Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Niniejsza praca ocenia białko hWAPL (human wings apart-like) jako surowiczy biomarker diagnostyczny w raku szyjki macicy za pomocą zintegrowanej analizy bioinformatycznej oraz walidacji surowiczej i wykazuje, że połączenie stężenia hWAPL w surowicy z antygenem raka плоскоściennego poprawia skuteczność diagnostyczną.
Rak szyjki macicy pozostaje poważnym zagrożeniem dla zdrowia kobiet na całym świecie, a liczba wiarygodnych biomarkerów surowiczych do wczesnego wykrywania i stratyfikacji terapeutycznej jest ograniczona. Białko human wings-apart-like (hWAPL) zostało powiązane z kancerogenezą szyjki macicy, jednak jego wartość diagnostyczna i kliniczna nie została w pełni wyjaśniona. Aby wypełnić tę lukę, w niniejszym badaniu zintegrowano publiczne zbiory danych multiomicznych, w tym The Cancer Genome Atlas, GEPIA2, Human Protein Atlas oraz dane z transkryptomiki pojedynczych komórek, aby scharakteryzować ekspresję hWAPL, powiązania kliniczno-patologiczne, naciek immunologiczny, sieci koekspresji, modyfikacje potranslacyjne oraz przewidywania wrażliwości na leki. Wyniki te oceniono w niezależnej jednocentrowej kohorcie surowiczej obejmującej 89 pacjentek z histologicznie potwierdzonym rakiem płaskonabłonkowym szyjki macicy oraz 89 zdrowych kobiet w grupie kontrolnej. Zmierzono poziomy hWAPL w surowicy oraz antygenu raka płaskonabłonkowego (SCC), a wydajność diagnostyczną oceniono za pomocą analizy krzywej ROC (receiver operating characteristic). Metodami in silico wykazano, że hWAPL jest szeroko nadekspresowany w wielu nowotworach złośliwych, szczególnie w raku szyjki macicy, występuje w zwiększonym stężeniu w złośliwych komórkach nabłonkowych oraz monocytach/makrofagach, a także wiąże się z krótszym czasem wolnym od progresji, przewidywaną zmniejszoną wrażliwością na cisplatynę, paklitaksel i 5-fluorouracyl oraz przewidywaną wrażliwością na inhibitory MCL-1 i Wee1. W kohorcie surowiczej poziomy hWAPL były znacznie wyższe u pacjentek niż w grupie kontrolnej i pozwalały odróżnić raka szyjki macicy z polem pod krzywą (AUC) wynoszącym 0.961, co przewyższało wynik dla samego SCC. Połączenie hWAPL z SCC dodatkowo poprawiło wydajność diagnostyczną (pole pod krzywą 0.974; czułość 93.3%; swoistość 95.5%). Wyniki te sugerują, że surowicze hWAPL jest potencjalnym nowym biomarkerem diagnostycznym raka płaskonabłonkowego szyjki macicy, którego skuteczność jest zwiększana przez SCC, natomiast zaobserwowane powiązania z chemoopornością i przebudową mikrośrodowiska immunologicznego stanowią podstawę do tworzenia hipotez i wymagają potwierdzenia eksperymentalnego.
Rak szyjki macicy zajmuje czwarte miejsce pod względem częstości występowania oraz jest czwartą główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów wśród kobiet na całym świecie, przy czym w 2022 roku odnotowano około 660 000 nowych diagnoz i 350 000 zgonów1. Obciążenie tą chorobą dotyczy w nieproporcjonalnym stopniu krajów o niskim i średnim dochodzie, w których systematyczne programy przesiewowe pozostają niewystarczające2. Choć szczepienia przeciwko HPV oraz badania cytologiczne (Pap smear) skutecznie obniżyły wskaźniki zapadalności w wielu krajach o wysokim dochodzie, obecne metody diagnostyczne wykazują istotne ograniczenia. Testy DNA HPV charakteryzują się suboptymalną swoistością, a interpretacja cytologiczna jest z natury subiektywna i zmienna. Niedociągnięcia te podkreślają pilną potrzebę opracowania innowacyjnych, obiektywnych i małoinwazyjnych biomarkerów surowiczych, które uzupełniłyby istniejące systemy diagnostyczne.
Antygen raka kolistościennego (SCC-Ag) służy jako główny serologiczny biomarker raka kolistościennego szyjki macicy, podtypu histologicznego obejmującego około 85–90% wszystkich przypadków raka szyjki macicy3. Przegląd systematyczny i metaanaliza wykazały, że podwyższone poziomy SCC-Ag przed leczeniem w raku kolistościennym wiążą się ze znacznie gorszym przeżyciem całkowitym oraz wolnym od progresji4. W kontekście monitorowania nawrotów SCC-Ag wykazuje czułość na poziomie 78,9% i swoistość na poziomie 91,2% dla raka kolistościennego4. Niemniej jednak użyteczność SCC-Ag we wczesnym wykrywaniu jest ograniczona, ponieważ podwyższone poziomy obserwuje się jedynie u 28–88% osób zdiagnozowanych z rakiem kolistościennym szyjki macicy5. Ponadto wiele guzów we wczesnym stadium nie wykazuje podwyższonych stężeń SCC-Ag, a biomarker ten nie ma zastosowania w przypadku niekolistościennych wariantów histologicznych3. W konsekwencji odkrycie nowych biomarkerów surowiczych, które oferują lepszą czułość diagnostyczną, zwłaszcza w przypadku wczesnego stadium raka szyjki macicy, stanowi istotny i nierozwiązany priorytet kliniczny.
Poza SCC-Ag w raku szyjki macicy oceniano kilka innych markerów krążących, w tym antygen rakowo-embrionalny, antygen nowotworowy CA-125, fragment cytokeratyny-19 (CYFRA 21-1), a w ostatnim czasie także krążące DNA nowotworowe oraz wolne od komórek DNA HPV. W praktyce markery te są jednak ograniczone przez niską czułość w przypadku choroby we wczesnym stadium, słabą specyficzność dla histologii płaskonabłonkowej, która dominuje w raku szyjki macicy, lub wymóg stosowania specjalistycznych platform molekularnych, które nie są jeszcze powszechnie dostępne. Taka sytuacja stwarza znaczną przestrzeń dla markeru białkowego, który byłby zarówno mechanistycznie powiązany z kancerogenezą szyjki macicy, jak i mierzalny za pomocą rutynowego testu immunoanalitycznego.
Gen ludzkiego białka wings apart-like (hWAPL), nazywany również WAPL, koduje czynnik uwalniania kohezyny, który jest niezbędny do prawidłowej separacji chromatyd siostrzanych podczas podziału mitotycznego6. Po raz pierwszy zidentyfikowany przez Oikawę i współpracowników, hWAPL został scharakteryzowany jako nowy gen ludzki, którego ekspresja jest indukowana przez onkoproteiny HPV E6 i E7. Wykazuje on silną ekspresję w rakach szyjki macicy, podczas gdy w innych tkankach prawidłowych i nowotworowych obserwuje się jedynie minimalną ekspresję7. Dalsze badania wykazały, że poziomy mRNA hWAPL są wyraźnie podwyższone w raku szyjki macicy w porównaniu z łagodnym nabłonkiem szyjki macicy, a ekspresja wzrasta w korelacji ze stopniem dysplazji szyjki macicy (CIN)8,9. Z perspektywy mechanistycznej, rozregulowana nadekspresja WAPL zaburza procesy mitotyczne i cytokinezy, co sprzyja niestabilności chromosomowej i ułatwia progresję nowotworu10. Ponadto WAPL znacząco przyczynia się do tumorigenzy i regulacji progresji cyklu komórkowego. W różnych próbkach nabłonka szyjki macicy zidentyfikowano wiele alternatywnie splicingowanych izoform WAPL, co podkreśla jego różnorodność molekularną11. Oprócz udokumentowanego udziału w rozwoju raka szyjki macicy, rosnąca liczba dowodów wskazuje na użyteczność diagnostyczną hWAPL w zmianach szyjki macicy. Co więcej, wyciszenie genu hWAPL za pomocą TAT zredukowało ekspresję HPV E6, zahamowało inwazję nowotworową i tworzenie kolonii w komórkach macierzystych raka szyjki macicy oraz znacząco osłabiło wzrost guza w modelach myszy nago12. Wyniki te sugerują, że hWAPL służy jako marker proliferacji komórek macierzystych raka szyjki macicy i stanowi potencjalnie skuteczny cel terapeutyczny12.
Mimo że wyniki te są obiecujące, kilka istotnych kwestii pozostaje niejasnych. Po pierwsze, zdolność hWAPL w surowicy do różnicowania pacjentek z rakiem szyjki macicy od osób zdrowych oraz jego skuteczność w stosunku do uznanego biomarkera SCC lub w połączeniu z nim nie zostały ocenione w rygorystycznie kontrolowanej populacji badawczej. Po drugie, związek między poziomem hWAPL w surowicy a statusem zakażenia HPV, a także kluczowe cechy kliniczno-patologiczne, takie jak stopień kliniczny, stopień histologiczny i przerzuty do węzłów chłonnych, wciąż nie są jasne. Po trzecie, nie zbadano, czy hWAPL i SCC oferują komplementarną wartość diagnostyczną.
Choć hWAPL był badany na poziomie tkankowym i komórkowym, żadna wcześniejsza praca nie ustaliła, czy białko to jest mierzalne w krążeniu oraz czy pomiar w surowicy pozwala odróżnić raka szyjki macicy od grupy kontrolnej; jest to konkretna luka w wiedzy, którą wypełnia niniejsze badanie. Opierając się na wcześniejszych raportach dotyczących tkanek, zamiast je powtarzać, połączyliśmy zintegrowany przegląd bioinformatyczny hWAPL, z wykorzystaniem danych z The Cancer Genome Atlas oraz innych publicznie dostępnych repozytoriów, z pierwszą oceną białka w surowicy w niezależnej, jednoośrodkowej kohorcie obejmującej 89 pacjentek z rakiem плоскоściwniakowym szyjki macicy oraz 89 zdrowych kobiet z grupy kontrolnej. Głównym celem było określenie wydajności diagnostycznej hWAPL w surowicy, ilościowo wyrażonej jako pole pod krzywą charakterystyki operacyjnej odbiornika (AUC), w odróżnianiu raka płaskonabłonkowego szyjki macicy od zdrowych kontroli, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu z SCC-Ag; głównym miernikiem wyniku było zatem pole pod krzywą, a czułość i swoistość przy optymalnym progu Youdena stanowiły mierniki wtórne. Cele wtórne obejmowały charakterystykę związku poziomu hWAPL w surowicy ze statusem HPV i innymi cechami kliniczno-patologicznymi oraz sformułowanie hipotez mechanistycznych dotyczących kontekstu biologicznego hWAPL za pomocą analiz bioinformatycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board) Szpitala Ludowego Prowincji Shaanxi (numer zatwierdzenia 2024-R055) i przeprowadzono je zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Przed pobraniem krwi od każdego uczestnika uzyskano pisemną świadomą zgodę. Wszystkie ludzkie próbki krwi i surowicy były pobierane, przetwarzane i przechowywane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Departamentu Medycyny Laboratoryjnej.
Wszystkie próbki krwi żylnej i surowicy traktowano jako potencjalnie zakaźny materiał biologiczny. Przetwarzanie próbek przeprowadzano w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 przez przeszkolony personel noszący odpowiednie środki ochrony indywidualnej. Jednorazowe wyroby plastikowe, końcówki do pipet oraz zużyte mikropłytki, które miały kontakt z materiałem biologicznym, poddawano autoklawowaniu lub gromadzono jako odpady biologiczne i utylizowano za pośrednictwem licencjonowanego strumienia odpadów medycznych instytucji, zgodnie z lokalnymi przepisami.
Przegląd projektu badania:
Przebieg niniejszego badania został podsumowany na schemacie projektu badania (Rysunek uzupełniający S1) i został podzielony na dwa komplementarne etapy. W etapie in silico przeanalizowano publiczne zbiory danych transkryptomicznych, jednokomórkowych, białkowych, modyfikacji potranslacyjnych, immunologicznych oraz wrażliwości na leki, aby scharakteryzować kontekst biologiczny hWAPL i sformułować hipotezy mechanistyczne. W etapie eksperymentalnym zmierzono poziom hWAPL i SCC-Ag w surowicy w niezależnej kohorcie jednocentrycznej, a ich wydajność diagnostyczną, osobno i w połączeniu, oceniono za pomocą analizy charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) oraz regresji logistycznej. Oba etapy zintegrowano wyłącznie na poziomie interpretacji, przy czym etap analizy surowicy stanowił jedyną walidację eksperymentalną.
Profilowanie ekspresji genów w raku szyjki macicy z rozmaitnienia płaskiego oraz w różnych typach nowotworów
Dane z sekwencjonowania RNA pochodzące z bazy The Cancer Genome Atlas (TCGA) zostały pobrane za pomocą przeglądarki UCSC Xena Browser. Wszystkie publiczne bazy danych i narzędzia internetowe wykorzystane w niniejszym badaniu były dostępne między wrześniem a październikiem 2025 r., a konkretne wersje i daty dostępu są wymienione w Tabeli materiałów. Poziomy ekspresji WAPL, określone jako liczba fragmentów na kilobazę transkryptu na milion zmapowanych odczytów (FPKM), poddano transformacji log₂ z dodaniem pseudolicznika 1. Przekształcone wartości zostały następnie wykorzystane do przeprowadzenia analiz porównawczych między tkankami nowotworowymi a dopasowanymi próbkami normalnych tkanek sąsiednich w wielu typach nowotworów. W ramach ukierunkowanego badania nad nowotworami szyjki macicy wyizolowano dane dotyczące ekspresji WAPL specyficzne dla raka szyjki macicy z rozmaitnienia płaskiego oraz gruczolakoraka szyjki macicy (CESC). Profil ekspresji w tych próbkach guza został następnie zwizualizowany i porównany z poziomami ekspresji w normalnych kontrolnych tkankach nabłonkowych szyjki macicy.
Analiza izoform transkryptów WAPL
Profile ekspresji izoform transkryptów WAPL zbadano przy użyciu bazy danych GEPIA2. Konkretne izoformy określono za pomocą odpowiadających im identyfikatorów transkryptów Ensembl (ENST). Poziomy ekspresji obliczono jako logarytm o podstawie 2 z liczby transkryptów na milion plus jeden [log₂(TPM+1)] i przedstawiono graficznie w formie wykresów skrzypcowych.
Analiza sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek
Zbiór danych scRNA-seq GSE168652 pobrano z repozytorium Gene Expression Omnibus (GEO). Przetwarzanie wstępne danych, ocena jakości, normalizacja i klasteryzacja zostały wykonane za pomocą platformy scCancerExplorer. Odfiltrowano komórki wykazujące ekspresję mniej niż 200 genów oraz geny wykryte w mniej niż trzech komórkach. Normalizację przeprowadzono metodą Log-Normalize ze współczynnikiem skalowania 10 000.
Za pomocą transformacji stabilizującej wariancję zidentyfikowano 2000 genów o największej zmienności, które następnie wykorzystano do analizy głównych składowych (PCA). W celu redukcji wymiarowości, w oparciu o pierwsze 30 głównych składowych, zastosowano algorytm UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection). Grupowanie oparte na grafach zrealizowano za pomocą algorytmu Louvain przy rozdzielczości 0,8. Klastry komórek adnotowano zgodnie z uznanymi genami markerowymi. Poziomy ekspresji WAPL zmierzono w różnych populacjach komórek, a stadia cyklu komórkowego określono metodą CellCycleScoring.
Analiza ekspresji białek i modyfikacji potranslacyjnych
Ekspresję i dystrybucję wewnątrzkomórkową WAPL w CSCC oceniono z wykorzystaniem bazy danych Human Protein Atlas. Miejsca modyfikacji potranslacyjnych (PTM) zidentyfikowano za pomocą PhosphoSitePlus. Ponadto, przy użyciu narzędzia Xiantao Academic, zbadano potencjalne powiązania między poziomami ekspresji WAPL a genami zaangażowanymi w procesy modyfikacji białek, a konkretnie AKT1, AKT2, KAT2B, EP300, USP7 i KAT5, w przebiegu CSCC13,14,15,16,17.
Analiza sieci koekspresji i wzbogacenia funkcjonalnego
Dane z sekwencjonowania RNA dla TCGA-CSCC, przetworzone przy użyciu algorytmu STAR i znormalizowane do liczby transkrypcji na milion (TPM), pobrano z portalu Genomic Data Commons (GDC). Aby zidentyfikować geny koekspresjonowane z WAPL, zastosowano próg przesiewowy oparty na bezwzględnej wartości współczynnika korelacji Pearsona większej niż 0,6 oraz poziomie istotności statystycznej P < 0,05.
Aby zbadać funkcje biologiczne związane z WAPL, w pierwszej kolejności przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji po podzieleniu pacjentów na grupy o wysokiej i niskiej ekspresji WAPL, przyjmując medianę wartości ekspresji jako punkt odcięcia. Geny różnicowo eksprimowane zidentyfikowano za pomocą platformy Xiantao Academic, a następnie poddano je analizie wzbogacenia Gene Ontology, obejmującej kategorie procesów biologicznych, komponentów komórkowych i funkcji molekularnych, wraz z analizą ścieżek Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Niezależnie zbadano relacje oddziaływań białkowych z udziałem WAPL przy użyciu bazy STRING, a powstałą sieć oddziaływań zrekonstruowano i przeanalizowano w programie Cytoscape.
Analizę wzbogacenia zestawów genów (GSEA) przeprowadzono z wykorzystaniem baz danych Reactome, WikiPathways oraz KEGG, przyjmując kryteria przesiewowe w postaci bezwzględnego znormalizowanego wyniku wzbogacenia (|NES|) > 1 oraz wskaźnika fałszywych odkryć (FDR) < 0,25.
Analiza infiltracji immunologicznej
Do analizy danych transkrypomicznych z kohorty TCGA-CESC wykorzystano narzędzia obliczeniowe TIMER 2.0 oraz xCell, co umożliwiło ilościową ocenę stanu infiltracji dla 24 różnych populacji komórek odpornościowych.
Przewidywanie wrażliwości na leki
Przewidywania wrażliwości na leki zostały opracowane na podstawie bazy danych GDSC2 z wykorzystaniem pakietu R oncoPredict. Obliczono połowową maksymalną stężenie hamujące (IC50) dla panelu 86 związków chemioterapeutycznych.
Analiza przeżywalności i diagnostyczna
Krzywe przeżycia całkowitego (OS) oraz czasu wolnego od progresji (PFI) sporządzono przy użyciu platformy analitycznej Xiantao, dzieląc kohorty pacjentów na dwie grupy na podstawie mediany poziomu ekspresji WAPL. Znaczenie prognostyczne zmiennych oceniono za pomocą jednowymiarowych i wielowymiarowych modeli regresji proporcjonalnych hazardów Coxa. Aby ocenić zdolność diagnostyczną WAPL oraz SCC (SERPINB3) w różnicowaniu CSCC od przyległej tkanki prawidłowej, zastosowano analizę krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla danych transkryptomicznych, wyrażonych jako liczba transkryptów na milion (TPM), pobranych z bazy The Cancer Genome Atlas.
Pobieranie próbek surowicy i analiza ELISA
Badanie to uzyskało zatwierdzenie Komisji Bioetycznej Szpitala Ludowego Prowincji Shaanxi (nr zatwierdzenia 2024-R055) i zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Pobrano łącznie 89 próbek surowicy od pacjentek z histopatologicznie potwierdzonym CSCC oraz 89 próbek od zdrowych kobiet z grupy kontrolnej, dopasowanych pod względem wieku. Mediana wieku wynosiła 54 lata (zakres 31–77 lat) w kohorcie CSCC oraz 41 lat (zakres 30–52 lat) w kohorcie kontrolnej. Wszystkie przypadki raka szyjki macicy były nowo zdiagnozowane i nieleczone w momencie pobierania krwi; próbki pobrano przed rozpoczęciem jakiejkolwiek operacji, chemioterapii lub radioterapii. Zauważamy, że mimo iż obie grupy pochodziły z porównywalnego środowiska klinicznego, mediany wieku różniły się o 13 lat. Różnica ta została bezpośrednio zbadana w sekcji Wyniki oraz w dedykowanej analizie wrażliwości skorygowanej o wiek, a w sekcji Dyskusja została uznana za ograniczenie badania.
Krew żylną pobierano do probówek bez przeciwkrzepliwych, pozostawiano do skrzepnięcia w temperaturze otoczenia przez 10–20 min, a następnie wirowano przy 2,000–3,000 × g przez 20 min. Surowicę oddzielano w ciągu 1 h od pobrania, natychmiast rozdzielano na alikwoty i przechowywano w temperaturze −20 °C; odstęp czasu między nakłuciem żyły a zamrożeniem nie przekraczał 2 h dla żadnej próbki. Alikwoty poddano jednemu cyklowi zamrażania i rozmrażania przed analizą, a wszystkie pomiary zakończono w ciągu trzech miesięcy od przechowywania. Otrzymaną surowicę podzielono na alikwoty i przechowywano w −20 °C. Próbki hemolizowane lub lipemiczne wykluczano z analizy.
Ilościowe oznaczenie poziomu białka hWAPL w surowicy przeprowadzono przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu testu immunoenzymatycznego (ELISA) opartego na zasadzie kanapki z dwoma przeciwciałami. W skrócie, zarówno standardy kalibracyjne, jak i próbki testowe naniesiono w duplikacie do dołków mikropłytek uprzednio pokrytych przeciwciałem wychwytującym specyficznym dla hWAPL, a następnie inkubowano przez 30 min w 37 °C. Po serii etapów płukania w celu usunięcia niezwiązanego materiału, wprowadzono przeciwciało detekcyjne skierowane przeciwko hWAPL, znakowane peroksydazą chrzanową (HRP), i inkubowano w tych samych warunkach.
Po kolejnym przemyciu, do dołków dodano po 50 µL roztworów substratów chromogennych A i B, a następnie inkubowano je w ciemności w temperaturze 37 °C przez 10 min. W celu przerwania reakcji enzymatycznej dodano roztwór stopujący (50 µL). Gęstość optyczną zmierzono przy długości fali podstawowej 450 nm oraz referencyjnej 630 nm w ciągu 15 min od zatrzymania reakcji. Krzywą wzorcową sporządzono przy użyciu kalibratorów rozcieńczonych seryjnie w zakresie stężeń 10–450 pg/mL. Stężenie hWAPL dla każdej nieznanej próbki wyznaczono poprzez interpolację z tej krzywej wzorcowej i skorygowano o wszelkie rozcieńczenia przedanalityczne. Analizę przeprowadzono ściśle według instrukcji producenta. Zgodnie ze specyfikacją producenta, roboczy zakres detekcji zestawu wynosi 10–450 pg/mL. Próbki analizowano w ostatecznym rozcieńczeniu 5-krotnym, a materiał, którego gęstość optyczna przekraczała wartość najwyższego kalibratora, poddano dalszemu rozcieńczeniu i ponownej analizie, stosując całkowity czynnik rozcieńczenia podczas obliczeń wstecznych. Parametry analityczne zweryfikowano w matrycy surowicy przed analizą próbek badawczych: seryjnie rozcieńczona pula surowicy o wysokim stężeniu wykazała akceptowalną liniowość w całym zakresie kalibracji, a odzysk po dodaniu kalibratora rekombinowanego w trzech pulach surowicy mieścił się w dopuszczalnym przedziale, co jest zgodne z konstrukcją zestawu opartą na metodzie kanapkowej z dwoma przeciwciałami. Dolna granica oznaczalności odpowiadała najniższemu kalibratorowi (10 pg/mL). Podkreślamy, że zestaw ten jest oznakowany przez producenta wyłącznie do celów badawczych i nie jest klinicznie zwalidowanym wyrobem do diagnostyki in vitro; zatem stężenia bezwzględne i wyznaczony punkt odcięcia należy interpretować jako specyficzne dla danej platformy i tymczasowe, co omówiono poniżej.
Równolegle poziom SCC-Ag w surowicy oznaczono przy użyciu platformy Abbott Alinity i za pomocą chemiluminescencyjnego mikrocząsteczkowego testu immunoenzymatycznego (CMIA), przy górnej granicy referencyjnej wynoszącej 1,5 ng/mL. Wszystkie procedury analityczne przeprowadzono w dubletach przez personel laboratoryjny, który nie znał stanu choroby ani żadnych zmiennych klinicznych, w tym stopnia zaawansowania klinicznego, stopnia histologicznego oraz statusu HPV. Współczynniki zmienności międzyseryjnej i wewnątrzseryjnej dla zastosowanych metodologii utrzymano poniżej 10%.
Analiza statystyczna
Ponieważ stężenia hWAPL w surowicy nie spełniały założenia o rozkładzie normalnym zgodnie z testem Shapiro–Wilka (wszystkie P < 0,05), kolejne analizy przeprowadzono z wykorzystaniem metod nieparametrycznych. Zmienne ciągłe przedstawiono zatem jako mediany z zakresami międzykwartylnymi (IQRs). Różnice między dwiema niezależnymi grupami oceniano za pomocą testu U Manna–Whitneya, natomiast porównania trzech lub więcej grup przeprowadzono testem H Kruskala–Wallisa. Korelacje między zmiennymi oceniano za pomocą analizy korelacji rang Spearmana dla danych ciągłych lub porządkowych oraz za pomocą współczynnika korelacji punktowo-dwuseryjnej dla zmiennych binarnych, takich jak status zakażenia HPV. Wyniki przeżycia porównywano za pomocą testu log-rank, a współczynniki hazardu z 95% przedziałami ufności oszacowano na podstawie regresyjnych modeli proporcjonalnych hazardów Coxa.
Wydajność diagnostyczną oceniono za pomocą analizy krzywej ROC, a optymalny punkt odcięcia dla każdego biomarkera wyznaczono poprzez maksymalizację indeksu Youdena. Różnice w polu pod krzywą (AUC) przetestowano z wykorzystaniem metody DeLonga. Aby zbadać łączną użyteczność diagnostyczną, zbudowano model binarnej regresji logistycznej, w którym zmienną zależną był stan choroby (CSCC = 1; kontrola = 0), a niezależnymi predyktorami były surowicze hWAPL oraz antygen SCC. Wynikowe prawdopodobieństwa predykcyjne zapisano jako wynik złożony do późniejszej analizy ROC.
Różnice w wrażliwości na leki między grupami z wysoką i niską ekspresją WAPL oceniono za pomocą pakietu limma, stosując progi skorygowanego P < 0,05 oraz |log₂ fold change| > 0,3. Istotność statystyczną zdefiniowano jako dwustronną wartość P < 0,05. Wszystkie analizy przeprowadzono z użyciem programów SPSS, R lub określonych narzędzi online. Wykorzystane pakiety R obejmowały survival, survminer, pROC, ggplot2, oncoPredict oraz limma. Dla wszystkich analiz wysokowymiarowych, w których jednocześnie testowano wiele hipotez, a mianowicie dla porównań pan-cancer, przesiewu koekspresji, analiz różnicowej ekspresji i wzbogacenia funkcjonalnego oraz analizy wrażliwości na leki, wartości P skorygowano pod kątem wielokrotnych porównań przy użyciu metody Benjamini–Hochberg (false discovery rate); w odpowiednich przypadkach podano skorygowane wartości P. Korelacje parzyste między hWAPL a poszczególnymi genami lub frakcjami komórek odpornościowych podano z nominalnymi wartościami P, a wyniki tych korelacji uznano za generujące hipotezy, a nie potwierdzające. Ze względu na to, że niewielka liczba pól kliniczno-patologicznych w kohorcie publicznej była niecałkowicie wypełniona, przypadki z brakującymi danymi wykluczono z odpowiadających im analiz w sposób parzysty zamiast stosować imputację, a liczbę przypadków możliwych do oceny podano dla każdej zmiennej w Table 1. Aby uwzględnić różnicę wieku między kohortami surowiczymi, przeprowadzono analizę wrażliwości z użyciem binarnej regresji logistycznej skorygowanej o wiek oraz obliczono korelację Spearmana między poziomem hWAPL w surowicy a wiekiem w każdej grupie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Szeroka nadekspresja hWAPL w nowotworach złośliwych u ludzi, zwłaszcza w tkankach raka szyjki macicy
Analiza pan-nowotworowa zbiorów danych TCGA wykazała, że WAPL wykazuje znacznie podwyższoną ekspresję w większości guzów litych w porównaniu z odpowiadającymi im tkankami prawidłowymi (Rysunek 1A). Warto zauważyć, że hWAPL był znacząco nadeksprimowany w raku płaskonabłonkowym szyjki macicy oraz gruczołowym raku szyjki macicy (CESC) spośród 21 in...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Nasza analiza pan-nowotworowa danych TCGA wykazała, że ekspresja WAPL jest wyraźnie podwyższona w większości guzów litych w porównaniu z tkankami prawidłowymi, przy czym najsilniejsza nadekspresja została zaobserwowana w CESC. Obserwacja ta jest zgodna z wcześniejszymi ustaleniami, według których mRNA hWAPL jest eksprymowane głównie w raku szyjki macicy, przy minimalnej ekspresji w innych tkankach prawidłowych i nowotworowych7. Oikawa i wsp. pierwotnie scharakteryzowali hWAPL...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Autorzy pragną podziękować wszystkim uczestnikom oraz personelowi klinicznemu zaangażowanemu w to badanie. Praca ta była wspierana przez Program Podstawowych Badań Nauk Przyrodniczych Prowincji Shaanxi (Grant nr 2021JM-552).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Abbott GmbH, Wiesbaden, Niemcy | Nie podano | Wykorzystywane do detekcji SCC-Ag | |
| Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, Chiny | Model RT-3100 | Wykorzystywane do mycia płytek | |
| Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, Szanghaj, Chiny | Model TLXY-IIC wirówka niskoprędkościowa | Wykorzystywana do wirowania próbek surowicy | |
| Cytoscape Consortium | Wersja 3.9.1 | Wykorzystywane do wizualizacji sieci; wizualizacja sieci | |
| National Cancer Institute | https://portal.gdc.cancer.gov; dostęp w październiku 2025 | Wykorzystywane do pobierania danych TPM z projektu TCGA-CSCC wyrównanych za pomocą STAR; RRID:SCR_014514 | |
| Platforma internetowa/baza danych | Nie dotyczy | Wykorzystywana do przewidywania wrażliwości na leki; referencyjne dane dotyczące wrażliwości na leki | |
| National Center for Biotechnology Information | GPL24676 Illumina NovaSeq 6000 (Homo sapiens) | Wykorzystywane do pobierania zestawu danych sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek; zestaw danych single-cell RNA-seq | |
| Platforma internetowa | Nie dotyczy | Wykorzystywana do analizy izoform transkryptów i ekspresji genów; analiza izoform transkryptów i ekspresji | |
| Pakiet R | Wersja 3.4.4 | Wykorzystywany do wizualizacji danych | |
| Platforma internetowa/baza danych | Nie dotyczy | Wykorzystywana do analizy ekspresji białek i lokalizacji subkomórkowej; ekspresja i lokalizacja białek | |
| Shanghai Fusheng Biotechnology Co., Ltd. | A977261-96T | A977261-96T; ELISA metodą kanapkową z dwoma przeciwciałami; zakres detekcji 10-450 pg/mL; wyłącznie do celów badawczych (www.affandi-e.com) | |
| Pakiet R | Wersja 3.54.0 | Wykorzystywany do analizy różnicowej | |
| Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, Chiny | Model RT-6100 | Wykorzystywane do pomiaru gęstości optycznej | |
| Pakiet R | Wersja 0.2 | Wykorzystywany do przewidywania wrażliwości na leki (IC50); RRID:SCR_023220 | |
| Platforma internetowa/baza danych | Nie dotyczy | Wykorzystywana do analizy modyfikacji potranslacyjnych; analiza miejsc modyfikacji potranslacyjnych | |
| Pakiet R | Wersja 1.18.0 | Wykorzystywany do analizy krzywej ROC | |
| R Foundation for Statistical Computing | Wersja 4.2.1 | Wykorzystywane do analizy statystycznej i analizy bioinformatycznej; analiza statystyczna i bioinformatyczna | |
| Abbott GmbH, Wiesbaden, Niemcy | REF 09P3374 | Wykorzystywane do oznaczania ilościowego SCC-Ag w surowicy | |
| Platforma internetowa | Nie dotyczy | Wykorzystywana do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek | |
| Sanli Medical Technology Development Co., Ltd., Liuyang, Hunan, Chiny | Nie podano | Wykorzystywane do pobierania krwi żylnej | |
| IBM Corp. | Wersja 26.0 | Wykorzystywane do analizy statystycznej; analiza statystyczna | |
| STRING Consortium | Wersja 11.5 | Wykorzystywane do analizy sieci interakcji białko-białko; sieci interakcji białko-białko | |
| Pakiet R | Wersja 3.4 | Wykorzystywany do analizy przeżywalności | |
| Pakiet R | Wersja 0.4.9 | Wykorzystywany do wizualizacji krzywych przeżywalności | |
| National Cancer Institute | https://www.cancer.gov/tcga; dostęp w październiku 2025 | RRID:SCR_003193; dane transkryptomiczne nowotworów | |
| Platforma internetowa | http://timer.cistrome.org; dostęp w październiku 2025 | RRID:SCR_018737; analiza infiltracji immunologicznej | |
| UCSC Xena Browser | https://xenabrowser.net; dostęp w październiku 2025 | Wykorzystywane do pobierania danych TCGA; pobieranie danych TCGA | |
| Platforma internetowa/narzędzie | Wersja 1.0 | Wykorzystywane do szacowania infiltracji komórek odpornościowych | |
| Platforma internetowa | https://www.xiantaoxueshu.com; dostęp w październiku 2025 | Wykorzystywana do analiz różnicowej ekspresji, korelacji, przeżywalności oraz analiz diagnostycznych |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.