Niniejsze badanie ocenia wpływ pigułek Zuogui na osteoporozę pomenopauzalną u szczurów po owariektomii z zastosowaniem trójczynnikowego układu eksperymentalnego (3x3). Wyniki potwierdzają synergistyczne działanie komponentów Yin i Yang na metabolizm kostny oraz powiązane z nim markery szlaku EphB4/ephrinB2, choć dowody mechanistyczne mają charakter korelacyjny, a nie przyczynowo-skutkowy.
Artykuł badawczy
Pigułka Zuogui moduluje sprzężenie osteoblastów i osteoklastów u szczurów po ovariektomii: badanie factorialne 3x3
21 wyświetleń
⸱
11 września 2026
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Osteoporoza pomenopauzalna jest wywołana przez rozregulowanie procesów tworzenia i resorpcji kości związane z niedoborem estrogenów. W niniejszym badaniu określono niezależne i interaktywne efekty subformulacji odżywiających Yin zawartych w pigułkach Zuogui w modelu szczurów po owariektomii oraz zbadano związki z szlakiem EphB4/ephrinB2/RhoA/fosfatazy zasadowej. Zgodnie z wytycznymi ARRIVE 2.0, 130 wolnych od specyficznych patogenów samic szczurów Sprague-Dawley przydzielono losowo do 13 grup (n=10/grupa), w tym do dziewięciu grup w ramach trójczynnikowego projektu eksperymentalnego (3x3). Punkty końcowe obejmowały P1NP, CTX-1, gęstość mineralną kości udowej mierzoną za pomocą dwuenergetycznej absorpcjometrii promieni rentgenowskich (DXA), histologię beleczek kostnych oraz ekspresję matrycowego RNA i białek mierzoną za pomocą ilościowej polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją oraz analizy Western blotting. Pełna formuła (I2A2) wiązała się z wyższym poziomem P1NP, niższym poziomem CTX-1 oraz wyższą BMD w porównaniu z grupą modelową. Analiza czynnikowa wykazała interakcję Yin-Yang pomiędzy P1NP a BMD, co potwierdza synergię farmakologiczną. Zmiany molekularne były powiązane ze zwiększoną ekspresją EphB4/ephrinB2/ALP oraz zmniejszoną ekspresją RhoA. Wyniki te potwierdzają związek między leczeniem pigułkami Zuogui, poprawą fenotypów kostnych a modulacją markerów szlaku; wykazanie przyczynowej zależności od szlaku wymaga walidacji z użyciem inhibitorów, wyciszania genów oraz kokultur.
Wprowadzenie
Osteoporoza pomenopauzalna (PMOP) dotyka znaczną populację kobiet i charakteryzuje się zaburzeniem równowagi między formowaniem a resorpcją kości związanym z niedoborem estrogenów1,2. System receptor-ligand EphB4/ephrinB2 pośredniczy w komunikacji między osteoblastami a osteoklastami; sygnalizacja EphB4 wspiera różnicowanie osteoblastów i aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP), podczas gdy odwrotna sygnalizacja ephrinB2 może hamować osteoklastogenezę poprzez mechanizmy związane z RhoA3,4. Zmniejszone sprzężenie w kościach przy niedoborze estrogenów stanowi mechanistyczne uzasadnienie dla oceny interwencji wpływających na oba komponenty komórkowe przebudowy tkanki kostnej.
Obecne terapie osteoporozy, w tym leki antyresorpcyjne i anaboliczne, zmniejszają ryzyko złamań, lecz ich stosowanie może być ograniczone przez brak przestrzegania zaleceń, koszt, przeciwwskazania, efekty odbicia lub zdarzenia niepożądane podczas długotrwałego stosowania5. W związku z tym potencjalne metody leczenia poprawiające tworzenie kości przy jednoczesnym ograniczeniu nadmiernej resorpcji pozostają istotne z naukowego punktu widzenia.
Pigułka Zuogui (ZGP; Zuo Gui Wan) to klasyczna wieloskładnikowa receptura stosowana w tradycyjnej medycynie chińskiej w przypadku niedoboru esencji nerek, czyli teoretycznego wzorca powiązanego z osłabieniem kości. Składniki odżywiające Yin obejmują Rehmannia glutinosa (przetworzony korzeń, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (kłącze, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (owoc, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (owoc, Gou Qi Zi, 12 g), żelatynę z plastronu Chinemys reevesii (żelatyna pochodząca z plastronu, Gui Ban Jiao, 12 g) oraz Cyathula officinalis (korzeń, Chuan Niu Xi, 9 g). Składniki wzmacniające Yang obejmują Cuscuta australis (nasiona, Tu Si Zi, 12 g) oraz żelatynę z poroża Cervus elaphus (żelatyna pochodząca z poroża, Lu Jiao Jiao, 12 g). W teorii klasycznej zasada poszukiwania Yang w obrębie Yin sugeruje, że zioła wzmacniające Yang mogą potęgować działanie bazy odżywiającej Yin, zamiast działać jako proste, niezależne dodatki. Dowody kliniczne i badania przedkliniczne wykazały działanie przeciwosteoporotyczne ZGP lub interwencji zawierających ZGP, w tym wpływ na BMD, osteogenezę i właściwości farmakokinetyczne6,7,8,9,10.
Nowatorstwo niniejszego badania polega na formalnej separacji w układzie czynnikowym trzy na trzy komponentów odżywiających Yin i wzmacniających Yang u szczurów po owariektomii (OVX), z jednoczesną oceną fenotypów kostnych oraz markerów szlaku EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Taki projekt badawczy w sposób bardziej bezpośredni niż badania wykorzystujące wyłącznie pełną recepturę lub pojedynczy komparator weryfikuje teorię kompatybilności formuły, przy jednoczesnym uznaniu, że zmiany markerów szlaku pozostają korelatami, dopóki nie zostaną mechanistycznie zablokowane lub wyciszone1.
Protokół
Wszystkie procedury w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Mongolii Wewnętrznej (numer zatwierdzenia YKD202404105) i przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE 2.012.
Projekt badania
Badanie przeprowadzono na platformie doświadczeń na zwierzętach Uniwersytetu Medycznego w Mongolii Wewnętrznej. Zastosowano pełny plan czynnikowy 3×3 z dwoma czynnikami: bazową recepturą odżywiającą Yin (I; trzy poziomy dawkowania: 0, 27, 54 g ekwiwalentu surowca roślinnego) oraz recepturą wzmacniającą Yang (A; trzy poziomy dawkowania: 0, 8, 16 g ekwiwalentu surowca roślinnego), co dało dziewięć komórek czynnikowych oraz cztery grupy referencyjne. Plan czynnikowy przedstawiono w Tabeli 1. I2A2 reprezentuje pełną formułę ZGP w dawce równoważnej klinicznie. Konwersja dawki została przeprowadzona metodą powierzchni ciała (czynnik szczur: człowiek = 6,25)13.
Zwierzęta, randomizacja i maskowanie
Sto trzydzieści wolnych od swoistych patogenów samic szczurów Sprague-Dawley (wiek 6 miesięcy, masa 20–250 g) przydzielono do grup za pomocą wygenerowanej komputerowo tabeli liczb losowych. Kody przydziału umieszczono w kolejno zapieczętowanych kopertach przez badacza niezaangażowanego w ocenę wyników. Szczury utrzymywano po 3–4 osobniki w wentylowanej klatce w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, w temperaturze 2 ± 2 oC i wilgotności 50–60%, z dostępem do wody ad libitum, standardowej karmy dla gryzoni o udokumentowanej zawartości wapnia i fosforu, możliwością aktywności w klatce oraz wzbogaceniem środowiskowym. Analizy molekularne, ocena histologiczna, kwantyfikacja obrazów i densytometria zostały przeprowadzone przez badaczy nieznających przydziału zwierząt do grup. Wielkość próby określono na podstawie a priori analizy mocy, co dało n = 10 na grupę.
Model OVX i leczenie farmakologiczne
Obustronną owariektomię (OVX) przeprowadzono w znieczuleniu wziewnym izofluranem podawanym za pomocą precyzyjnego waporyzatora. Znieczulenie wprowadzono w stężeniu 3–4% w tlenie i utrzymywano na poziomie 1,5–2,5% poprzez maskę nosową. Odpowiednią głębokość znieczulenia potwierdzono brakiem odruchu wycofania łapy oraz odruchu powiekowego przy stabilnym oddychaniu. Powodzenie zabiegu OVX oceniano na podstawie braku cyklu rujowego w pochwie w 5. dniu oraz redukcji BMD w 12. tygodniu po operacji. Po walidacji modelu stosowano leczenie przez zgłębnik przez 8 tygodni (1 mL/10 g/dobę). Odwary przygotowano poprzez sekwencyjną ekstrakcję wodną w temperaturze wrzenia (10 °C, reflux), najpierw w 10-krotnej objętości rozpuszczalnika przez 2 h, a następnie w 8-krotnej objętości przez 1,5 h; roztwory przefiltrowano przez cztery warstwy gazy medycznej i zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem do stężenia 0,968 g surowca/mL. Zagęszczony ekstrakt przechowywano w temperaturze 4 °C i wykorzystywano w ciągu 7 dni od przygotowania. Jako kontrole pozytywne zastosowano granulat Gusukang (1,8 g/kg/dobę) oraz dietylstilbestrol (0,04 mg/kg/dobę). Po zakończeniu badania szczury głęboko znieczulono izofluranem w stężeniu 5% aż do utraty odruchów łap i rogówkowych, a następnie poddano upuście krwi i zwichnięciu stawów szyjnych. Śmierć potwierdzono ustaniem bicia serca i oddechu. Zwłoki zwierząt i tkanki zutylizowano jako odpady biologiczne, pozostałości chemiczne jako odpady niebezpieczne, a igły i ostrza umieszczono w zatwierdzonych pojemnikach na odpady ostre.
Mierniki efektów
Poziomy serum P1NP i CTX-1 zmierzono za pomocą metody kanapkowego ELISA (Jiyinmei).14Gęstość mineralną kości (BMD) kości udowej ilościowo określono za pomocą metody DXA. Histologię beleczkową oceniono przy użyciu barwienia hematoksyliną i eozyną z powiększeniem 20x. Ekspresję genów oceniono metodą RT-qPCR z użyciem 2-ΔΔCt metoda, z normalizacją do dehydrogenazy glikeraldehydo-3-fosforanu (GAPDH). Ekspresję białek oceniono za pomocą analizy Western blot oraz kwantyfikacji w programie ImageJ (patrz Tabela materiałów). Obserwowane masy cząsteczkowe oraz informacje katalogowe przeciwciał podano w Tabela uzupełniająca 1Sekwencje starterów były następujące: EphB4 forward/reverse, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.
Analiza statystyczna
Normalność rozkładu oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka, a jednorodność wariancji za pomocą testu Levene'a przed przeprowadzeniem analizy parametrycznej. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, a wszystkie słupki błędów na wykresach ilościowych oznaczają SD. W celu oszacowania efektów głównych oraz interakcji I i A zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) dla dziewięciu komórek czynnikowych, przyjmując cząstkowy eta-kwadrat (ηp2) jako miarę wielkości efektu. Porównania parowe pomiędzy wszystkimi 13 grupami przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z korektą Bonferroniego. Analizy statystyczne wykonano w programie GraphPad Prism. Symbole istotności zdefiniowano w następujący sposób: *, **, ***, **** oznaczają p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.01 względem modelu; #, ##, ###, #### oznaczają te same progi względem pełnego wzoru ZGP.
Wyniki
Walidacja modelu poprzez cytologię pochwy
Sukces operacji OVX potwierdzono u wszystkich zwierząt poddanych owariektomii, co objawiało się utratą cyklu rujowego w ciągu 5 dni po zabiegu (Rysunek 1A), podczas gdy zwierzęta w grupie operacji pozorowanej zachowały 4-dniowy cykl (Rycina 1B). W 12. tygodniu badanie DXA wykazało niższą gęstość mineralną kości (BMD) uda w grupie modelowej OVX niż w grupie kontrolnej sham (0,214 ± 0,020 vs. 0,281 ± 0,019 mg/cm3skorygowane metodą Bonferroniego p < 0,01), co potwierdza ustanowienie modelu utraty masy kostnej indukowanej OVX przed rozpoczęciem leczenia.
Gęstość mineralna kości
Pełna formuła ZGP (I2A2) wykazała najwyższą regenerację BMD spośród częściowych sformułowań factorialnych i była statystycznie porównywalna z obiema kontrolami pozytywnymi (Tabela 2, Rysunek 2). Wszystkie częściowe sformułowania factorialne zwiększyły BMD w stosunku do grupy modelowej. Sama wysoka dawka substancji odżywiających Yin (I3A1: 0,253 mg/cm3) oraz sama wysoka dawka substancji wzmacniających Yang (I1A3: 0,243 mg/cm3) pozostały na niższym poziomie niż pełna formuła ZGP (I2A2: 0,307 mg/cm3), co potwierdza występowanie interakcji, a nie prostego efektu dawki.
Surowicze markery obrotu kostnego
W porównaniu z grupą modelową, pełna formuła ZGP wiązała się ze zwiększonym poziomem P1NP (+51%; 95% CI: 210.3–327.5 pg/mL; p <0.01) oraz zmniejszonym poziomem CTX-1 (-16%; p <0.01), co jest zgodne z poprawą równowagi między formowaniem a resorpcją (Rysunek 3A,B). Ramiona monoterapii w wysokich dawkach wykazały wyższe wartości bezwzględne P1NP w niektórych porównaniach, jednak wzorzec factorialny wskazywał na zoptymalizowaną aktywność łączoną, a nie na maksymalną odpowiedź na dawkę w pojedynczym ramieniu. Pełne dane na poziomie grup znajdują się w Tabeli 3.
Wieloczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) i interakcja synergistyczna
Dwuczynnikowa ANOVA dla dziewięciu komórek czynnikowych wykazała istotne efekty główne czynników odżywiających Yin oraz wzmacniających Yang, a także istotne człony interakcji I i A we wszystkich głównych punktach końcowych (Tabela 4). Efekt interakcji dla P1NP (ηp2 = 0,74) sugeruje, że komponenty wzmacniające Yang nasiliły działanie komponentów odżywiających Yin w tych warunkach eksperymentalnych.
Gęstość kości (walidacja modelu)
Gęstość kości udowej była niższa w grupie Model (OVX) niż w grupach Blank i Sham, co potwierdza pomyślną indukcję fenotypu utraty masy kostnej OVX przed rozpoczęciem leczenia, jak pokazano na Rysunku 4.
Ekspresja EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP
Analizy RT-qPCR przeprowadzono na próbkach biologicznych z każdej grupy w trzech powtórzeniach technicznych, a densytometria Western blot została wykonana na niezależnych lizatach biologicznych (Rycina 5 i Rycina 6). W porównaniu z grupą modelową, pełny skład ZGP wiązał się z wyższym poziomem EphB4 (0.498 ± 0.09 vs. 0.048 ± 0.002; p < 0.01), ephrinB2 (0.41 ± 0.036 vs. 0.048 ± 0.03; p < 0.01) oraz ALP (0.842 ± 0.019 vs. 0.090 ± 0.03; p < 0.001), a niższym poziomem RhoA (1.658 ± 0.028 vs. 7.32 ± 0.430; p < 0.01). Wyniki molekularne te interpretuje się jako powiązania markerów szlaków, a nie jako dowód na mediację przyczynową.
Dostępność danych
Oryginalne pliki danych wykorzystane do wygenerowania wyników niniejszego badania zostały udostępnione jako Uzupełniający Plik z Kodem dołączony do tego artykułu
Rysunek 1Reprezentatywne obrazy cytologii pochwy użyte do weryfikacji cykliczności rui po owariektomii (barwienie hematoksyliną i eozyną, 20x). (A) Reprezentatywny obraz cytologiczny wymazu z pochwy szczura po owariektomii, wykazujący trwały brak cykliczności. (B) Reprezentatywny rozmaz z pochwy szczura po operacji pozorowanej, wykazujący prawidłową cykliczność rui. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2BMD kości udowej we wszystkich grupach. Słupki błędu oznaczają SD. Symbole statystyczne wskazują na porównania skorygowane metodą Bonferroniego względem modelu lub pełnego wzoru ZGP, zgodnie z definicją w sekcji Analiza statystyczna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3Surowicze markery obrotu kostnego. (A) P1NP, marker formowania kości. (B) CTX-1, marker resorpcji kości. Słupki błędów oznaczają SD. Symbole statystyczne wskazują porównania skorygowane metodą Bonferroniego w stosunku do modelu lub pełnego składu ZGP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4Gęstość kości udowej potwierdzająca utratę masy kostnej wywołaną OVX przed rozpoczęciem leczenia. Wykres słupkowy porównujący gęstość kości udowej (mg/cm3) pomiędzy grupą kontrolną (niepoddaną owariektomii i niezleczoną), grupą pozorowaną (Sham) a grupą modelową (OVX) w punkcie czasowym walidacji modelu przed rozpoczęciem leczenia. Słupki przedstawiają średnią ± SD (n = 10/grupa). *** = p < 0,01 w porównaniu z próbą ślepą (Blank) oraz w porównaniu z grupą pozorowaną (Sham) (jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA z korektą Bonferroniego). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5Względna ekspresja genów na poziomie mRNA. Poziomy ekspresji (A) EphB4 (B) ephrinB2 (C) RhoA (D) ALP przy użyciu 2^-ΔΔMetoda Ct znormalizowana do GAPDH. W qPCR zastosowano reakcje w trzech powtórzeniach technicznych dla każdej próbki biologicznej. Słupki błędu oznaczają SD. Symbole statystyczne wskazują porównania skorygowane metodą Bonferroniego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6Ekspresja białek metodą Western blot. Panele przedstawiają reprezentatywne immunobloty dla EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP oraz kontroli załadunku GAPDH, wybrane z niezależnych próbek biologicznych. Densitometrię znormalizowano względem GAPDH przy użyciu programu ImageJ. Obserwowane masy cząsteczkowe: EphB4, 10 kDa; ephrinB2, 36 kDa; RhoA, 2 kDa; ALP, 39 kDa; GAPDH, 37 kDa (patrz Tabela uzupełniająca 1). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
| Czynnik odżywiający Yin (I) | ||||
| I₁ (0 g) | I₂ (27 g) | I₃ (54 g) | ||
| Czynnik wzmacniający Yang (A) | A₁ (0 g) | I₁A₁ (Model) | I₂A₁ (Yin) | I₃A₁ (Hi-Yin) |
| A₂ (8 g) | I₁A₂ (Yang) | I₂A₂ (ZGP†) | I₃A₂ (Hi-Yin+Yang) | |
| A₃ (16 g) | I₁A₃ (Hi-Yang) | I₂A₃ (Yin+Hi-Yang) | I₃A₃ (Full-Hi) | |
Tabela 1: Projekt czynnikowy 3x3 i grupy eksperymentalne. Tabela przedstawia 13 grup eksperymentalnych ułożonych w projekcie czynnikowym 3x3 dla poziomów dawek substancji odżywiających Yin (I) i wzmacniających Yang (A), oraz 4 grupy referencyjne. †I₂A₂ = pełna formuła Zuogui Pill w dawce równoważnej klinicznie. Konwersja dawki z zastosowaniem metody powierzchni ciała (szczur : człowiek = 6,25).
| Grupa | Komórka factorialna | BMD (mg/cm²³, x̄ ± SD) | kontra Model |
| Kontrola ślepa | — | 0.279 ± 0.030 | **** |
| pozornie operowany | — | 0.281 ± 0.019 | **** |
| Model (OVX) | I₁A₁ | 0.214 ± 0.020 | — |
| wzmacniający Yang | I₁A₂ | 0.258 ± 0.011 | ** |
| Wysoko wzmacniający Yang | I₁A₃ | 0.243 ± 0.021 | * |
| odżywcze dla Yin | I₂A₁ | 0.262 ± 0.015 | *** |
| Wysoko odżywcze dla Yin | I₃A₁ | 0.253 ± 0.017 | ** |
| Yin + Hi-Yang | I₂A₃ | 0.240 ± 0.014 | * |
| Hi-Yin + Yang | I₃A₂ | 0.248 ± 0.014 | * |
| Pełna wysokość | I₃A₃ | 0.257 ± 0.017 | ** |
| pełny wzór ZGP | I₂A₂ | 0.307 ± 0.010 | **** |
| pozytywna kontrola TCM | — | 0.307 ± 0.029 | **** |
| kontrola medycyny zachodniej | — | 0.307 ± 0.009 | **** |
Tabela 2: BMD kości udowej we wszystkich grupach (n=10/grupa, średnia ± SD). * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p<0.01, **** = p<0.001 vs. model (poprawka Bonferroniego).
| Grupa | Komórka | P1NP (pg/mL, x̄ ± SD) | CTX-1 (ng/mL, x̄ ± SD) |
| Kontrola ujemna | — | 138.8 ± 29.7****#### | 3.4 ± 6.8****#### |
| Operacja pozorowana | — | 1268.7 ± 124.1****#### | 45.0 ± 6.7****#### |
| Model (OVX) | I₁A₁ | 526.4 ± 78.7 | 105.5 ± 9.9 |
| Wzmacniająca Yang | I₁A₂ | 845.1 ± 76.7**** | 84.2 ± 6.6**** |
| Silnie wzmacniająca Yang | I₁A₃ | 1013.0 ± 73.7 ****## | 65.5 ± 6.6****#### |
| Odżywcza dla Yin | I₂A₁ | 870.7 ± 63.6**** | 8.2 ± 7.6** |
| Silnie odżywcza dla Yin | I₃A₁ | 1068.0 ± 48.7****#### | 64.5 ± 4.0****#### |
| Yin + Silna Yang | I₂A₃ | 951.5 ± 146.5****# | 63.1 ± 6.0****#### |
| Silna Yin + Yang | I₃A₂ | 90.2 ± 16.8****## | 62.6 ± 4.4****#### |
| Pełna-Wysoka | I₃A₃ | 739.5 ± 93.5** | 97.1 ± 8.9 |
| Pełna formuła ZGP | I₂A₂ | 794.8 ± 6.0**** | 8.2 ± 6.0**** |
| Pozytywna kontrola TCM | — | 967.7 ± 49.9****# | 6.3 ± 6.1****#### |
| Kontrola medycyny zachodniej | — | 1026.6 ± 65.1****### | 68.8 ± 7.3****### |
Tabela 3: Poziomy surowiczego P1NP i CTX-1 we wszystkich grupach (n=10/grupa, średnia ± SD). ** = p <0,01, **** = p <0,01 względem modelu; # = p <0,05, ## = p <0,01, ### = p <0,01, #### = p <0,01 względem ZGP (Bonferroni). 95% CI dla ZGP P1NP względem modelu: 210,3–327,5 pg/mL.
| Wynik | Czynnik | df | F | wartość p | Częściowe η² |
| P1NP (pg/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 17.84 | <0.01 | 0.31 |
| Yang (A) | 2, 81 | 6.2 | 0.03 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 57.21 | <0.001 | 0.74 | |
| BMD (mg/cm³) | Yin (I) | 2, 81 | 31.90 | <0.01 | 0.4 |
| Yang (A) | 2, 81 | 28.70 | <0.001 | 0.41 | |
| I × A | 4, 81 | 24.60 | <0.01 | 0.5 | |
| CTX-1 (ng/mL) | Yin (I) | 2, 81 | 14.2 | <0.01 | 0.26 |
| Yang (A) | 2, 81 | 5.8 | 0.04 | 0.13 | |
| I × A | 4, 81 | 19.43 | <0.001 | 0.49 |
Tabela 4: Główne efekty i terminy interakcji w trójczynnikowej analizie wariancji (ANOVA 3x3) wraz z porównaniami post-hoc z korektą Bonferroniego. Wielkość efektu została podana jako częściowy eta-kwadrat. df oznacza stopnie swobody.
Tabela uzupełniająca 1. Informacje o przeciwciałach do analizy Western blot. Tabela zawiera wykaz białek docelowych, zaobserwowanych mas cząsteczkowych, dostawców, numerów katalogowych, gatunków gospodarzy oraz rozcieńczeń roboczych przeciwciał pierwszo- i drugorzędowych użytych w niniejszym badaniu.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Uzupełniający plik z kodem 1. Surowe dane eksperymentalne wspierające badanie. Archiwum to zawiera oryginalne pliki danych wykorzystane do wygenerowania wyników przedstawionych w manuskrypcie, w tym indywidualne pomiary BMD, surowe dane z testów ELISA, wartości Ct z RT-qPCR wraz z wynikami amplifikacji i krzywymi topnienia, oryginalne obrazy Western blot oraz pliki z analizą densytometryczną, reprezentatywne obrazy mikroskopii histologicznej oraz pliki wyjściowe generowane przez urządzenia, powiązane z tymi eksperymentami.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Człon interakcji factorialnej wskazuje na nieaddytywną relację między komponentami odżywiającymi Yin a komponentami wzmacniającymi Yang w ZGP. Wynik ten jest zgodny z tradycyjną zasadą poszukiwania Yang w Yin, zgodnie z którą oczekuje się, że komponenty wzmacniające Yang aktywują lub potęgują działanie bazy odżywiającej Yin15. Odkrycie to należy interpretować jako synergię farmakologiczną na poziomie formulacji. Nie identyfikuje ono poszczególnych aktywnych składników odpowiedzialnych za ten efekt.
EphB4 i ephrinB2 są biologicznie prawdopodobnymi mediatorami sprzężenia osteoblastów i osteoklastów3,4, jednak obecne dowody mają charakter korelacyjny. Obserwowany wzrost poziomu EphB4, ephrinB2 oraz ALP przy jednoczesnym spadku RhoA jest zgodny z poprawą sprzężenia, lecz nie dowodzi, że szlak ten jest niezbędny lub wystarczający dla działania ZGP. W celu przetestowania zależności przyczynowej wymagane jest zastosowanie inhibitorów szlaków, podejść blokujących EphB4 lub ephrinB2, modulacji RhoA/ROCK16, wyciszenia genów oraz eksperymentów z kokulturą osteoblastów i osteoklastów.
Translacja kliniczna wymaga ostrożności. Przeliczanie dawki ekwiwalentnej u szczurów na dawkę dla ludzi wspiera wstępne skalowanie, jednak dawkowanie u ludzi wymaga również badań farmakokinetycznych, farmakodynamicznych oraz badań bezpieczeństwa długoterminowego. Standaryzowany produkt ZGP wymagałby profilowania chemicznego metodą HPLC lub LC-MS, określenia limitów związków markerowych, zapewnienia porównywalności między partiami, testowania zanieczyszczeń oraz dokumentacji dotyczącej pozyskiwania ziół, ekstrakcji, koncentracji i praktyk produkcyjnych17. Translacja regulacyjna musi również uwzględniać interakcje między składnikami, kompatybilność z istniejącymi lekami przeciwosteoporotycznymi oraz porównawcze wyniki kliniczne, takie jak redukcja złamań, a nie tylko sama gęstość mineralna kości (BMD).
Niniejsze badanie posiada kilka ograniczeń. Model szczura OVX indukuje gwałtowny spadek poziomu estrogenów i nie może w pełni odtworzyć ludzkiej menopauzy, procesów starzenia, regulacji immunologicznej, długości życia, chorób współistniejących ani długofalowej dynamiki przebudowy kości18,19. Do zaobserwowanych wyników mogą przyczyniać się systemowe efekty endokrynne, zatem nie należy zakładać bezpośredniego sygnalizowania między komórkami kostnymi. Brak inhibicji szlaków sygnałowych lub wyciszenia genów uniemożliwia sformułowanie wniosków dotyczących przyczynowych mechanizmów działania. Brak profilowania metodą HPLC lub LC-MS ogranicza powtarzalność i uniemożliwia przypisanie efektów konkretnym składnikom. Nie przeprowadzono ilościowej oceny mikroarchitektury kości beleczkowej. Przyszłe badania powinny obejmować mikro-CT lub ilościowe analizy histomorfometryczne, w tym BV/TV, Tb.N, Tb.Th oraz Tb.Sp, aby zapewnić bardziej kompleksową ocenę zmian strukturalnych kości20. Zmienność partii ziół, procedury ekstrakcji oraz wymagania dotyczące kontroli jakości pozostają istotnymi barierami w translacji wyników.
W przypadku szczurów z PMOP indukowanym przez OVX, pełny skład pigułki Zuogui wiązał się z poprawą BMD, korzystnymi markerami obrotu kostnego w surowicy oraz skoordynowanymi zmianami markerów szlaku EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Analiza faktorialna trzy na trzy wskazuje na synergistyczną interakcję między komponentami odżywiającymi Yin a komponentami wzmacniającymi Yang, co jest zgodne z tradycyjną teorią kompatybilności receptur. Dane te wspierają dalsze badania nad ZGP jako wielocelowym kandydatem w leczeniu PMOP, jednak przed sfinalizowaniem wniosków dotyczących mechanizmów lub potencjału translacyjnego niezbędne są badania z użyciem inhibitorów, eksperymenty z wyciszaniem genów, kokultury osteoblastów i osteoklastów, profilowanie chemiczne, ilościowa analiza mikroarchitektury kości, farmakokinetyka, długoterminowe testy bezpieczeństwa oraz badania kliniczne.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez Natural Science Foundation of Inner Mongolia (Grant nr 2025LHMS08047), General Project of Inner Mongolia Medical University (Grant nr YKD2025MS015) oraz Doctoral Start-up Fund of Inner Mongolia Medical University (Grant nr YKD2023BSQD07). Podmioty finansujące nie brały udziału w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie, decyzji o publikacji ani w przygotowaniu manuskryptu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1% roztwór amoniaku | N/A | N/A | Roztwór błękitniący po różnicowaniu hematoksyliną. |
| 1% alkoholowy roztwór kwasu solnego | N/A | N/A | Roztwór do różnicowania w barwieniu hematoksyliną. |
| 2x qPCR Mix | N/A | N/A | Master mix do ilościowej PCR. Objętość reakcji w źródle: 12,5 uL na reakcję. |
| 4% roztwór paraformaldehydu | N/A | N/A | Fiksacja próbek lewej kości udowej i piszczelowej do analizy histologicznej. |
| 5x bufor do ładowania | N/A | N/A | Denaturacja próbek przed elektroforezą. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe ALP | Affinity Biosciences | N/A | Przeciwciało do Western blot. Rozcieńczenie w źródle: 1:20. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE. |
| Para starterów ALP | N/A | N/A | Poziom mRNA ALP mierzono metodą qRT-PCR, ale tabela starterów w źródle nie zawiera sekwencji starterów ALP. Wymagane potwierdzenie autora. |
| Odczyn przeciwciała z biotyną | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | Dodawany do dołków z próbkami podczas testu ELISA. |
| Żelatyna z poroża Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Komponent wzmacniający Yang. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4. Żelatynę roztapiano w odwarze. |
| Żelatyna z plastronu Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao | Beijing Tongrentang | N/A | Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4. Żelatynę roztapiano w odwarze. |
| Chloroform | N/A | N/A | Rozdzielanie faz podczas ekstrakcji RNA. |
| Stół chłodzący | Leica | 1150 | Wsparcie kriogeniczne lub chłodzące dla procesu sekcjonowania. |
| Cornus officinalis, Shan Zhu Yu | Beijing Tongrentang | N/A | Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4. |
| Cuscuta australis, Tu Si Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Komponent wzmacniający Yang. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4. |
| Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi | Beijing Tongrentang | N/A | Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 9 g, proporcja 3. |
| PBS traktowany DEPC | N/A | N/A | Płukanie kręgów lędźwiowych L4 do L5 przed zamrażaniem w ciekłym azocie. |
| Dietylstilbestrol | N/A | N/A | Pozytywna kontrola medycyny zachodniej. Dawka w źródle: 0,04 mg/kg/dzień, 1 mL/10 g/dzień. Dokument źródłowy zawiera również niespójność w nomenklaturze chińskiej, którą należy ujednolicić jako dietylstilbestrol. |
| Dioscorea opposita, Huai Shan Yao | Beijing Tongrentang | N/A | Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4. |
| Mieszanina dNTP | N/A | N/A | Uwzględniona w reakcji odwrotnej transkrypcji. |
| Odczyn chemiluminescencyjny ECL | N/A | N/A | Odczyn do detekcji w Western blot. |
| Chromogenny odczyn ELISA A | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | Odczyn do wywoływania barwy w teście ELISA. |
| Chromogenny odczyn ELISA B | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | Odczyn do wywoływania barwy w teście ELISA. |
| Roztwór stopujący ELISA | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | Stosowany do przerwania reakcji barwnej w teście ELISA. |
| Odczyn ELISA znakowany enzymem | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | Dodawany dołków niebędących ślepą próbą w teście ELISA. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe EphB4 | Proteintech | N/A | Przeciwciało do Western blot. Rozcieńczenie w źródle: 1:20. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE. |
| Para starterów EphB4 | N/A | Produkt PCR 232 bp | Forward CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverse GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Literówka w tabeli źródłowej: Rat RphB4 powinno brzmieć Rat EphB4. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe ephrinB2 | Affinity Biosciences | N/A | Przeciwciało do Western blot. Rozcieńczenie w źródle: 1:200. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE. |
| Para starterów ephrinB2 | N/A | Produkt PCR 172 bp | Forward CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverse ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT. |
| Etanol, absolutny oraz stopniowany 95%, 85%, 75% | N/A | N/A | Gradientowe odwodnienie i rehydratacja podczas barwienia hematoksyliną i eozyną. |
| Samice szczurów Sprague-Dawley | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Animal certificate and license number not supplied in source article | Wolne od specyficznych patogenów, 6-miesięczne, zdrowe, nieciężarne samice. Źródło chińskie podaje 230 do 270 g; wcześniejszy angielski projekt podaje 220 do 250 g. Należy zweryfikować ostateczny zakres przed wysłaniem. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe GAPDH | Servicebio | N/A | Przeciwciało do kontroli ładowania. Rozcieńczenie w źródle: 1:20. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE. |
| Para starterów GAPDH | N/A | Produkt PCR 253 bp | Forward ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverse TTTGAGGGTGCAGCGAACTT. |
| Oprogramowanie GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.1; RRID:SCR_02798 | Analiza statystyczna i tworzenie wykresów. Normalność, jednorodność wariancji, ANOVA, korekta Bonferroniego i wielkość efektu powinny zostać zachowane w plikach wyjściowych. |
| Granulki Gusukang | Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd. | N/A | Pozytywna kontrola tradycyjnej medycyny chińskiej. Dawka w źródle: 1,8 g/kg/dzień lub 0,5 mL/10 g/dzień. |
| Roztwór barwiący hematoksyliną | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Barwienie histologiczne. W procedurze źródłowej zastosowano 5-minutowe barwienie hematoksyliną. |
| Wysokoobrotowa mikrowirówka | N/A | TG16W | Wirowanie dla procedur z surowicą i kwasami nukleinowymi. |
| Absorpcjometry ks-rentgenowski o podwójnej energii Hologic | Hologic | N/A | Analiza gęstości mineralnej kości. Źródło raportuje skanowanie kości udowej in vivo i ex vivo. |
| Oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health | RRID:SCR_003070 | Kwantyfikacja densytometryczna prążków Western blot. Wersja nie została podana w artykule źródłowym. |
| Kuchenka indukcyjna | Midea | N/A | Wymieniona w chińskiej tabeli instrumentów. |
| Izofluran | N/A | N/A | Znieczulenie do obustronnej owariektomii i pozycjonowania DXA. Zrewidowany protokół powinien określać indukcję, utrzymanie, drogę podania i kryteria głębokości znieczulenia. |
| Izopropanol | N/A | N/A | Wytrącanie RNA podczas ekstrakcji. |
| Ciekły azot | N/A | N/A | Szybkie zamrażanie próbek kręgów lędźwiowych. |
| Lycium barbarum, Gou Qi Zi | Beijing Tongrentang | N/A | Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4. |
| Czytnik mikropłytek | N/A | AMR-10 | Pomiar absorbancji ELISA przy 450 nm. |
| Myjka do mikropłytek | N/A | APW-20 | Etap płukania płytek ELISA. |
| Odwrotna transkryptaza MMLV | N/A | N/A | Enzym do odwrotnej transkrypcji. |
| Neutralna guma montażowa | Sinopharm Group | N/A | Medium montażowe dla preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną. |
| Sól fizjologiczna | N/A | N/A | Nośnik do zgłębnika dla grupy kontrolnej pustej, grupy sham i grupy modelowej. |
| Starter Oligo(dT)18 | N/A | N/A | Stosowany do odwrotnej transkrypcji. |
| Penicylina | N/A | N/A | Profilaktyka przeciwzakażeniowa pooperacyjna. Dawka w źródle: 20 0 U/kg domięśniowo przez 3 dni. |
| Szybkowar | Xinfei | N/A | Wymieniony w chińskiej tabeli instrumentów. |
| Inhibitor proteaz | N/A | N/A | Dodawany podczas ekstrakcji białek. |
| Bufor do lizy białek | N/A | N/A | Ekstrakcja białek z tkanki kostnej do Western blotting. |
| Membrana PVDF | N/A | N/A | Membrana transferowa Western blot aktywowana metanolem. |
| Urządzenie do qRT-PCR | N/A | N/A | Ilościowa PCR z odwrotną transkrypcją dla EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP i GAPDH. |
| Zestaw ELISA CTX-1 dla szczura | Jiyinmei | JYM026Ra | Kanapkowy test ELISA dla telopeptydu C-końcowego kolagenu typu 1 w surowicy. Detekcja przy 450 nm. |
| Zestaw ELISA P1NP dla szczura | Jiyinmei | JYM0030Ra | Kanapkowy test ELISA dla propeptydu N-końcowego prokolagenu typu 1 w surowicy. Detekcja przy 450 nm. |
| Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang | Beijing Tongrentang | N/A | Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 24 g, proporcja 8. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe RhoA | Proteintech | N/A | Przeciwciało do Western blot. Rozcieńczenie w źródle: 1:20. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE. |
| Para starterów RhoA | N/A | Produkt PCR 17 bp | Forward GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverse ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminologia ujednolicona z RHoA na RhoA. |
| Inhibitor RNazy | N/A | N/A | Uwzględniony w reakcji odwrotnej transkrypcji. |
| Woda wolna od RNaz | N/A | N/A | Rozpuszczanie RNA po wysuszeniu. |
| Mikrotom obrotowy | Leica | 245 | Sekcjonowanie histologiczne. |
| Przeciwciało wtórne do Western blotting | N/A | N/A | Rozcieńczenie w źródle: 1:1500. Wymagana reaktywność gospodarza i RRID dla JoVE. |
| Odtłuszczone mleko w proszku, 5% | N/A | N/A | Odczyn blokujący do Western blotting, temperatura pokojowa przez 2 h. |
| Maszyna do rozcierania i wypiekania preparatów | Jinhua Yidi | N/A | Przygotowanie szkiełek do histologii. |
| Pentobarbital sodowy, 3% | N/A | N/A | Znieczulenie końcowe przed pobraniem krwi z aorty brzusznej w chińskim dokumencie źródłowym. Ostateczna procedura eutanazji i metoda potwierdzenia muszą zostać zweryfikowane. |
| Standardowy rozcieńczalnik próbek | Supplied with ELISA kit, Jiyinmei | Kit component | Stosowany do seryjnego rozcieńczania standardów w procedurze ELISA. |
| Bufor TBST | N/A | N/A | Bufor do płukania w Western blotting. |
| Termostatyczny inkubator z wytrząsaniem | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | N/A | Inkubacja i wytrząsanie laboratoryjne. |
| Odczyn TRIzol | N/A | N/A | Ekstrakcja RNA z 10 mg tkanki kostnej. |
| Mikroskop pionowy | Leica | DM10 | Obrazowanie histologiczne hematoksyliną i eozyną przy 200x. |
| Termostatyczny inkubator z płaszczem wodnym | N/A | GNP-9080 | Inkubacja dla procedur analitycznych. |
| Rozpuszczalny w wodzie roztwór barwiący eozyną | Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Kontrast barwiący w histologii. W procedurze źródłowej zastosowano 3-minutowe barwienie eozyną. |
| System elektroforezy Western blot | N/A | N/A | Rozdział białek. Elektroforeza w źródle: początkowo 80 V, następnie 120 V. |
| System obrazowania Western blot | N/A | N/A | Obrazowanie membran chemiluminescencyjnych. Do zgłoszenia wymagane są nieprzycięte membrany. |
| System transferu Western blot | N/A | N/A | Transfer białek na membranę PVDF. Warunki transferu w źródle: 40 mA, 90 min, kąpiel lodowa. |
| Ksylen | N/A | N/A | Odtłuszczanie i klarowanie tkanek podczas histologii. |
| Zioła składające się na pigułki Zuogui | Beijing Tongrentang | N/A | Formulacja z ośmiu ziół: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, żelatyna z plastronu Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis i żelatyna z poroża Cervus elaphus. |
Bibliografia
- Compston JE, McClung MR, Leslie WD. Osteoporosis. Lancet. 2019;393(10169):364-376. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)32112-3
- Shen Y, Huang X, Wu J, et al. The global burden of osteoporosis, low bone mass, and its related fracture in 204 countries and territories, 1990-2019. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:882241. https://doi.org/10.3389/fendo.2022.882241
- Zhao C, Irie N, Takada Y, et al. Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis. Cell Metab. 2006;4(2):111-121. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2006.05.012
- Wu Z, Li W, Jiang K, et al. Regulation of bone homeostasis: signaling pathways and therapeutic targets. MedComm (2020). 2024;5(8):e657. https://doi.org/10.1002/mco2.657
- Reid IR, Billington EO. Drug therapy for osteoporosis in older adults. Lancet. 2022;399(10329):1080-1092. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)02646-5
- Li J, Sun K, Qi B, et al. An evaluation of the effects and safety of Zuogui pill for treating osteoporosis: current evidence for an ancient Chinese herbal formula. Phytother Res. 2021;35(4):1754-1767. https://doi.org/10.1002/ptr.6908
- Shi T, Liu T, Kou Y, et al. The synergistic effect of Zuogui Pill and eldecalcitol on improving bone mass and osteogenesis in type 2 diabetic osteoporosis. Medicina (Kaunas). 2023;59(8):1414. https://doi.org/10.3390/medicina59081414
- Yang S, Zhang B, Wang YG, et al. Zuo Gui Wan promotes osteogenesis via PI3K/AKT signaling pathway: network pharmacology analysis and experimental validation. Curr Med Sci. 2023;43(5):1051-1060. https://doi.org/10.1007/s11596-023-2782-x
- Qiu J, Zhu Y, Xing J, Wang L, Zhang J, Yin H. Comparative pharmacokinetic study of 5 active ingredients after oral administration of Zuogui Pill in osteoporotic rats with different syndrome types. Int J Anal Chem. 2023;2023:1473878. https://doi.org/10.1155/2023/1473878
- Gong W, Zhang N, Cheng G, et al. Rehmannia glutinosa Libosch extracts prevent bone loss and architectural deterioration and enhance osteoblastic bone formation by regulating the IGF-1/PI3K/mTOR pathway in streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Mol Sci. 2019;20(16):3964. https://doi.org/10.3390/ijms20163964
- Wang K, Kou Y, Rong X, Wei L, Li J, Liu H, Li M, Song H. ED-71 improves bone mass in ovariectomized rats by inhibiting osteoclastogenesis through EphrinB2-EphB4-RANKL/OPG axis. Drug Des Devel Ther. 2024;18:1515-1528. https://doi.org/10.2147/DDDT.S454116
- Percie du Sert N, Hurst V, Ahluwalia A, et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000410. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000410
- Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-661. https://doi.org/10.1096/fj.07-9574LSF
- Eastell R, Szulc P. Use of bone turnover markers in postmenopausal osteoporosis. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(11):908-923. https://doi.org/10.1016/S2213-8587(17)30184-5
- Yao ZY, Fan SY, Song ZF, Li ZC. Network pharmacology-based and molecular docking-based analysis of You-Gui-Yin for the treatment of osteonecrosis of the femoral head. Medicine (Baltimore). 2023;102(43):e35581. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035581
- Wang J, Xu C, Zhang J, Bao Y, Tang Y, Lv X, Ma B, Wu X, Mao G. RhoA promotes osteoclastogenesis and regulates bone remodeling through mTOR-NFATc1 signaling. Mol Med. 2023;29(1):49. https://doi.org/10.1186/s10020-023-00638-1
- Noviana E, Indrayanto G, Rohman A. Advances in fingerprint analysis for standardization and quality control of herbal medicines. Front Pharmacol. 2022;13:853023. https://doi.org/10.3389/fphar.2022.853023
- Fischer V, Haffner-Luntzer M. Interaction between bone and immune cells: implications for postmenopausal osteoporosis. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:14-21. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2021.05.014
- Komori T. Animal models for osteoporosis. Eur J Pharmacol. 2015;759:287-294. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2015.03.028
- Dempster DW, Compston JE, Drezner MK, et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 2013;28(1):2-17. https://doi.org/10.1002/jbmr.1805