Przedstawiamy powtarzalny mysi model przerwania ciągłości wątroby prowadzący do głębokiego krwotoku, integrujący utratę krwi, koagulopatię wywołaną urazem oraz wyniki przeżywalności. Model ten umożliwia ocenę interwencji hemostatycznych, w tym zastosowania rekombinowanego czynnika VIIa i kwasu traneksamowego, wraz z analizą krzepnięcia, fibrynolizy i śmiertelności, stanowiąc kosztowo efektywną i skalowalną platformę do mechanistycznych i translacyjnych badań nad krwotokami.
Artykuł metodologiczny
Model laceracji wątroby u myszy upraszczający kwantyfikację koagulopatii krwotocznej, stanu zapalnego i przeżywalności wywołanych urazem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niekontrolowany krwotok pozostaje główną przyczyną możliwych do uniknięcia zgonów u pacjentów z urazami, a koagulopatia indukowana urazem (TIC) jest kluczowym czynnikiem determinującym wczesną śmiertelność. Modele eksperymentalne, które wiarygodnie odtwarzają krwotok i związane z nim reakcje koagulopatyczne, są niezbędne do badań mechanistycznych i oceny ukierunkowanych interwencji. W niniejszej pracy opisujemy standaryzowany mysi model głębokiego krwotoku z wykorzystaniem powtarzalnego przerwania wątroby (LL) wywołującego krwawienie, które można precyzyjnie ilościowo określić, przy jednoczesnym monitorowaniu ogólnoustrojowej koagulopatii, markerów zapalnych oraz śmiertelności.
Myszom przeprowadza się standaryzowaną laparotomię po linii środkowej, a następnie LL, przy czym utratę krwi określa się na podstawie gąbek nasiąkniętych krwią. Układowe markery krzepnięcia, fibrynolizy oraz markery zapalne są pobierane drogą krwawienia z żyły zaocznej przed zabiegiem oraz w określonych, seryjnych odstępach czasu po jego zakończeniu. LL z utratą krwi w sposób wiarygodny wywołuje TIC (charakteryzujący się wydłużeniem czasu aktywowanej częściowej tromboplastyny (aPTT), wzrostem poziomu kompleksu trombina-antytrybina (TAT), selektywnym niedoborem czynników krzepnięcia (F) V i VIII oraz aktywacją fibrynolizy). Równocześnie aktywacja zapalna objawia się zwiększonym poziomem interleukiny-6 (IL-6). Ponadto model ten umożliwia przeprowadzenie analiz przeżywalności po zszyciu nacięcia w linii środkowej.
W ramach zastosowania translacyjnego rhFVIIa i TXA są wykorzystywane do wykazania, że model ten jest wrażliwy na powstrzymanie krwotoku poprzez farmakologiczną modulację parametrów krzepnięcia i fibrynolizy. W porównaniu z modelami na dużych zwierzętach, ten system mysi oferuje ekonomiczną, wszechstronną i łatwo skalowalną możliwość badania innowacyjnych, celowanych interwencji w przypadku krwotoku urazowego.
Wprowadzenie
Urazy są główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności u młodych dorosłych (wiek < 45 lat)1,2, a niekontrolowany krwotok stanowi jedną z głównych przyczyn wczesnej śmiertelności3. Krytycznym czynnikiem prowadzącym do niekorzystnych wyników leczenia u ciężko rannych pacjentów jest rozwój koagulopatii powypadkowej (TIC)4,5. TIC jest złożoną, wieloczynnikową dysregulacją hemostazy, charakteryzującą się wyczerpaniem czynników krzepnięcia V i VIII6,7, zaburzoną fibrynolizą7,8,9 oraz systemową aktywacją stanu zapalnego10. TIC przyczynia się do utrzymującego się krwawienia i wiąże się ze zwiększonym zapotrzebowaniem na transfuzje11, niewydolnością narządową5 oraz zwiększoną śmiertelnością, pomimo postępów w zakresie resuscytacji typu damage-control oraz interwencji terapeutycznych5.
Modele eksperymentalne, które wiarygodnie odwzorowują wstrząs krwotoczny z towarzyszącymi zmianami koagulopatycznymi, są zatem niezbędne do badań mechanistycznych oraz oceny ukierunkowanych interwencji hemostatycznych. Modele kontrolowanego krwotoku wykorzystują standaryzowane odciąganie krwi, co może nie powodować uszkodzenia tkanek, które przyczynia się do systemowej odpowiedzi koagulopatycznej obserwowanej w klinicznych urazach12. Z tego względu modele krwotoku obejmujące uszkodzenie narządów miąższowych powinny zapewniać większą istotność kliniczną, pod warunkiem, że można ilościowo ocenić utrzymujące się krwawienie oraz reakcje systemowe13,14,15,16. Bardziej złożone modele TIC obejmują kombinacje urazów czaszkowo-mózgowych, złamań kości długich lub kończyn, uszkodzeń tkanek miękkich, laparotomii oraz kontrolowanego wstrząsu krwotocznego, aby odtworzyć wiele komponentów ciężkiego urazu17,18. Chociaż podejścia te zapewniają bardziej kompleksowe odwzorowanie wielonarządowych urazów, wielokrotne procedury powodowania urazów oraz manipulacje fizjologiczne mogą zwiększać złożoność techniczną i zmienność eksperymentalną.
Mimo dziesięcioleci badań, klinicznie istotne i powtarzalne modele eksperymentalne TIC pozostają ograniczone i heterogeniczne. Przeglądy literatury podkreślały potrzebę stworzenia solidnych modeli, które dokładniej odtwarzają kliniczną sekwencję uszkodzeń tkanek i wstrząsu krwotocznego oraz wspierają ocenę interwencji terapeutycznych17,19. Złożone modele wymagające rozległego instrumentarium, w tym cewnikowania serca i ciągłego monitorowania hemodynamicznego, mogą dostarczać szczegółowych informacji fizjologicznych, lecz wymagają one specjalistycznego sprzętu i dodatkowych manipulacji proceduralnych. Aby usunąć bariery w badaniach nad urazami, kluczowe wydaje się uproszczenie podejścia eksperymentalnego przy jednoczesnym zachowaniu głównych cech TIC. W niniejszej pracy opisujemy standaryzowany model mysi prowadzący do niekontrolowanego wstrząsu krwotocznego14, wykorzystujący powtarzalne LL, które wywołuje głębokie krwawienie i odtwarza kluczowe cechy TIC. Model ten umożliwia ocenę odpowiedzi krzepnięcia i zapalenia, w tym ogólne pomiary krzepnięcia (aPTT i generowanie trombiny), selektywne wyczerpanie czynników krzepnięcia (FV i FVIII) jako cechę charakterystyczną TIC, markery fibrynolizy oraz profilowanie cytokin. Aby wykazać czułość i istotność tego modelu w odniesieniu do urazów u ludzi, oceniamy wpływ rhFVIIa (środka prohemostatycznego) oraz TXA (środka antyfibrynolitycznego), stosowanych w resuscytacji urazowej, na stopień nasilenia krwotoku, progresję koagulopatii i przeżywalność.
Model ten umożliwia ponadto seryjne i terminalne pobieranie krwi, co pozwala na podłużną ocenę przebiegu krzepnięcia i procesów zapalnych w zależności od stopnia ciężkości urazu oraz zastosowanej interwencji terapeutycznej. Łącznie model ten stanowi powtarzalny i skalowalny system mysi do badania TIC w warunkach głębokiego krwotoku oraz do oceny hemostatycznych i celowanych interwencji farmakologicznych z wykorzystaniem klinicznie istotnych punktów końcowych, takich jak utrata krwi, koagulopatia, fibrynoliza, stan zapalny oraz przeżywalność.
W porównaniu do wcześniej opublikowanych modeli laceracji wątroby u myszy, w tym protokołu opisanego przez Dyer i wsp.13, metoda ta wprowadza kilka kluczowych udoskonaleń metodologicznych. Obejmują one ilościowy pomiar grawimetryczny utraty krwi, standaryzację stopnia urazu poprzez normalizację masy lacerowanej wątroby do masy ciała oraz kompleksowe profilowanie TIC, fibrynolizy i stanu zapalnego. Ponadto model ten umożliwia seryjne pobieranie próbek, modulację farmakologiczną oraz analizy przeżywalności z uwzględnieniem technik zamykania jamy brzusznej, co pozwala na fizyczną rekonwalescencję zamiast eutanazji. Wszystkie procedury mogą być wykonane w ramach jednego podejścia eksperymentalnego, zapewniając skalowalną i translacyjną platformę do badania krwawień oraz celowanych interwencji hemostatycznych.
Protokół
Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego (UCSD). Myszy C57BL/6J były hodowane i utrzymywane w wewnętrznym ośrodku hodowlanym UCSD. W eksperymentach wykorzystano myszy obu płci w wieku od 8 do 10 tygodni. Schematyczny przegląd przebiegu i harmonogramu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1.
UWAGA: Wielkość prób określono na podstawie wstępnych eksperymentów, przewidywanej zmienności poszczególnych punktów końcowych oraz wcześniejszego doświadczenia z modelem laceracji wątroby myszy. Ostateczne wielkości prób dla poszczególnych punktów końcowych i grup eksperymentalnych podano w odpowiednich podpisach do rycin. W przypadku pomiarów masy wątroby dane z wielu niezależnych eksperymentów zostały połączone w celu oceny spójności między kohortami eksperymentalnymi. W przypadku testów krzepnięcia przeprowadzonych w oddzielnych seriach eksperymentalnych, w każdej serii uwzględniono wcześniej przeanalizowane próbki w celu monitorowania spójności międzytestowej i powtarzalności.
1. Przygotowanie przedeksperymentalne
- Pobranie próbek wyjściowych (Dzień -1)
- Na 24 h przed eksperymentem pobrać ~200 µL krwi drogą zatwarną od każdej myszy (w wieku 8–10 tygodni) w celu ustalenia parametrów wyjściowych.
- Po pobraniu krwi podać podskórnie ~200 µL sterylnej soli fizjologicznej do iniekcji.
- Utrzymywać myszy w czystych klatkach w standardowych warunkach laboratoryjnych, przy kontrolowanej temperaturze 20–24 °C, wilgotności względnej 30%–70% i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum aż do dnia eksperymentu.
- Przygotowanie klatki (Dzień 0)
- W dniu eksperymentu przenieść mysz do czystej klatki wyłożonej świeżymi ręcznikami papierowymi.
- Usunąć pożywienie i wodę na 15 min przed eksperymentem i wstrzymać ich podawanie do momentu usunięcia gąbek absorpcyjnych po zabiegu.
2. Przygotowanie instrumentarium i pola operacyjnego
- Sterylizacja narzędzi
- Zasutklawuj narzędzia chirurgiczne, watę, aplikatory i papiery filtracyjne.
- Zdezynfekuj powierzchnię operacyjną za pomocą 70% etanolu.
- Przygotowanie stołu operacyjnego
- Rozłóż sterylne narzędzia na sterylnej ściereczce.
- Przygotuj stalowy pojemnik z 70% etanolem i sterylną watą do okresowego oczyszczania narzędzi.
- Uruchom sterylizator kuleczkowy i poczekaj, aż osiągnie 150 °C w celu sterylizacji pomiędzy zwierzętami.
3. Przygotowanie do utrzymania temperatury
- Przygotowanie podkładki izotermicznej
- Aktywuj podkładkę grzewczą izotermiczną bezpośrednio przed operacją zgodnie z instrukcją producenta.
- Ustaw podkładkę grzewczą izotermiczną tak, aby utrzymywała temperaturę ciała myszy w docelowym zakresie 36–37 °C przez cały czas trwania znieczulenia i zabiegu.
- Potwierdź równomierny rozkład ciepła na powierzchni podkładki.
- Umieść podkładkę na platformie chirurgicznej i przykryj ją sterylną ściereczką.
- Podłącz stół operacyjny do systemu znieczulania izofluranem.
4. Znieczulenie i procedury przedoperacyjne
- Indukcja znieczulenia
- Indukuj znieczulenie, umieszczając mysz w komorze indukcyjnej z 2% isofluranem w strumieniu tlenu 2 L/min.
- Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia za pomocą odruchu na uciśnięcie palca u nogi.
- Zapisz masę ciała przed operacją.
- Analgezja i podawanie leków
- Podaj buprenorfinę (3,25 mg/kg, podskórnie) w celu zapewnienia analgezji.
- Przygotuj niezbędne środki hemostatyczne.
- W grupach leczonych podaj rekombinowany ludzki aktywowany czynnik VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) lub kwas traneksamowy (10 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie dożylne zaoczodołowe na 5 min przed urazem.
- Zwierzętom kontrolnym podaj równoważną objętość (~100 µL) sterylnej soli fizjologicznej do iniekcji.
5. Przygotowanie chirurgiczne
- Przygotowanie pola operacyjnego
- Przenieś znieczuloną mysz na deskę chirurgiczną umieszczoną na macie izotermicznej.
- Utrzymuj znieczulenie za pomocą maski nosowej, stosując 1,5%–2% izofluranu w przepływie 2 L/min tlenu przez cały czas trwania zabiegu.
- Ułóż mysz na plecach i unieruchom wszystkie cztery kończyny za pomocą taśmy.
- Wygol region brzuszny.
- Przeprowadź przygotowanie aseptyczne, stosując naprzemiennie powidon-jod i 70% etanol (trzy cykle).
6. Procedura nacięcia wątroby
- Przygotowanie materiałów do ważenia
- Zważ dwie probówki 1.5 mL, w tym jedną zawierającą 0.5 mL soli fizjologicznej oraz jedną pustą probówkę.
- Zważ trzy pierwotne i dwa wtórne trójkąty absorpcyjne dla każdego zwierzęcia i zapisz ich łączną masę.
- Zważ jedną łódeczkę wagową dla każdego zwierzęcia do późniejszego ważenia wyciętej tkanki wątroby.
- Indukcja uszkodzenia wątroby
- Wykonaj laparotomię w linii środkowej o długości około 0.5 cala (12.7 mm), aby odsłonić wątrobę.
- Umieść dwa trójkąty absorpcyjne wzdłuż prawej i lewej ściany brzucha, unikając kontaktu z wątrobą.
- Wyprowadź na zewnątrz lewy płat wątroby i zidentyfikuj brzegi płata, aby ustandaryzować zakres usuwania tkanki. Unikaj niezamierzonego uszkodzenia tkanki.
- Za pomocą ostrych nożyczek nacinaj około 75% płata jednym kontrolowanym ruchem, aby zapewnić spójność między zwierzętami.
- Przenieś wyciętą, naciętą tkankę do zważonej wcześniej pustej probówki w celu późniejszej kwantyfikacji stopnia uszkodzenia.
- Wprowadź trzeci trójkąt absorpcyjny do jamy brzusznej, aby ułatwić jednorodne zbieranie krwi podczas fazy krwawienia.
- Szybkie zamknięcie jamy brzusznej w celu utrzymania krwawienia wewnętrznego (krok krytyczny)
- Natychmiast zamknij ścianę brzucha w czasie ~10–15 s, używając dwóch chirurgicznych klipsów autoklawowalnych.
- Zapewnij precyzyjne dopasowanie krawędzi nacięcia, aby uzyskać całkowite zamknięcie bez szczelin. Niepełne zamknięcie może spowodować wyciek krwi na zewnątrz i niedoszacowanie utraty krwi.
- Podczas zamykania zastosuj stałe, ale delikatne napięcie, unikając ucisku zawartości brzucha, co mogłoby zmienić dynamikę krwawienia.
- Wzmocnij zamknięcie klejem tkankowym (2–3 krople), aby zapewnić całkowitą szczelność jamy brzusznej.
- Monitorowanie po uszkodzeniu
- Zważ wyciętą tkankę wątroby i znormalizuj pomiar do masy ciała, aby określić i potwierdzić zakres uszkodzenia wątroby.
- Umieść mysz z powrotem w klatce ustawionej na podkładce izotermicznej.
- Pozostaw krwawienie na 60 min dla grupy końcowej i grupy przeżywalności.
7. Pobieranie krwi i ilościowe określanie utraty krwi
- Pobieranie i przetwarzanie próbek krwi
- W przypadku kohorty końcowej ponowno znieczul mysz izofluranem w 60 min po laceracji wątroby.
- W przypadku kohorty przeżywalności ponowno znieczul mysz izofluranem w 6 h oraz 7 dni po laceracji wątroby w celu pobrania krwi.
- Krew pobierz metodą nakłucia zaocznego do probówek zawierających roztwór cytrynianu sodu (stosunek krwi do antykoagulantu: 9:1) w celu przygotowania osocza.
- Próbki wirowano przy 2,000 × g przez 10 min, a następnie poddano drugiemu wirowaniu przy 12,000 × g przez 5 min, aby uzyskać osocze ubogie w płytki krwi do dalszych analiz krzepnięcia i fibrynolizy.
- Pomiar utraty krwi
- W 60 min po laceracji wątroby ponownie otwórz jamę brzuszną w obu kohortach (końcowej i przeżywalności) i usuń gąbki absorpcyjne nasączone krwią.
- Przenieś wszystkie nasączone krwią gąbki do wcześniej zważonej probówki zawierającej sterylną sól fizjologiczną.
- Użyj dodatkowych, wcześniej zważonych gąbek absorpcyjnych do zebrania pozostałej krwi z jamy brzusznej.
- Zważ probówkę po pobraniu krwi, aby uzyskać końcową masę probówki.
- Oblicz utratę krwi, korzystając z następującego równania grawimetrycznego:
Utrata krwi (µL/g) = [(końcowa masa probówki − początkowa masa probówki – masa gąbki absorpcyjnej) / masa ciała myszy] × 1000.
UWAGA: Wszystkie masy wyrażone są w gramach. Mnożnik 1,000 przelicza gramy krwi na mikrolitry, przyjmując gęstość krwi wynoszącą około 1 g/mL.
- Kohorta przeżywalności i wyników podłużnych
- Po pomiarze utraty krwi w 60 min natychmiast zamknij nacięcie za pomocą zszywek chirurgicznych i kleju tkankowego, aby zapewnić całkowite uszczelnienie jamy brzusznej.
- Przed wybudzeniem podaj podskórnie 400 µL sterylnej soli fizjologznej.
- Umieść mysz w standardowym klatce i monitoruj ją stale podczas wybudzania z narkozy; dokonaj oceny w 2 h, 6 h i 24 h po operacji, a następnie monitoruj codziennie do 7 dnia.
8. Opieka pooperacyjna
- Monitorowanie pooperacyjne
- Zwierzęta należy stale monitorować podczas wczesnego wybudzania z narkozy pod kątem oznak stresu lub zachorowania.
- Należy rejestrować przeżywalność oraz obserwacje kliniczne podczas każdej zaplanowanej oceny.
- Opieka wspomagająca
- Podawać 400 µL sterylnej soli fizjologicznej podskórnie codziennie przez 3 dni.
- Zapewnić leczenie przeciwbólowe (buprenorfina, 3,25 mg/kg, podskórnie) co 72 h zgodnie z zatwierdzonym protokołem opieki nad zwierzętami.
- Utrzymywać myszy w standardowych klatkach z dostępem ad libitum do pokarmu i wody.
- Humanitarne punkty końcowe
- Zwierzęta należy monitorować pod kątem zdefiniowanych humanitarnych punktów końcowych, takich jak silna lub uporczywa letargia, niezdolność do poruszania się lub pobierania pokarmu i wody, ciężka niewydolność oddechowa, brak reakcji lub inne oznaki silnego stresu określone w zatwierdzonym instytucjonalnym protokole opieki nad zwierzętami.
- Zwierzęta, które osiągną zdefiniowane humanitarne punkty końcowe, należy uśmiercić zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Monitorowanie przeżywalności należy kontynuować do 7. dnia lub do momentu osiągnięcia humanitarnego punktu końcowego.
9. Procedury końcowe i pobieranie tkanek
- W określonych punktach końcowych eksperymentu znieczulić myszy i pobrać krew poprzez nakłucie zastocza okołożebnego.
- Uśmiercić zwierzęta poprzez inhalację CO₂ zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
- Pobrać organy i przygotować tkanki do analizy histologicznej zgodnie z określonymi procedurami analitycznymi.
10. Analizy krzepnięcia, fibrinolizy i cytokin
UWAGA: Odczynniki, zestawy testowe i sprzęt użyte w tych procedurach są wymienione w Tabeli materiałów.
- Pomiar aPTT
- Wszystkie czasy krzepnięcia należy rejestrować przy użyciu koagulometru wymienionego w Tabeli materiałów.
- Zmieszać 25 µL osocza mysiego z 25 µL odczynnika aPTT i inkubować przez 3 min w temperaturze 37 °C. Krzepnięcie należy zainicjować poprzez dodanie 25 µL CaCl₂ (25 mM) przygotowanego w HBS (20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.4), a następnie zarejestrować czas krzepnięcia.
- Pomiar aktywności FV, FII i FX
- Zmieszać 5 µL osocza mysiego z 20 µL odpowiedniego osocza z niedoborem czynnika oraz 25 µL HBS zawierającego 0,5% albuminy surowicy bydlęcej.
- Inkubować przez 1 min w temperaturze 37 °C, a następnie zainicjować krzepnięcie poprzez dodanie odczynnika Innovin wymienionego w Tabeli materiałów.
- Wyznaczyć aktywność czynnika w stosunku do odpowiedniego układu kalibracyjnego/referencyjnego.
- Pomiar FVIII
- Wyznaczyć poziom FVIII za pomocą chromogenicznego testu FVIII zgodnie z instrukcjami producenta.
- Pomiar fibrynogenu
- Wyznaczyć stężenie fibrynogenu metodą Claussa. Dodać 10 µL osocza mysiego do 40 µL soli fizjologicznej buforowanej HEPES zawierającej 0,01% albuminy surowicy bydlęcej i inkubować przez 3 min w temperaturze 37 °C.
- Zainicjować tworzenie skrzepu poprzez dodanie 25 µL trombiny (25 U/mL), a następnie wyznaczyć stężenie fibrynogenu na podstawie kalibracji testu.
- Pomiar biomarkerów osoczowych
- Zmierzyć poziom kompleksów TAT, kompleksów PAP oraz D-dimeru w osoczu przy użyciu dostępnych komercyjnie zestawów testowych wymienionych w Tabeli materiałów. Każdy test należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta.
- Użyć standardów, kalibratorów i kontroli specyficznych dla danego testu zgodnie z wytycznymi producentów i obliczyć stężenia analitów na podstawie odpowiednich krzywych wzorcowych.
- Pomiar IL-6 w osoczu
- Zmierzyć stężenia IL-6 w osoczu w stanie spoczynkowym oraz po 60 min i 6 h od laceracji wątroby przy użyciu multipleksowego testu cytokin wymienionego w Tabeli materiałów.
- Test należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta, a dane przeanalizować za pomocą oprogramowania Q-View producenta.
Wyniki
Model LL pozwala na uzyskanie powtarzalnego i ustandaryzowanego stopnia ciężkości obrażeń u myszy. Rycina 1A obrazuje spójność masy wątroby po nacięciu po normalizacji do masy ciała (%BW), przy medianie obrażeń wynoszącej 1,4% BW we wszystkich grupach eksperymentalnych. Ta spójność potwierdza niezawodność indukcji chirurgicznej i umożliwia powtarzalność wyników między zwierzętami oraz w różnych warunkach eksperymentalnych. Zdolność do standaryzacji stopnia ciężkości obrażeń jest kluczowa dla oceny późniejszych odpowiedzi fizjologicznych niezależnie od zmienności uszkodzeń tkanek.
Walidacja odpowiedzi krwotocznej i modulacji terapeutycznej w obrębie modelu została przedstawiona na Rysunku 1B. Myszy poddano wstępnemu leczeniu solą fizjologiczną, środkiem przedhemostatycznym rhFVIIa lub środkiem przeciwfibrinolitycznym TXA, a następnie określono ilość utraconej krwi i znormalizowano ją do masy ciała (µL/g). Myszy traktowane solą fizjologiczną wykazały znaczny krwotok po LL, podczas gdy myszy traktowane rhFVIIa lub TXA wykazały zmniejszoną utratę krwi. Wyniki te potwierdzają zdolność tego modelu do wykrywania farmakologicznej modulacji krwotoku oraz oceny interwencji hemostatycznych w warunkach niekontrolowanego krwawienia.
Model ten odtwarza również kluczowe cechy koagulopatii wywołanej urazem. Jak pokazano na Rysunku 1C, LL doprowadziło do wydłużenia aPTT, co wskazuje na upośledzenie krzepnięcia po urazie. Leczenie rhFVIIa lub TXA złagodziło to wydłużenie, co sugeruje przywrócenie funkcji krzepnięcia. Podobnie generowanie trombiny, oceniane na podstawie kompleksów TAT, wzrosło po LL i uległo zmniejszeniu po leczeniu TXA, podczas gdy rhFVIIa nie obniżyło poziomu TAT (Rysunek 1D), co sugeruje modulację aktywacji krzepnięcia.
Dalsza charakterystyka koagulopatii przedstawiona jest na Rysunku 2. LL doprowadziło do selektywnego wyczerpania czynników krzepnięcia V i VIII, co jest zgodne z TIC, a zmiany te zostały cofnięte po zastosowaniu rhFVIIa lub TXA (Rysunek 2A,B). W przeciwieństwie do nich, poziomy czynników II i X nie uległy istotnym zmianom (Rysunek 2C,D), co wskazuje, że zmiany te zachodzą przy zachowaniu czynników II i X, co wspiera fenotyp z dominacją TIC, a nie przypominający rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC).
Przebieg fibrynolizy po LL przedstawiono na Rysunku 3. Po urazie odnotowano spadek poziomu fibrynogenu, co wskazuje na jej zużycie, a podanie rhFVIIa lub TXA nie doprowadziło do jego pełnej regeneracji (Rysunek 3A). Z kolei markery fibrynolizy, w tym kompleksy plazmina-antyplazmina (PAP) oraz D-dimery, uległy zwiększeniu po LL. rhFVIIa obniżyło poziom kompleksów PAP, ale nie wpłynęło znacząco na poziom D-dimerów. TXA obniżyło poziomy zarówno kompleksów PAP, jak i D-dimerów po LL (Rysunek 3B,C).
Na koniec, na Ryc. 4 oceniono ogólnoustrojową odpowiedź zapalną oraz przeżywalność. Poziomy interleukiny 6 (IL-6) w osoczu mierzono w 60. minucie i po 6 h od LL we wszystkich grupach badawczych. Poziomy IL-6 są podwyższone we wczesnych punktach czasowych we wszystkich grupach (Ryc. 4A). Przeżywalność w okresie 7 dni oceniono za pomocą analizy Kaplana-Meiera. Siedmiodniowa przeżywalność wyniosła 75% w grupie solnej, 55% w grupie rhFVIIa i 80% w grupie leczonej TXA. Nie zaobserwowano istotnej różnicy między grupą solną a grupą TXA, natomiast przeżywalność była istotnie niższa w grupie rhFVIIa w porównaniu z grupami solną i TXA (Ryc. 4B).
Rycina 1: Walidacja modelu przerwania wątroby (LL): powtarzalność stopnia urazu, ilościowa utrata krwi i indukcja koagulopatii. Ciężki krwotok wewnętrzny jest indukowany poprzez laparotomię pośrodkową, a następnie ustandaryzowane LL. Myszy są poddawane wstępnemu leczeniu solą fizjologiczną (~100 µL), rekombinowanym ludzkim aktywowanym czynnikiem VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) lub kwasem traneksamowym (TXA; 10 mg/kg) przed urazem, aby ocenić farmakologiczną modulację krwawienia i koagulopatii. (A) Stopień urazu jest kwantyfikowany jako masa przerwanej wątroby znormalizowana do masy ciała (%BW), co wykazuje powtarzalną indukcję ustandaryzowanego urazu u zwierząt. (B) Utratę krwi kwantyfikuje się metodą grawimetryczną i normalizuje do masy ciała (µL/g), co wykazuje mierzalny krwotok, który jest redukowany po zastosowaniu TXA. (C) Aktywowany czas częściowej protrombiny (aPTT) oraz (D) kompleksy trombiny i antytrombiny (TAT) wykazują powtarzalną indukcję koagulopatii po LL, z obserwowaną modulacją po leczeniu rhFVIIa lub TXA. Dane przedstawiono jako wartości indywidualne z medianą i rozstępem międzykwartylnym; porównania przeprowadzono za pomocą nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya (n = 5–21). ****P ≤ 0.0001. Adaptowano za zgodą Joseph i wsp.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Walidacja koagulopatii wywołanej urazem (TIC) po rozszarpaniu wątroby (LL): selektywne wyczerpanie czynników krzepnięcia. Ciężki krwotok wewnętrzny jest indukowany poprzez laparotomię pośrodkową, a następnie standaryzowane LL. Myszy są poddawane wstępnemu leczeniu solą fizjologiczną (~100 µL), rekombinowanym ludzkim aktywowanym czynnikiem VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) lub kwasem traneksamowym (TXA; 10 mg/kg) przed urazem, aby ocenić farmakologiczną modulację koagulopatii. Parametry krzepnięcia są oceniane 60 minut po LL. (A) Poziomy czynnika V i (B) czynnika VIII wykazują powtarzalne wyczerpanie po LL, co jest spójne z TIC. (C) Czynnik II i (D) czynnik X pozostają względnie zachowane, co wskazuje na selektywne wyczerpanie czynników krzepnięcia, a nie globalne zużycie. Dane przedstawiono jako wartości indywidualne wraz z medianą i rozstępem międzykwartylowym (n = 7–10). Porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya. ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Adaptowano za zgodą Joseph et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Walidacja aktywacji fibrynolizy po przerwanym urazie wątroby (LL). Ciężki krwotok wewnętrzny wywołano poprzez laparotomię pośrodkową, a następnie standaryzowany LL. Myszy otrzymywały przed urazem sól fizjologiczną (~100 µL), rekombinowany ludzki aktywowany czynnik VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) lub kwas traneksamowy (TXA; 10 mg/kg), aby ocenić farmakologiczną modulację fibrynolizy. Parametry fibrynolityczne oceniono 60 minut po LL. (A) Poziomy fibrynogenu wykazują zużycie po urazie, co jest zgodne z aktywacją fibrynolizy i wyczerpaniem czynników krzepnięcia. (B) Poziomy kompleksów plazminy z antyplazminą (PAP) oraz (C) D-dimerów uległy zwiększeniu po LL, co wskazuje na aktywną degradację fibryny i systemową aktywację fibrynolizy. Dane przedstawiono jako wartości indywidualne wraz z medianą i rozstępem międzykwartylowym (n = 8–13). Porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya. **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Adaptowano za zgodą Joseph et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Walidacja systemowej odpowiedzi zapalnej i ocena przeżywalności po laceracji wątroby (LL). Ciężki krwotok wewnętrzny jest indukowany poprzez laparotomię pośrodkową, a następnie standaryzowaną LL. Myszom przed urazem podaje się soli fizjologicznej (100 µL), rekombinowany ludzki aktywowany czynnik VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) lub kwas traneksamowy (TXA; 10 mg/kg). Po urazie nacięcie brzuszne jest zamykane za pomocą klipsów chirurgicznych i kleju tkankowego, a zwierzęta są przenoszone do klatek macierzystych. Opieka wspomagająca polega na codziennym podawaniu soli fizjologicznej (400 µL) podskórnie przez pierwsze trzy dni po urazie. Próbki osocza są pobierane po 60 min i 6 h po LL w celu oceny systemowej aktywacji zapalnej. (A) Poziomy interleukiny-6 (IL-6) wykazują trwałą systemową odpowiedź zapalną po urazie. Dane przedstawiono jako wartości indywidualne z medianą i rozstępem międzykwartylnym. Porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu nieparametrycznego testu U Manna–Whitneya (n = 9–13). (B) Siedmiodniową przeżywalność oceniono za pomocą analizy Kaplana-Meiera, co demonstruje zdolność modelu do wspierania podłużnych punktów końcowych opartych na wynikach (n = 20). ****P ≤ 0.0001. Adaptowano za zgodą Joseph et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina uzupełniająca 1: Schematyczny przegląd modelu przerwania wątroby i harmonogramu eksperymentalnego. Rycina ta podsumowuje przebieg eksperymentalny dla ustandaryzowanego mysiego modelu przerwania wątroby (LL) w celu wywołania niekontrolowanego krwotoku. Myszy poddawane są laparotomii w linii pośrodkowej, a następnie powtarzalnemu LL obejmującemu około 75% lewego płata wątroby. Przed urazem myszy otrzymują dożylnie drogą zatoczno-orbitarną, 5 min przed LL, roztwór soli fizjologicznej (~100 µL, kontrola nośnika), rekombinowany ludzki aktywowany czynnik VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) lub kwas traneksamowy (TXA; 10 mg/kg). Ilość utraconej krwi jest określana przy użyciu uprzednio zważonych gąbek brzusznych umieszczonych w jamie brzusznej w momencie urazu, wyjętych 60 min po LL i zważonych w celu określenia całkowitej objętości krwotoku. Następnie jama brzuszna jest zamykana za pomocą klipsów do ran z klejem tkankowym. Próbki krwi są pobierane drogą zatoczno-orbitarną w 60 min w grupie końcowej oraz w 6 h i 7 d w grupie przeżywalności. Plazmę analizuje się pod kątem parametrów krzepnięcia, w tym czasu częściowej tromboplastyny aktywowanej (aPTT), aktywności czynników krzepnięcia, kompleksów trombiny-antytrombiny (TAT), kompleksów plazminy-α2-antyplazminy (PAP) oraz poziomu D-dimeru w 60 min. Profilowanie cytokin jest przeprowadzane w 60 min i 6 h. Przeżywalność jest monitorowana przez okres 7 dni. Adaptacja za zgodą Joseph et al.16. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
W niniejszym badaniu przedstawiamy powtarzalny mysi model głębokiego krwotoku z wykorzystaniem standaryzowanej LL, który integruje ilościową ocenę utraty krwi, charakterystykę TIC i stanu zapalnego oraz analizę przeżywalności w ramach jednego eksperymentu. Model ten generuje spójny stopień ciężkości urazu, co potwierdza porównywalna masa rozciętej wątroby znormalizowana do masy ciała, umożliwiając jednocześnie powtarzalną ocenę krwotoku i systemowych odpowiedzi hemostatycznych w grupach eksperymentalnych. Zastosowanie modelu gryzonia z standaryzowanym urazem i ilościowymi miernikami wyników pozwala na efektywną ocenę wielu punktów końcowych w ramach jednej struktury eksperymentalnej, co wspiera powtarzalne i skalowalne badanie TIC bez konieczności stosowania technicznie złożonych procedur.
Co istotne, model ten odtwarza kluczowe cechy TIC, w tym wydłużenie ogólnych parametrów krzepnięcia (aPTT), zwiększoną generację trombiny odzwierciedloną przez kompleksy TAT, selektywne wyczerpanie czynników krzepnięcia V i VIII oraz aktywację fibrynolizy potwierdzoną podwyższonym poziomem kompleksów PAP i tworzeniem się D-dimerów. Zmiany te zachodzą przy zachowaniu poziomu czynników II i X, co przemawia za fenotypem zdominowanym przez TIC, a nie za rozsianym krzepnięciem wewnątrznaczyniowym. Możliwość jednoczesnego ilościowego oznaczenia tych parametrów zapewnia istotne translacyjnie ramy do oceny dysregulacji hemostazy po urazie traumatycznym.
Kluczową zaletą tego modelu jest uwzględnienie przeżywalności jako punktu końcowego w warunkach krwotoku urazowego. W celu przetestowania klinicznie istotnych strategii ratunkowych oceniono działanie rhFVIIa oraz TXA – dwóch czynników stosowanych lub badanych w ramach resuscytacji urazowej u ludzi. TXA wykazała spójny wpływ na redukcję utraty krwi, normalizację koagulopatii i aktywacji fibrynolizy, co przekładało się na zwiększenie przeżywalności. Z kolei rhFVIIa spowodowała znaczną śmiertelność związaną z nadmierną korekcją parametrów hemostatycznych i niepełną kontrolą fibrynolizy16.
Wyniki te podkreślają istotny aspekt modelu: przeżywalność jest wypadkową złożonej interakcji między stopniem nasilenia krwotoku, koagulopatią a odpowiedzią systemową, a nie wynikiem izolowanej korekty poszczególnych szlaków hemostatycznych. Wydaje się, że ten model krwotoku jest czuły na integrację biochemicznych parametrów hemostazy z przeżywalnością, która w praktyce klinicznej stanowi krytyczny czynnik determinujący wynik leczenia. Choć podstawowym modelowanym w tym systemie urazem jest ciężki krwotok urazowy, do końcowego wyniku może przyczyniać się również wtórne uszkodzenie narządów. W naszym poprzednim badaniu z wykorzystaniem tego modelu, u myszy leczonych rhFVIIa zaobserwowano mikrozakrzepy płucne oraz odkładanie fibryny, co wiązało się ze zwiększoną śmiertelnością, sugerując potencjalny wpływ zakrzepowo-zapalnego uszkodzenia narządów na wynik 16.
Chociaż w niniejszym badaniu nie uwzględniono współczesnej grupy pozorowanej, wcześniej wykazaliśmy, że laparotomia bez LL nie prowadziła do TIC, co dowodzi konieczności wystąpienia dodatkowej gwałtownej utraty krwi (wstrząsu) w celu wywołania charakterystycznych zaburzeń krzepnięcia obserwowanych w TIC14.
Dla powtarzalności tego modelu istotnych jest kilka kwestii technicznych. Zakres i lokalizacja LL powinny być zestandaryzowane, ponieważ różnice w ilości usuniętej wątroby mogą znacząco wpływać na nasilenie krwawienia i wynikową odpowiedź koagulopatyczną. W naszym protokole usuwa się ~75% lewego płata wątroby, a masę uszkodzonej wątroby normalizuje się do masy ciała, co zapewnia obiektywny pomiar spójności urazu. Szybkie i szczelne zamknięcie jamy brzusznej jest również kluczowe, aby zapobiec zewnętrznej utracie krwi i utrzymać ograniczony obszar krwotoku wewnątrzbrzusznego podczas okresu obserwacji. W celu dokładnego pomiaru utraty krwi należy konsekwentnie odzyskiwać wcześniej zważone gąbki, stosując tę samą procedurę i czas zbierania we wszystkich grupach eksperymentalnych. Kroki te minimalizują zmienność zależną od operatora i są szczególnie ważne, ponieważ różnice w początkowej utracie krwi mogą wpływać na późniejszą koagulopatię i przeżywalność. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia przed zamknięciem lub utraty krwi na zewnątrz, zwierzę powinno zostać wykluczone.
Ograniczeniem tego modelu jest fakt, że koncentruje się on na urazie narządu, co nie odzwierciedla heterogeniczności politraumy, która może obejmować złamania kości długich, zmiażdżenia tkanek miękkich oraz inne złożone stany wstrząsowe. Jednakże ten ukierunkowany uraz jest również zamierzonym elementem modelu, pozwalającym na badanie skutków głębokiego krwotoku i TIC bez dodatkowej złożoności proceduralnej i zmienności wprowadzanej przez wiele rodzajów urazów. Podsumowując, ten mysi model LL stanowi kosztowo efektywne (w porównaniu z badaniami na dużych zwierzętach), solidne i skalowalne podejście do badania krwotoku związanego z urazem, TIC oraz śmiertelności. Dzięki połączeniu prostej platformy eksperymentalnej z wykorzystaniem małych gryzoni ze standaryzowanym urazem, ilościowym pomiarem utraty krwi, kompleksowym profilowaniem hemostatycznym i oceną przeżywalności, model ten stanowi praktyczną alternatywę dla bardziej zaawansowanych instrumentalnie modeli urazowych. Umożliwia on zintegrowaną ocenę utraty objętości krwi, krzepnięcia (aPTT, FII, FV, FVIII, FX, TAT), fibrynolizy (fibrynogen, PAP, D-dimer) oraz punktów końcowych dotyczących przeżywalności w klinicznie istotnym kontekście, co czyni go odpowiednim do oceny interwencji antyfibrynolitycznych i ukierunkowanych działań hemostatycznych.
Oświadczenia
A.v.D. otrzymał honoraria za udział w radach doradczych ds. naukowych, konsultacje oraz wystąpienia dla BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech oraz uniQure. A.v.D. jest współzałożycielem Hematherix LLC, firmy biotechnologicznej opracowującej terapię superFVa w leczeniu powikłań krwotocznych. B.C.J., M.L.C. oraz R.M. nie zgłosili żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy dr. Laurentowi Mosnierowi za pomoc techniczną.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igła 25 G | BD Diagnostics | 305124 | |
| Igła 30 G | BD Diagnostics | 305106 | |
| System anestezjologiczny | Patterson Scientific | 78915712 | |
| Odczynnik aPTT – STA-C.K. Prest. 5 | Stago | 597 | |
| Autoclip | Fine Science Tools | 12022-19 | |
| Aplikator Autoclip | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Usuwacz Autoclip | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Seryjowa albumina wołowa | Sigma Aldrich | 10735078001 | |
| Chlorek wapnia | Fisher scientific | C79-500 | |
| Kapilara – zwykła | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Aplikator bawełniany | Medique | 19-090-701 | |
| Kulki bawełniane | Fisher Scientific | 22-456-103 | |
| Zestaw ELISA do oznaczania D-dimerów | Invitrogen | EEL094 | |
| Izotermiczna mata Delta Phase | Braintree Scientific | 50-195-4663 | |
| Ethanol | Fisher scientific | BP28184 | |
| Ethiqa | Fidelis | SKU 072117 | |
| Osocze z niedoborem czynnika II | Affinity Biologicals | FII-DP | |
| Osocze z niedoborem czynnika V | Affinity Biologicals | FV-DP | |
| Osocze z niedoborem czynnika VIII | Affinity Biologicals | FVIII-DP | |
| Osocze z niedoborem czynnika X | Affinity Biologicals | FX-DP | |
| Papier filtracyjny, ekstra gruby, 7 cm × 8,4 cm | Fisher Scientific | PI88605 | |
| Pinceta Graefe | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Komora indukcyjna | Patterson Scientific | 78933385 | |
| Sól fizjologiczna do iniekcji | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Innovin | Siemens Healthineers | 23-044-778 | |
| Izofluran | Med Vet International | 50-304-2993 | |
| K824086 Chromogenix Coatest SP Factor VIII | Diapharma | K822585 | |
| Szybkoschnący klej tkankowy Liqui Vet | World Precision Instrument | 50-253-9340 | |
| Sterylizator do mikrokulek | Fisher scientific | 14-955-342 | |
| Probówki do mikrowirówki – 1,5 mL | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Zestaw multipleksowy do cytokin mysich | Quansys Biosciences | 111049MS-13P | |
| Zestaw do oznaczania kompleksu PAP | Biotechne | NBP3-06903 | |
| powidon-jodyna | Med Vet International | 50-283-2277 | |
| Rekombinowany ludzki aktywowany czynnik VII | Novo Nordisk | 0169-7001 | |
| Cytrynian sodu | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Obłożenie chirurgiczne | Stoelting | 10-000-695 | |
| Platforma chirurgiczna equaflow mouse 5, rozdzielacz anestezjologiczny | Patterson Scientific | 78919268 | |
| Nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 91405-11 | |
| Taśma | Fisher scientific | 15-901-5R | |
| Zestaw do oznaczania kompleksu TAT | Siemens Healthineers | 23-044-704 | |
| Trombina | Invitrogen | PIRP43100 | |
| Kwas traneksamowy | Auromedics | 55150-0188-10 | |
| Trymer | Stoelting | 10-000-792 | |
| System filtracji na węgiel aktywny WAG | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Łódeczka do ważenia | Fisher Scientific | 01-549-752 |
Bibliografia
- Rhee P, et al. Increasing trauma deaths in the United States. Ann Surg. 2014;260(1):13-21.
- Kauvar DS, Lefering R, Wade CE. Impact of hemorrhage on trauma outcome: an overview of epidemiology, clinical presentations, and therapeutic considerations. J Trauma. 2006;60(6):S3-S11.
- Bernhardt IM, et al. Timing of trauma deaths due to uncontrolled bleeding have not changed in three decades: a multicenter study of patients in hemorrhagic shock. Am J Surg. 2025;250.
- Cohen MJ, Christie SA. Coagulopathy of trauma. Crit Care Clin. 2017;33(1):101-18.
- Kornblith LZ, Moore HB, Cohen MJ. Trauma-induced coagulopathy: the past, present, and future. J Thromb Haemost. 2019;17(6):852-62.
- Brohi K, et al. Acute traumatic coagulopathy: initiated by hypoperfusion: modulated through the protein C pathway? Ann Surg. 2007;245(5):812-8.
- Cohen MJ, et al. Early coagulopathy after traumatic brain injury: the role of hypoperfusion and the protein C pathway. J Trauma. 2007;63(6):1254-61; discussion 1261-2.
- Davenport RA, et al. Activated protein C drives the hyperfibrinolysis of acute traumatic coagulopathy. Anesthesiology. 2017;126(1):115-27.
- Moore HB, et al. Hyperfibrinolysis, physiologic fibrinolysis, and fibrinolysis shutdown: the spectrum of postinjury fibrinolysis and relevance to antifibrinolytic therapy. J Trauma Acute Care Surg. 2014;77(6):811-7; discussion 817.
- Johansson PI, et al. Traumatic endotheliopathy: a prospective observational study of 424 severely injured patients. Ann Surg. 2017;265(3):597-603.
- Vernon T, Morgan M, Morrison C. Bad blood: a coagulopathy associated with trauma and massive transfusion review. Acute Med Surg. 2019;6(3):215-22.
- Lie SL, Rognes IN. Human and animal models for studying hemorrhagic shock. Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2025;33(1):124.
- Dyer M, et al. Uncontrolled hemorrhagic shock modeled via liver laceration in mice with real time hemodynamic monitoring. J Vis Exp. 2017;(123).
- Joseph BC, et al. An engineered activated factor V for the prevention and treatment of acute traumatic coagulopathy and bleeding in mice. Blood Adv. 2022;6(3):959-69.
- Joseph BC, et al. Traumatic bleeding and mortality in mice are intensified by iron deficiency anemia and can be rescued with tranexamic acid. Res Pract Thromb Haemost. 2024;8(6):102543.
- Chumappumkal Joseph B, et al. The effects of recombinant human activated factor VII and tranexamic acid on traumatic bleeding and mortality in mice. Res Pract Thromb Haemost. 2026;10(3):103436.
- Ask A, et al. Spotlight on animal models of acute traumatic coagulopathy: an update. Transfus Apher Sci. 2022;61(2):103412.
- Mayer AR, et al. A systematic review of large animal models of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neurosci Biobehav Rev. 2019;104:160-77.
- Frith D, Cohen MJ, Brohi K. Animal models of trauma-induced coagulopathy. Thromb Res. 2012;129(5):551-6.
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny