowa IHC dla przekrojów guzów mózgu utrwalonych w FFPE

UWAGA: Poniższy protokół opisuje dwukolorową chromogenną procedurę IHC opartą na substratach, służącą do jednoczesnego wykrywania dwóch antygenów w tym samym przekroju guza mózgu utrwalonego w FFPE. W porównaniu z jednobarwną IHC, procedura dwukolorowa jest bardziej czasochłonna, ponieważ wymaga sekwencyjnych cykli barwienia z niezależnymi inkubacjami przeciwciał pierwszorzędowych, w tym etapów inkubacji nocnej dla każdej rundy barwienia. Niemniej jednak, ten rozszerzony schemat postępowania umożliwia wiarygodne, jednoczesne wykrywanie antygenów w tym samym przekroju tkanki, przy jednoczesnym zachowaniu morfologii tkanki i wyraźnej separacji sygnałów chromogennych w mikroskopii świetlnej.

Deparafinizacja (20 min):
1. Należy przeprowadzić proces deparafinizacji analogicznie do procedury IHC jednobarwnej opisanej w kroku 1.1 w dygestorium chemicznym, stosując jednak środki rozjaśniające bezksylowe (np. Histo-Clear I i Histo-Clear II zamiast ksylenu).
  UWAGA: Należy stosować środki ochrony osobistej (PPE) zgodnie z krokiem 1.1 i wykonywać ten etap w dygestorium chemicznym. Zaleca się stosowanie preparatów Histo-Clear, ponieważ chromogen jest częściowo rozpuszczalny w ksylenie, a przetwarzanie bezksylowe pomaga zachować intensywność barwienia podczas IHC dwubarwnej. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków. Roztwory rozjaśniające można wykorzystać ponownie, jeśli są przechowywane w szczelnych szklanych pojemnikach i pozostają czyste.
Stopniowa rehydratacja (15 min):
1. Analogicznie do procedury IHC jednobarwnej opisanej w kroku 1.2. Skrawki należy rehydratować sekwencyjnie, stopniowo zmniejszając stężenie etanolu (100%, 90% i 70%), przez 5 min w każdym kroku.
  UWAGA: Należy zastosować oddzielny zestaw bezksylowego etanolu o różnych stężeniach, ponieważ etanol użyty do IHC jednobarwnej w kroku 1.2 jest prawdopodobnie zanieczyszczony ksylenem II.
Płukanie wodą (5 min):
1. Analogicznie do procedury IHC jednobarwnej w kroku 1.3; szkiełka należy umieścić w wodzie destylowanej na 5 min, aby zakończyć proces rehydratacji.
  UWAGA: Analogicznie do kroku 1.3; w ciągu tych 5 min należy przygotować roztwór do odsłaniania antygenów.
Odsłanianie antygenów (~20 min): Należy zastosować tę samą procedurę odsłaniania antygenów, co w przypadku IHC jednobarwnej w kroku 1.4.
Chłodzenie (10–20 min): Należy zastosować ten sam proces chłodzenia, co opisano dla IHC jednobarwnej w kroku 1.5.
Płukanie w DPBS (10 min): Należy przeprowadzić proces wypłukiwania roztworu do odsłaniania antygenów zgodnie z instrukcją dla IHC jednobarwnej w kroku 1.6.
Bariera hydrofobowa (<1 min/szkiełko):
1. Podczas płukania w DPBS w kroku 2.6 należy utworzyć barierę hydrofobową wokół skrawków tkanek, stosując tę samą procedurę/protokół, co w kroku 1.7.
2. Za pomocą pisaka do barier hydrofobowych należy narysować barierę odpychającą ciecz wokół każdego skrawka tkanki, a następnie ponownie umieścić szkiełko w roztworze płuczącym DPBS w pojemniku do barwienia. Kroki te należy powtórzyć dla wszystkich szkiełek.
Blokowanie fosfatazy alkalicznej (5 min):
1. Po utworzeniu barier hydrofobowych na wszystkich skrawkach tkanek, należy wyjąć szkiełka z pojemnika do barwienia, położyć je płasko w komorze nawilżanej, dodać jedną kroplę roztworu blokującego endogenną fosfatazę alkaliczną (np. BLOXALL) na każdy skrawek i inkubować przez 5 min. Następnie należy niezwłocznie przejść do kroku 2.9.
  UWAGA: Ponieważ w protokole IHC dwubarwnej stosuje się przeciwciała wtórne sprzężone z AP, niezbędne jest zablokowanie aktywności endogennej fosfatazy alkalicznej, aby zredukować sygnał tła podczas rozwoju koloru czerwonego lub niebieskiego. Roztwór blokujący BLOXALL jest tutaj stosowany w celu zahamowania endogennej fosfatazy alkalicznej. Hamuje on również endogenną peroksydazę, zatem roztwór blokujący ten można stosować w protokole IHC jednobarwnej do blokowania aktywności endogennej peroksydazy zamiast 3% roztworu H₂O₂.
Płukanie w DPBS (10 min):
1. Szkiełka należy płukać w roztworze 1× DPBS w pojemniku do barwienia dwukrotnie przez 5 min każde płukanie.
2. Po drugim płukaniu należy wyjąć szkiełka z pojemnika do barwienia, położyć je płasko w komorze nawilżanej i dodać wodę destylowaną na krawędzie komory.
  UWAGA: Nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków, dlatego należy niezwłocznie przystąpić do blokowania niespecyficznego wiązania antygen-przeciwciało w kroku 2.10.
Blokowanie surowicą (~70 min):
1. Należy zastosować ten sam proces blokowania surowicą, co w protokole IHC jednobarwnej opisanym w kroku 1.10.
  1. Najpierw należy blokować uniwersalnym buforem blokującym (5% BSA; 50 µL/skrawek) przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie 2,5% normalną surowicą konia (jedna kropla/skrawek), dopasowaną do gatunku gospodarza wtórnego przeciwciała anty-rabbit IgG sprzężonego z AP, przez kolejne 30 min w temperaturze pokojowej z zamkniętą pokrywą komory nawilżanej.
  2. Po tym czasie należy delikatnie otrzepać szkiełka o papier chłonny, aby usunąć surowicę, a następnie przejść do kroku 2.11.
    UWAGA: W ostatniej minucie etapu blokowania należy przygotować przeciwciało pierwszorzędowe I (patrz Tabela 1), zgodnie z opisem w kroku 1.10.
Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym I (~16 h):
1. Należy przeprowadzić proces inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym analogicznie do kroku 1.11. Na przykład do każdego skrawka tkanki dodaje się ~50 µL przeciwciała rabbit anti-CD3 rozcieńczonego 1:100 w 2,5% normalnej surowicy konia (patrz Tabela 1).
2. Inkubować przez noc (~16 h) w temperaturze 4 °C w komorze nawilżanej.
Płukanie w DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Należy zastosować tę samą procedurę płukania (3 etapy płukania po 5 min każdy), co opisano dla protokołu IHC jednobarwnej w kroku 1.12.
2. Po trzecim płukaniu szkiełka należy położyć płasko wewnątrz komory nawilżanej. Następnie należy niezwłocznie przejść do kroku 2.13.
  UWAGA: Obowiązują te same uwagi co w kroku 1.12, np. czas każdego płukania można wydłużyć do 10–15 min, a płukanie powinno być łagodne i statyczne. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków.
Inkubacja z przeciwciałem wtórnym I (~32–35 min):
1. Na każdy skrawek należy nanieść jedną kroplę wtórnego przeciwciała anti-rabbit IgG sprzężonego z AP (patrz Tabela 2) i inkubować skrawki tkanek przez 30 min w temperaturze pokojowej z zamkniętą pokrywą komory nawilżanej.
  UWAGA: Aby zredukować tło w kroku 2.15, przeciwciało wtórne można rozcieńczyć 1:1 w PBS.
Płukanie w DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Należy zastosować tę samą procedurę płukania w 1× DPBS/0,1% Tween 20, co w kroku 1.14.
2. UWAGA: Podczas ostatniego etapu płukania należy na świeżo przygotować roboczy roztwór substratu (5 mL, zgodnie z zaleceniem; patrz Tabela 3) według instrukcji producenta (patrz przygotowanie odczynników w Pliku uzupełniającym 1).
Rozwój koloru czerwonego (12–15 min):
1. Po zakończeniu kroku 2.14 szkiełka należy położyć płasko na blacie o białym tle, np. na białym papierze chłonnym, jak opisano w kroku 1.15.
2. Należy dokładnie wymieszać świeżo przygotowany roboczy roztwór substratu czerwonego, a następnie nanieść 50 µL na każdy skrawek tkanki (nadmiar roztworu należy usunąć).
3. Skrawki tkanek należy inkubować w temperaturze pokojowej do momentu pojawienia się czerwonego koloru, kontrolując reakcję co 2–3 min na białym tle lub pod mikroskopem świetlnym.
  UWAGA: Czas wymagany do rozwoju koloru czerwonego różni się w zależności od markerów i może wynosić 20–30 min. Jednak w przypadku barwienia komórek CD3⁺ w skrawkach guza mózgu 005 z systemem detekcji AP, kolor czerwony rozwija się zazwyczaj w ciągu 12–15 min.
Płukanie buforem (5 min):
1. Jak tylko pojawi się pożądany czerwony sygnał w kroku 2.15, należy płukać skrawki w 1× DPBS/0,1% Tween 20 przez 5 min w pojemniku do barwienia.
2. W czasie płukania należy na świeżo przygotować przeciwciało pierwszorzędowe II w odpowiednim buforze blokującym (np. przeciwciało rabbit anti-Ki67 rozcieńczone 1:100 w 2,5% normalnej surowicy konia; patrz Tabela 1).
  UWAGA: W przeciwieństwie do płukania wodą destylowaną stosowanego w IHC jednobarwnej (krok 1.16), tutaj stosuje się DPBS/0,1% Tween 20 nie tylko w celu zatrzymania reakcji, ale także w celu dokładnego wypłukania nadmiaru chromogenu i przygotowania do drugiego cyklu barwienia.
Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym II (~16 h):
1. Szkiełka należy umieścić w komorze nawilżanej i dodać ~50 µL świeżo przygotowanego przeciwciała rabbit anti-Ki67 do każdego skrawka tkanki. Inkubować przez noc (~16 h) w temperaturze 4 °C.
Płukanie w DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.12.
2. Po trzecim płukaniu należy wyjąć szkiełka z pojemnika do barwienia i położyć je płasko w komorze nawilżanej. Następnie należy niezwłocznie przejść do kroku 2.19.
Inkubacja z przeciwciałem wtórnym II (~32–35 min):
1. Należy postępować zgodnie z procedurą z kroku 2.13. Na każdy skrawek należy nanieść jedną kroplę przeciwciała anti-rabbit IgG sprzężonego z AP (patrz Tabela 2) i inkubować skrawki tkanek przez 30 min w temperaturze pokojowej z zamkniętą pokrywą komory nawilżanej.
Płukanie w DPBS (0,1% Tween 20) (~18–20 min):
1. Należy zastosować tę samą procedurę płukania w 1× DPBS/0,1% Tween 20, co w kroku 1.14.
  UWAGA: Podczas ostatniego etapu płukania należy na świeżo przygotować roboczy roztwór substratu (5 mL, zgodnie z zaleceniem; patrz Tabela 3) według instrukcji producenta (patrz przygotowanie odczynników w Pliku uzupełniającym 1).
Rozwój koloru niebieskiego (10–12 min):
1. Po zakończeniu kroku 2.20 szkiełka należy położyć płasko na blacie o białym tle.
2. Należy dokładnie wymieszać świeżo przygotowany roboczy roztwór substratu niebieskiego, a następnie nanieść 50 µL na każdy skrawek tkanki (nadmiar roztworu należy usunąć).
3. Skrawki tkanek należy inkubować w temperaturze pokojowej do momentu pojawienia się niebieskiego koloru, kontrolując reakcję co 2–3 min na białym tle lub pod mikroskopem świetlnym.
  UWAGA: Podobnie jak w przypadku rozwoju koloru czerwonego w kroku 2.15, czas wymagany do rozwoju koloru niebieskiego może wynosić 20–30 min. Jednak w przypadku barwienia komórek Ki67⁺ w skrawkach guza mózgu 005 z systemem detekcji AP, kolor niebieski rozwija się w ciągu 10–12 min.
Płukanie buforem (5 min):
1. Jak tylko pojawi się pożądany niebieski sygnał w kroku 2.21, należy zanurzyć skrawki w 1× DPBS/0,1% Tween 20 na 5 min w pojemniku do barwienia. Następnie należy usunąć roztwór płuczący.
Płukanie wodą (1 min): Skrawki należy płukać w wodzie destylowanej przez 1 min. Po płukaniu wodę destylowaną należy usunąć.
Stopniowe odwadnianie (15–17 min):
1. Szkiełka należy zanurzyć w 70% etanolu w pojemniku do barwienia na 5 min (następnie przelać 70% etanol z powrotem do szklanej butelki w celu ponownego użycia), następnie w 90% etanolu na 5 min (następnie przelać do butelki) i na koniec w 100% etanolu na 5 min (następnie przelać do butelki).
2. Każdy krok należy powtórzyć w dygestorium. Następnie należy przejść do kroku 2.25.
  UWAGA: W tym etapie odwadniania stosuje się te same (bezksylowe) roztwory etanolu z kroku 2.2, które można wykorzystywać wielokrotnie, jeśli pozostają czyste.
Rozjaśnianie bezksylowe:
1. Do oczyszczenia skrawków tkanek/szkiełek należy użyć tych samych roztworów bezksylowych (tj. Histo-Clear), co w kroku 2.1.
  1. Najpierw należy zanurzyć szkiełka w bezksylowym roztworze I w pojemniku do barwienia na 10 min (następnie przelać bezksylowy roztwór I z powrotem do szklanej butelki w celu ponownego użycia), a następnie w bezksylowym roztworze II przez kolejne 10 min.
  2. Szkiełka należy trzymać w bezksylowym roztworze II do momentu zakończenia montowania (tj. krok 2.26).
    UWAGA: Jeśli jest to konieczne, skrawki mogą pozostać w bezksylowym roztworze II dłużej w celu montowania.
    UWAGA: Należy stosować środki ochrony osobistej (PPE) zgodnie z krokiem 1.1 i wykonywać ten etap w dygestorium chemicznym.
Montowanie bezksylowe:
1. Szkiełka należy wyjmować pojedynczo z bezksylowego roztworu II i kłaść płasko w dygestorium. Na szkiełko o odpowiedniej wielkości należy nanieść jedną kroplę bezksylowego medium montującego, a następnie przyłożyć szkiełko dekrywacyjne stroną z medium do skrawków tkanki.
2. Należy delikatnie docisnąć szkiełko dekrywacyjne kciukiem, aby równomiernie rozprowadzić medium montujące na wszystkich trzech skrawkach i usunąć pęcherzyki powietrza.
  UWAGA: Montowanie należy zakończyć w ciągu 30 s na szkiełko, ponieważ medium montujące może szybko wyschnąć. Należy stosować środki ochrony osobistej (PPE) zgodnie z krokiem 1.1 i wykonywać ten etap w dygestorium chemicznym.
Suszenie na powietrzu i mikroskopia świetlna: Szkiełka należy suszyć na powietrzu w dygestorium przez co najmniej 2 h przed oceną i obrazowaniem za pomocą mikroskopu świetlnego. Po wyschnięciu zamontowane szkiełka można przechowywać w pudełkach na szkiełka w temperaturze pokojowej przez lata.

Wyniki

Jednobarwna immunohistochemia (IHC) z wykorzystaniem chromogennego systemu detekcji opartego na HRP pozwoliła na uzyskanie wyraźnego i powtarzalnego barwienia w przekrojach guzów mózgu FFPE 005. Reprezentatywne obrazy barwienia antygenów powierzchniowych przedstawiono na Rysunku 1, co demonstruje skuteczną detekcję markerów limfocytów T (CD3, CD4, CD8), markerów makrofagów związanych z guzem (TAM) (CD68, F4/80) oraz cząsteczki punktu kontrolnego układu odpornościowego PD-L1. We wszystkich przypadkach barwienie pozytywne objawiało się jako wyraźny brązowy sygnał chromogenny przy użyciu DAB jako chromogenu, z zachowaniem morfologii tkanki i minimalnym barwieniem tła, co wskazuje, że protokół jednobarwnej IHC jest kompatybilny z różnymi antygenami związanymi z błoną komórkową.

Zastosowalność protokołu IHC z jednym kolorem w detekcji antygenów wewnątrzkomórkowych zostało przedstawione na Rysunku 2. Reprezentatywne obrazy barwienia wykazują pomyślną detekcję wewnątrzkomórkowych markerów transkrypcyjnych, sygnalizacyjnych, proliferacyjnych, cytotoksycznych i apoptotycznych, w tym T-bet, FoxP3, fosforylowanego STAT1 (pSTAT1), Ki67, granzymu B oraz rozszczepionej kaspazy-3. Podobnie jak w przypadku barwienia antygenów powierzchniowych, detekcja markerów wewnątrzkomórkowych dała wyraźne brązowe sygnały chromogeniczne przy zachowaniu architektury tkanki, przy minimalnym nieswoistym barwieniu tła (Rysunek 2), co dowodzi, że protokół nadaje się do wykrywania zarówno antygenów powierzchniowych, jak i wewnątrzkomórkowych.

Protokół dwukolorowego IHC został z powodzeniem zastosowany do jednoczesnego wykrywania dwóch antygenów w tym samym przekroju tkankowym, z wykorzystaniem sekwencyjnej strategii detekcji chromogennej opartej na fosfatazie alkalicznej (AP). Jak pokazano na Rysunku 3, podwójne barwienie CD3(czerwony)/Ki67(niebieski) oraz pSTAT1(czerwony)/CD68(niebieski), które są odpowiednio wskaźnikami proliferujących limfocytów T i makrofagów typu M1¹⁹, pozwoliło uzyskać wyraźnie rozróżnialne sygnały chromogenne w mikroskopii świetlnej, co dowodzi skutecznej jednoczesnej detekcji dwóch antygenów z wyraźną separacją kolorów dzięki zastosowaniu sekwencyjnego schematu barwienia. Aby dodatkowo wykazać wszechstronność tej metody barwienia dwukolorowego, ten sam protokół z powodzeniem zastosowano do jednoczesnego wykrywania markera neuronalnego (NeuN w kolorze czerwonym) oraz zielonego białka fluorescencyjnego (GFP w kolorze niebieskim) w przekrojach guzów mózgu pochodzących z guzów 005 GSC wykazujących ekspresję GFP (Rysunek 4). Kolokalizacja GFP i NeuN prawdopodobnie wskazuje, że komórki 005 GSC różnicują się w dojrzałe fenotypy wykazujące ekspresję markera neuronalnego NeuN²¹.

Obrazy na Rysunku 1, Rysunku 2 oraz Rysunku 3 są reprezentatywne dla czterech niezależnych guzów, z jednym przekrojem na guz dla wszystkich barwionych antygenów komórek odpornościowych, z wyjątkiem obrazu F4/80, który reprezentuje dwa niezależne guzy, oraz obrazu PD-L1, który reprezentuje trzy niezależne guzy, z dwoma przekrojami zarówno dla F4/80, jak i PD-L1. Obraz na Rysunku 4 reprezentuje pojedynczy przekrój guza. Ponieważ protokół podwójnego IHC został zastosowany do sekwencyjnego barwienia dwóch antygenów (np. CD3⁺ i Ki67^+, lub CD68⁺ i pSTAT1⁺) w tym samym przekroju tkanki w dwóch do czterech niezależnych guzów i został dodatkowo zwalidowany poprzez wspólne barwienie komórek GFP⁺ i NeuN⁺, wyniki te potwierdzają powtarzalność zastosowania protokołu podwójnego IHC. Podobnie, protokół pojedynczego IHC został pomyślnie zastosowany do 12 niezależnych antygenów komórek odpornościowych, co demonstruje jego szeroką stosowalność w opisanych tutaj warunkach barwienia.

Wspólnie te reprezentatywne wyniki wykazują, że opisane protokoły IHC jednobarwnej i dwubarwnej oparte na substracie stanowią praktyczne i powtarzalne metody wykrywania szerokiego zakresu antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w tkankach GBM utrwalonych w FFPE.

Immunohistochemia markerów odpornościowych CD3, CD4, CD8, CD68, F4/80, PD-L1, obrazy mikroskopowe.
Rycina 1: Jednobarwne barwienie immunohistochemiczne (IHC) antygenów powierzchniowych. Jednobarwne (brązowe) barwienie IHC antygenów powierzchniowych dla limfocytów T naciekających guz (CD3⁺, CD4⁺ i CD8⁺), makrofagów związanych z guzem (CD68⁺ i F4/80⁺) oraz cząsteczki punktu kontrolnego odporności PD-L1 (PD-L1⁺) z wykorzystaniem systemu detekcji opartego na peroksydazie chrzanowej (HRP) w przekrojach mysiego GBM pochodzącego z komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego (GSC) (szczegóły w sekcji 1 protokołu). Przedstawiono reprezentatywne obrazy IHC (powiększenie 10× dla CD3, CD4 i CD8; powiększenie 20× dla CD68, F4/80 i PD-L1). Komórki pozytywne są zabarwione na brązowo. Paski skali = 100 μμm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Markery immunohistochemiczne T-bet, FoxP3, p-STAT1, Ki67, GranB, CC3 w sekcjach tkankowych.
Rycina 2: Jednobarwne barwienie immunohistochemiczne (IHC) dla antygenów wewnątrzkomórkowych. Oparte na substracie jednobarwne (brązowe) barwienie IHC dla wewnątrzkomórkowych markerów transkrypcyjnych (T-bet⁺ i FoxP3⁺), sygnalizacyjnych (pSTAT1⁺), proliferacyjnych (Ki67⁺), cytotoksycznych (granzym B⁺, GranB) i apoptotycznych (rozszczepiona kaspaza-3⁺, CC3) w sekcjach guzów mózgu z zastosowaniem systemu detekcji opartego na peroksydazie chrzanowej (HRP) w mysich sekcjach GBM pochodzących z komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego (GSC) (szczegóły w sekcji 1 protokołu). Przedstawiono reprezentatywne obrazy IHC (powiększenie 10× dla FoxP3, GranB i CC3; powiększenie 20× dla T-bet, pSTAT1 i Ki67). Komórki dodatnie są zabarwione na brązowo. Paski skali = 100 μμm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza histologiczna, markery CD3/Ki67 i pSTAT1/CD68, obraz mikroskopowy, badanie proliferacji komórek.
Rycina 3: Dwukolorowa immunohistochemia (IHC) dla proliferujących limfocytów naciekających guz (TILs) oraz makrofagów związanych z guzem (TAMs) typu M1. Substratowe dwukolorowe (czerwony/niebieski) barwienie IHC komórek T proliferujących naciekających guz CD3⁺(czerwony)/Ki67⁺(niebieski) oraz makrofagów typu M1 pSTAT1⁺(czerwony)/CD68⁺(niebieski) z wykorzystaniem systemu detekcji opartego na fosfatazie alkalicznej (AP) w przekrojach mysiego GBM pochodzących z komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego (GSC) (szczegóły w sekcji 2 protokołu). Przedstawiono reprezentatywne obrazy IHC (powiększenie 20×). Na górnym obrazie komórki CD3⁺ są zabarwione na czerwono, komórki Ki67⁺ na niebiesko, a kilka komórek kolokalizujących wskazano czarnymi strzałkami. Analogicznie, na dolnym obrazie komórki pSTAT1⁺ są zabarwione na czerwono, komórki CD68⁺ na niebiesko, a kilka komórek kolokalizujących wskazano czarnymi strzałkami. Paski skali = 100 μμm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tkanka barwiona NeuN/GFP, guz vs. tkanka niezgutowa, obraz mikroskopowy, analiza różnicowania komórkowego.
Rycina 4: Dwukolorowa immunohistochemia (IHC) w kierunku komórek neuronalnych i komórek macierzystych glejaka dodatnich pod kątem zielonego białka fluorescencyjnego (GFP⁺) (GSCs). Dwukolorowe (czerwony/niebieski) barwienie IHC NeuN⁺(czerwony)/GFP⁺(niebieski) oparte na substracie z wykorzystaniem systemu detekcji opartego na fosfatazie alkalicznej (AP) w przekrojach mysiego GBM pochodzących z komórek macierzystych glejaka (GSC) (szczegóły w sekcji 2 protokołu). Przedstawiono reprezentatywny obraz IHC (powiększenie 20×). Komórki NeuN⁺ (marker neuronalny) są zabarwione na czerwono, komórki GFP⁺ (eksprymowane przez 005 GSCs) są zabarwione na niebiesko, a kilka komórek kolokalizowanych wskazano czarnymi strzałkami. Pasek skali = 100 μμm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko	Numer katalogowy	Dostawca	Rozcieńczenie robocze	Bufor do rozcieńczania	Gatunek gospodarza	Odpowiednie przeciwciało wtórne
CD3e	ab5690	Abcam	1:100	Surowica konia	Królik	Przeciwciała przeciwko IgG królika
CD4	14-9766-80	eBioscience	1:200	Surowica kozia	Szczur	Przeciwciała anty-IgG szczura
CD68	ab125212	Abcam	1:100	Surowica konia	Królik	Przeciwciało anty-królicze IgG
CD8a	14-0808-80	eBioscience	1:100	Surowica kozia	Szczur	Przeciwciała anty-IgG szczura
Kaspaza-3 w formie aktywnej (cleaved caspase-3)	9661	CST	1:100	Surowica końska	Królik	Przeciwciało anty-królicze IgG
F4/80	ab111101	Abcam	1:100	Surowica konia	Królik	przeciwciała anty-królicze IgG
FoxP3	ab54501*	Abcam	1:450	Surowica konia	Królik	Przeciwciała przeciwko IgG królika
GFP	ab183734	Abcam	1:200	Surowica konia	Królik	Przeciwciała anty-królicze przeciwko IgG
Granzym B	ab4059	Abcam	1:150	Surowica konia	Królik	Przeciwciała anty-królicze IgG
Ki67	ab16667	Abcam	1:100	Surowica końska	Królik	Przeciwciała przeciwko IgG królika
NeuN	24307	CST	1:400	Surowica konia	Królik	przeciwciało przeciwko IgG królika
PD-L1	ab205921	Abcam	1:400	Surowica końska	Królik	przeciwciała przeciwko królikiemu IgG
pSTAT1	9167	CST	1:100	Surowica konia	Królik	Przeciwciała przeciwko króliczym IgG
T-bet	ab91109	Abcam	1:100	Surowica konia	Mysz	Przeciwciała przeciwko mysim IgG

Tabela 1: Lista przeciwciał pierwszorzędowych. Przeciwciała pierwszorzędowe wykorzystane w niniejszym badaniu, wraz z ich źródłami, zoptymalizowanymi rozcieńczeniami roboczymi, zalecanymi buforami do rozcieńczania, gatunkami gospodarza oraz odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi do immunohistochemicznego barwienia jednobarwnego i dwubarwnego.

Koniugowane przeciwciało wtórne	Numer katalogowy	Gatunek gospodarza	Kropla/przekrój	Dostawca
anty-IgG szczura sprzężone z HRP	MP-7444-15	Koza	Jedna kropla (nierozcieńczona)	Vector Laboratories
przeciwciało anty-królicze IgG znakowane HRP	MP-7401	Koń
przeciwciało przeciwko IgG mysiem znakowane HRP	MP-7402-15	Koń
AP przeciwciało przeciwko IgG szczura	MP-5404-15	Koza
AP anty-królicze IgG	MP-5401	Koń

Tabela 2: Lista przeciwciał wtórnych. Odczynniki detekcyjne wtórne zoptymalizowane dla protokołów IHC jednobarwnych i dwubarwnych, zawierające koniugaty enzymatyczne (HRP lub AP), gatunki gospodarza, zalecaną objętość aplikacji oraz informacje o dostawcy.

Substrat	Enzym detekcyjny	Skład buforu	Przygotowanie odczynników	Czas inkubacji	Notatki
Vector Blue	Fosfataza zasadowa	100 mM Tris-HCl, pH 8,2–8,5, 0,1% Tween 20	2 krople (80 µL) Odczynnik 1 + 2 krople (80 µL) Odczynnik 2 + 2 krople (45 µL) Odczynnik 3	20–30 min	Do podwójnego barwienia IHC kolorem niebieskim; częściowo rozpuszczalne w ksylenie; zalecane odczynniki i media montażowe bezksylenowe
Vector Red	Fosfataza alkaliczna	100 mM Tris-HCl, pH 8,2–8,5, 0,1% Tween 20	2 krople (80 µL) Odczynnik 1 + 2 krople (80 µL) Odczynnik 2 + 2 krople (80 µL) Odczynnik 3	20–30 min	Do podwójnego barwienia IHC w kolorze czerwonym
DAB	Peroksydaza chrzanowa	Bufor substratowy dostarczony przez producenta	1 kropla chromogenu dodana do 1 ml substratu DAB	Zmienna (patrz krok 2.16)	Powoduje powstawanie brązowego zabarwienia; substancja rakotwórcza, należy obchodzić się zgodnie z zasadami bezpieczeństwa

Tabela 3: Lista substratów chromogennych. W tabeli tej podsumowano substraty chromogenne stosowane w IHC jednobarwnym i dwubarwnym, w tym kompatybilne enzymy detekcyjne, sposób przygotowania i formuły, czasy inkubacji oraz kluczowe zalecenia dotyczące obchodzenia się z odczynnikami w celu uzyskania optymalnego rozwoju sygnału chromogennego.

Plik uzupełniający 1: Przygotowanie odczynników, buforów i substratów. Plik ten podsumowuje zasady przygotowania, przechowywania oraz krytyczne uwagi dotyczące obchodzenia się ze wszystkimi odczynnikami, buforami, roztworami blokującymi i substratami chromogennymi wykorzystywanymi w protokołach immunohistochemii jedno- i dwukolorowej.Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Niniejsze badanie opisuje szczegółowy i powtarzalny schemat chromogennej IHC oparty na substracie, służący do jednobarwnej i dwubarwnej detekcji antygenów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w tkankach guzów mózgu utrwalonych w FFPE, pochodzących z ortotopowego modelu GSC. Głównym celem tego badania było opracowanie metodologicznego, praktycznego protokołu krok po kroku w celu niezawodnej chromogennej detekcji antygenów w tkankach GBM u osobników immunokompetentnych.

Chromogenna IHC pozostaje powszechnie stosowaną metodą oceny markerów komórkowych w tkankach FFPE, ponieważ pozwala na zachowanie architektury tkanki przy jednoczesnej lokalizacji przestrzennej antygenów w TME¹⁵^,¹⁶. Powtarzalne barwienie chromogenne wymaga starnej optymalizacji wielu parametrów technicznych, w tym odsłaniania antygenów, warunków blokowania, stężenia przeciwciał, czasu utleniania chromogenu oraz sposobu obchodzenia się z tkanką podczas barwienia i montowania. Niewielkie odchylenia na tych etapach mogą prowadzić do utraty tkanki, słabej intensywności sygnału, nadmiernego barwienia tła lub słabego zachowania morfologii. Niniejszy protokół odnosi się do typowych problemów technicznych, dostarczając szczegółowych wytycznych proceduralnych w celu poprawy spójności i powtarzalności barwienia.

Stosując schemat IHC z jednym kolorem, reprezentacyjne barwienia wykazały skuteczną detekcję szerokiego zakresu antygenów związanych z błoną komórkową i wewnątrzkomórkowych, w tym markerów limfocytów T, markerów związanych z makrofagami, cząsteczek punktów kontrolnych odporności, białek sygnalizacyjnych, markerów proliferacji oraz antygenów związanych z apoptozą. Te reprezentatywne wyniki potwierdzają przydatność protokołu do wykrywania różnych klas antygenów w tkankach GBM utrwalonych w FFPE przy użyciu standardowego chromogennego systemu detekcji opartego na HRP.

Powszechnym wyzwaniem technicznym w podwójnym chromogenicznym IHC jest jednoczesne wykrywanie dwóch antygenów w sytuacji, gdy oba przeciwciała pierwszorzędowe zostały wytworzone u tego samego gatunku gospodarza, co może utrudnić kompatybilność przeciwciał i rozróżnienie sygnałów. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy sekwencyjny schemat barwienia dwukolorowego opartego na AP, wykorzystujący odrębne substraty chromogenne, które umożliwiają wyraźną wizualną separację sygnałów antygenowych w mikroskopii świetlnej.

Reprezentatywne współbarwienie CD3/Ki67 oraz pSTAT1/CD68 wykazało pomyślną jednoczesną detekcję antygenów w obrębie tego samego przekroju tkankowego. Dodatkowe zastosowanie tego schematu pracy do współbarwienia NeuN/GFP dodatkowo potwierdza wszechstronność sekwencyjnego protokołu dwukolorowego poza analizą markerów immunologicznych. Dwukolorowe barwienie IHC można ilościowo określić za pomocą oceny manualnej lub cyfrowej analizy obrazu. Typowe wskaźniki obejmują liczbę lub procent komórek pojedynczo i podwójnie pozytywnych, a także ich rozkład w obrębie guza. Przy stosowaniu analizy cyfrowej zaleca się spójne ustalanie progów oraz wybór regionów, aby zapewnić powtarzalność wyników.

Aby uzyskać wiarygodne wyniki barwienia w protokole IHC z jednym kolorem, należy uwzględnić kontrolę negatywną z pominięciem przeciwciała pierwszorzędowego. Kontrola ta nie powinna generować sygnału chromogennego podczas wywoływania substratu (krok 1.15), co potwierdzi specyficzność procedury barwienia. W przypadku protokołu IHC z dwoma kolorami zaleca się zastosowanie dodatkowych kontroli negatywnych poprzez pominięcie przeciwciała pierwszorzędowego I (krok 2.11), przeciwciała pierwszorzędowego II (krok 2.17) lub obu przeciwciał pierwszorzędowych. Ponieważ oba przeciwciała pierwszorzędowe pochodzą z tego samego gatunku gospodarza, kontrole te weryfikują, czy drugie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi (krok 2.19) nie wykrywa pozostałości przeciwciała pierwszorzędowego z pierwszego cyklu barwienia, oraz pomagają wykluczyć zjawisko przenoszenia lub niespecyficzny sygnał chromogenny.

Choć reprezentatywne obrazy przedstawione w niniejszym protokole ilustrują optymalne wyniki barwienia, użytkownicy mogą sporadycznie napotkać wyniki suboptymalne, w tym słaby lub nieobecny sygnał chromogenny, nadmierne barwienie tła, nierównomierne barwienie w obrębie przekroju tkanki lub niski stosunek sygnału do szumu. Takie rezultaty są zazwyczaj związane z niewłaściwym odsłanianiem antygenu, suboptymalnym stężeniem przeciwciał, niewystarczającym blokowaniem, nadmiernym utrwalaniem substratu chromogennego lub wysychaniem tkanki podczas procedury barwienia. Problemy te można zazwyczaj rozpoznać poprzez porównanie z odpowiednimi kontrolami pozytywnymi i negatywnymi oraz skorygować poprzez optymalizację warunków odsłaniania antygenu, rozcieńczenia przeciwciał, etapów blokowania, procedur płukania oraz czasu inkubacji z chromogenem, zgodnie z opisem zawartym w protokole.

Jednym z ograniczeń niniejszego badania jest fakt, że przydatność IHC jednobarwnej lub dwubarwnej została zademonstrowana na reprezentatywnych przekrojach tkankowych z tego samego modelu nowotworu, a nie zastosowana systematycznie w wielu modelach nowotworów lub na różnych etapach progresji nowotworu. Ograniczenie to nie wpływa jednak na główny cel badania, którym było opracowanie i udokumentowanie powtarzalnego schematu metodologicznego dla chromogennej IHC jednobarwnej i dwubarwnej opartej na substratach. W porównaniu z immunofluorescencją, chromogenna IHC jest kompatybilna z rutynową mikroskopią w świetle przechodzącym, lepiej zachowuje morfologię tkanki i jest w mniejszym stopniu podatna na autofluorescencję tkankową. Choć protokół ten został tutaj zoptymalizowany dla ortotopowego modelu GBM pochodzącego z GSC u osobników immunokompetentnych, może on zostać dostosowany do innych przedklinicznych modeli nowotworów, a po optymalizacji specyficznej dla danych markerów – do ludzkich preparatów nowotworowych FFPE. Integracja z platformami patologii cyfrowej i analizy obrazu może dodatkowo rozszerzyć jego użyteczność w półilościowych analizach tkankowych.

Oświadczenia

S.D.R. jest współtwórcą patentów dotyczących onkolitycznych wirusów herpes simplex, których właścicielem i zarządcą są Georgetown University oraz Massachusetts General Hospital, a które przyniosły tantiemy od firm Amgen i Acti\Vec Inc.; pełnił również rolę konsultanta i otrzymywał honoraria od firm Replimune, Cellinta i Greenfire Bio, a także honoraria i udziały od EG 427. Pozostali autorzy oświadczają, że niniejszy manuskrypt został przygotowany w przypadku braku jakichkolwiek relacji komercyjnych lub finansowych, które mogłyby zostać uznane za potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

D.S. otrzymał częściowe wsparcie z funduszu College of Science and Technology na North Carolina Agricultural and Technical State University (NCA&T), stypendium Faculty Fellowship Grant (GRADS-4C) na NCA&T oraz grant z NIH (1R16NS147983-01). Podobnie S.D.R. otrzymał częściowe wsparcie z Thomas A. Pappas Chair in Neurosciences, natomiast R.H.N. otrzymał częściowe wsparcie z grantu NIH (1R35GM153737). Dziękujemy dr. Inder Vermie i dr. Yasushi Sodzie za udostępnienie 005 GSCs.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szklane butelki o pojemności 2 L	Corning	CORN1395-2L	Stosowane do przygotowania i przechowywania 10× DPBS, 1× DPBS, woda destylowana i bufor cytrynian sodu
zlewka Pyrex o pojemności 2 L	Corning	1000-2L	Stosowane do mikrofalowej odmaskowania antygenów w buforze cytrynianu sodu (600–objętość robocza 800 ml)
2,5% normalne surowica konia lub normalna surowica kozy			Produkty te są dostarczane w zestawach z przeciwciałami wtórnymi firmy Vector Laboratories. Są one stosowane do blokowania specyficznego dla gatunku oraz do rozcieńczania przeciwciał, w zależności od gatunku gospodarza przeciwciała wtórnego (anty-królicze lub anty-szczurze IgG), aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie i tło barwienia.
30% nadtlenek wodoru (H₂O₂)	Fisher Scientific	BP2633500
szklane butelki o pojemności 500 mL	VWR International	VWRU10754-818	Stosowane do przygotowania i przechowywania odczynników łatwopalnych do IHC jednobarwnej oraz odczynników bezksylenowych do IHC dwubarwnej
Absorbujący papier na blat z chusteczkami Kimwipes			Stosowane podczas procedur barwienia w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał lub roztworu piorącego z przekrojów tkankowych przed kolejnymi inkubacjami, co minimalizuje przenoszenie reagentów i kontaminację krzyżową
przeciwciało anty-CD3e	Abcam	ab5690
przeciw-CD4	eBioscience	14-9766-80
przeciw-CD68	Abcam	ab125212
przeciwciało anty-CD8a	eBioscience	14-0808-80
Przeciwciało przeciwko rozszczepionej kaspazie-3	CST	9661
przeciwciało anty-F4/80	Abcam	ab111101
anty-FoxP3	Abcam	ab54501
Przeciwciało przeciwko GFP	Abcam	ab183734
Przeciwciało przeciwko granzymowi B	Abcam	ab4059
Przeciwciało anty-Ki67	Abcam	ab16667
przeciw-NeuN	CST	24307
Przeciwciało anty-PD-L1	Abcam	ab205921
anty-pSTAT1	CST	9167
przeciwciało anty-T-bet	Abcam	ab91109
AP przeciwciało anty-królicze IgG	Vector Laboratories	MP-5401
AP przeciwciało przeciw szczurzym IgG	Vector Laboratories	MP-5404-15
roztwór blokujący BLOXALL	Vector Laboratories	SP-6000-100	Stosowany głównie w dwukolorowej IHC w celu zahamowania aktywności endogennej peroksydazy i fosfatazy zasadowej
Sery albuminy bydlęcej (BSA)	Bioworld	22070007-2	Stosowany do przygotowania 5% uniwersalnego buforu blokującego w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania
Cytoseal 60 permanentne medium montażowe	Nauki o mikroskopii elektronowej	18006	Medium montażowe kompatybilne z ksylenem stosowane w jednobarwnym IHC
substrat i chromogen DAB	DAKO	K346811-2	Stosowane do jednobarwnej detekcji chromogenicznej opartej na HRP. Przygotować bezpośrednio przed użyciem, dodając 1 kroplę chromogenu do 1 ml substratu DAB zgodnie z instrukcją producenta.’zgodnie z instrukcjami. Niewykorzystany roztwór roboczy należy zutylizować po przygotowaniu. DAB jest potencjalnym kancerogenem i należy z nim obchodzić się zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i chemicznego
Woda destylowana			Stosowana do przygotowywania odczynników, płukania oraz przygotowywania buforów. Można również użyć wody ultrapure lub Milli-Q.
DPBS (bufor fosforanowy Dulbecco)’roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS)	Corning	55-031-PC
Etanol, 200 proof	Decon Labs	2701
szkiełka przedmiotowe Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Pozytywnie naładowane szkiełka przedmiotowe do skrawków tkanek
Szkiełka nakrywkowe	Corning lub Millipore Sigma		Należy dobrać odpowiednie rozmiary w zależności od liczby przekrojów tkanki na jednym szkiełku. Typowe rozmiary obejmują: 24 mm × 24 mm (pojedynczy przekrój tkanki), 24 mm × 40 mm (dwa przekroje tkanki), 24 mm × 50 mm (trzy przekroje tkanek)
Hematoksylina	Fisher Scientific	220-102
Histo-Clear (1 L)	Nauki o mikroskopii elektronowej	64111-01	Środek przejaśniający bezksylenowy stosowany w dwukolorowej IHC. Przygotować dwie butelki o pojemności 500 ml, oznaczone jako Histo-Clear I oraz Histo-Clear II
przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z HRP	Vector Laboratories	MP-7402-15
przeciwciało przeciwko IgG królika sprzężone z HRP	Vector Laboratories	MP-7401
przeciwciało przeciwko szczurzym IgG sprzężone z HRP	Vector Laboratories	MP-7444-15
Komory nawilżane	Stellar Scientific	HS-120879	Do inkubacji skrawków tkanek z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi
Pisak do tworzenia barier hydrofobowych (pisak PAP)	Vector Laboratories	H-4000	Służy do tworzenia hydrofobowej bariery wokół skrawków tkanek w celu zatrzymania przeciwciał i odczynników podczas inkubacji oraz zapobiegania kontaminacji krzyżowej między wieloma skrawkami tkanek na tym samym szkiełku.
Kimwipes	Kimtech Science	34155	Stosowane do delikatnego usuwania pozostałości odczynników i buforu płuczącego z przekrojów tkanek
Mieszadło magnetyczne	IKA	I-10001529	Do przygotowania roztworów zapasowych cytrynianu sodu i DPBS
Kuchenka mikrofalowa	Panasonic (model: NN-L931BF)	SN: 6H61050036	pojemność 2,2 stopy sześciennej. Wymagane do termicznej regeneracji antygenów z użyciem szklanego zlewki o pojemności 2 l
Mikroskop świetlny Nikon	Nikon	SN: 707798	Nikon Eclipse Ci-L nr seryjny: 707798, silnik świetlny Sola 5M5-LCR-VA nr seryjny: 11787, oprogramowanie: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, kamery: Nikon DS-Fi3 nr seryjny: 110865 (kolor) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (B/W)
pH-metr	VWR International	77619-152	Do regulacji pH buforu do odmaskowania antygenów
Folia spożywcza	Fisher Scientific	01810	Służy do luźnego przykrycia buforu do odmaskowywania antygenów podczas podgrzewania w kuchence mikrofalowej, aby zminimalizować parowanie i zapobiec wysychaniu tkanki
Kasetki na szkiełka z polioksymetylenu (POM)	Mopec	SP234	Kompatybilne z powyższymi pojemnikami do barwienia; każda kasetka mieści do 24 szkiełek przedmiotowych
Waga precyzyjna	Mettler Toledo	30697420	Do odważania cytrynianu sodu i proszku DPBS
Lodówka	Thermo Scientific	TSG3005CA	Do przechowywania odczynników i przeciwciał wrażliwych na temperaturę
Kasetki do przechowywania preparatów	Fisher Scientific	22-267294
Pojemniki/szalki do barwienia	Mopec	SP233	Każdy pojemnik mieści jedną kasetę do barwienia na 24 slajdy
Mieszadła magnetyczne	Fisher Scientific	14-512-128	Do przygotowania roztworów zapasowych cytrynianu sodu i DPBS
Cytrynian trisodu dwuwodny	Odczynniki chemiczne Thermo Scientific	AA3643936
Tween 20	Thermo Scientific	AAJ20605AP
permanentny medium montujący VectaMount PT	Vector Laboratories	H-5600-60	Bezksylenowy medium do trwałego montowania stosowane w dwukolorowej IHC
zestaw substratów fosfatazy zasadowej Vector Blue	Vector Laboratories	SK-5300	Stosowany do wywoływania niebieskiego sygnału chromogennego podczas dwubarwnej immunohistochemii (IHC) opartej na fosfatazie alkalicznej (AP). Ponieważ Vector Blue jest częściowo rozpuszczalny w ksylenie, w procedurach barwienia dwubarwnego należy stosować bezksylenowe środki do przejaśniania oraz media montażowe.
Zestaw substratu fosfatazy alkalicznej Vector Red	Vector Laboratories	SK-5100	Stosowany do wywołania czerwonego sygnału chromogennego podczas dwukolorowej immunohistochemii (IHC) opartej na fosfatazie alkalicznej (AP)
Ksylen (1 l)	StatLab	8400-1	Stosowany jako środek do deparafinizacji i przejaśniania w jednobarwnej immunohistochemii (IHC). Przygotować dwie butelki o pojemności 500 ml, odpowiednio oznakowane jako Ksylen I i Ksylen II.

Bibliografia

Sipos D, et al. Glioblastoma: Clinical presentation, multidisciplinary management, and long-term outcomes. Cancers (Basel). 2025;17(1):146.
Himes BT, et al. Immunosuppression in glioblastoma: Current understanding and therapeutic implications. Front Oncol. 2021;11:770561.
Lin H, et al. Understanding the immunosuppressive microenvironment of glioma: mechanistic insights and clinical perspectives. J Hematol Oncol. 2024;17(1):31.
Puviindran BJ, et al. Within and beyond the tumor: Mechanisms of glioblastoma-induced immunosuppression. Neurooncol Adv. 2025;7(Suppl 4):iv4-iv18.
He J, Yan X, Hu S. Glioma stem cells: drivers of tumor progression and recurrence. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):293.
Dharmapuri S, et al. Multiplexed immunohistochemical analysis of the immune microenvironment of biliary tract cancers pre- & post-neoadjuvant chemotherapy: case series. Ann Transl Med. 2024;12(4):78.
Hatogai K, et al. Comprehensive immunohistochemical analysis of tumor microenvironment immune status in esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(30):47252-64.
Liu X, et al. Spatial heterogeneity of infiltrating immune cells in the tumor microenvironment of non-small cell lung cancer. Transl Oncol. 2024;50:102143.
Kazama A, et al. Tumor-infiltrating immune cell status predicts successful response to immune checkpoint inhibitors in renal cell carcinoma. Sci Rep. 2022;12(1):20386.
Park DH, Kim YZ. Simple analysis using immunohistochemical staining for tumor-infiltrating lymphocytes in brain metastasis of small cell lung cancer. J Neurointensive Care. 2024;7(2):49-55.
Bogajewska-Rylko E, et al. When is immunohistochemistry useful in assessing tumor necrotic tissue? Anticancer Res. 2021;41(1):197-201.
Saha D, Rabkin SD. Immunohistochemistry for tumor-infiltrating immune cells after oncolytic virotherapy. Methods Mol Biol. 2020;2058:179-90.
Saha D, et al. combinatorial effects of VEGFR kinase inhibitor Axitinib and oncolytic virotherapy in mouse and human glioblastoma stem-like cell models. Clin Cancer Res. 2018;24(14):3409-22.
Li M, et al. Characterization and oncolytic virus targeting of FAP-expressing tumor-associated pericytes in glioblastoma. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):221.
Bommareddy PK, et al. Oncolytic herpes simplex virus expressing IL-2 controls glioblastoma growth and improves survival. J Immunother Cancer. 2024;12(4):e008880.
Chernov A, Chutko A, Alaverdian D, Kashuro V, Galimova E. Chemotherapy sensitivity of primary glioblastoma cells and immunohistochemical markers to predict survival of patients with glioblastoma. Clin Transl Oncol. 2026;28(3):974-85.
Saha D, Rabkin SD, Martuza RL. Temozolomide antagonizes oncolytic immunovirotherapy in glioblastoma. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000345.
Jahan N, Talat H, Alonso A, Saha D, Curry WT. Triple combination immunotherapy with GVAX, anti-PD-1 monoclonal antibody, and agonist anti-OX40 monoclonal antibody is highly effective against murine intracranial glioma. Oncoimmunology. 2019;8(5):e1577108.
Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Macrophage polarization contributes to glioblastoma eradication by combination immunovirotherapy and immune checkpoint blockade. Cancer Cell. 2017;32(2):253-67.e5.
Lu L, Saha D, Martuza RL, Rabkin SD, Wakimoto H. Single agent efficacy of the VEGFR kinase inhibitor axitinib in preclinical models of glioblastoma. J Neurooncol. 2015;121(1):91-100.
Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Oncolytic herpes simplex virus immunovirotherapy in combination with immune checkpoint blockade to treat glioblastoma. Immunotherapy. 2018;10(9):779-86.
Marumoto T, et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 2009;15(1):110-6.
Cheema TA, et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(29):12006-11.
Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Curing glioblastoma: oncolytic HSV-IL12 and checkpoint blockade. Oncoscience. 2017;4(7-8):67-9.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Macierziste komórki glejaka wielopostaciowego mikrośrodowisko guza protokół immunohistochemiczny detekcja chromogenna dwubarwna IHC guzy mózgu FFPE naciekające guza komórki odpornościowe implantacja ortotopowa barwienie fosfatazą zasadową

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Informuj mnie o aktualizacjach: