Pigułka Zuogui moduluje sprzężenie osteoblastów i osteoklastów u szczurów po ovariektomii: badanie factorialne 3x3

Podsumowanie

Niniejsze badanie ocenia wpływ pigułek Zuogui na osteoporozę pomenopauzalną u szczurów po owariektomii z zastosowaniem trójczynnikowego układu eksperymentalnego (3x3). Wyniki potwierdzają synergistyczne działanie komponentów Yin i Yang na metabolizm kostny oraz powiązane z nim markery szlaku EphB4/ephrinB2, choć dowody mechanistyczne mają charakter korelacyjny, a nie przyczynowo-skutkowy.

Streszczenie

Osteoporoza pomenopauzalna jest wywołana przez rozregulowanie procesów tworzenia i resorpcji kości związane z niedoborem estrogenów. W niniejszym badaniu określono niezależne i interaktywne efekty subformulacji odżywiających Yin zawartych w pigułkach Zuogui w modelu szczurów po owariektomii oraz zbadano związki z szlakiem EphB4/ephrinB2/RhoA/fosfatazy zasadowej. Zgodnie z wytycznymi ARRIVE 2.0, 130 wolnych od specyficznych patogenów samic szczurów Sprague-Dawley przydzielono losowo do 13 grup (n=10/grupa), w tym do dziewięciu grup w ramach trójczynnikowego projektu eksperymentalnego (3x3). Punkty końcowe obejmowały P1NP, CTX-1, gęstość mineralną kości udowej mierzoną za pomocą dwuenergetycznej absorpcjometrii promieni rentgenowskich (DXA), histologię beleczek kostnych oraz ekspresję matrycowego RNA i białek mierzoną za pomocą ilościowej polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją oraz analizy Western blotting. Pełna formuła (I2A2) wiązała się z wyższym poziomem P1NP, niższym poziomem CTX-1 oraz wyższą BMD w porównaniu z grupą modelową. Analiza czynnikowa wykazała interakcję Yin-Yang pomiędzy P1NP a BMD, co potwierdza synergię farmakologiczną. Zmiany molekularne były powiązane ze zwiększoną ekspresją EphB4/ephrinB2/ALP oraz zmniejszoną ekspresją RhoA. Wyniki te potwierdzają związek między leczeniem pigułkami Zuogui, poprawą fenotypów kostnych a modulacją markerów szlaku; wykazanie przyczynowej zależności od szlaku wymaga walidacji z użyciem inhibitorów, wyciszania genów oraz kokultur.

Wprowadzenie

Osteoporoza pomenopauzalna (PMOP) dotyka znaczną populację kobiet i charakteryzuje się zaburzeniem równowagi między formowaniem a resorpcją kości związanym z niedoborem estrogenów^1,2. System receptor-ligand EphB4/ephrinB2 pośredniczy w komunikacji między osteoblastami a osteoklastami; sygnalizacja EphB4 wspiera różnicowanie osteoblastów i aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP), podczas gdy odwrotna sygnalizacja ephrinB2 może hamować osteoklastogenezę poprzez mechanizmy związane z RhoA^3,4. Zmniejszone sprzężenie w kościach przy niedoborze estrogenów stanowi mechanistyczne uzasadnienie dla oceny interwencji wpływających na oba komponenty komórkowe przebudowy tkanki kostnej.

Obecne terapie osteoporozy, w tym leki antyresorpcyjne i anaboliczne, zmniejszają ryzyko złamań, lecz ich stosowanie może być ograniczone przez brak przestrzegania zaleceń, koszt, przeciwwskazania, efekty odbicia lub zdarzenia niepożądane podczas długotrwałego stosowania⁵. W związku z tym potencjalne metody leczenia poprawiające tworzenie kości przy jednoczesnym ograniczeniu nadmiernej resorpcji pozostają istotne z naukowego punktu widzenia.

Pigułka Zuogui (ZGP; Zuo Gui Wan) to klasyczna wieloskładnikowa receptura stosowana w tradycyjnej medycynie chińskiej w przypadku niedoboru esencji nerek, czyli teoretycznego wzorca powiązanego z osłabieniem kości. Składniki odżywiające Yin obejmują Rehmannia glutinosa (przetworzony korzeń, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (kłącze, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (owoc, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (owoc, Gou Qi Zi, 12 g), żelatynę z plastronu Chinemys reevesii (żelatyna pochodząca z plastronu, Gui Ban Jiao, 12 g) oraz Cyathula officinalis (korzeń, Chuan Niu Xi, 9 g). Składniki wzmacniające Yang obejmują Cuscuta australis (nasiona, Tu Si Zi, 12 g) oraz żelatynę z poroża Cervus elaphus (żelatyna pochodząca z poroża, Lu Jiao Jiao, 12 g). W teorii klasycznej zasada poszukiwania Yang w obrębie Yin sugeruje, że zioła wzmacniające Yang mogą potęgować działanie bazy odżywiającej Yin, zamiast działać jako proste, niezależne dodatki. Dowody kliniczne i badania przedkliniczne wykazały działanie przeciwosteoporotyczne ZGP lub interwencji zawierających ZGP, w tym wpływ na BMD, osteogenezę i właściwości farmakokinetyczne^6,7,8,9,10.

Nowatorstwo niniejszego badania polega na formalnej separacji w układzie czynnikowym trzy na trzy komponentów odżywiających Yin i wzmacniających Yang u szczurów po owariektomii (OVX), z jednoczesną oceną fenotypów kostnych oraz markerów szlaku EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP. Taki projekt badawczy w sposób bardziej bezpośredni niż badania wykorzystujące wyłącznie pełną recepturę lub pojedynczy komparator weryfikuje teorię kompatybilności formuły, przy jednoczesnym uznaniu, że zmiany markerów szlaku pozostają korelatami, dopóki nie zostaną mechanistycznie zablokowane lub wyciszone¹.

Protokół

Wszystkie procedury w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Mongolii Wewnętrznej (numer zatwierdzenia YKD202404105) i przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE 2.0¹².

Projekt badania

Badanie przeprowadzono na platformie doświadczeń na zwierzętach Uniwersytetu Medycznego w Mongolii Wewnętrznej. Zastosowano pełny plan czynnikowy 3×3 z dwoma czynnikami: bazową recepturą odżywiającą Yin (I; trzy poziomy dawkowania: 0, 27, 54 g ekwiwalentu surowca roślinnego) oraz recepturą wzmacniającą Yang (A; trzy poziomy dawkowania: 0, 8, 16 g ekwiwalentu surowca roślinnego), co dało dziewięć komórek czynnikowych oraz cztery grupy referencyjne. Plan czynnikowy przedstawiono w Tabeli 1. I2A2 reprezentuje pełną formułę ZGP w dawce równoważnej klinicznie. Konwersja dawki została przeprowadzona metodą powierzchni ciała (czynnik szczur: człowiek = 6,25)¹³.

Zwierzęta, randomizacja i maskowanie

Sto trzydzieści wolnych od swoistych patogenów samic szczurów Sprague-Dawley (wiek 6 miesięcy, masa 20–250 g) przydzielono do grup za pomocą wygenerowanej komputerowo tabeli liczb losowych. Kody przydziału umieszczono w kolejno zapieczętowanych kopertach przez badacza niezaangażowanego w ocenę wyników. Szczury utrzymywano po 3–4 osobniki w wentylowanej klatce w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, w temperaturze 2 ± 2 ^oC i wilgotności 50–60%, z dostępem do wody ad libitum, standardowej karmy dla gryzoni o udokumentowanej zawartości wapnia i fosforu, możliwością aktywności w klatce oraz wzbogaceniem środowiskowym. Analizy molekularne, ocena histologiczna, kwantyfikacja obrazów i densytometria zostały przeprowadzone przez badaczy nieznających przydziału zwierząt do grup. Wielkość próby określono na podstawie a priori analizy mocy, co dało n = 10 na grupę.

Model OVX i leczenie farmakologiczne

Obustronną owariektomię (OVX) przeprowadzono w znieczuleniu wziewnym izofluranem podawanym za pomocą precyzyjnego waporyzatora. Znieczulenie wprowadzono w stężeniu 3–4% w tlenie i utrzymywano na poziomie 1,5–2,5% poprzez maskę nosową. Odpowiednią głębokość znieczulenia potwierdzono brakiem odruchu wycofania łapy oraz odruchu powiekowego przy stabilnym oddychaniu. Powodzenie zabiegu OVX oceniano na podstawie braku cyklu rujowego w pochwie w 5. dniu oraz redukcji BMD w 12. tygodniu po operacji. Po walidacji modelu stosowano leczenie przez zgłębnik przez 8 tygodni (1 mL/10 g/dobę). Odwary przygotowano poprzez sekwencyjną ekstrakcję wodną w temperaturze wrzenia (10 °C, reflux), najpierw w 10-krotnej objętości rozpuszczalnika przez 2 h, a następnie w 8-krotnej objętości przez 1,5 h; roztwory przefiltrowano przez cztery warstwy gazy medycznej i zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem do stężenia 0,968 g surowca/mL. Zagęszczony ekstrakt przechowywano w temperaturze 4 °C i wykorzystywano w ciągu 7 dni od przygotowania. Jako kontrole pozytywne zastosowano granulat Gusukang (1,8 g/kg/dobę) oraz dietylstilbestrol (0,04 mg/kg/dobę). Po zakończeniu badania szczury głęboko znieczulono izofluranem w stężeniu 5% aż do utraty odruchów łap i rogówkowych, a następnie poddano upuście krwi i zwichnięciu stawów szyjnych. Śmierć potwierdzono ustaniem bicia serca i oddechu. Zwłoki zwierząt i tkanki zutylizowano jako odpady biologiczne, pozostałości chemiczne jako odpady niebezpieczne, a igły i ostrza umieszczono w zatwierdzonych pojemnikach na odpady ostre.

Mierniki efektów

Poziomy serum P1NP i CTX-1 zmierzono za pomocą metody kanapkowego ELISA (Jiyinmei).¹⁴Gęstość mineralną kości (BMD) kości udowej ilościowo określono za pomocą metody DXA. Histologię beleczkową oceniono przy użyciu barwienia hematoksyliną i eozyną z powiększeniem 20x. Ekspresję genów oceniono metodą RT-qPCR z użyciem 2^-ΔΔCt metoda, z normalizacją do dehydrogenazy glikeraldehydo-3-fosforanu (GAPDH). Ekspresję białek oceniono za pomocą analizy Western blot oraz kwantyfikacji w programie ImageJ (patrz Tabela materiałów). Obserwowane masy cząsteczkowe oraz informacje katalogowe przeciwciał podano w Tabela uzupełniająca 1Sekwencje starterów były następujące: EphB4 forward/reverse, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.

Analiza statystyczna

Normalność rozkładu oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka, a jednorodność wariancji za pomocą testu Levene'a przed przeprowadzeniem analizy parametrycznej. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, a wszystkie słupki błędów na wykresach ilościowych oznaczają SD. W celu oszacowania efektów głównych oraz interakcji I i A zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) dla dziewięciu komórek czynnikowych, przyjmując cząstkowy eta-kwadrat (ηp²) jako miarę wielkości efektu. Porównania parowe pomiędzy wszystkimi 13 grupami przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z korektą Bonferroniego. Analizy statystyczne wykonano w programie GraphPad Prism. Symbole istotności zdefiniowano w następujący sposób: *, **, ***, **** oznaczają p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.01 względem modelu; #, ##, ###, #### oznaczają te same progi względem pełnego wzoru ZGP.

Wyniki

Walidacja modelu poprzez cytologię pochwy

Sukces operacji OVX potwierdzono u wszystkich zwierząt poddanych owariektomii, co objawiało się utratą cyklu rujowego w ciągu 5 dni po zabiegu (Rysunek 1A), podczas gdy zwierzęta w grupie operacji pozorowanej zachowały 4-dniowy cykl (Rycina 1B). W 12. tygodniu badanie DXA wykazało niższą gęstość mineralną kości (BMD) uda w grupie modelowej OVX niż w grupie kontrolnej sham (0,2...

Dyskusja

Człon interakcji factorialnej wskazuje na nieaddytywną relację między komponentami odżywiającymi Yin a komponentami wzmacniającymi Yang w ZGP. Wynik ten jest zgodny z tradycyjną zasadą poszukiwania Yang w Yin, zgodnie z którą oczekuje się, że komponenty wzmacniające Yang aktywują lub potęgują działanie bazy odżywiającej Yin¹⁵. Odkrycie to należy interpretować jako synergię farmakologiczną na poziomie formulacji. Nie identyfikuje ono poszczególnych aktywnych składników odpowiedzialnych za ten efekt...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1% roztwór amoniaku	N/A	N/A	Roztwór błękitniący po różnicowaniu hematoksyliną.
1% alkoholowy roztwór kwasu solnego	N/A	N/A	Roztwór do różnicowania w barwieniu hematoksyliną.
2x qPCR Mix	N/A	N/A	Master mix do ilościowej PCR. Objętość reakcji w źródle: 12,5 uL na reakcję.
4% roztwór paraformaldehydu	N/A	N/A	Fiksacja próbek lewej kości udowej i piszczelowej do analizy histologicznej.
5x bufor do ładowania	N/A	N/A	Denaturacja próbek przed elektroforezą.
Przeciwciało pierwszorzędowe ALP	Affinity Biosciences	N/A	Przeciwciało do Western blot. Rozcieńczenie w źródle: 1:20. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE.
Para starterów ALP	N/A	N/A	Poziom mRNA ALP mierzono metodą qRT-PCR, ale tabela starterów w źródle nie zawiera sekwencji starterów ALP. Wymagane potwierdzenie autora.
Odczyn przeciwciała z biotyną	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Dodawany do dołków z próbkami podczas testu ELISA.
Żelatyna z poroża Cervus elaphus, Lu Jiao Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Komponent wzmacniający Yang. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4. Żelatynę roztapiano w odwarze.
Żelatyna z plastronu Chinemys reevesii, Gui Ban Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4. Żelatynę roztapiano w odwarze.
Chloroform	N/A	N/A	Rozdzielanie faz podczas ekstrakcji RNA.
Stół chłodzący	Leica	1150	Wsparcie kriogeniczne lub chłodzące dla procesu sekcjonowania.
Cornus officinalis, Shan Zhu Yu	Beijing Tongrentang	N/A	Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4.
Cuscuta australis, Tu Si Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Komponent wzmacniający Yang. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4.
Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi	Beijing Tongrentang	N/A	Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 9 g, proporcja 3.
PBS traktowany DEPC	N/A	N/A	Płukanie kręgów lędźwiowych L4 do L5 przed zamrażaniem w ciekłym azocie.
Dietylstilbestrol	N/A	N/A	Pozytywna kontrola medycyny zachodniej. Dawka w źródle: 0,04 mg/kg/dzień, 1 mL/10 g/dzień. Dokument źródłowy zawiera również niespójność w nomenklaturze chińskiej, którą należy ujednolicić jako dietylstilbestrol.
Dioscorea opposita, Huai Shan Yao	Beijing Tongrentang	N/A	Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4.
Mieszanina dNTP	N/A	N/A	Uwzględniona w reakcji odwrotnej transkrypcji.
Odczyn chemiluminescencyjny ECL	N/A	N/A	Odczyn do detekcji w Western blot.
Chromogenny odczyn ELISA A	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Odczyn do wywoływania barwy w teście ELISA.
Chromogenny odczyn ELISA B	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Odczyn do wywoływania barwy w teście ELISA.
Roztwór stopujący ELISA	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Stosowany do przerwania reakcji barwnej w teście ELISA.
Odczyn ELISA znakowany enzymem	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Dodawany dołków niebędących ślepą próbą w teście ELISA.
Przeciwciało pierwszorzędowe EphB4	Proteintech	N/A	Przeciwciało do Western blot. Rozcieńczenie w źródle: 1:20. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE.
Para starterów EphB4	N/A	Produkt PCR 232 bp	Forward CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverse GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Literówka w tabeli źródłowej: Rat RphB4 powinno brzmieć Rat EphB4.
Przeciwciało pierwszorzędowe ephrinB2	Affinity Biosciences	N/A	Przeciwciało do Western blot. Rozcieńczenie w źródle: 1:200. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE.
Para starterów ephrinB2	N/A	Produkt PCR 172 bp	Forward CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverse ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
Etanol, absolutny oraz stopniowany 95%, 85%, 75%	N/A	N/A	Gradientowe odwodnienie i rehydratacja podczas barwienia hematoksyliną i eozyną.
Samice szczurów Sprague-Dawley	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	Animal certificate and license number not supplied in source article	Wolne od specyficznych patogenów, 6-miesięczne, zdrowe, nieciężarne samice. Źródło chińskie podaje 230 do 270 g; wcześniejszy angielski projekt podaje 220 do 250 g. Należy zweryfikować ostateczny zakres przed wysłaniem.
Przeciwciało pierwszorzędowe GAPDH	Servicebio	N/A	Przeciwciało do kontroli ładowania. Rozcieńczenie w źródle: 1:20. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE.
Para starterów GAPDH	N/A	Produkt PCR 253 bp	Forward ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverse TTTGAGGGTGCAGCGAACTT.
Oprogramowanie GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.4.1; RRID:SCR_02798	Analiza statystyczna i tworzenie wykresów. Normalność, jednorodność wariancji, ANOVA, korekta Bonferroniego i wielkość efektu powinny zostać zachowane w plikach wyjściowych.
Granulki Gusukang	Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	Pozytywna kontrola tradycyjnej medycyny chińskiej. Dawka w źródle: 1,8 g/kg/dzień lub 0,5 mL/10 g/dzień.
Roztwór barwiący hematoksyliną	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Barwienie histologiczne. W procedurze źródłowej zastosowano 5-minutowe barwienie hematoksyliną.
Wysokoobrotowa mikrowirówka	N/A	TG16W	Wirowanie dla procedur z surowicą i kwasami nukleinowymi.
Absorpcjometry ks-rentgenowski o podwójnej energii Hologic	Hologic	N/A	Analiza gęstości mineralnej kości. Źródło raportuje skanowanie kości udowej in vivo i ex vivo.
Oprogramowanie ImageJ	National Institutes of Health	RRID:SCR_003070	Kwantyfikacja densytometryczna prążków Western blot. Wersja nie została podana w artykule źródłowym.
Kuchenka indukcyjna	Midea	N/A	Wymieniona w chińskiej tabeli instrumentów.
Izofluran	N/A	N/A	Znieczulenie do obustronnej owariektomii i pozycjonowania DXA. Zrewidowany protokół powinien określać indukcję, utrzymanie, drogę podania i kryteria głębokości znieczulenia.
Izopropanol	N/A	N/A	Wytrącanie RNA podczas ekstrakcji.
Ciekły azot	N/A	N/A	Szybkie zamrażanie próbek kręgów lędźwiowych.
Lycium barbarum, Gou Qi Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 12 g, proporcja 4.
Czytnik mikropłytek	N/A	AMR-10	Pomiar absorbancji ELISA przy 450 nm.
Myjka do mikropłytek	N/A	APW-20	Etap płukania płytek ELISA.
Odwrotna transkryptaza MMLV	N/A	N/A	Enzym do odwrotnej transkrypcji.
Neutralna guma montażowa	Sinopharm Group	N/A	Medium montażowe dla preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną.
Sól fizjologiczna	N/A	N/A	Nośnik do zgłębnika dla grupy kontrolnej pustej, grupy sham i grupy modelowej.
Starter Oligo(dT)18	N/A	N/A	Stosowany do odwrotnej transkrypcji.
Penicylina	N/A	N/A	Profilaktyka przeciwzakażeniowa pooperacyjna. Dawka w źródle: 20 0 U/kg domięśniowo przez 3 dni.
Szybkowar	Xinfei	N/A	Wymieniony w chińskiej tabeli instrumentów.
Inhibitor proteaz	N/A	N/A	Dodawany podczas ekstrakcji białek.
Bufor do lizy białek	N/A	N/A	Ekstrakcja białek z tkanki kostnej do Western blotting.
Membrana PVDF	N/A	N/A	Membrana transferowa Western blot aktywowana metanolem.
Urządzenie do qRT-PCR	N/A	N/A	Ilościowa PCR z odwrotną transkrypcją dla EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP i GAPDH.
Zestaw ELISA CTX-1 dla szczura	Jiyinmei	JYM026Ra	Kanapkowy test ELISA dla telopeptydu C-końcowego kolagenu typu 1 w surowicy. Detekcja przy 450 nm.
Zestaw ELISA P1NP dla szczura	Jiyinmei	JYM0030Ra	Kanapkowy test ELISA dla propeptydu N-końcowego prokolagenu typu 1 w surowicy. Detekcja przy 450 nm.
Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang	Beijing Tongrentang	N/A	Komponent odżywiający Yin. Dawka w pełnej formule w źródle: 24 g, proporcja 8.
Przeciwciało pierwszorzędowe RhoA	Proteintech	N/A	Przeciwciało do Western blot. Rozcieńczenie w źródle: 1:20. Wymagany numer RRID i numer partii dla JoVE.
Para starterów RhoA	N/A	Produkt PCR 17 bp	Forward GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverse ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminologia ujednolicona z RHoA na RhoA.
Inhibitor RNazy	N/A	N/A	Uwzględniony w reakcji odwrotnej transkrypcji.
Woda wolna od RNaz	N/A	N/A	Rozpuszczanie RNA po wysuszeniu.
Mikrotom obrotowy	Leica	245	Sekcjonowanie histologiczne.
Przeciwciało wtórne do Western blotting	N/A	N/A	Rozcieńczenie w źródle: 1:1500. Wymagana reaktywność gospodarza i RRID dla JoVE.
Odtłuszczone mleko w proszku, 5%	N/A	N/A	Odczyn blokujący do Western blotting, temperatura pokojowa przez 2 h.
Maszyna do rozcierania i wypiekania preparatów	Jinhua Yidi	N/A	Przygotowanie szkiełek do histologii.
Pentobarbital sodowy, 3%	N/A	N/A	Znieczulenie końcowe przed pobraniem krwi z aorty brzusznej w chińskim dokumencie źródłowym. Ostateczna procedura eutanazji i metoda potwierdzenia muszą zostać zweryfikowane.
Standardowy rozcieńczalnik próbek	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Stosowany do seryjnego rozcieńczania standardów w procedurze ELISA.
Bufor TBST	N/A	N/A	Bufor do płukania w Western blotting.
Termostatyczny inkubator z wytrząsaniem	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	N/A	Inkubacja i wytrząsanie laboratoryjne.
Odczyn TRIzol	N/A	N/A	Ekstrakcja RNA z 10 mg tkanki kostnej.
Mikroskop pionowy	Leica	DM10	Obrazowanie histologiczne hematoksyliną i eozyną przy 200x.
Termostatyczny inkubator z płaszczem wodnym	N/A	GNP-9080	Inkubacja dla procedur analitycznych.
Rozpuszczalny w wodzie roztwór barwiący eozyną	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Kontrast barwiący w histologii. W procedurze źródłowej zastosowano 3-minutowe barwienie eozyną.
System elektroforezy Western blot	N/A	N/A	Rozdział białek. Elektroforeza w źródle: początkowo 80 V, następnie 120 V.
System obrazowania Western blot	N/A	N/A	Obrazowanie membran chemiluminescencyjnych. Do zgłoszenia wymagane są nieprzycięte membrany.
System transferu Western blot	N/A	N/A	Transfer białek na membranę PVDF. Warunki transferu w źródle: 40 mA, 90 min, kąpiel lodowa.
Ksylen	N/A	N/A	Odtłuszczanie i klarowanie tkanek podczas histologii.
Zioła składające się na pigułki Zuogui	Beijing Tongrentang	N/A	Formulacja z ośmiu ziół: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, żelatyna z plastronu Chinemys reevesii, Cyathula officinalis, Cuscuta australis i żelatyna z poroża Cervus elaphus.