Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany protokół modelu stenozy zastawki aortalnej indukowanej prowadnicą u myszy

225 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72218

⸱

21 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, 3Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowany model stenozy zastawki aortalnej indukowanej drutem prowadzącym u myszy C57BL/6. Specjalistyczna, wydrukowana w technologii 3D platforma wspierająca naczynia umożliwia precyzyjną kontrolę krwotoku, co przekłada się na 95% przeżywalność w ciągu 24 godzin (19/20) oraz 90% ogólnej skuteczności modelu po 4 tygodniach (18/20).

Streszczenie

Stenoza zastawki aortalnej (AVS) jest istotną chorobą układu sercowo-naczyniowego o rosnącej rozpowszechnieniu w starzejących się populacjach, jednak niedobór tkanek chorobowo zmienionych zastawek poważnie ogranicza badania nad mechanizmami choroby oraz rozwój terapii. Niniejszy protokół ustanawia i optymalizuje powtarzalny model AVS u myszy, udoskonalając metodę uszkodzenia zastawki indukowanego drutem prowadzącym według Hondy poprzez kontrolowane zarządzanie krwotokiem. Samce i samice myszy C57BL/6 zostają poddane procedurze uszkodzenia zastawki aortalnej drutem prowadzącym; procedura ta została ulepszona dzięki zastosowaniu specjalnie wydrukowanej w technologii 3D platformy wspierającej naczynia, która zapewnia precyzyjną kontrolę krwotoku podczas wprowadzania i wycofywania drutu. Mierniki wyników obejmują przeżywalność po 24 h, ocenę echokardiograficzną po 4 tygodniach oraz walidację histopatologiczną. Zoptymalizowany protokół pozwala osiągnąć 95% przeżywalność po 24 h (19 z 20 zwierząt); wśród osobników, które przeżyły, 94,7% (18 z 19) spełnia zdefiniowane kryterium sukcesu hemodynamicznego po 4 tygodniach, co daje ogólną skuteczność modelu na poziomie 90% (18 z 20 zwierząt), potwierdzoną badaniem echokardiograficznym i analizą histologiczną. Ten zstandaryzowany model stanowi niezawodną i powtarzalną platformę do badania mechanizmów degeneracji zastawek oraz oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Wprowadzenie

Choroby zastawek serca pozostają znacznym obciążeniem dla systemów opieki zdrowotnej zarówno w krajach rozwiniętych, jak i rozwijających się, a ich rozpowszechnienie rośnie równolegle ze starzeniem się populacji1. Chociaż przezcewnikowa implantacja zastawki aortalnej (TAVI) odmieniła leczenie ciężkiej stenozy aortalnej2,3, mechanizmy komórkowe i molekularne napędzające degenerację zastawek są wciąż nie w pełni zrozumiane, a nie istnieje żadna zatwierdzona terapia farmakologiczna pozwalająca spowolnić lub odwrócić postęp choroby4,5. Główną przeszkodą w badaniach nad chorobami zastawek jest ograniczona dostępność zmienionej chorobowo tkanki do analiz6,7. Próbki ludzkich zastawek aortalnych są trudne do pozyskania w wystarczającej ilości, a modele zwierzęce, które wiarygodnie odtwarzają patologiczne zmiany w zastawkach, są równie rzadkie8. Ta luka skłoniła do podjęcia trwałych wysiłków w celu opracowania modeli zwierzęcych, które odtwarzają hemodynamiczne i histologiczne cechy stenozy zastawki aortalnej (AVS).

Konwencjonalne podejścia dietetyczne, takie jak długotrwałe podawanie diety wysokotłuszczowej myszom ApoE⁻/⁻, wymagają 20–24 tygodni i charakteryzują się niską skutecznością, gdyż tylko u niewielkiej części zwierząt rozwija się wyraźny fenotyp stenozy9,10,11,12. Model uszkodzenia zastawki indukowany drutem prowadzącym, opisany przez Hondę i współpracowników, rozwiązał wiele z tych problemów poprzez mechaniczne uszkodzenie płatków zastawki drogą dostępu przez tętnicę szyjną13. Oryginalna technika obejmuje preparację tętnicy szyjnej, wsteczne wprowadzenie drutu prowadzącego do zastawki aortalnej, wielokrotne drapanie płatków oraz rotację drutu — co powoduje szybkie zmiany hemodynamiczne w ciągu kilku dni i wytworzenie stabilnego fenotypu stenozy do 4 tygodnia13,14,15,16. Ze względu na relatywną szybkość i bezpośredniość, metoda Hondy została szeroko przyjęta w aktualnych badaniach nad zastawkami. Niemniej jednak nadal istnieją pewne istotne luki. Pełne szczegóły procedury nie zostały w pełni udokumentowane w literaturze, brakuje standaryzacji między laboratoriami, a rola kontroli krwotoków — główny czynnik determinujący zachorowalność okołooperacyjną w tym modelu — nigdy nie została systematycznie omówiona. Niespójności te obniżają powtarzalność i ograniczają możliwości translacji klinicznej.

Postawiono hipotezę, że systematyczna optymalizacja kontroli krwotoku może znacząco poprawić przeżywalność okołoperacyjną i niezawodność modelu. Niniejszy protokół przedstawia dopracowane i ustandaryzowane podejście, rozwijające metodę Hondy poprzez wprowadzenie specjalnie zaprojektowanej, wydrukowanej w technologii 3D platformy wsparcia naczyniowego. Urządzenie to umożliwia regulację napięcia podłużnego tętnicy szyjnej, zapewniając całkowitą tymczasową hemostazę podczas wprowadzania i wycofywania drutu prowadzącego, bez zmiażdżenia naczynia. Dzięki temu podejściu zoptymalizowany protokół pozwala osiągnąć 95% przeżywalność po 24 h (19 z 20 zwierząt); wśród osobników przeżyłych 94,7% (18 z 19) spełnia zdefiniowane wcześniej kryterium sukcesu hemodynamicznego w 4 tygodniu, co daje ogólną skuteczność modelu na poziomie 90% (18 z 20 zwierząt). Szczegółowa dokumentacja procedury krok po kroku została udostępniona w celu ułatwienia powtarzalności badań w różnych laboratoriach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt opisane w niniejszym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) szpitala West China Hospital (protokół nr 20240311055). W całym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 (8–10 tygodni; około 22–25 g) oraz samice myszy C57BL/6 (8–10 tygodni; około 18–20 g). Wszystkie materiały, odczynniki, instrumenty, oprogramowanie i urządzenia specjalistyczne użyte w tym protokole, w tym customowa platforma do podtrzymywania naczyń wydrukowana w technologii 3D, wyszczególniono w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie przedoperacyjne i cięcie chirurgiczne

  1. Zanestezuj mysz izofluranem (3% do indukcji, 1,5–2% do podtrzymania) odparowanym w 100% tlenie. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, weryfikując brak odruchów wycofania kończyny (ścisknięcie palca).
    UWAGA: Izofluran jest anestetykiem lotnym. Stosuj go przy aktywnym odsysaniu gazów lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i przestrzegaj instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa.
  2. Nałóż maść okulistyczną do obu oczu. Umieść mysz w pozycji na plecach na platformie chirurgicznej z regulacją temperatury utrzymywaną na poziomie 37 °C.
  3. Przygotuj pole operacyjne, usuwając włosy z przedniego odcinka szyi za pomocą chemicznego kremu do depilacji.
  4. Zdezynfekuj skórę, wykonując trzy naprzemienne cykle przemywania povidone-jodem (lub chlorheksydyną) i 70% alkoholem (lub ciepłą jałową solą fizjologiczną), kończąc działanie środkiem antyseptycznym.
  5. Wprowadź podskórnie 0,5% lidokainę wzdłuż planowanej linii nacięcia w celu wyprzedzającego znieczulenia miejscowego.
  6. Następnie, używając mikronożyczek, wykonaj podłużne nacięcie skóry w linii środkowej (około 1,0–1,5 cm) na przedniej części szyi, przesunięte lekko na prawo od linii środkowej tchawicy.
    UWAGA: Mikronożyczki, igły, prowadnice i inne narzędzia ostre mogą spowodować obrażenia. Należy z nimi obchodzić się ostrożnie i utylizować zużyte materiały ostrymi w zatwierdzonych pojemnikach na odpady medyczne.

2. Izolacja naczynia i umieszczenie szwów

  1. Pod chirurgicznym stereomikroskopem odsłoń prawą wspólną tętnicę szyjną (RCCA) poprzez tępe rozczłonkowanie nadkładających warstw powięzi i mięśni. Ostrożnie oddziel RCCA od sąsiedniego nerwu błędnego i otaczającej tkanki łącznej, dbając o to, aby uniknąć mechanicznego podrażnienia nerwu błędnego.
    UWAGA: Przez cały czas trwania procedury utrzymuj ślinianki i odsłonięte tkanki w wilgotności, przemywając je ciepłą sterylną solą fizjologiczną, aby zapobiec wysychaniu.
  2. Podwiąż trwale dystalny koniec RCCA za pomocą nici jedwabnej 6-0, wiążąc ją w bezpieczny, nieprzesuwający się węzeł.
  3. Załóż luźny pętelkowy węzeł z nici jedwabnej 6-0 wokół proksymalnego odcinka RCCA, pozostawiając go niezaciśniętym do późniejszego użycia podczas wprowadzania drutu prowadzącego.

3. Aplikacja platformy i arteriotomia

UWAGA: Przed operacją należy wysterylizować platformę wydrukowaną w technologii 3D za pomocą tlenku etylenu (EtO), a następnie odpowiednio ją napowietrzyć, natomiast wszystkie metalowe narzędzia chirurgiczne należy wysterylizować w autoklawie.

OSTROŻNIE: Tlenek etylenu jest toksyczny, łatwopalny i rakotwórczy. Sterylizację EtO należy przeprowadzać wyłącznie w zatwierdzonych placówkach, zapewniając odpowiednie napowietrzanie i przestrzegając instytucjonalnych procedur utylizacji odpadów.

  1. Ostrożnie wprowadź wydrukowaną w technologii 3D platformę wspierającą naczynia pod izolowany odcinek RCCA, pozycjonując odwrócony wierzchołek w kształcie litery V bezpośrednio pod naczyniem.
  2. Powoli dostosuj położenie platformy, aby zwiększyć napięcie podłużne RCCA, zapinając wcześniej umieszczone szwy w progresywnie wyższych wycięciach bocznych.
    UWAGA: Odwrócony wierzchołek w kształcie litery V został zaprojektowany pod kątem 120°, aby dopasować się do krzywizny naczynia bez miażdżenia jego ściany. Zaprzestań zwiększania napięcia w momencie, gdy pulsacja tętnicza przestanie być widoczna. Ten krytyczny punkt końcowy zapewnia tymczasową hemostazę bez nadmiernego uszkodzenia naczynia.
  3. Za pomocą mikronoopcinek wykonaj małą poprzeczną arteriotomię (około połowy obwodu naczynia) na ustabilizowanym odcinku RCCA. Jeśli napięcie zostało prawidłowo ustawione, nie powinno dojść do krwawienia lub powinno być ono minimalne.

4. Wprowadzenie drutu prowadzącego i uszkodzenie zastawki

  1. Pod kontrolą mikroskopową wprowadzić drut prowadzący (średnica 0,014 inch / 0,36 mm) do światła tętnicy poprzez poprzeczną arteriotomię w kierunku wstecznym, w stronę korzenia aorty.
    UWAGA: Kaliber ten jest standardowy dla opublikowanych modeli uszkodzeń drutem prowadzącym i odpowiada średnicy światła mysiej RCCA (~0,4–0,5 mm), co daje stosunek drutu do naczynia na poziomie około 0,7–0,9.
    OSTRZEŻENIE: Drut prowadzący może przebić naczynia lub otaczające tkanki. Przesuwać go powoli pod kontrolą wizualną, a zużyte druty utylizować jako odpady ostry lub skażone odpady chirurgiczne.
  2. Zaciągnąć wcześniej umieszczony proksymalny węzeł poślizgowy wokół naczynia i drutu prowadzącego, aby uzyskać pełną hemostazę w miejscu wprowadzenia. Po zabezpieczeniu węzła poślizgowego ostrożnie usunąć platformę wydrukowaną w 3D spod naczynia.
    UWAGA: W przypadku wystąpienia nieoczekiwanego krwawienia podczas wprowadzania lub jeśli średnica drutu powoduje nadmierne tarcie, tymczasowo przywrócić pozycję platformy, aby wspomóc hemostazę, lub lekko zmniejszyć napięcie platformy, aby pozwolić na rozszerzenie światła naczynia przed ponowną próbą wprowadzenia.
  3. Ostrożnie przesunąć drut prowadzący w kierunku wstecznym przez RCCA, poza łuk aorty i w stronę zastawki aortalnej. Pod kontrolą echokardiograficzną w czasie rzeczywistym potwierdzić, że końcówka drutu prowadzącego przeszła przez zastawkę aortalną i weszła do lewej komory.
  4. Przy całkowicie zaciągniętym proksymalnym węźle poślizgowym w celu utrzymania hemostazy, przeprowadzić mechaniczne uszkodzenie zastawki, wykonując 100 ruchów posuwisto-zwrotnych przez zastawkę aortalną, a następnie 100 ruchów obrotowych drutu prowadzącego przeciwko płatkom zastawki.
    UWAGA: Wykonanie 100 ruchów posuwisto-zwrotnych i 100 ruchów obrotowych ustalono w drodze szerokiej optymalizacji wewnętrznej jako liczbę najlepiej balansującą czas procedury z niezawodną indukcją hemodynamicznie istotnej stenozy.

5. Wycofanie drutu prowadzącego i zamknięcie rany

  1. Po zakończeniu uszkodzenia zastawki powoli wycofaj drut prowadzący z naczynia.
  2. Bezzwłocznie przekształć proksymalny supeł przesuwny w trwały węzeł nieprzesuwny, aby podwiązać proksymalną prawą wspólną tętnicę szyjną (RCCA) i zapobiec krwawieniu po zabiegu.
  3. Zamknij nacięcie skóry za pomocą przerywanych szwów nylonowych 5-0 lub chirurgicznych klipsów do ran.
  4. Nie podawaj pooperacyjnych niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ). Nie podawaj antybiotyków okołooperacyjnych, ponieważ procedura jest wykonywana w warunkach aseptycznych.
  5. Przenieś zwierzę do czystej, ogrzewanej klatki pooperacyjnej i monitoruj je w sposób ciągły aż do pełnego powrotu zdolności poruszania się.

6. Echokardiograficzna ocena hemodynamiki przezwalwularnej

  1. Przeprowadzić oceny echokardiograficzne u wszystkich przeżyłych myszy w 4. tygodniu po operacji w celu oceny stopnia stenozy zastawki aortalnej.
  2. Zindukować znieczulenie, umieszczając zwierzę w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem w 100% tlenie. Potwierdzić głębokość znieczulenia poprzez weryfikację utraty odruchów wycofywania łapy. Wyepilować przednią ścianę klatki piersiowej za pomocą chemicznego kremu do usuwania włosów. Nałożyć maść oftalmiczną do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
  3. Przenieść znieczuloną mysz w pozycji grzbietnej na platformę obrazującą z regulacją temperatury.
  4. Przymocować łapy do powierzchniowych elektrod elektrokardiograficznych (ECG) w celu ciągłego monitorowania częstości akcji serca. Titrować stężenie izofluranu (zazwyczaj 1,0–1,5%), aby utrzymać stabilną fizjologiczną częstość akcji serca na poziomie 450–550 uderzeń na min.
  5. Oczyścić przednią ścianę klatki piersiowej i nałożyć obfitą warstwę uprzednio podgrzanego żelu sprzęgającego.
  6. Nabywanie obrazów w trybie B
    1. Używając systemu ultradźwiękowego Vevo 3100 z przetwornikiem MX550D (40 MHz), nacisnąć przycisk B-Mode, aby rozpocząć dwuwymiarowe obrazowanie w czasie rzeczywistym.
    2. Ustawić przetwornik w pozycji lewostronnej przymostkowej, aby uzyskać widok długiej osi przymostkowej lewej komory, zastawki aortalnej i aorty wstępującej. Zoptymalizować głębokość, szerokość i wzmocnienie 2D.
  7. Nabywanie obrazów w trybie M i pomiary lewej komory
    1. Z widoku długiej osi przymostkowej nacisnąć przycisk M-Mode. Ustawić linię próbkowania w poprzek lewej komory na poziomie mięśni brodawkowatych.
    2. Nacisnąć Start, aby rozpocząć akwizycję. Po uzyskaniu stabilnego zapisu obejmującego co najmniej trzy cykle kardiologiczne, nacisnąć Save.
    3. W programie Vevo LAB użyć narzędzia LV Trace do obrysowania wsierdzia w końcowej rozkurcz i końcowej skurczu, a następnie zapisać wewnętrzne wymiary lewej komory, grubość ściany przedniej i tylnej (LVAWd, LVPWd) oraz masę lewej komory.
  8. Zmienić położenie i kąt przetwornika, aby uzyskać dedykowany widok łuku aorty.
    ​UWAGA: Uzyskanie tego konkretnego widoku łuku aorty jest niezbędne do dokładnych pomiarów prędkości przezwalwularnej, ponieważ zapewnia optymalne wyrównanie wiązki ultradźwięków z kierunkiem przepływu krwi przez zastawkę aortalną.
  9. Ocena w trybie kolorowego Dopplera
    1. Z widoku łuku aorty nacisnąć przycisk Color. Ustawić pole kolorów nad zastawką aortalną i proksymalną częścią aorty wstępującej.
    2. Dostosować skalę kolorów i wzmocnienie tak, aby jet skurczowy był wyraźnie widoczny bez aliasingu. Nacisnąć Start, a następnie Save.
  10. Pomiar prędkości w trybie Dopplera impulsowego
    1. Nacisnąć przycisk PW Doppler. Ustawić bramkę objętości próbkowania w najwęższym punkcie jetu (vena contracta) i zastosować korekcję kąta (<60°).
    2. Nacisnąć Start, aby rozpocząć zapis spektralny; po zarejestrowaniu co najmniej trzech cykli kardiologicznych nacisnąć Save. W programie Vevo LAB zmierzyć szczytową prędkość przezwalwularną za pomocą narzędzia Peak Velocity, wyliczając średnią z co najmniej trzech cykli.

7. Przetwarzanie histologiczne i barwienie korzenia aorty

  1. Po ocenie echokardiograficznej należy potwierdzić głęboką anestezję, weryfikując całkowity brak odruchu wycofania kończyny dolnej. Przeprowadzić zwichnięcie szyi jako drugą metodę eutanazji, zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt (wydanie z 2020 r.) oraz zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi.
    OSTROŻNIE: Trupy zwierząt, wycięte tkanki i materiały zanieczyszczone krwią stanowią odpady biologiczne/zwierzęce. Należy je utylizować zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i zasadami funkcjonowania zapleczy dla zwierząt.
  2. Wykonać torakotomię za pomocą chirurgicznych nożyczek mikrochirurgicznych w celu odsłonięcia serca.
  3. Wprowadzić igłę perfuzyjną do wierzchołka lewej komory i przepłukać krążenie systemowe zimnym, sterylnym roztworem soli fosforanowej (PBS). Prawidłową perfuzję sygnalizuje bladość wątroby i płuc.
  4. Wyciąć nienaruszone serce i zanurzyć je w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze pokojowej na minimum 24 h, aby zapewnić całkowitą fiksację.
    OSTROŻNIE: Paraformaldehyd jest toksyczny i drażniący. 4% PFA należy obsługiwać w dygestorium z zastosowaniem odpowiednich środków ochrony indywidualnej, a odpady z PFA utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  5. Przenieść utrwaloną tkankę do automatycznego procesora tkanek w celu sekwencyjnego odwadniania w szeregu stężeń etanolu, a następnie przejrzystania ksylenem i infiltracji woskiem parafinowym w 65 °C.
    OSTROŻNIE: Ksylen jest łatwopalny i toksyczny, a gorąca parafina może spowodować oparzenia. Ksylen należy obsługiwać w dygestorium lub zatwierdzonym procesorze, a odpady zawierające ksylen utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  6. Zatopić przetworzone serca w blokach parafinowych.
    UWAGA: Prawidłowa orientacja serca podczas zatapiania jest krytyczna. Ułożyć serce tak, aby umożliwić przekroje poprzeczne przez pierścień aorty na poziomie trzech płatków zastawki.
  7. Za pomocą mikrotomu obrotowego wykonać seryjne przekroje poprzeczne o grubości 4–5 µm przez płaszczyznę zastawki aortalnej, upewniając się, że wszystkie trzy płatki zostały uchwycone. Przenieść skrawki na szkiełka przedmiotowe i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  8. Wyonać barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) na wybranych szkiełkach w celu oceny morfologii tkanki, przebudowy strukturalnej oraz grubości płatków zastawki.
  9. Wyonać barwienie metodą Von Kossa na sąsiednich przekrojach seryjnych, aby wykryć i ilościowo określić zwapnienia dystroficzne, widoczne jako ciemnobrązowe lub czarne złogi mineralne w obrębie płatków zastawki.

8. Zabieg chirurgiczny pozorowany

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedurę kontrolną sham. Myszy z grupy sham zostają poddane tej samej anestezji, przygotowaniu skóry, odsłonięciu naczynia, arteriotomii oraz wstecznej insercji drutu prowadzącego co myszy z grupy z uszkodzeniem aorty drutem (AWI); drut prowadzący jest wprowadzany do poziomu nadzastawkowego, ale nie przechodzi przez zastawkę aorty i nie wykonuje się mechanicznego uszkodzenia zastawki.

  1. Zanurzyć mysz w znieczuleniu i przygotować pole operacyjne zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.5.
  2. Pod kontrolą stereomikroskopu odsłonić prawą tętnicę szyjną wspólną (RCCA) poprzez rozdzielanie tępe
  3. Trwale podwiązać dystalny koniec RCCA jedwabną nicią 6-0 i zawiązać luźny supeł poślizgowy proksymalnie (zgodnie z krokami 2.2–2.3).
  4. Wykonać poprzeczną arteriotomię i wprowadzić drut prowadzący zgodnie z opisem w krokach 3.1–4.2.
  5. Wprowadzić drut prowadzący w kierunku wstecznym do poziomu nadzastawkowego aorty wstępującej pod kontrolą echokardiograficzną, upewniając się, że końcówka drutu NIE przechodzi przez zastawkę aorty.
    UWAGA: NIE wykonywać ruchów pchających, ciągnących ani rotacyjnych, które mogłyby uszkodzić zastawkę, opisanych w kroku 4.4. Wycofać drut prowadzący i niezwłocznie podwiązać proksymalny odcinek RCCA zgodnie z opisem w krokach 5.1–5.2.
  6. Zamknąć nacięcie skóry za pomocą przerywanych szwów nylonowych 5-0 lub klipsów chirurgicznych.
    UWAGA: Podobnie jak w grupie AWI, analgezję śródoperacyjną zapewniono poprzez miejscową infiltrację lidokainą (krok 1.5). Przenieść zwierzę do ogrzewanej klatki pooperacyjnej i monitorować do pełnego odzyskania sprawności ruchowej.
  7. Myszy z grupy Sham poddać identycznemu monitorowaniu pooperacyjnemu, ocenie echokardiograficznej w 4. tygodniu oraz opracowaniu histologicznemu, jak w przypadku grupy AWI.

9. Analiza statystyczna i projekt badania

  1. W ramach badania 20 myszy (10 samców, 10 samic) poddano procedurze AWI, a 6 myszy C57BL/6 (3 samców, 3 samic) poddano procedurze Sham.
  2. Zmierzyć szczytową prędkość przezklapową (kryterium określające sukces modelu) u wszystkich przeżyłych zwierząt (19 AWI, 6 Sham).
  3. Przeanalizować szczegółowe wskaźniki echokardiograficzne i histologiczne w określonej wcześniej, zrównoważonej pod względem płci podgrupie 6 myszy AWI (3 samców, 3 samic).
  4. Upewnić się, że wszystkie pomiary echokardiograficzne i histologiczne są wykonywane przez badaczy oślepionych na przydział do grup.
  5. Ocenić normalność rozkładu danych testem Shapiro-Wilka przed zastosowaniem testów parametrycznych. Porównać dwie niezależne grupy (AWI vs. Sham) za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t Studenta.
  6. Przeanalizować i przedstawić dane dotyczące przeżywalności metodą Kaplana-Meiera.
  7. Wszystkie analizy przeprowadzić w programie GraphPad Prism. Przedstawić dane jako średnia ± SEM, przyjmując p < 0,05 za wartość istotną statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowanie platformy drukowanej w technologii 3D do kontroli krwotoków

Aby zapobiec krwawieniu okołoperacyjnemu – głównej przyczynie zachorowalności i śmiertelności w konwencjonalnym modelu AVS indukowanym przez drut prowadzący – zaprojektowano wydrukowaną w technologii 3D platformę wsparcia naczyniowego (Rysunek 1). Platformę wykonano metodą stereolitografii (SLA) z biokompatybilnej żywicy fotopolimerowej (zgodnej z normami USP Class VI / ISO 10...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis stabilnego i bezpiecznego modelu zwierzęcego zwężenia zastawki aortalnej. Cechą charakterystyczną tego podejścia jest platforma pomocnicza, która ułatwia wprowadzenie drutu prowadzącego do wspólnej tętnicy szyjnej. Platforma jest wytwarzana za pomocą stereolitografii (SLA) z biokompatybilnej żywicy fotopolimerowej (grubość strukturalna 1,07 mm) i posiada odwróconą wierzchołkową powierzchnię w kształcie litery V z kątem wierzchołkowym 120°; kompletny plik projektu jest swobodnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca została sfinansowana przez Narodowy Główny Projekt Naukowo-Technologiczny w zakresie Niezakaźnych Chorób Przewlekłych (2026ZD0554300); Narodową Fundację Nauk Naturalnych Chin (U23A20395, 82170375, 82500455); Prowincjonalną Fundację Nauk Naturalnych Sichuan (2026NSFSC0552); Podstawowe Fundusze Badawcze dla Uniwersytetów Centralnych; Projekty Naukowo-Technologiczne Autonomicznego Regionu Tybetu w Chinach (XZ202501ZY0120) oraz projekt „1.3·5” Szpitala West China Uniwersytetu w Sichuan (ZYGD23021, 23HXFH009). Autorzy dziękują Qipu Feng (Centrum Eksperymentów na Zwierzętach, Szpital West China, Uniwersytet w Sichuan) za pomoc przy badaniu ultrasonograficznym małych zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Platforma do wsparcia naczyniowego drukowana w 3DWykonana na zamówienieN/AWsparcie naczyniowe wykonane na zamówienie w druku 3D; dołączono uzupełniający plik CAD w formacie .stp.
4% ParaformaldehydServicebioG1101-3MLFiksacja tkanek
Nylonowa nić chirurgiczna 5-0Jinhuan MedicalF503Zamknięcie skóry za pomocą szwów przerywanych
Jedwabna nić chirurgiczna 6-0Jinhuan MedicalRC411Trwałe podwiązanie dystalnej RCCA i proksymalny węzeł poślizgowy
Żel do sprzęgania akustycznego (podgrzany)KepplerKL-250Echokardiografia
Biokompatybilna żywica fotopolimerowaFormlabsRS-F2-BMCL-01Materiał do druku SLA użyty do wykonania platformy do wsparcia naczyniowego drukowanej w 3D.
Myszy C57BL/6 (8–10 tygodni; samce 22–25 g, samice 18–20 g)GemPharmatechC57BL/6Obie płcie stosowane w badaniu; utrzymywane w standardowych warunkach
Tlenek etylenu (gaz)Instytucjonalna sterylizatorniaN/ASterylizacja platformy do wsparcia naczyniowego drukowanej w 3D.
FreeCADFreeCAD Project Association1.1.1Wizualizacja CAD i generowanie rysunku konstrukcyjnego 3D z pliku .stp.
GraphPad PrismGraphPad Software9.0Analiza statystyczna i tworzenie wykresów
Drut prowadzący, średnica 0,014 calaBoston ScientificH749393071900Mechaniczne uszkodzenie zastawki aorty
Zestaw do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E)BeyotimeC0105SMorfologia i grubość płatków zastawki
IzofluranRWD Life ScienceR510-22-2Indukcja 3%; utrzymanie 1,5–2% w 100% O2
LidokainaShijiazhuang Pharmaceutical GroupH14024045Zapobiegawcza infiltracja miejscowa w miejscu nacięcia (0,5%, krok 1.5)
Nożyczki mikrochirurgiczneRWD Life ScienceF11022-11Nacięcie skóry, arteriotomia, torakotomia
Przetwornik MX550D (40 MHz)FUJIFILM VisualSonicsMX550DEchokardiografia
Krem do usuwania włosów NairNair255 gDo depilacji przedniej części szyi i ściany klatki piersiowej
Bufor fosforanowy (PBS)ServicebioG4202-100MLPerfuzja
Mikrotom obrotowyLeica BiosystemsRM2125 RTSSeryjne cięcie w grubości 4–5 µm
Stereomikroskop (chirurgiczny)OlympusSZX7Izolacja naczyń i mikrochirurgia
System ultradźwiękowy o wysokiej rozdzielczości Vevo 3100FUJIFILM VisualSonicsVevo 3100Echokardiografia
Zestaw do barwienia metodą von KossaServicebioG1043-20MLWykrywanie zwapnień dystroficznych
KsylenNanjing Chemical Reagent Co., Ltd.C0430530209Przejaśnianie tkanek podczas obróbki w parafinie.

Bibliografia

  1. Otto CM, Newby DE, Hillis GS. Calcific aortic stenosis: a review. JAMA. 2024;332(23):2014–2026.
  2. Vincent F, et al. Transcatheter aortic valve replacement in bicuspid aortic valve stenosis. Circulation. 2021;143(10):1043–1061.
  3. Kraler S, et al. Calcific aortic valve disease: from molecular and cellular mechanisms to medical therapy. Eur Heart J. 2021;43(7):683–697.
  4. Blaser MC, Bäck M, Lüscher TF, Aikawa E. Calcific aortic stenosis: omics-based target discovery and therapy development. Eur Heart J. 2025;46(7):620–634.
  5. Lindman BR, et al. Calcific aortic stenosis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2(1):16006.
  6. Yu Chen H, et al. Dyslipidemia, inflammation, calcification, and adiposity in aortic stenosis: a genome-wide study. Eur Heart J. 2023;44(21):1927–1939.
  7. Peeters FECM, et al. Calcific aortic valve stenosis: hard disease in the heart: a biomolecular approach towards diagnosis and treatment. Eur Heart J. 2018;39(28):2618–2624.
  8. Cai D, Saint L, Markley J, Chen SY. Novel humanized aortic valve calcification model. Circ Res. 2025;136(12):1632–1635.
  9. Rattazzi M, et al. Calcification of advanced atherosclerotic lesions in the innominate arteries of ApoE-deficient mice: potential role of chondrocyte-like cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(7):1420–1425.
  10. Aikawa E, et al. Arterial and aortic valve calcification is abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 2009;119(13):1785–1794.
  11. Hjortnaes J, et al. Arterial and aortic valve calcification inversely correlates with osteoporotic bone remodeling: a role for inflammation. Eur Heart J. 2010;31(16):1975–1984.
  12. Aikawa E, et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 2007;116(24):2841–2850.
  13. Honda S, et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34(2):270-278. doi:10.1161/ATVBAHA.113.302610.
  14. Zhu Z, et al. Models for calcific aortic valve disease in vivo and in vitro. Cell Regen. 2024;13:6.
  15. Zhong G, et al. Activation of Piezo1 promotes osteogenic differentiation of aortic valve interstitial cells through YAP-dependent glutaminolysis. Sci Adv. 2023;9(22):eadg0478.
  16. Li S, et al. Targeted inhibition of PTPN22 is a novel approach to alleviate osteogenic responses in aortic valve interstitial cells and aortic valve lesions in mice. BMC Med. 2023;21(1):252.
  17. Niepmann ST, et al. The graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics the human functional and morphological disease phenotype. Clin Res Cardiol. 2019;108(8):847–856.
  18. Qian N, et al. A novel mouse model of calcific aortic valve stenosis. Anim Models Exp Med. 2024;7(4):523–532.
  19. Iqbal F, et al. Sortilin enhances fibrosis and calcification in aortic valve disease by inducing interstitial cell heterogeneity. Eur Heart J. 2023;44(10):885–898.
  20. Billig H, et al. Aortic valve stenosis and osteoporosis: insights from a mouse model. BMC Cardiovasc Disord. 2025;25(1):562.
  21. Artiach G, et al. Omega-3 polyunsaturated fatty acids reduce aortic valve disease via the resolvin E1-ChemR23 axis. Circulation. 2020;142(8):776–789.
  22. Clayton JA, Collins FS. NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 2014;509(7500):282–283.
  23. Li B, et al. IGF1-mediated mesenchymal-endothelial transition as a potential regulatory target in calcific aortic valve disease. BMC Med. 2025;23(1):600.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model uszkodzenia prowadnicąmysi model AVSkontrola krwotokuplatforma wsparcia naczyniowegoocena echokardiograficznawalidacja histopatologicznadegeneracja zastawkiinterwencje terapeutyczneoptymalizacja modelu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.