Czułość rozproszenia Ramana wzmocniona powierzchniowo i odpowiadająca na redox do monitorowania reakcji akupunktury u szczurów z upośledzoną tolerancją na glukozę

Podsumowanie

To badania eksploracyjnego modelu na szczurach przedstawiają czuły na redoks powierzchniowo wzmocniony rozproszony Ramana (SERS) - aktywną mikroigłę do jednoczesnej interwencji akupunkturowej i śledzenia proporcjonalnego indeksów SERS związanych z lokalną zdolnością utleniania i potencjałem redoks u szczurów z upośledzoną tolerancją na glukozę.

Streszczenie

Upośledzona tolerancja glukozy (IGT) wiąże się z zaburzeniem równowagi redoks i zwiększonym stresem oksydacyjnym, ale dynamiczne in vivo śledzenie zmian związanych z redoks w czasie interwencji akupunkturowej pozostaje technicznie wyzwaniem. W niniejszym badaniu opracowano czuły na redoks system mikroigieł aktywowanych ramanowskim rozpraszaniem powierzchniowym (SERS) dla jednoczesnej interwencji akupunkturowej i względnego śledzenia wskaźników SERS związanych z zdolnością utleniania (OC) i potencjałem redoks (RP) u szczurów z IGT. Czułe na stres oksydacyjny i redoks sondy SERS zostały przygotowane przez funkcjonalizację nanoskorup ze złota (GNS) z p-fenylenodianiaminą (p-PDA) dla reaktywności OC i antrachinonem dla reaktywności RP, odpowiednio. Sondy zostały załadowane do dwóch wytrawionych rowków na igłach akupunkturowych, aby skonstruować aktywne ramanowo mikroigiełki. W badaniu eksploracyjnym użyto szczurów Sprague–Dawley, samców, wolnych od specyficznych patogenów. Trzy szczury służyły jako normalne grupy kontrolne, a 20 szczurów karmiono wysokoenergetyczną dietą i otrzymywało się streptozotocyna (STZ) w celu indukcji IGT. Po przesiewaniu, 18 kwalifikujących się szczurów z IGT zostało podzielonych na grupy wysokoenergetycznej diety i normalnej diety, po 9 szczurów w każdej grupie dietetycznej. Każda grupa dyiety została dalsze podzielona na punkty akupunkturowe skręcania, punkty nieakupunkturowe skręcania i bezpośredniego wprowadzania igły akupunkturowej, po 3 szczury w każdej podgrupie. Nakaływanie było wykonywane dwa razy dziennie przez 7 kolejnych dni, a zanotowano poziom glukozy na czczo (FPG), poziom glukozy 2 h po posiłku (2hPG) oraz wskaźniki SERS związane z OC i RP. Wyniki wykazały, że nakaływanie w punktach akupunkturowych z skręcaniem było związane z niższymi wartościami FPG i 2hPG oraz zmienionymi wskaźnikami SERS związanymi z OC i RP w tym modelu szczurów z IGT. Ponieważ nie zawierały one zewnętrznych krzywych kalibracyjnych, niezależnych biochemicznych testów stresu oksydacyjnego, testów wypłukiwania sond i testów biokompatybilności, proporcje SERS należy interpretować jako względne wskaźniki optyczne związane z redoks, a nie jako bezwzględne stężenia biochemiczne lub bezwzględne wartości potencjału redoks. Te wyniki wspierają wykonalność aktywowanych ramanowo mikroigieł jako eksploracyjnej platformy przedklinicznej dla łączenia interwencji akupunkturowej z lokalnym śledzeniem SERS w szczurach z IGT.

Wprowadzenie

Upośledzona tolerancja glukozy (IGT), zmniejszenie zdolności organizmu do tolerowania glukozy, reprezentuje przejściową fazę między normalnym poziomem glukozy we krwi a hiperglikemią cukrzycową¹. IGT jest zatem kluczowym wczesnym sygnałem ostrzegawczym i odwracalnym etapem w rozwoju cukrzycy typu 2². Dane kliniczne pokazują, że około 30% populacji z IGT przejdzie do cukrzycy typu 2 w ciągu 5–10 lat³; jednak, dzięki terminowej interwencji, ten procent może być zmniejszony do mniej niż 10%⁴.

IGT jest dynamicznym i złożonym procesem, a utrzymujące się środowisko o wysokim poziomie glukozy jest kluczowym wyzwalaczem zaburzeń metabolizmu oksydacyjnego⁵. Gdy organizm przebywa w przedłużonym stanie hiperglikemii, łańcuch oddechowy mitochondriów funkcjonuje nieprawidłowo, a wskaźnik wytwarzania reaktywnych form tlenu wzrasta o 30–50%, bezpośrednio zwiększając moc utleniającą w organizmie⁶; jednocześnie, wysoki poziom cukru hamuje aktywność kluczowych enzymów, takich jak glutation reduktaza, uniemożliwiając systemowi antyoksydacyjnemu usuwanie nadmiaru reaktywnych form tlenu w odpowiednim czasie i dalsze zakłócanie równowagi utleniania i redukcji. Ponadto, IGT jest towarzyszona przez zmiany patologiczne, w tym insulinoopornością i łagodnym upośledzeniem funkcji komórek beta, prowadząc do zakresu biologicznych i biochemicznych reakcji^7,8. Wraz z ewolucją stanu redoks, te zmiany dodatkowo pogarszają zaburzenia metabolizmu glukozy i podnoszą potencjalne ryzyko powikłań cukrzycowych, w tym retinopatii, nefropatii i choroby układu krążenia^9,10. Dlatego monitorowanie zdolności utleniania (OC) i potencjału redoks (RP) u osób lub modeli zwierzęcych z IGT powinno poprawić nasze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw rozwoju IGT i przewodzić projektowaniu ukierunkowanych strategii terapeutycznych.

Akupunktura ma ponad 3000-letnią historię i wykazała dobrą skuteczność kliniczną w leczeniu wielu chorób¹¹. Ponadto, liczne badania eksperymentalne na zwierzętach wykazały, że akupunktura wywiera korzystny wpływ na regulację stanów stresu oksydacyjnego w modelach zwierzęcych poprzez wzmocnienie układu enzymów antyoksydacyjnych i zmniejszenie peroksydacji lipidów¹². Jako tradycyjna chińska praktyka medyczna, akupunktura wykazała również znaczące korzyści w leczeniu cukrzycy i IGT. Stwierdzono, że punkty akupunktowe Guanyuan (CV4) i Sanyinjiao (SP6) aktywizują ścieżkę SIRT1/PGC-1α w mięśniach szkieletowych, zmniejszając insulinooporność u myszy z otyłością cukrzycową¹³. Ponadto, punkty akupunktowe Tianshu (ST25) modulują aktywność neuronów hamujących glukozę zlokalizowanych w bocznej hipotalamusie i przyczyniają się do regulacji metabolizmu glikolipidowego¹⁴. Jednak większość badań nad mechanizmami akupunktury dożylnej koncentruje się głównie na układach neuromodulacyjnych, immunomodulacyjnych i żołądkowo-jelitowych, w których akupunktura może wpływać na metabolizm glukozy poprzez modulacje funkcji układu autonomicznego lub pośrednio regulować poziom glukozy we krwi poprzez zwiększenie równowagi flory jelitowej^15,16. Specyficzny mechanizm wpływu akupunktury w leczeniu IGT oraz jej wpływ na stres oksydacyjny nie zostały jeszcze głęboko zbadane i nie posiadają wsparcia eksperymentalnego.

Wzmocniona rozproszona Ramana (SERS) zapewnia dużą czułość i swoistość, co umożliwia wykrywanie szerokiej gamy analitów. Nanosondy SERS oparte na nanowłóknach optycznych¹⁷, błonach chitozańowych¹⁸ oraz poprzednie badania wykazały, że igły akupunkturowe¹⁹ mogą być wykorzystywane do wykrywania biomarkerów, neuroprzekaźników i innych aspektów biochemii komórkowej in vivo. Igły akupunkturowe, w szczególności, reprezentują obiecujące narzędzia do badań głębokich tkanek, umożliwiając minimalnie inwazyjne monitorowanie in situ z następującą analizą ex vivo. Akupunktura, jako dobrze ugruntowana metoda terapeutyczna, ma niezwykle szerokie zastosowania kliniczne. Ostatnie badania wykazały, że włókna optyczne wspierane przez SERS, opatrunki ranne i urządzenia mikronigielkowe mogą wspierać in situ lub minimalnie inwazyjne śledzenie sygnałów związanych z redoksem w biologicznie istotnych ustawieniach^20,21. Równolegle, aktywne w SERS igły akupunkturowe i powiązane systemy mikronigielkowe pojawiły się jako obiecujące nośniki do integracji zdolności wykrywania z interwencją w tkankach¹⁹, co skutkuje mikronigielkami aktywnymi w SERS z in vivo odpowiedzią i moż

Protokół

Zwierzęta i modele IGT

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Etykę Zwierząt Instytutu Badawczego Uniwersytetu Południowo-Wschodniego w Suzhou (numer zgody SEU-IACUC-20250318007) i przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Szczury uzyskano i przetrzymywano w warunkach swobodnych od specyficznych patogenów (SPF) w temperaturze 25 °C z cyklem 12 h światła/12 h ciemności. W przypadku procedur wymagających znieczulenia, szczury były znieczulone za pomocą izofluranu dostarczanego w tlenie przez komorę indukcyjną i utrzymywane za pomocą maski nosowej. Izofluran był stosowany w stężeniu 3% do indukcji i 1% do podtrzymania znieczulenia, przy czym stężenie było dostosowywane według częstości oddechu i reakcji na procedurę.

Właściwą głębokość znieczulenia potwierdzono przed nakłuciem lub wstrzyknięciem poprzez utratę odruchu prawidłowego położenia ciała i brak reakcji na ściśnięcie palca. Podczas znieczulenia monitorowano wzorzec oddechu, pozycję ciała i odzyskiwanie, a zwierzęta umieszczano na podgrzewanej poduszce, aby utrzymać temperaturę ciała. Zwierzęta przetrzymywano po 2 w klatce z wolnym dostępem do pokarmu i wody, chyba że wymagano postu na potrzeby testu glukozy. Po przybyciu szczury były aklimatyzowane przez 1 tydzień przed indukcją modelu. Dobrostan zwierząt było monitorowane codziennie, w tym ogólną aktywność, pielęgnację, przyjmowanie pokarmu, wagę ciała, stan miejsca wstrzyknięcia i odzyskiwanie po znieczuleniu. Na koniec badania szczury zostały poddane eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt. Eutanazję przeprowadzano poprzez stopniowe wypełnianie CO₂, po czym potwierdzono śmierć za pomocą metody dyslokacji szyjnej. Zwierzęta, które spełniały kryteria humanitarnego punktu końcowego, w tym ciężką utratę masy ciała, uporczywą nieruchomość, nieprawidłowe oddychanie, niemożność jedzenia lub picia lub ciężki dystres, były eutanatyzowane natychmiast, zamiast być utrzymywane do zaplanowanego punktu końcowego. W badaniu zastosowano samce szczurów Sprague'a-Dawleya o stopniu czystości swobodnej od specyficznych patogenów o wadze 200 ± 20 g. Po 1 tygodniu aklimatyzacji szczury losowo przydzielono do dwóch grup: trzy szczury w grupie normalnej karmiono normalnym pokarmem, podczas gdy 20 szczurów w grupie modelowej karmiono pokarmem wysokotłuszczowym (50% pokarmu podstawowego + 10% smalcu + 25% sacharozy + 15% proszku żółtkowego) przez 3 tygodnie. Zwierzęta w grupie modelowej otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcie 20 mg/kg 2% roztworu STZ (rozpuszczonego w buforze cytrynowym 0,1 mol/L, pH 4,4) przez 12 h, po 12-godzinnym poście bez ograniczeń wodnych. Szczury w grupie normalnej otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcie odpowiedniej dawki buforu cytrynowego po karmieniu normalnym pokarmem. Test tolerancji glukozy dootrzewnowej (IPGTT) przeprowadzono 1 tydzień później. Reagenty i sprzęt użyty w badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

Glikemię na czczo (FPG) mierzono pobraniem krwi z końca ogona szczurów z każdej grupy po 12-godzinnym poście bez ograniczeń wodnych, a glikemię po 2 godzinach (2hPG) rejestrowano po dootrzewnym wstrzyknięciu 20% dekstryzy 2 g/kg. W grupie normalnej zakres FPG wynosił 5,1–6,6 mmol/l, a zakres 2hPG glukozy 7,3–9,4 mmol/l, w porównaniu z FPG ≤ 7,0 mmol/l i zakresem 2hPG 10–16 mmol/l w grupie modelowej. Wśród 20 szczurów przydzielonych do indukcji modelu IGT, 18 spełniło zdefiniowane kryteria IGT po IPGTT i zostało włączonych do dalszego eksperymentu interwencyjnego. Dwa szczury zostały wykluczone, ponieważ ich wartości FPG lub 2hPG wypadły poza zdefiniowany zakres IGT. 18 kwalifikujących się szczurów zostało następnie losowo przydzielonych do grupy z wysokotłuszczową dietą i grupy z dietą normalną, po 9 szczurów w każdej grupie. Każda grupa dietetyczna została następnie podzielona na trzy podgrupy: skręcanie punktu akupunkturowego, skręcanie punktu niebędącego punktem akupunkturowym i bezpośrednie wprowadzenie igły w punkt akupunkturowy, po 3 szczury w każdej podgrupie. Było to eksploracyjne badanie nad rozwojem metody, mające na celu ocenę wykonalności połączenia interwencji akupunkturowej z śledzeniem ratiometrycznym opartym na SERS w przedklinicznym modelu szczurów z IGT. Nie przeprowadzono formalnego obliczenia mocy statystycznej. Wielkość podgrupy trzech szczurów wybrano na podstawie wykonalności, wstępnych badań SERS-mikroigiełkowych i zasady ograniczenia liczby zwierząt. Szczury losowo przydzielano do grup eksperymentalnych; formalne ukrycie alokacji i zaślepienie nie zostały przeprowadzone.

Protokoły leczenia akupunkturą przesiewano w oparciu o dowody wskazujące na kliniczne praktyki w medycynie tradycyjnej chińskiej i wykonalność eksperymentów na zwierzętach²². Wybrane punkty akupunkturowe to Zhongwan (RN12/

Wyniki

Wytwarzanie mikroigieł aktywnych w SERS do detekcji OC i RP

W celu zidentyfikowania zmian w OC i RP wykonano mikroigły aktywne w SERS zawierające odpowiednie sondy. Reprezentatywne obrazy SEM potwierdziły dwukanałową strukturę mikroigieł aktywnych w SERS. Rysunek 2A przedstawia korpus igły do akupunktury z dwoma wytrawionymi kanałami, Rysunek 2B pokazuje kanał wypełniony GNS, a Rysunek 2C prezentuje powiększony widok GNS rozmieszczonych wewnątrz kanału. Obrazy te potwierdziły, że wytrawione kanały mogą służyć jako zlokalizowane miejsca ładowania sond SERS reagujących na OC i RP. Stosunek intensywności piku I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ wykorzystano do określenia stopnia utlenienia p-PDA. Rysunek 3A przedstawia widma SERS p-PDA przed i po oddziaływaniu z 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, natomiast Rysunek 3B prezentuje widma sondy redoks w wodnych roztworach 1 × 10⁻³ M NaBH4 oraz 1 × 10^-4 M HAuCl₄. Odpowiedź sondy RP wyrażono jako stosunek intensywności pików (I₁₆₀₆ cm^-1/I₁₆₆₆ cm^-1), który malał wraz ze wzrostem RP.

Aby ocenić selektywność sondy reagującej na potencjał oksydacyjny, zmierzono stosunek I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ po wystawieniu na działanie różnych czynników redukujących i utleniających. Niezależne pomiary sondy przeprowadzono dla n = 3 na grupę, przyjmując sondę SERS lub niezależnie przygotowaną mikroigłę jako jednostkę analizy (Rycina 3C). W porównaniu z grupą CK (test Kruskala-Wallisa, a następnie test wielokrotnych porównań Dunna), czynniki redukujące FeSO₄ i Na₂SO₄ nie zmieniły znacząco stosunku I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ (p > 0,05). Kwas askorbinowy (AA, p < 0,001), mimo że został uwzględniony jako czynnik redukujący, również spowodował wzrost tego stosunku w obecnych warunkach analizy. W związku z tym odpowiedź na AA zinterpretowano ostrożnie jako specyficzną dla sondy odpowiedź spektralną w tym teście w roztworze, a nie jako dowód na działanie utleniające. Z kolei odczynniki utleniające lub związane z utlenianiem zwiększyły ten stosunek w różnym stopniu. Wzrost stosunku odnotowano po wystawieniu na CuSO₄ (p < 0,0001), H₂O₂ (p < 0,0001), FeCl₃ (p < 0,0001) oraz HAuCl₄ (p < 0,0001). Aby ocenić stabilność sondy OC w temperaturze pokojowej, spektra SERS rejestrowano w odstępach godzinnych przez okres 6 h przed reakcją sondy z 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃ (Rycina 3D), a następnie obliczono odpowiadające im stosunki I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹. Po adsorpcji sondy wartość początkowa pozostawała stabilna na poziomie około 0,20 ± 0,02, podobnie jak wartość dla reakcji z FeCl₃ na poziomie około 0,9 ± 0,10 w ciągu 6 h. Wyniki te sugerują, że p-PDA na GNS jest stabilne w powietrzu.

Reakcje OC i RP w punktach akupunkturowych i nieakupunkturowych

Poprzednie badania²⁹ wykazały, że sonda OC osiąga maksymalną odpowiedź 10 min po wprowadzeniu. Ryciny 4A i B ilustrują odpowiedź aktywnych na SERS mikroił w zdrowych szczurach, umieszczonych w punktach akupunkturowych ST36 i RN12, a także w miejscach oddalonych o 5 mm od tych punktów, przez 10 min. W tych eksperymentach n = 3 szczury na grupę, a widma zebrane z wielu punktów tej samej sondy potraktowano jako powtórzenia techniczne i uśredniono przed analizą na poziomie grupy. Mikroiły aktywne na SERS skutecznie reagowały na zmiany OC i RP in vivo, przy braku istotnych różnic w OC i RP w grupie punktów akupunkturowych w porównaniu z grupą punktów nieakupunkturowych (test t dla prób niezależnych, p > 0,05).

Aby dokładniej określić wpływ obracania igły na miejscowe OC i RP in vivo, mikroiły aktywne w SERS wprowadzono do zdrowych szczurów w punktach akupunkturowych ST36 i RN12 oraz w odległości 5 mm poza tymi punktami, na głębokość 10 mm. Podczas manewru obracania w każdym punkcie akupunkturowym, igła sąsiadująca z punktem pozostawała nieobrócona i odwrotnie, a zmiany wartości OC i RP w miejscu nakłucia były rejestrowane (Rycina 4C–F). Nie stwierdzono istotnych zmian w OC i RP w zależności od tego, czy obracanie wykonywano w punktach akupunkturowych, czy poza nimi u zdrowych szczurów, nie zaobserwowano również wpływu obracania w punkcie sąsiednim (p > 0,05).

Zmiany OC i RP u szczurów z IGT w związku z akupunkturą, rotacją igieł i warunkami dietetycznymi

Aby potwierdzić pomyślne ustanowienie szczurzego modelu IGT, w szczurach modelowych i kontrolnych zmierzono odpowiednio wartości FPG oraz 2hPG za pomocą testu IPGTT. Grupa kontrolna obejmowała n = 3 szczury, a grupa modelowa n = 18 szczurów, które spełniały określone wcześniej kryteria upośledzonej tolerancji glukozy. Szczury modelowe wykazały wyższy poziom glukozy we krwi na czczo niż szczury kontrolne (6,92 mmol/L w porównaniu do 5,54 mmol/L; test U Manna-Whitneya, p < 0,01) oraz wyższy poziom glukozy we krwi 2 h po posiłku niż szczury kontrolne (11,52 mmol/L w porównaniu do 7,92 mmol/L; test U Manna-Whitneya, p < 0,001) (Rycina 5), co wskazuje na pomyślną indukcję IGT u zwierząt modelowych.

Aby zweryfikować wpływ kombinacji punktów akupunkturowych, rotacji igieł i warunków dietetycznych u szczurów z IGT, wybrano typowy zestaw par punktów akupunkturowych. 18 kwalifikujących się szczurów modelowych podzielono następnie na grupy z dietą wysokotłuszczową oraz dietą normalną, po n = 9 szczurów w każdej grupie dietetycznej. Każda grupa dietetyczna została dalej podzielona na trzy podgrupy interwencyjne: rotację w punktach akupunkturowych, rotację poza punktami akupunkturowymi oraz bezpośrednie wkłucie w punktach akupunkturowych, po n = 3 szczury w każdej podgrupie. Wartości FPG zapisywano przed każdym dniem nakłuwania (ryciny 6A–C), a wartości 2hPG (rycina 6D>) mierzono po 7 dniach nakłuwania za pomocą testu IPGTT w każdej grupie. W tym eksploracyjnym zbiorze danych nie zaobserwowano wyraźnej różnicy w poziomie FPG lub 2hPG między grupami modelowymi z dietą wysokotłuszczową a dietą normalną po nakłuwaniu w punktach akupunkturowych. Porównania między nakłuwaniem w punktach akupunkturowych a nakłuwaniem poza nimi sugerowały, że rotacja w punktach akupunkturowych wiązała się z niższymi wartościami glukozy we krwi w obecnych warunkach eksperymentalnych (testy t dla prób niezależnych, p < 0,05). Ze względu na niewielką liczebność podgrup oraz brak możliwości pełnego statystycznego rozdzielenia wpływu diety, lokalizacji punktu akupunkturowego i manipulacji rotacyjnej, wyniki te zinterpretowano jako wstępne obserwacje na modelu zwierzęcym.

Monitorowano zmiany w wskaźnikach SERS związanych z potencjałem redoks oraz zdolnością oksydacyjną podczas tygodniowej interwencji akupunkturowej u szczurów z IGT. W analizach tych w każdej podgrupie uwzględniono n = 3 szczury, a każdy szczur traktowano jako jednostkę analizy biologicznej. U szczurów na diecie wysokotłuszczowej wskaźnik SERS związany ze zdolnością oksydacyjną spadał w czasie w grupach z rotacją w punktach akupunkturowych oraz bezpośrednim nakłuciem w punktach akupunkturowych, natomiast pozostał na stosunkowo wyższym poziomie w grupie z rotacją poza punktami akupunkturowymi (Rysunek 7A). Wskaźnik SERS związany z potencjałem redoks wzrósł w czasie w grupach z rotacją w punktach akupunkturowych oraz bezpośrednim nakłuciem w punktach akupunkturowych, podczas gdy w grupie z rotacją poza punktami akupunkturowymi odnotowano porównawczo słabszy wzrost (Rysunek 7B). Podobne tendencje zaobserwowano u szczurów z IGT na normalnej diecie. Wskaźnik SERS związany ze zdolnością oksydacyjną spadał w czasie w grupach z rotacją w punktach akupunkturowych oraz bezpośrednim nakłuciem w punktach akupunkturowych, przy mniejszej zmianie w grupie z rotacją poza punktami akupunkturowymi (Rysunek 7C). Wskaźnik SERS związany z potencjałem redoks wzrósł w czasie w grupach z rotacją w punktach akupunkturowych oraz bezpośrednim nakłuciem w punktach akupunkturowych, natomiast w grupie z rotacją poza punktami akupunkturowymi pozostał on na porównawczo niższym poziomie (Rysunek 7D).

Aby dalej porównać wpływ warunków dietetycznych przy zastosowaniu tej samej manipulacji akupunkturowej, porównano podgrupy z rotacją punktów akupunkturowych z grup z dietą wysokotłuszczową oraz dietą normalną. W tym porównaniu indeks SERS związany z wydajnością oksydacyjną spadał w czasie w obu warunkach dietetycznych, przy czym w 7. dniu zaobserwowano większy spadek w podgrupie z rotacją punktów akupunkturowych przy diecie normalnej (Ryc. 7E). Indeks SERS związany z potencjałem redoks wzrastał w czasie w obu warunkach dietetycznych, osiągając wyższą wartość w 7. dniu w podgrupie z rotacją punktów akupunkturowych przy diecie normalnej (Ryc. 7F). Wyniki te sugerują, że rotacja punktów akupunkturowych i normalizacja diety wiązały się ze zmianami w lokalnych indeksach SERS związanych z redoksem u szczurów z IGT. Ponieważ każda podgrupa składała się tylko z trzech szczurów i nie przeprowadzono niezależnych biochemicznych testów stresu oksydacyjnego, wyniki te należy interpretować jako eksploracyjne obserwacje w modelu zwierzęcym, a nie jako ostateczny dowód biochemiczny na poprawę stanu stresu oksydacyjnego.

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:

Wszystkie numeryczne dane surowe wykorzystane do sporządzenia wykresów i analizy statystycznej, w tym pomiary glikemii, wartości stosunków uzyskane metodą SERS oraz dane źródłowe dla ilościowych paneli rysunków, zostały uporządkowane i przesłane jako Tabela uzupełniająca 1. W przypadku eksperymentów z ciągłym monitorowaniem sondy, generowanych bezpośrednio przez urządzenie analityczne, wyeksportowane wartości oraz reprezentatywne wyniki generowane przez urządzenie, służące do oceny wydajności sondy, zawarto w Pliku uzupełniającym 1.

Rycina 1: Schemat metodologiczny interwencji akupunkturowej i lokalnego ratiometrycznego śledzenia SERS z wykorzystaniem dwukorytowej mikroigły aktywnej w SERS. Schemat przedstawia wprowadzenie dwukorytowej mikroigły aktywnej w SERS do punktu akupunkturowego lub sąsiedniego miejsca niebędącego punktem akupunkturowym, a następnie akwizycję widma Ramana. Autorzy przygotowali tę rycinę przy użyciu oprogramowania WPS; licencja autorska nie jest wymagana. Skróty: SERS = powierzchniowo wzmocnione rozproszenie Ramanowskie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy SEM mikroigieł aktywnych w SERS. (A) Trzon igły do akupunktury z dwoma rowkami; pasek skali = 200 µm; powiększenie = 77×. (B) Rowek zintegrowany z GNS; pasek skali = 20 µm; powiększenie = 1 000×. (C) Powiększony obraz rowka z punktu B; pasek skali = 2 µm; powiększenie = 30 000×. Skróty: SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa; GNS = złote nanowłoki (gold nanoshells). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Charakterystyka sond SERS reagujących na OC oraz RP. (A) Znormalizowane widma p-PDA przed i po oddziaływaniu z FeCl₃. (B) Znormalizowane widma SERS sond RP odpowiednio w roztworach NaBH₄ oraz HAuCl₄. (C) Stosunki I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ dla sond OC w różnych roztworach utleniających i redukujących. n=3 niezależnych pomiarów sondy na grupę. Test Kruskala-Wallisa, a następnie test wielokrotnych porównań Dunna względem grupy CK. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). (D) Sześciogodzinna ocena stabilności sondy reagującej na OC przed i po reakcji z FeCl₃. Skróty: SERS = powierzchniowo wzmocnione rozproszenie Ramanowskie; CK = kontrola; p-PDA = p-fenylendiamina; AA = kwas askorbinowy. ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wskaźniki SERS związane z OC i RP, zmierzone przy użyciu różnych metod nakłuwania w punktach akupunkturowych i poza nimi u zdrowych szczurów. (A) Wskaźnik SERS związany z OC po bezpośrednim wprowadzeniu igły w punktach akupunkturowych i sąsiednich miejscach poza punktami akupunkturowymi. (B) Wskaźnik SERS związany z RP po bezpośrednim wprowadzeniu igły w punktach akupunkturowych i sąsiednich miejscach poza punktami akupunkturowymi. (C) Wskaźnik SERS związany z OC po bezpośrednim wprowadzeniu igły w miejscach poza punktami akupunkturowymi oraz po rotacji igły w punktach akupunkturowych. (D) Wskaźnik SERS związany z RP po bezpośrednim wprowadzeniu igły w miejscach poza punktami akupunkturowymi oraz po rotacji igły w punktach akupunkturowych. (E) Wskaźnik SERS związany z OC po bezpośrednim wprowadzeniu igły w punktach akupunkturowych i rotacji igły w sąsiednich miejscach poza punktami akupunkturowymi. (F) Wskaźnik SERS związany z RP po bezpośrednim wprowadzeniu igły w punktach akupunkturowych i rotacji igły w sąsiednich miejscach poza punktami akupunkturowymi. OC obliczono jako I_{1450 cm}^-1/I_{1500 cm}^-1, a RP obliczono jako I_{1606 cm}^-1/I_{1666 cm}^-1. n=3 w każdej grupie. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Nie zaobserwowano istotnych różnic w porównaniach parzystych. Skróty: OC = zdolność utleniająca (oxidative capacity); RP = potencjał redoks (redox potential). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wartości FPG i 2hPG w teście IPGTT u szczurów w grupie modelowej i kontrolnej (CK). FPG i 2hPG mierzono w celu weryfikacji ustanowienia modelu szczura z zaburzoną tolerancją glukozy. n = 3 szczury w grupie kontrolnej i n = 18 szczurów w grupie modelowej. Analizę statystyczną przeprowadzono testem U Manna–Whitneya, a wyniki przedstawiono jako średnią ± SEM. **p < 0.01, ***p < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 6: Wartości FPG i 2hPG u szczurów z IGT podczas procedur akupunktury. (A) Wartości FPG dla grupy poddanej akupunkturze z rotacją igieł w punktach akupunkturowych oraz bezpośrednim wprowadzeniem igieł w punkty akupunkturowe (n = 3 na grupę). (B) Wartości FPG dla grupy poddanej wkłuciom z rotacją w punktach akupunkturowych i w miejscach niebędących punktami akupunkturowymi (n = 3 na grupę). (C) Wartości FPG dla grup na diecie wysokotłuszczowej i diecie standardowej (n = 3 na grupę). (D) Wartości 2hPG w 7. dniu u szczurów na diecie wysokotłuszczowej i diecie standardowej w warunkach rotacji w punktach akupunkturowych, rotacji w miejscach niebędących punktami akupunkturowymi oraz bezpośredniego wprowadzenia igieł w punkty akupunkturowe (n = 3 na grupę). Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. Zaplanowane porównania parami punktów końcowych w panelu D analizowano za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t Studenta. *p < 0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 7: Zmiany OC i RP u szczurów w każdej grupie podczas 1 tygodnia akupunktury. (A) Zmiany OC u szczurów z IGT na diecie wysokotłuszczowej. (B) Zmiany RP u szczurów z IGT na diecie wysokotłuszczowej. (C) Zmiany OC u szczurów z IGT na diecie normalnej. (D) Zmiany RP u szczurów z IGT na diecie normalnej. (E) Porównanie indeksu SERS związanego z OC pomiędzy warunkami diety wysokotłuszczowej a diety normalnej w podgrupie z rotacją igieł w punktach akupunkturowych; (F) Porównanie indeksu SERS związanego z RP pomiędzy warunkami diety wysokotłuszczowej a diety normalnej w podgrupie z rotacją igieł w punktach akupunkturowych. n = 3 szczury na podgrupę. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Pomiary seryjne zinterpretowano jako eksploracyjne trendy podłużne. Skróty: OC = oxidative capacity (zdolność oksydacyjna); RP = redox potential (potencjał redoks). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Reprezentatywne wyniki generowane przez aparat do oceny odpowiedzi sondy.Plik ten zawiera reprezentatywne wyniki ciągłego monitorowania, wygenerowane bezpośrednio przez aparat analityczny i wykorzystane do oceny parametrów odpowiedzi sondy.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela danych surowych do analiz ilościowych.Plik ten zawiera numeryczne dane źródłowe wykorzystane do generowania wykresów i analiz statystycznych, w tym pomiary glukozy we krwi, wartości stosunków uzyskane metodą SERS oraz ilościowe dane z paneli rysunków.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Upośledzona tolerancja glukozy reprezentuje odwracalny etap przejściowy przed cukrzycą typu 2 i jest ściśle związana z dysfunkcją metaboliczną, opornością na insulinę oraz dysregulacją związaną ze stresem oksydacyjnym. Interwencja w stylu życia i inne wczesne strategie terapeutyczne mogą zmniejszyć ryzyko progresji z upośledzoną tolerancją glukozy do cukrzycy, ale narzędzia do dynamicznego monitorowania lokalnych reakcji biochemicznych podczas interwencji pozostają ograniczone³⁰. Akupunktura była opisywana jako wpływająca na metabolizm glukozy i szlaki związane ze stresem oksydacyjnym w badaniach eksperymentalnych i klinicznych. Jednak większość badań mechanizmu akupunktury opiera się na pomiarach końcowych w krwi lub tkankach, a stosunkowo niewiele metod pozwala na minimalnie inwazyjne śledzenie lokalnych odpowiedzi związanych z redoks w trakcie interwencji akupunkturowej. Poprzednie badania kliniczne dotyczące leczenia IGT potwierdziły, że ryzyko cukrzycy można znacznie zmniejszyć poprzez interwencje w stylu życia, w tym modyfikacje dietetyczne, redukcję masy ciała i zwiększenie aktywności fizycznej³¹. Akupunktura okazała się skuteczna w poprawianiu wskaźników metabolizmu glukozy i obniżaniu poziomu glukozy na czczo i 2hPG. Dlatego wyjaśnienie związku między akupunkturą, redoks i IGT może zapewnić podejście do odwrócenia IGT lub interwencji w jej progresji, zmniejszając tym samym częstość występowania cukrzycy, a także zapewniając wgląd w patologię IGT i mechanizmy leżące u podstawy jej rozwoju.

Obecne badanie proponuje dwukanałową, czułą na redoks powierzchnię wzmocnionego rozpraszania Ramana aktywną platformę mikroigłową do łączenia interwencji akupunkturowej z lokalnym śledzeniem SERS w modelu szczura z upośledzoną tolerancją glukozy. W tym systemie dwie wytrawione rysy na pojedynczej igle akupunkturowej zostały wykorzystane do przenoszenia sond odpowiedzialnych za zdolność utleniania i potencjał redoks. Taki projekt pozwolił na igiełkę akupunkturową funkcjonować nie tylko jako narzędzie interwencji, ale także jako nośnik sensoryczny dla względnych lokalnych wskaźników optycznych związanych z redoks. Wyniki wykazały, że igłowanie w punktach akupunkturowych z zakręcaniem było związane z niższymi wartościami glukozy na czczo i 2hPG oraz zmianami w wskaźnikach SERS związanych z zdolnością utleniania i potencjałem redoks u szczurów z upośledzoną tolerancją glukozy. Te wyniki wspierają wykonalność stosowania mikroigłowych sond SERS do badania lokalnych odpowiedzi związanych z redoks podczas interwencji akupunkturowej. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki sugerują, że igłowanie w punktach akupunkturowych z zakręcaniem było związane z niższymi wartościami FPG i 2hPG oraz zmianami w wskaźnikach OC- i RP-związanych SERS u szczurów z IGT. Te wyniki wspierają wykonalność stosowania mikroigłowych sond SERS do śledzenia lokalnych odpowiedzi optycznych związanych z redoks podczas interwencji akupunkturowej. Jednakże, ponieważ nie wykonano standardowych biochemicznych badań stresu oksydacyjnego, analizy wycieku sond oraz testów biokompatybilności tkanek, zaobserwowane zmiany w wskaźnikach SERS nie powinny być interpretowane jako ostateczna biochemiczna ewidencja poprawy stresu oksydacyjnego.

Można zastosować kilka alternatywnych podejść do dalszego zbadania tej samej hipotezy. Standardowe badania stresu oksydacyjnego, w tym pomiary reaktywnych form tlenu, malondialdehydu, nadtlenoktydazy, katalazy, glutationu peroksydazy i stosunków glutationu/glutationu dwusiarczkowego, mogą służyć do zweryfikowania, czy zmiany w wskaźnikach pochodzących z SERS odpowiadają konwencjonalnym biomarkerom stresu oksydacyjnego^32,33. Elektrochemiczne sondy redoks, czujniki redoks oparte na fluorescencji, badania chemiluminescencyjne, mikrodializa zbiorcza z następczą analizą biochemiczną oraz immunohistochemiczne lub histologiczne walidacje oparte na tkankach mogą również dostarczyć uzupełniających informacji. Połączenie sensorycznych mikroigłowych sond SERS z tymi niezależnymi podejściami pomoże określić, czy zaobserwowane zmiany optyczne odzwierciedlają specyficzne biochemiczne zmiany redoks lub szersze lokalne reakcje tkankowe na igłowanie i stan metaboliczny³⁴.

Potencjalne zastosowania tej metody wykraczają poza obecny model upośledzonej tolerancji glukozy. Ponieważ dysfunkcja redoks jest zaangażowana w choroby metaboliczne, uszkodzenia tkanek, stany zapalne i naprawę ran, mikroigłowe sondy SERS mogą zapewnić przydatne narzędzie przedkliniczne do monitorowania lokalnych odpowiedzi związanych z redoks w modelach związanych z cukrzycą, badaniach nad gojeniem ran, modelach chorób zapalnych i innych minimalnie inwazyjnych ustawieniach interwencji³⁵. W badaniach nad akupunkturą platforma ta może być przydatna do porównywania punktów akupunkturowych, miejsc niebędących punktami akupunkturowymi, różnych manipulacji igłowaniem oraz różnych harmonogramów interwencji. Jednak te zastosowania pozostają eksploratorskie i wymagają dalszej technicznej i biologicznej walidacji.

Należy zauważyć kilka ograniczeń. Po pierwsze,

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Merkaptopropyl)trimetoksysilan (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Kwas askorbinowy	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Glichometr	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Paski testowe do glukometrów	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Siarczan miedzi (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Alkohol etylowy (≥99,7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Siarczan żelaza(II) (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glukoza (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Nadtlenek wodoru (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Chlorku żelaza(III) (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Metakrylan metylu (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Mikroskop ramanowski	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-Fenylenodiamina (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polimetakrylan metylu (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Mikroskop elektronowy	Zeiss	ULTRA Plus
Boranek sodu (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Siarczan sodu (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Igły akupunkturowych ze stali nierdzewnej	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Oprogramowanie do analizy statystycznej	International Business Machines Corporation	Wersja 2021
Streptozotocyna (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Kwas tetrachlorozłotowy (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
Oprogramowanie SPSS	International Business Machines Corporation, Armonk, Nowy Jork, USA	wersja 26.0
szczury	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley
karma podstawowa	Anuokang Biotech.	SY10001
Tłuszcz wieprzowy	MCE	HY-W127601
Sakcharoza	MCE	HY-B1779
Proszek żółtka	MCE	HY-B2235B
Cytrynian wodny	Sigma-Aldrich	C1909
Cytrynian trójnatronowy dwuwodorowy	Sigma-Aldrich	S4641
Bufor cytrynianowy	beyotime	P0086
Bufor fosforanowy	beyotime	ST448-1L
Izofluran	Bioss	D54468
System znieczulenia izofluranem dla małych zwierząt	RWD Life Science	R500
Izba indukcyjna i korek nosowy	RWD Life Science	R500compatible accessories
Podgrzewana podkładka	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
75% etanol	Boyu Bio.	YB60401
Komora do eutanazji CO2	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365