Niniejsze badanie przedstawia zintegrowany schemat wizualizacji łączący standaryzowany pobór i przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, siedmioznacznikowy panel cytometrii przepływowej, multipleksowy test cytokinowy obejmujący 13 analitów oraz ujednolicony potok analizy.
Artykuł badawczy
Zintegrowana wizualizacja rekrutacji neutrofili oraz profilowania cytokin zapalnych w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) jest najłatwiej dostępną macierzą próbek do badania stanu zapalnego dolnych dróg oddechowych, jednak konwencjonalne analizy opierają się na cytometrii przepływowej z użyciem pojedynczych markerów w połączeniu z enzymatycznym testem immunoabsorpcyjnym (ELISA) przeprowadzanym dla każdego analitycznie osobno, co ogranicza gęstość informacji i zaciera powiązania między komórkami a czynnikami. Niniejsze badanie przedstawia zintegrowany schemat wizualizacji, który łączy standaryzowane pobieranie i wstępne przetwarzanie z siedmiomarkerowym panelem cytometrii przepływowej dla neutrofili i monocytów, multipleksowym testem cytokinowym dla 13 analitytów oraz jednolitym potokiem analizy opartym na jednorodnej aproksymacji i projekcji rozmaitości (UMAP), metaklastrowaniu FlowSOM, klastrowaniu hierarchicznym, sieciach korelacji Spearmana oraz analizie głównych składowych (PCA).
Przepływ pracy zastosowano w prospektywnej kohorcie jednocentrycznej obejmującej 12 dorosłych poddawanych bronchoskopii, w tym 64 pacjentów z mikrobiologicznie potwierdzoną infekcją płuc oraz 48 kontrolnych osób bez infekcji. Odczyty cytologiczne i cytometryczne z przepływem wykazały wyraźne przejście z profilu pęcherzykowego z dominacją makrofagów na profil z dominacją neutrofili podczas infekcji, przy czym odsetek neutrofili wzrósł z mediany 3,2% do 68,4%, a bezwzględna koncentracja neutrofili zwiększyła się około 50-krotnie. Profilowanie multipleksowe ujawniło skoordynowaną odpowiedź cytokinową składającą się z trzech modułów, w której moduły chemokin, prozapalne i regulacyjne były wszystkie upregulowane, a CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α i G-CSF wykazywały najsilniejszą dyskryminację pojedynczego markera w badanej kohorcie (pole pod krzywą [AUC] od 0,89 do 0,94). Zintegrowana wizualizacja z wykorzystaniem PCA, macierzy korelacji i grafu sieciowego ujawniła ściśle powiązaną oś neutrofile–chemokiny na poziomie uczestników, przy czym liczba neutrofili w BALF okazała się centralnym węzłem sieci.
Przepływ pracy wykorzystuje wyłącznie materiał rutynowo pozyskiwany podczas klinicznie wskazanych BAL, nie wymaga dodatkowej objętości próbki i zapewnia gęstą informacyjnie strukturę do analizy stanu zapalnego dróg oddechowych w infekcjach układu oddechowego, co może być możliwe do wdrożenia w laboratoriach opieki trzeciego stopnia wyposażonych w wieloparametrową cytometrię przepływową oraz platformy multiplex bead-array, z możliwością rozszerzenia na podłużne badania jednokomórkowe i oceny terapeutycznej. Szersze zastosowanie kliniczne poszczególnych analitytów jako biomarkerów będzie wymagało prospektywnej walidacji w niezależnych kohortach wieloośrodkowych.
Wprowadzenie
Zgony z powodu infekcji dolnych dróg oddechowych pozostają istotną przyczyną śmiertelności na świecie, mimo postępów w strategiach szczepień i metodach leczenia; dotyczy to zwłaszcza populacji dziecięcej i osób starszych1. Neutrofile są głównymi komórkami pojawiającymi się we wczesnych etapach wrodzonej odpowiedzi odpornościowej w dotkniętym układzie oddechowym, co jest procesem kluczowym dla eliminacji wnikającego patogenu; jednak niekontrolowany stan zapalny z udziałem neutrofili prowadzi do przerwania bariery włośniczkowo-pęcherzykowej, uszkodzeń oksydacyjnych tkanek oraz rozwoju zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS)2,3. Neutrofile w przestrzeni powietrznej płuc wykazują również kinetykę rekrutacji, wzorce retencji oraz zachowanie efektorowe, które różnią się od tych w innych tkankach, a różnice te wpływają na to, czy infekcja ustąpi, czy rozwinie się w ciężkie zapalenie płuc4.
Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) stanowi ważne źródło informacji o mikrośrodowisku pęcherzyków płucnych i oferuje najbliższe odwzorowanie odporności klinicznej w tym obszarze5. Chemokina CXCL8 odgrywa kluczową rolę w rekrutacji neutrofili do płuc za pośrednictwem swoich receptorów, CXCR1 i CXCR2, wraz z innymi chemokinami, w tym CXCL1, CXCL2 i CXCL56. Cytokiny IL-1β, IL-6 i TNF-α dodatkowo wzmacniają ten proces, podczas gdy IL-10 działa jako cytokina przeciwstawna. Wykazano, że ich poziomy w BALF korelują z ciężkością infekcji płuc oraz rozwojem powikłań płucnych wynikających z bakteryjnego, wirusowego i atypowego zapalenia płuc7, a multipleksowe profile biomarkerów BALF są wdrażane w celu wcześniejszej diagnostyki i różnicowania patogenów w infekcjach dolnych dróg oddechowych8.
Rutynowe badania BALF zazwyczaj nie obejmują w pełni biologii leżącej u podstaw testu. Liczbę komórek można oszacować poprzez manualne różnicowanie komórek w próbkach z cytocentryfugi, podczas gdy mediatorów rozpuszczalnych mierzy się za pomocą poszczególnych testów enzymatycznych ELISA, a wyniki przedstawia w formie wykresu słupkowego. Chemokiny, cytokiny i każdy typ komórek są oceniane osobno, bez ustanowienia korelacji między konkretnym gradientem stężenia chemokiny a populacjami komórek, na które ona wpływa w próbce. Połączenie modułów cytokin, relacji dawka-odpowiedź między chemokinami a neutrofilami oraz subpopulacji pacjentów z ich własnymi sygnaturami zapalnymi jest często pomijane w przypadku braku analizy wielowymiarowej9.
Postępy w dziedzinie obliczeń sprawiają, że takie holistyczne podejście staje się coraz bardziej realistyczne. Połączenie wieloparametrycznej cytometrii przepływowej i spektralnej cytometrii przepływowej z metodami redukcji wymiarowości, takimi jak t-rozproszone osadzanie sąsiadów stochastycznych (t-SNE) lub jednolita aproksymacja i projekcja rozmaitości (UMAP), pozwala na mapowanie wysokowymiarowych fenotypów immunologicznych w przestrzeni dwuwymiarowej, przy czym UMAP wykazuje lepsze zachowanie topologii globalnej i powtarzalność w zastosowaniach do danych cytometrycznych10. Panele wieloanalityczne cytokin, a następnie klasteryzacja hierarchiczna i sieci korelacyjne, pomagają w identyfikacji sygnatur skorelowanych z ciężkością stanu, których nie można wykryć za pomocą podejść opartych na pojedynczych cytokinach1. Pomimo postępów w tej dziedzinie, żaden schemat postępowania nie łączy jeszcze tych metod w celu badania rekrutacji neutrofili i sygnatur cytokin z tych samych próbek BALF w przebiegu infekcji dróg oddechowych. Niniejsze badanie opisuje zintegrowany schemat wizualizacji do badania rekrutacji neutrofili z wykorzystaniem cytologii i wieloparametrycznej cytometrii przepływowej, a następnie analiz UMAP i sygnatur cytokin za pomocą wieloparametrycznego testu immunoenzymatycznego, wraz z klasteryzacją hierarchiczną, macierzami korelacji i analizą głównych składowych. Schemat ten pozwala na uzyskanie zintegrowanej wizualizacji, która obejmuje komórkowe i rozpuszczalne odczyty immunologiczne dróg oddechowych na jednym wykresie, z wykorzystaniem próbek BALF rutynowo pobieranych podczas klinicznie wskazanej bronchoskopii w zakażeniach dolnych dróg oddechowych.
Protokół
Populacja badana i etyka
Było to jednorodne, prospektywne badanie obserwacyjne przeprowadzone w trzeciostopniowym szpitalu dydaktycznym między styczniem 2026 a kwietniem 2026 roku. Protokół został zatwierdzony pod numerem 2026HL-038, a od każdego uczestnika przed przystąpieniem do jakichkolwiek procedur badawczych uzyskano pisemną świadomą zgodę.
Do badania kolejno rekrutowano osoby dorosłe w wieku od 18 do 75 lat, którym w ramach rutynowej opieki klinicznej przeprowadzono diagnostyczną elastyczną bronchoskopię z płukaniem pęcherzykowym (BAL). Pacjentów przydzielono do grupy zakażonej lub kontrolnej bez zakażeń na podstawie ostatecznych diagnoz klinicznych i mikrobiologicznych. Przegląd zintegrowanego procesu wizualizacji, od rekrutacji pacjentów po zintegrowane wyniki wizualne, przedstawiono na Rysunku 1.
Rysunek 1: Przegląd zintegrowanego procesu wizualizacji profilowania rekrutacji neutrofili i odpowiedzi cytokin zapalnych w płycie BALF. Pięć etapów podsumowuje, od lewej do prawej: prospektywną rekrutację grup zakażonych i kontrolnych z przeprowadzeniem bronchoskopii i BAL, przygotowanie BALF poprzez wydzielenie osadu komórkowego i frakcji nadsączu, równoległe pomiary komórkowe (cytologia Wrighta-Giemsy i wieloparametrowa cytometria przepływowa) oraz rozpuszczalne (bead-based immunoassay 13-pleks), zunifikowany potok wizualizacji (UMAP z meta-klasteryzacją FlowSOM, hierarchiczna mapa ciepła, analiza głównych składowych i sieć korelacji Spearmana) oraz zintegrowany wynik wizualny. Skróty: BAL = bronchoalveolar lavage (płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe); BALF = BAL fluid (płyn z BAL); UMAP = uniform manifold approximation and projection. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Kryteria włączenia do grupy zakażonej były następujące: (1) pacjenci z rozpoznaniem zapalenia płuc nabytego poza szpitalem (CAP), zapalenia płuc nabytego w szpitalu (HAP) lub zapalenia płuc związanego z wentylacją mechaniczną (VAP) zgodnie z wytycznymi Infectious Diseases Society of America (IDSA) i American Thoracic Society (ATS); (2) wykrycie jednego lub więcej patogenów poprzez hodowlę BALF ≥104 jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL, oddechowy multiplex polymerase chain reaction (PCR), metagenomiczne sekwencjonowanie następnej generacji BALF lub specyficzne testy antygenowo-przeciwciałowe z parowanych próbek z dróg oddechowych i surowicy.
Kryteria grupy kontrolnej były następujące: (1) nieinfekcyjne wskazania do bronchoskopii, obejmujące ocenę niejednoznacznego guzka płucnego, nieprawidłowe wyniki radiologiczne niewskazujące na infekcję lub badanie w kierunku przewlekłego kaszlu; (2) brak ostrej infekcji płuc potwierdzony ujemnymi wynikami badań mikrobiologicznych oraz brak jakichkolwiek oznak stanu zapalnego lub ogólnoustrojowej infekcji w momencie wykonywania bronchoskopii; oraz (3) brak stosowania antybiotyków w ciągu 30 dni przed udziałem w badaniu. Grupę kontrolną zrekrutowano spośród pacjentów poddawanych bronchoskopii z powodu innych klinicznie uzasadnionych schorzeń płuc, a nie spośród zdrowych ochotników, co odzwierciedla populację, w której rutynowo pobiera się BAL ze wskazań klinicznych w ośrodku badawczym.
Kryteria wykluczenia obejmowały: (1) nowotwór złośliwy i/lub chemioterapię cytotoksyczną w ciągu ostatnich sześciu miesięcy; (2) seropozywność w kierunku HIV; (3) przeszczep narządu litego lub komórek macierzystych krwiotwórczych; (4) przewlekłą terapię immunosupresyjną z codzienną dawką ekwiwalentu prednizonu > 0,3 mg/kg przez ponad 3 tygodnie; (5) kobiety w ciąży/karmiące piersią; (6) nadkecalność krwawiczą w wywiadzie lub jakiekolwiek przeciwwskazania do elastycznej bronchoskopii; (7) istniejącą ciężką przewlekłą chorobę dróg oddechowych (przewlekła obturacyjna choroba płuc [COPD] w stadium III/IV według Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD], idiopatyczne włóknienie płuc, ciężka astma uporczywa lub klinicznie istotne rozstrzenie oskrzeli); (8) aktywną gruźlicę; (9) udział w innym badaniu interwencyjnym w ciągu ostatnich 30 dni. BAL wykonano podczas pierwszej bronchoskopii, w ciągu 72 h od przyjęcia z powodu infekcji oraz w ciągu 48 h od intubacji u pacjentów wentylowanych mechanicznie z infekcjami.
Obliczenia wielkości próby skupiły się na głównym punkcie końcowym na poziomie komórkowym: liczbie neutrofili w BALF pomiędzy grupami. Przy przewidywanej wielkości efektu wynoszącej 0,6 SD między drogami oddechowymi zainfekowanymi a niezainfekowanymi oraz przy uwzględnieniu 15% dopuszczalnego odsetka osób wycofujących się, do uzyskania dwustronnej wartości α = 0,05 przy 80% mocy statystycznej wymagana była minimalna wielkość próby wynosząca 45 obiektów na grupę. Spośród 156 kwalifikujących się kandydatów 27 nie spełniło kryteriów kwalifikowalności (18 nie spełniło kryteriów włączenia, głównie z powodu niemożności zidentyfikowania czynnika patogennego odpowiedzialnego za chorobę w określonym czasie lub braku zgody na samą procedurę; 9 spełniło kryteria wykluczenia, przede wszystkim ze względu na aktywny proces nowotworowy lub historię podawania chemioterapii, przewlekłe stosowanie kortykosteroidów, ciężką istniejącą przewlekłą chorobę płuc lub skłonność do krwawień). Pozostałych 129 uczestników poddano bronchoskopii. Następnie 17 obiektów wycofano z badania (7 z powodu niewystarczającej wydajności BALF < 40%; 4 z powodu wycofania zgody podczas hospitalizacji oraz 6 z powodu reklasyfikacji obiektów po końcowej ocenie mikrobiologicznej – 4 kandydatów z grupy kontrolnej zdiagnozowano z utajoną infekcją na podstawie wyników hodowli, a u 2 kandydatów z grupy infekcji zabrakło dowodów na infekcję po analizie hodowli). Ostateczna grupa badawcza objęła 112 uczestników: 64 z infekcją i 48 bez infekcji.
Pobieranie i wstępne przetwarzanie BALF
Bronchoskopię przeprowadzili doświadczeni operatorzy zgodnie ze standardowym protokołem instytucjonalnym, spójnym z opublikowanymi zaleceniami technicznymi dotyczącymi płukania oskrzelowo-pęcherzykowego12. Lidokainę zastosowano miejscowo, a pacjenci otrzymali umiarkowaną sedację dożylną przy jednoczesnym podawaniu tlenu uzupełniającego w celu utrzymania saturacji tlenem (SpO₂) >92%. Elastyczny bronchoskop wprowadzono i umieszczono w segmencie oskrzelowo-płucnym z nieprawidłowościami radiologicznymi. W przypadkach, gdy zmiany radiologiczne były rozlane lub niemożliwe do zlokalizowania, wybrano prawy płat środkowy lub segmenty języczkowe lewego płata. Po każdym wlewie wykonywano delikatne ssanie manualne z ciśnieniem ujemnym < 100 mmHg. Podano łącznie od trzech do pięciu wlewów sterylnej soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C, po 20–40 mL każdy, co dało całkowitą objętość 100–150 mL. Współczynnik odzysku oszacowano jako objętość odzyskaną w stosunku do objętości wlanej; do analizy zakwalifikowano jedynie próbki o odzysku ≥40%.
Zebrane próbki z drugiego i kolejnych płukań połączono, aby zmniejszyć zanieczyszczenie oskrzelowe i uzyskać próbkę wzbogaconą w komórki pęcherzyków płucnych. Połączony płyn z płukania bronchoalveolarnego (BALF) przechowywano w lodzie i przetwarzano w ciągu 2 h od pobrania, biorąc pod uwagę niedawne doniesienia dotyczące zmian w składzie komórkowym i różnicowaniu liczby komórek po przedłużonym przechowywaniu i ogrzewaniu próbek ludzkiego BALF13. Po filtracji przez sterylną nylonową siatkę o rozmiarze oczek 70 micronów w celu usunięcia śluzu, przeprowadzonej wyłącznie poprzez przejście mechaniczne bez dodawania środków mukolitycznych lub zapobiegających grudkowaniu, takich jak ditiotreitol (ponieważ testy pilotażowe wykazały, że jest to wystarczające do usunięcia grudek śluzu bez mierzalnej utraty integralności epitopów powierzchniowych w dalszych etapach), płyn poddano wirowaniu przy 400 × g przez 10 min w 4 °C. Nadpłyn odlano i podzielono na aliquoty w probówkach kriogenicznych o niskim wiązaniu białek do analizy cytokin, a komórki zawieszono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z 0,5% albuminy surowicy bydlęcej i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), przy czym część z nich zachowano do badania cytologicznego i cytometrii przepływowej. Próbki cytokin zamrożono w ciekłym azotcie, przechowywano w temperaturze –80 °C i poddano nie więcej niż jednemu cyklowi zamrażania i rozmrażania przed użyciem.
Cytologia neutrofili i ilościowe oznaczanie metodą cytometrii przepływowej
W zakresie cytopatologii 100 µL zawiesiny komórkowej BALF naniesiono na szkiełko przedmiotowe za pomocą cytocentryfugi (patrz Tabela materiałów) przy 300 × g przez 5 min, wysuszono na powietrzu i zabarwiono metodą Wrighta-Giemsy. Różnicowe obliczenia wykonano przez technika hematologii nieznającego historii choroby pacjenta, który policzył minimum 400 komórek na szkiełku i obliczył wartości procentowe makrofagów, limfocytów, neutrofili i eozynofili. Procentowa zawartość neutrofili w BALF została uznana za główny parametr oceny w cytopatologii, biorąc pod uwagę aktualne dowody sugerujące ich użyteczność w rozróżnianiu zakaźnych i niezakaźnych chorób płuc u pacjentów z naciekami płucnymi14.
Protokół kwantyfikacji metodą cytometrii przepływowej oparto na niedawnej walidacji protokołu różnicowania leukocytów w płynie z wymywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) z wykorzystaniem czterech barwników15, uzupełniając go o dodatkowe markery służące do identyfikacji neutrofili. Konkretnie, około 5 × 105 komórek wyizolowanych z BALF blokowano odczynnikiem blokującym ludzkie receptory Fc (patrz Tabela materiałów) przez 10 min w temperaturze 4 °C, a następnie barwiono przez 20 min w 4 °C przeciwciałami przeciwko CD45 (klon HI30), CD66b (klon G10F5), CD15 (klon HI98), CD16 (klon 3G8), CD11b (klon ICRF44), CD14 (klon M5E2) oraz HLA-DR (klon L243), stosując dodatkowo barwnik do oceny żywotności z możliwością utrwalenia (patrz Tabela materiałów). Do lizy erytrocytów wykorzystano komercyjny roztwór do lizy erytrocytów (patrz Tabela materiałów) przez 10 min w temperaturze pokojowej. Po lizie erytrocytów komórki przemyto dwukrotnie w PBS uzupełnionym o 2% płodowej surowicy cielęcej i resuspenderowano w buforze do cytometrii, a następnie przeanalizowano za pomocą wielokolorowego cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów). Kompensację przeprowadzono z użyciem kulek kompensacyjnych barwionych pojedynczo (patrz Tabela materiałów), a dla każdego panelu uwzględniono próbki z pominięciem jednego fluorochromu (FMO) oraz próbki niebarwione.
Dla każdej próbki zarejestrowano co najmniej 1 × 105 zdarzeń CD45⁺. W pierwszej kolejności wyznaczono bramkę dla singletów na wykresie FSC-A/FSC-H, następnie dla żywych (barwnik żywotności⁻) leukocytów CD45⁺, po czym przeprowadzono wykluczenie monocytów-makrofagów CD14⁺HLA-DR⁺, aby wyselekcjonować granulocyty CD66b⁺ o wysokim rozproszeniu bocznym. Neutrofile zdefiniowano następnie w populacji granulocytów jako zdarzenia CD15⁺CD16⁺CD11b⁺. Główna bramka dla granulocytów CD66b⁺ została wyznaczona szeroko wokół wszystkich zdarzeń o wysokim rozproszeniu bocznym, a nie ograniczono jej do granicy CD15⁺CD16⁺CD11b⁺, tak aby neutrofile aktywowane (CD16-dim, CD11b-high) oraz inne mniej dojrzałe formy granulocytów pozostały w całkowitej zautomatyzowanej liczbie neutrofili; bardziej rygorystyczna definicja CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ została zastosowana wyłącznie do charakterystyki podgrupy dojrzałych neutrofili, raportowanej oddzielnie w późniejszych analizach klastrowych. Liczbę neutrofili w BALF (komórki/µL) oszacowano na podstawie procentowej zawartości neutrofili oraz całkowitej liczby komórek jądrzastych określonej za pomocą zautomatyzowanego analizatora hematologicznego (patrz Tabela materiałów). Macierze kompensacji, strategia bramkowania oraz raporty kontroli jakości dla poszczególnych próbek zostały zarchiwizowane, a analitycy nie znali przydziału uczestników do grup podczas akwizycji i analizy.
Multiplexowe profilowanie cytokin zapalnych
Nadpłyny BALF rozmrożono raz na kruszonej lodzie, po czym krótko wymieszano w wortexie i klarowano poprzez wirowanie przy 10,000 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C bezpośrednio przed analizą. Pomiar 13 analitów w trzech kategoriach funkcjonalnych przeprowadzono z wykorzystaniem platformy do multipleksowych testów immunoenzymatycznych opartych na kuleczkach, z zastosowaniem niestandardowego panelu kuleczek magnetycznych (patrz Tabela materiałów). Grupa prozapalna obejmowała IL-1β, IL-6, IL-17A oraz TNF-α; grupa chemokin obejmowała CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 oraz CCL3/MIP-1α; natomiast grupa regulacyjna obejmowała IL-10, IFN-γ, IL-1RA oraz G-CSF. Wybór analitów oparto na tych, które najczęściej opisywano jako informacyjne w analizach multipleksowych cytokin w BALF lub surowicy w badaniach nad zapaleniami płuc/ciężkimi infekcjami dróg oddechowych7,11. Współczynnik rozcieńczenia (1:2 w buforze do testu) określono na podstawie eksperymentu pilotażowego przeprowadzonego na reprezentatywnym podzbiorze próbek zakażonych i kontrolnych, aby zapewnić, że >90% pomiarów mieściło się w zakresie krzywej wzorcowej.
Krzywe wzorcowe wyznaczono przy użyciu siedmiopunktowych rozcieńczeń seryjnych rekombinowanych standardów producenta, przygotowanych w dwóch powtórzeniach na każdej płytce, wraz z jedną studnią kontrolną (blank) w celu odjęcia tła. Dopasowanie krzywej przeprowadzono za pomocą regresji logistycznej pięcioparametrowej (5PL) przy użyciu autorskiego oprogramowania do akwizycji i analizy danych urządzenia (patrz Tabela materiałów). Dolną granicę oznaczalności (LLOQ) obliczono jako najmniejszą ilość standardu dającą odzysk z dopasowania wstecznego (back-fit recovery) w zakresie od 80% do 120% oraz wewnątrzseryjny współczynnik zmienności (CV) ≤ 20%. Wartości poniżej LLOQ zastąpiono wartością LLOQ/√2. Dwie połączone próbki kontroli jakości płynu z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), pochodzące odpowiednio od reprezentatywnego pacjenta zakażonego oraz od osoby zdrowej, zostały podzielone na alikwoty i dodane do każdej płytki w celu monitorowania długoterminowej wydajności. Standardy zapewnienia jakości oparto na zaleceniach dotyczących najlepszych praktyk wynikających z 12-letniego wieloośrodkowego programu oceny biegłości w badaniach multiplex opartych na koralikach16, obejmujących wymogi takie jak CV wewnątrzanalizy ≤ 10% w studniach powtórzonych, CV między płytkami ≤ 20% dla kontroli jakości oraz minimalna liczba koralików ≥ 50 na analityt w studni. Płytki, które nie spełniły powyższych kryteriów, poddano ponownemu badaniu. Analizę przeprowadzono w jednej serii w ciągu czterech tygodni, przy użyciu jednej partii zestawu, z randomizowanym przeplataniem próbek zakażonych i kontrolnych.
Procedura analizy wizualizacji
Pliki standardu cytometrii przepływowej (FCS) przeanalizowano wstępnie za pomocą komercyjnego oprogramowania do cytometrii przepływowej (patrz Tabela materiałów>) w celu kompensacji i wyznaczenia bramek dla żywych singletów CD45⁺, a następnie wyeksportowano do obiektywnej analizy w programie R v4.4. Dla każdej próbki pobrano podpróbkę 10 000 zdarzeń CD45⁺ i połączono je, a intensywność sygnału przekształcono za pomocą funkcji arcsinh z współczynnikiem 150. Redukcję wymiarowości i projekcje UMAP przeprowadzono przy użyciu pakietu uwot dla 15 najbliższych sąsiadów i minimalnej odległości 0,1, wraz z równoległymi osadzeniami t-SNE przy użyciu pakietu Rtsne z perplexity 3010. Klastry fenotypowe zidentyfikowano za pomocą FlowSOM z 100 węzłami samoorganizującej się mapy, a następnie podzielono na 12–15 klastrów poprzez meta-klasteryzację, stosując podejście oparte na optymalizacji, które zostało niedawno zwalidowane dla wielowymiarowych danych cytometrycznych17. Każdy klaster zaanotowano na podstawie mediany ekspresji markerów linii i aktywacji, a następnie zweryfikowano w odniesieniu do bramkowanych ręcznie populacji.
Do analizy danych dla wielu cytokin (multiplex) zastosowano najpierw transformację log₁₀ wartości surowych, a następnie ustandaryzowano je pomiędzy analitytami za pomocą oceny z przed przeprowadzeniem dalszych analiz. Zarówno analityty, jak i pacjenci zostali poddani klasteryzacji hierarchicznej z wykorzystaniem odległości euklidesowej i metody łączenia Ward.D2; wyniki przedstawiono na mapie ciepła z klasteryzacją wierszy i kolumn. Takie podejście zastosowano w celu wykrycia współwyrażanych modułów cytokin i klasyfikacji podgrup pacjentów w kohortach zapalnych analizowanych metodą multiplex9. Macierze korelacji dla wszystkich komórkowych i rozpuszczalnych biomarkerów wygenerowano, stosując parzyste korelacje rang Spearmana. Mapy ciepła macierzy korelacji sporządzono wraz z siecią, w której węzły odpowiadają biomarkerom, a krawędzie wskazują korelacje, które pozostały istotne po korekcie na wielokrotne testowanie metodą Benjamini–Hochberg (BH). Szerokość krawędzi skalowano zgodnie z wartością bezwzględną współczynnika korelacji |ρ|, a krawędzie uwzględniono tylko wtedy, gdy |ρ| ≥ 0.30 i p < 0.05 po korekcie. Analizę głównych składowych (PCA) przeprowadzono na ustandaryzowanej macierzy zawierającej komórki i cytokiny, używając funkcji prcomp() ze skalowaniem wariancji jednostkowej. Uczestników rzutowano na dwie pierwsze główne składowe z nałożeniem grup zakażonych i kontrolnych. Spójne próbkowanie w dół (downsampling) oraz standaryzacja wszystkich analiz zapewniły porównywalność odczytów biomarkerów komórkowych i rozpuszczalnych we wszystkich wizualizacjach.
Analiza statystyczna
Zmienne ciągłe opisano za pomocą mediany (rozstęp międzykwartylowy, IQR) w przypadku rozkładu nienormalnego według testów Shapiro-Wilka oraz średniej (odchylenie standardowe, SD) w pozostałych przypadkach. Zmienne kategoryczne opisano za pomocą częstości i proporcji. Porównania między grupami przeprowadzono za pomocą testu U Manna-Whitneya, gdy zmienne ciągłe miały rozkłady nienormalne, testu t Welcha, gdy zmienne ciągłe miały rozkład normalny, oraz testu chi-kwadrat/dokładnego testu Fishera w przypadkach odpowiednich dla zmiennych kategorycznych. Zależności między zmiennymi ciągłymi oceniono za pomocą współczynnika korelacji rang Spearmana. Aby uwzględnić stopień fałszywych odkryć (FDR) w analizach korelacji i analizach multipleksowych cytokin, wartości p skorygowano metodą Benjamini-Hochberga z wartością graniczną q < 0,05. W wszystkich analizach głównych za statystycznie istotne uznano dwustronne p < 0,05. Tam, gdzie było to możliwe, przypadki z brakującymi danymi w poszczególnych zmiennych zachowano i poddano analizie przypadków kompletnych dla danej zmiennej, natomiast w celu przeprowadzenia analizy wrażliwości zastosowano wielokrotną imputację za pomocą równań łańcuchowych (m = 20). Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) oraz odpowiadająca im powierzchnia pod krzywą (AUC) zostały wygenerowane dla poszczególnych cytokin przy użyciu pakietu pROC w całej kohorcie badania; nie zastosowano oddzielnej zewnętrznej kohorty walidacyjnej. Wstępnie określone analizy wrażliwości powtórzyły główne porównania grup po wykluczeniu uczestników, którzy otrzymali antybiotyki w ciągu 72 h przed bronchoskopią, oraz po stratyfikacji grupy infekcyjnej ze względu na stan wentylacji mechanicznej i podtyp zapalenia płuc (pozyszpitalne, szpitalne lub związane z wentylacją mechaniczną). Analizy przeprowadzono przy użyciu pakietów rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC oraz mice w programie R v4.4. Rysunki wygenerowano przy użyciu komercyjnego oprogramowania do wykresów naukowych (patrz Tabela materiałów).
Wyniki
Populacja badawcza i charakterystyka próbek
W końcowej kohorcie analizy znalazło się 112 osób, w tym 64 osoby w grupie z infekcją oraz 48 osób w kontrolnej grupie bez infekcji. Dane demograficzne wyjściowe były podobne w obu grupach, natomiast parametry laboratoryjne związane z infekcją były wyższe w grupie z infekcją, co przedstawiono w Tabeli 1. Infekcje były powodowane głównie przez bakterie Gram-ujemne, a głównymi patogenami bakteryjnymi były Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa oraz Acinetobacter baumannii. Inne patogeny obejmowały Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, czynniki atypowe, wirusy oraz infekcje mieszane.
Wskaźniki odzysku BALF spełniły wcześniej określony próg ≥40% dla wszystkich zachowanych próbek, przy czym w grupie infekcyjnej wskaźniki te były nieco niższe w porównaniu z grupą kontrolną (mediana 48,3% vs 53,3%, p = 0,03), co jest zgodne ze zwiększonym stanem zapalnym dróg oddechowych i przekrwieniem błony śluzowej w zakażonych drogach oddechowych. Ponieważ odzyskana objętość również różniła się między grupami (58 mL vs 64 mL, p = 0,04), wszystkie raportowane stężenia cytokin mogą podlegać niewielkiej różnicy międzygrupowej w czynniku rozcieńczenia; wcześniej określona analiza wrażliwości ograniczona do próbek ze wskaźnikiem odzysku ≥50% (n = 42 infekcja, n = 34 kontrola) powtórzyła kierunek i wielkość każdego porównania międzygrupowego (największa zmiana wielkości efektu < 8%), co wskazuje, że błąd rozcieńczenia prawdopodobnie nie odpowiada za zaobserwowane różnice. Czas między pobraniem a przetworzeniem wynosił 65 min dla grupy infekcyjnej i 62 min dla grupy kontrolnej, mieszcząc się w 2-godzinnym oknie czasowym. Kryteria kontroli jakości (QC) na poziomie próbek wskazały na wyniki wysokiej jakości. Różnicowe obliczenia cytologiczne uzyskano na podstawie ≥400 policzonych komórek we wszystkich 112/112 próbkach (100%). Akwizycje z cytometrii przepływowej spełniły wcześniej określone kryterium ≥1 × 105 zdarzeń CD45⁺ we wszystkich 112/112 próbkach (100%), przy medianie żywotności żywych komórek wynoszącej 89,4% (IQR 85,6–92,8%). Wszystkie płytki do multipleksowej analizy cytokin spełniły kryteria QC po jednym powtórzeniu pomiaru. Dla wszystkich 13 analitów wewnątrzassayowy współczynnik zmienności (CV) wyniósł 4,7% (2,1–9,3%, wszystkie <10%), między-płytkowy CV dla połączonych próbek QC wyniósł 11,2% (6,8–18,4%, wszystkie <20%), a mediana liczby kulek wyniosła 78 zdarzeń/analit/dołek (53–142, wszystkie ≥ 50).
| Zmienna | Zakażenie (n = 64) | Grupa kontrolna (n = 48) | wartość p |
| Wiek, lata, mediana [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| Mężczyźni, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BMI, kg/m²2, mediana [IQR] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| Historia palenia, n (%) | 0.52 | ||
| Nigdy | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| Poprzedni | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| Aktualny | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| Nadciśnienie tętnicze, n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| Cukrzyca, n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| Choroba wieńcowa, n (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| Przewlekła choroba nerek, n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| Wskazania do bronchoskopii, n (%) | — | ||
| Zapalenie płuc nabyte poza szpitalem | 35 (54.7) | — | |
| Zapalenie płuc nabyte w szpitalu | 19 (29.7) | — | |
| Zapalenie płuc związane z wentylacją mechaniczną | 10 (15.6) | — | |
| Guzek płuca o nieokreślonym charakterze | — | 23 (47.9) | |
| Utrwalająca się nieprawidłowość radiologiczna | — | 15 (31.3) | |
| Ocena przewlekłego kaszlu | — | 10 (20.8) | |
| Patogen sprawczy, n (%) | — | ||
| Bakterie Gram-ujemne | 28 (43.8) | ||
| Bakterie Gram-dodatnie | 16 (25.0) | ||
| Patogeny atypowe | 7 (10.9) | ||
| Wirusy układu oddechowego | 8 (12.5) | ||
| Zakażenie mieszane | 5 (7.8) | ||
| Wentylacja mechaniczna podczas BAL, n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| Stosowanie antybiotyków w ciągu 72 h przed BAL, n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| Objętość podana, mL, mediana [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| Odzyskana objętość, ml, mediana [IQR] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| wskaźnik odzysku BALF, %, mediana [IQR] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| Czas przetwarzania, min, mediana [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| Liczba leukocytów we krwi, × 10⁹/L, mediana [IQR] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| Neutrofile we krwi, %, mediana [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| Białko C-reaktywne, mg/L, mediana [IQR] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| Prokalcytonina, ng/ml, mediana [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
Tabela 1: Charakterystyka demograficzna, kliniczna i parametry przetwarzania BALF w kohorcie badawczej. Porównano bazowe cechy demograficzne, choroby współistniejące, wskazania do bronchoskopii, patogeny sprawcze, parametry procedury oraz laboratoryjne wartości krwi obwodowej pomiędzy 64 uczestnikami w grupie z zakażeniem a 48 w kontrolnej grupie bez zakażenia. Zmienne ciągłe przedstawiono jako medianę [rozstęp międzykwartylowy] i porównano za pomocą testu U Mann-Whitneya; zmienne kategoryczne przedstawiono jako n (%) i porównano za pomocą testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera, gdzie było to właściwe. Skróty: BAL = płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe; BALF = płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego; BMI = wskaźnik masy ciała; IQR = rozstęp międzykwartylowy; WBC = liczba białych krwinek.
Wizualizacja rekrutacji neutrofili do BALF
U osobników zakażonych zaobserwowano wyraźną zmianę stosunku populacji zdominowanej przez makrofagi na populację zdominowaną przez neutrofile, co przedstawiono na Ryc. 2. Preparaty z cytocentryfy zabarwiono metodą Wrighta-Giemsy, a barwienie wykazało wyraźną różnicę między obiema grupami: w grupie kontrolnej stwierdzono więcej makrofagów pęcherzykowych, niektóre limfocyty i kilka neutrofili, natomiast w grupie zakażonej dominowały neutrofile z licznymi bakteriami wewnątrzkomórkowymi, zdegenerowanymi jądrami i ziarnistościami toksycznymi. Do weryfikacji różnic wykorzystano różnicowe obliczenia liczby komórek na podstawie zliczenia co najmniej 400 komórek, przy czym odsetek neutrofili wzrósł z wartości mediany 3,2% (IQR: 1,8–5,6%) w grupie kontrolnej do 68,4% (IQR: 49,2–82,5%) w grupie zakażonej (p < 0,001), podczas gdy odsetek makrofagów pęcherzykowych spadł z 88,2% (IQR: 82,4–92,5%) do 22,6% (IQR: 12,3–38,5%) (p < 0,001). Procentowa zawartość limfocytów była podobna w obu grupach (7,4% [4,8–11,3%] vs 6,5% [3,4–11,2%], p = 0,42).
Analizy bramkowania i redukcji wymiarowości potwierdziły i rozszerzyły fenotypy komórkowe zaobserwowane podczas mikroskopii. Po wykluczeniu debrisów, dubletów i martwych komórek, granulocyty CD45⁺CD66b⁺ stanowiły medianę 65,8% (IQR: 46,2–79,4%) leukocytów CD45⁺ w grupie z infekcją w porównaniu do 4,1% (IQR: 2,3–6,8%) w grupie kontrolnej (p < 0,001). W obrębie populacji granulocytów, dojrzałe neutrofile CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ stanowiły 92,4% (IQR: 87,5–95,8%) wszystkich granulocytów w grupie z infekcją w porównaniu do 88,6% (IQR: 82,3–93,5%) w grupie kontrolnej, co wskazuje, że zrekrutowana pula neutrofili składała się głównie z dojrzałych, w pełni zróżnicowanych komórek, a nie z wczesnych prekursorów. Projekcje UMAP i t-SNE oparte na macierzy białek powierzchniowych po transformacji arcsinh wykazały niemal identyczną topologię, w której przypadki infekcji zajmowały rozległą wyspę dojrzałych neutrofili CD15⁺CD16⁺CD11b⁺, która była słabo zasiedlona w próbkach kontrolnych, podczas gdy wyspa makrofagów pęcherzykowych HLA-DR⁺CD14⁺ wykazała odwrotny wzorzec, będąc gęsto zasiedloną w kontrolach i słabo zasiedloną w infekcjach. Meta-klasteryzacja za pomocą FlowSOM zidentyfikowała 13 subpopulacji, wśród których subpopulacja dojrzałych neutrofili (38,4% [22,6–56,2%] vs 2,8% [1,5–4,6%], p < 0,001) oraz klaster aktywowanych neutrofili CD16-dim CD11b-high (22,6% [11,4–32,5%] vs 0,4% [0,1–1,2%], p < 0,001) wykazały największy wzrost liczebności między grupami.
W odniesieniu do absolutnej liczby neutrofili, w grupie zakażonej odnotowano około 50-krotny wzrost liczby neutrofili w BALF w porównaniu z grupą kontrolną. Całkowita liczba komórek jądrowych na µL BALF wzrosła ze 156 cells/µL (IQR 88–232) w grupie kontrolnej do 384 cells/µL (IQR 180–712) w grupie zakażonej (p < 0.001), a liczba neutrofili wzrosła z 5 cells/µL (IQR 2–13) w grupie kontrolnej do 262 cells/µL (IQR 89–578) w grupie zakażonej (p < 0.001). Różnice parzyste w procencie i absolutnej liczbie neutrofili między grupami pozostały wysoce istotne po korekcie Benjamini–Hochberg (BH) (q < 0.001).
Rysunek 2: Wizualizacja rekrutacji neutrofili w BALF. Reprezentatywne pola cytospinowe barwione metodą Wrighta-Giemsy od uczestnika z grupy kontrolnej oraz uczestnika zakażonego ilustrują przejście z profilu komórkowego BALF z przewagą makrofagów do profilu z przewagą neutrofili. Obok siebie przedstawiono: czterostopniową strategię bramkowania w cytometrii przepływowej (singlety FSC → żywe leukocyty CD45⁺ → granulocyty CD66b⁺ po wykluczeniu CD14⁺HLA-DR⁺ → dojrzałe neutrofile CD15⁺CD16⁺CD11b⁺), rzutowanie UMAP danych z cytometrii przepływowej po transformacji arcsinh z nałożonymi 13 metaklastrami FlowSOM w kolorach odpowiadających adnotacjom biologicznym oraz wykresy pudełkowe procentowej zawartości neutrofili w BALF i absolutnej koncentracji neutrofili (komórki/µL, skala logarytmiczna), co pozwala na bezpośrednie porównanie fenotypów komórkowych zidentyfikowanych w grupach zakażonej i kontrolnej. Skróty: BALF = płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego; FSC = rozproszenie światła w przód; UMAP = jednolita aproksymacja i projekcja rozmaitości. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Wizualizacja profili cytokin zapalnych w BALF
Wzorzec skoordynowanych odpowiedzi w obrębie wielu osi cytokinowych odróżniał grupę zakażeń od grupy kontrolnej, a cytokiny zostały pogrupowane w trzy spójne moduły funkcjonalne, jak pokazano na Rycini 3. Klasteryzacja log₁₀-przekształconych i znormalizowanych stężeń cytokin z użyciem metody Ward.D2 pozwoliła na stworzenie wyraźnego dendrogramu próbek podzielonego na dwie grupy, w którym próbki z zakażeń i kontrolne znajdowały się po przeciwnych końcach dendrogramu, a zaobserwowano jedynie siedmiu błędnie sklasyfikowanych uczestników (sześć osób z grupy kontrolnej zgrupowało się z próbkami z zakażeń, głównie w przypadkach przewlekłego kaszlu z łagodnym neutrofilowym zapaleniem dróg oddechowych, oraz jedna próbka z zakażenia zgrupowała się z grupą kontrolną, co odpowiadało wczesnemu atypowemu zapaleniu płuc). Dendrogram analitytów zdefiniował trzy klastry cytokin. Klaster chemokin, obejmujący CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 oraz CCL3, wykazał największą zmianę krotności (fold change) między grupą zakażeń a grupą kontrolną oraz najwyższą korelację wewnątrzmodułową. Klaster prozapalny, zawierający IL-1β, IL-6, IL-17A oraz TNF-α, wykazał podobne wzrosty kierunkowe, choć nieco mniej wyraźne. Klaster regulatorowy, obejmujący IL-10, IL-1RA, IFN-γ oraz G-CSF, był również podwyższony w próbkach z zakażeń, co wskazuje, że odpowiedź nie była wyłącznie prozapalna, lecz równolegle angażowała mechanizmy przeciwregulacyjne i przeciwwirusowe.
Wartości mediany (IQR) wszystkich badanych analitów były wyższe w grupie zakażonej w porównaniu z grupą kontrolną, a skorygowana wartość p była mniejsza niż 0,001 dla wszystkich 13 analitów po korekcie wskaźnika fałszywych odkryć metodą BH (BH-FDR). Wśród analitów CXCL8/IL-8 wykazywał najwyższe stężenie i największą krotność zmiany (wzrost z 68 [32–142] pg/mL w grupie kontrolnej do 2 485 [842–6 520] pg/mL w grupie zakażonej, co stanowi około 36-krotny wzrost). Analogiczny wzorzec zaobserwowano dla CXCL1/GRO-α, gdzie odnotowano około 21-krotny wzrost (78 [36–148] vs 1 672 [524–3 890] pg/mL). IL-1β wykazywał około 13-krotny wzrost (5,8 [2,6–11,4] vs 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA oraz G-CSF wykazały wzrosty od 13- do 16-krotnych (odpowiednio: 16,4 [7,8–30,5] vs 248 [82–612] pg/mL; 112 [48–258] vs 1 748 [658–3 964] pg/mL; 24 [10–52] vs 384 [125–912] pg/mL). Inne, mniejsze wzrosty obejmowały TNF-α (~8-krotny), CXCL10/IP-10 (~9-krotny), CCL2/MCP-1 (~8-krotny), CCL3/MIP-1α (~10-krotny), IL-10 (~10-krotny), IFN-γ (~6-krotny) oraz IL-17A (~4-krotny).
Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) w obrębie kohorty wykazała, że IL-8 (AUC 0,94), IL-1β (AUC 0,92), IL-6 (AUC 0,91), CXCL1 (AUC 0,91) oraz G-CSF (AUC 0,89) są analitykami o najsilniejszej zdolności dyskryminacyjnej jako pojedyncze markery pomiędzy grupą zakażoną a grupą kontrolną; wartości AUC te podsumowują różnicowanie w obrębie analizowanej kohorty w przypadku braku oddzielnego zewnętrznego zestawu walidacyjnego. Analiza wrażliwości z zastosowaniem wielokrotnej imputacji za pomocą łańcuchowych równań (m = 20) dostarczyła szacunków mieszczących się w granicach 5% median dla przypadków pełnych dla każdego analityka i nie zmieniła kolejności rang wielkości efektu.
Przeprowadzono wcześniej określone analizy wrażliwości, aby ocenić wpływ wcześniejszej ekspozycji na antybiotyki oraz podtypu zapalenia płuc na obserwowane różnice w stężeniu cytokin. Gdy powtórzono porównania grup głównych po wykluczeniu 41 uczestników z grupy zakażonej (64,1%), którzy otrzymali antybiotyki w ciągu 72 h przed BAL, wszystkie 13 analizowanych parametrów pozostało istotnie wyższymi u pozostałych 23 przypadków zakażeń niż w grupie kontrolnej po korekcie BH-FDR (skorygowane p < 0,001 dla pięciu głównych czynników różnicujących), przy wartościach punktowych, które były nieco wyższe, a nie niższe od median dla całej kohorty (na przykład CXCL8/IL-8 2 860 [980–7 110] pg/mL oraz IL-1β 92 [34–210] pg/mL), co jest zgodne z częściowym tłumieniem cytokin w drogach oddechowych przez ekspozycję na antybiotyki przed BAL. Stratyfikacja grupy zakażonej według podtypu zapalenia płuc wykazała tę samą kolejność rang chemokin i cytokin prozapalnych w przypadku pozaszpitalnego zapalenia płuc (n = 35), szpitalnego zapalenia płuc (n = 19) oraz zapalenia płuc związanego z wentylatorem (n = 10), przy czym podgrupa z zapaleniem płuc związanym z wentylatorem wykazywała najwyższe poziomy median dla CXCL8, CXCL1, IL-6 i G-CSF, a status wentylacji mechanicznej nie zmienił kierunku żadnego porównania międzygrupowego.
Rysunek 3: Wizualizacja profili cytokin zapalnych w BALF. Mapa ciepła klastrowania hierarchicznego dla log₁₀-transformowanych i z-standaryzowanych stężeń 13 mierzonych analitytów u wszystkich 112 uczestników, z kolorowymi paskami adnotacji nad mapą ciepła wskazującymi przynależność do grupy (kontrolna, infekcja), podtyp zapalenia płuc (CAP, HAP lub VAP) oraz kategorię patogenu sprawczego (infekcja Gram-ujemna, Gram-dodatnia, atypowa, wirusowa lub mieszana). Wykresy pudełkowe dla czołowych cytokin o różnej zawartości (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF i TNF-α; skala log₁₀, pg/mL) porównują grupę z infekcją i grupę kontrolną. *** p < 0,001 po korekcie FDR według metody BH. Skróty: BALF = płyn z prania oskrzelowo-pęcherzykowego; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = pozaszpitalne zapalenie płuc; HAP = szpitalne zapalenie płuc; VAP = zapalenie płuc związane z wentylacją mechaniczną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Sprzężona wizualizacja rekrutacji neutrofili i profili cytokin
Połączenie frakcji komórkowych i rozpuszczalnych ujawniło silny związek biologiczny między rekrutacją neutrofilów a systemem chemokin, co przedstawiono na Rysunku 4. Dwuwymiarowy obraz uzyskano z analizy głównych składowych (PCA) zestandaryzowanej macierzy komórkowej i cytokinowej, gdzie PC1 odpowiadał za 51,1% całkowitej wariancji, a PC2 za kolejne 12,7%, co daje łącznie 63,8%. PC1 oddzielał grupę zakażoną od grupy kontrolnej, charakteryzując się wysokimi dodatnimi ładunkami dla neutrofilów w BALF, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β oraz G-CSF i wysokimi ujemnymi ładunkami dla makrofagów. PC2 rozdzielał trajektorię bogatą w chemokiny (wysokie dodatnie ładunki dla CXCL8 i CXCL1) od trajektorii bogatej w regulatory (dodatnie ładunki dla IL-10, IL-1RA oraz IFN-γ), przez co w grupie zakażonej uczestnicy mieli tendencję do podziału według stopnia ciężkości stanu, przy czym przypadki respiratorowego zapalenia płuc z koniecznością wentylacji mechanicznej trafiały do kwadrantu o wysokim poziomie chemokin.
Korelacje rang Spearmana pomiędzy 17 cechami komórkowymi i rozpuszczalnymi wykazały silną dodatnią korelację między liczbą neutrofili w BALF a ogólną osią chemokin (CXCL8 ρ = 0,78; CXCL1 ρ = 0,74; CCL3 ρ = 0,69; CCL2 ρ = 0,61; CXCL10 ρ = 0,54; wszystkie skorygowane p < 0,001). Drugi poziom istotnych korelacji stwierdzono pomiędzy liczbą neutrofili a osią prozapalną (G-CSF ρ = 0,65; IL-1β ρ = 0,62; IL-6 ρ = 0,58; TNF-α ρ = 0,51), a następnie umiarkowane dodatnie korelacje z osią regulatorową (IL-10 ρ = 0,45; IL-1RA ρ = 0,48). Procent makrofagów wykazał lustrzaną ujemną korelację zarówno z osią chemokin, jak i osią prozapalną o podobnej sile. Korelacje wewnątrz osi były znacznie silniejsze niż korelacje między osiami (mediana |ρ| wewnątrz osi = 0,68 vs mediana |ρ| między osiami = 0,33), co potwierdza koncepcję wspólnych nadrzędnych szlaków regulacyjnych kontrolujących osie chemokin, prozapalną i regulatorową.
Sieć korelacji odwzorowała to sprzężenie na grafie, w którym neutrofile w BALF stanowiły najbardziej centralny węzeł (hub), przy czym wszystkie 13 krawędzi prowadzących do cytokin przetrwało korektę BH pod kątem wielokrotnego testowania. Ze 136 możliwych połączeń parzystych między 17 cechami, 99 spełniło wspólne kryterium |ρ| ≥ 0,30 oraz skorygowaną metodą BH wartość p < 0,05 i zostało zachowanych. Graf sieci korelacji wykazał wyraźną trójblokową architekturę modułową, która odzwierciedlała klastry uzyskane z grupowania hierarchicznego: najgęstsze i najsilniejsze połączenia występowały między modułem chemokin a liczbą i procentem neutrofili w BALF, połączenia o średniej wadze wiązały moduł prozapalny zarówno z neutrofilami, jak i modułem chemokin, a cienkie połączenia z modułu regulacyjnego łączyły bloki chemokin i prozapalny. Węzeł procentowy makrofagów znajdował się naprzeciwko bloku neutrofile–chemokiny i był z nim połączony wachlarzem krawędzi o ujemnych wagach. Zbiorczo analiza PCA, macierz korelacji oraz graf sieci ujawniły spójny wzorzec, w którym nacieki neutrofili w BALF i odpowiedź chemokinowa są silnie powiązane na poziomie poszczególnych uczestników, a szlaki prozapalne i regulacyjne pełnią rolę dobrze zdefiniowanych, lecz wzajemnie powiązanych modułów wokół tej osi neutrofile–chemokiny.
Rycina 4: Połączona wizualizacja rekrutacji neutrofili i profili cytokin zapalnych. Wykres biplot analizy głównych składowych ustandaryzowanej macierzy komórkowej i cytokinowej z uczestnikami wyróżnionymi kolorami według grup, mapa ciepła korelacji Spearmana oraz graf sieciowy wszystkich 17 cech komórkowych i rozpuszczalnych (wielkość węzłów określona przez stopień, skala krawędzi według |ρ|, przefiltrowane pod kątem p < 0,05 skorygowanego metodą BH oraz |ρ| ≥ 0,30), z zaznaczeniem centrum neutrofili–chemokin. Skróty: BH = Benjamini–Hochberg; PC = główna składowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Zanonimizowany zbiór danych na poziomie uczestników oraz kod analizy w języku R użyty w tej badaniu zostały udostępnione jako Tabela uzupełniająca S1 oraz Plik uzupełniający 1. Inne dane wspierające wyniki tego badania są dostępne od autora korespondencyjnego na uzasadnioną prośbę.
Tabela uzupełniająca S1: Zbiór danych BALF. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.
Plik uzupełniający 1: Plik ZIP zawierający kody analizy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Niezawodność niniejszego protokołu zależy od kilku decyzji podjętych przed i w trakcie analizy. Ustalenie dolnej granicy wskaźnika odzysku na poziomie 40% oraz łączenie drugiej i kolejnych alikwotów było zamierzoną decyzją, ponieważ pierwszy alikwot zawiera większe wzbogacenie materiałów z dróg oddechowych oskrzeli, natomiast wskaźnik odzysku systematycznie różni się w zależności od wieku, płci, historii palenia tytoniu oraz analizowanego oskrzela18. Blokowanie receptorów Fc oraz miareczkowanie przeciwciał przeciwko poszczególnym klonom w celu zapewnienia prawidłowych granic bramkowania pomiędzy dojrzałymi neutrofilami CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ a makrofagami pęcherzykowymi CD14⁺HLA-DR⁺ (dominującymi komórkami w próbce BALF o najwyższym nieswoistym barwieniu i tle autofluorescencji) jest kluczowe dla zachowania spójności pomiędzy dwiema grupami19,20. Ograniczenie cykli zamrażania i rozmrażania oraz 2-godzinny ramy czasowe dla analizy multipleksowej również nie są przypadkowe. Dane dotyczące ludzkiego BALF wykazały znaczną redukcję odsetka neutrofili w czasie od 6 do 24 h, nawet przy przechowywaniu w 4 °C, podczas gdy odsetki makrofagów i limfocytów pozostały stałe13. Parametry dla algorytmów t-SNE i UMAP, a także parametry dla siatki FlowSOM o 10 węzłach i dla 12–15 metaklastrów, zostały ustalone przed analizą grup, aby zapobiec dostrojeniu post hoc, co jest jedną z znanych przyczyn braku powtarzalności potoków analitycznych w cytometrii16. Informacje o operatorach oraz identyfikacja płyt/pomiarów mogą zostać zachowane dla każdego zdarzenia komórkowego, aby umożliwić zastosowanie metod korekcji efektu serii (batch-correction) w przyszłych analizach na dużą skalę21.
Istnieje kilka typowych przyczyn niepowodzeń, które nie wymagają zmian w protokole. Niska wydajność odzysku (<40%) wynika zazwyczaj z niewłaściwego ułożenia klina lub zbyt silnego ssania; problem ten należy rozwiązać poprzez skorygowanie pozycji bronchoskopu i zmniejszenie ssania do <10 mmHg przed aspiracją kolejnej porcji. Nadmierną autofluorescencję makrofagów pęcherzykowych, która jest głównym czynnikiem zakłócającym w analizie cytometrycznej komórek płuc, można ograniczyć poprzez uwzględnienie niebarwionych kontroli komórek płuc w każdej serii oraz precyzyjne zdefiniowanie bramki makrofagów o wysokim rozproszeniu bocznym (side-scatter), zamiast polegania wyłącznie na barwnikach żywotności19. Panele multipleksowe są często obciążone niską liczbą kulek lub występowaniem wartości odstających. Wykonanie wstępnej krzywej rozcieńczeń dla podzbioru próbek zainfekowanych i kontrolnych przed ustaleniem rozcieńczenia 1:2 pozwala uniknąć nasycenia sygnału CXCL8, CXCL1 oraz G-CSF, które w próbkach z zapaleniem płuc znajdują się w najwyższej części krzywej standardowej ze względu na wcześniej odkryty efekt macierzy w próbkach BALF2. Protokół można dodatkowo dostosować w zależności od specyfiki kohorty. W przypadku, gdy próbki zawierają głównie jeden typ patogenu, ograniczenie panelu podstawowego do samych chemokin i mediatorów prozapalnych pozwoli zachować wystarczającą moc statystyczną. W przypadku populacji mieszanej, zawierającej bakterie, wirusy i patogeny atypowe, korzystne będzie również pomiar mediatorów regulacyjnych, ponieważ niedawno udowodniono istnienie specyficznego dla patogenów sygnatury w neutrofilach i makrofagach pęcherzykowych23, a wykazano, że kombinacja cytokin prozapalnych i regulacyjnych w BALF odzwierciedla ciężkość przebiegu pozaszpitalnego zapalenia płuc24.
Wkładem niniejszego schematu postępowania nie jest pojedyncza obserwacja napływu neutrofili czy podwyższenia poziomu chemokin i cytokin prozapalnych w infekcji dróg oddechowych, co jest szeroko udokumentowane, lecz połączenie siedmioznacznikowego panelu cytometrii przepływowej dla neutrofili i monocytów z multiplexowym testem immunoologicznym na 13 analitów w ramach wspólnego potoku wizualizacji zastosowanego do tej samej próbki BALF. Wdrożenie siedmioznacznikowego panelu ukierunkowanego na neutrofile i monocyty, wraz z multiplexowym testem immunoologicznym na 13 analitów, pozwala uchwycić złożoność fenotypową i cytokinową; bez tego analiza wymagałaby kilku niezależnych testów przy znacznie większej objętości BALF, niż można uzyskać z typowej próbki pobranej podczas bronchoskopii. Pierwsze z tych rozwiązań jest spójne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że wielobarwna cytometria przepływowa jest tak samo niezawodna jak manualna mikroskopia w identyfikacji typów komórek w próbkach BALF15, natomiast kryteria akceptacji dla drugiego rozwiązania odzwierciedlają najlepsze praktyki uznanego wieloośrodkowego programu oceny kompetencji w zakresie multiplexowych testów opartych na koralikach16. W szczególności, połączony heatmap, wykres sieciowy oraz analiza PCA stworzone przy użyciu identycznych znormalizowanych danych wejściowych ujawniają relacje między typami komórek a ich powiązanymi czynnikami, które wcześniej można było jedynie wnioskować poprzez sumowanie niezależnych wykresów słupkowych. Jest to istotne, ponieważ pochodzące z BALF chemokiny CXCL8, CCL2 i CCL3 współpracują w celu rekrutacji neutrofili i monocytów ze wspólnego łożyska naczyniowego, a ich wspólna struktura niesie informacje, których nie da się uzyskać z niezależnych odczytów pojedynczych analitów9,10. BALF jest już rutynowo pobierany w celach klinicznych i nie wymaga dodatkowej objętości, zatem proponowany schemat postępowania może zostać wprowadzony jako translacyjne rozszerzenie istniejących usług bronchoskopowych, a nie jako samodzielna procedura diagnostyczna.
Praktyczny czas realizacji całego procesu, obejmującego transport próbek, barwienie, akwizycję w cytometrii przepływowej, inkubację i odczyt testu multipleksowego oraz późniejszą analizę obliczeniową, wynosi około 24 h w warunkach laboratorium badawczego. W związku z tym proces ten jest pozycjonowany jako narzędzie do głębokiego fenotypowania w celu charakterystyki mechanistycznej i monitorowania odpowiedzi na leczenie, a nie jako szybki test triage przy łóżku pacjenta do podejmowania decyzji krytycznych czasowo, takich jak natychmiastowe rozróżnienie między zapaleniem płuc związanym z wentylacją mechaniczną a sterylnym ostrym zespołem niewydolności oddechowej, w przypadku których standardem opieki pozostają szybsze badania mikrobiologiczne i testy z pojedynczymi biomarkerami.
Należy wspomnieć o kilku ograniczeniach. BALF jest pobierany z dróg oddechowych i reprezentuje bezpośrednie interakcje powierzchniowe w przestrzeni powietrznej, jednak nie zawiera komórek zlokalizowanych w ścianie pęcherzyków płucnych i przegrodach, gdzie znajduje się wiele aktywowanych makrofagów i limfocytów tkankowych. W związku z tym nie występuje relacja jeden do jednego między stanem immunologicznym przestrzeni powietrznej a miąższem, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi25. Detekcja oparta na wieloparametrycznych koralikach jest podatna na reaktywność krzyżową przeciwciał, a także na efekty macierzy, które są szczególnie powszechne w środowisku BALF zawierającym mucyny i surfaktant w porównaniu do surowicy krwi; dodatkowo, procesu rozcieńczania płynu wyścielającego nabłonek roztworem soli fizjologicznej nie można skorygować za pomocą żadnego z markerów endogennych, takich jak mocznik, co jest zgodne z niedawno opublikowanymi krytykami26. Odzyskana objętość płynu z płukania była średnio o 6 mL niższa w grupie zakażonej niż w grupach kontrolnych, zatem raportowane tutaj stężenia bezwzględne podlegają niewielkiej różnicy w czynniku rozcieńczenia między grupami, a nie zastosowano żadnego endogennego markera rozcieńczenia. Wcześniejsza ekspozycja na antybiotyki u 41 z 64 uczestników grupy zakażonej (64,1%) może osłabiać stężenia cytokin w drogach oddechowych i odzysk patogenów. Co ważne, protokół stanowi jedynie obraz z jednego punktu czasowego podczas wskazanego klinicznie badania bronchoskopowego, co uniemożliwia analizę kinetyki rekrutacji neutrofili, maksymalnej sekrecji chemokin oraz ich ustępowania u poszczególnych pacjentów. Wartości AUC dla pojedynczych analitów zostały wyprowadzone z tej samej kohorty, która posłużyła do identyfikacji biomarkerów, wobec braku niezależnej kohorty walidacyjnej, i powinny być interpretowane jako miary dyskryminacji wewnątrz kohorty, a nie jako zewnętrznie zwalidowana wydajność diagnostyczna; przyjęcie jakiegokolwiek punktu odcięcia dla pojedynczego markera w praktyce klinicznej wymagałoby prospektywnej walidacji w niezależnej kohorcie wieloośrodkowej. Wstępnie określone analizy wrażliwości, ograniczone do próbek o wyższym odzysku, uczestników nieleczonych antybiotykami oraz stratyfikowane według stanu wentylacji mechanicznej i podtypu zapalenia płuc (pozyszpitalne, szpitalne lub związane z respiratorem), nie zmieniły kierunku porównań między grupami.
W przyszłości ograniczenia te można będzie wyeliminować poprzez zastosowanie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek lub CITE-seq do tych samych osadów BALF wykorzystywanych do ilościowego oznaczania białek i komórek, co zostało z sukcesem wdrożone w dużych kohortach pacjentów z bakteryjnym zapaleniem płuc oraz pediatrycznym zapaleniem płuc wywołanym przez Mycoplasma pneumoniae, aby zidentyfikować podgrupy neutrofili pęcherzykowych i makrofagów nierozróżnialne za pomocą tradycyjnej cytometrii przepływowej27,28. Uzupełnienie informacji uzyskanych z analiz przestrzeni pęcherzykowych o dane dostarczone przez obrazową cytometrię masową lub transkryptomikę przestrzenną dopasowanych biopsji, a nawet materiału z sekcji zwłok, pozwoliłoby na kontekstualizację tych informacji29. Powiązanie podłużnego pobierania próbek BALF z oceną antagonistów CXCR1/CXCR2 oraz blokady receptora IL-6, z których oba podejścia wykazały korzyść w zakresie przeżywalności lub wsparcia narządowego w ciężkim zapaleniu płuc i zespole ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), pozwoliłoby również na przetestowanie osi neutrofile–chemokiny, uwydatnionej w tym schemacie postępowania, jako narzędzia wspomagającego decyzje terapeutyczne30,31.
Podsumowując, niniejsze badanie opisuje zintegrowany schemat wizualizacji składający się ze zstandaryzowanych procedur pobierania i przygotowania BALF, siedmioznacznikowego panelu cytometrii przepływowej kwantyfikującego skład neutrofili i monocytów, wielopleksowego testu cytokinowego mierzącego 13 cytokin oraz wspólnej platformy wizualizacji obejmującej analizy UMAP, klasteryzację hierarchiczną, sieć korelacji i PCA. Dzięki zastosowaniu tego schematu w prospektywnej kohorcie 12 dorosłych pacjentów poddawanych klinicznie wskazanej bronchoskopii, analiza wykazała wyraźne przejście w składzie immunologicznych komórek pęcherzyków płucnych z makrofagów na neutrofile u pacjentów z infekcją, wykryła trzymodułowy wzorzec odpowiedzi cytokinowej oraz ujawniła silnie sprzężoną oś neutrofil-chemokina, której nie można zaobserwować przy użyciu pomiarów pojedynczych znaczników. Procedura opiera się wyłącznie na materiale pobranym podczas diagnostyki klinicznej, nie wymaga dodatkowej objętości próbki i może być wykonalna w laboratoriach trzeciego stopnia opieki wyposażonych w aparaturę do wieloparametrowej cytometrii przepływowej i wielopleksowej analizy koralikowej. Szersze zastosowanie oraz jakiekolwiek wykorzystanie poszczególnych analitów jako biomarkerów diagnostycznych będzie wymagało prospektywnej walidacji w niezależnych kohortach wieloośrodkowych. Badanie to przedstawia zatem powtarzalną i bogatą w dane metodologię charakterystyki stanu zapalnego dróg oddechowych w infekcjach oddechowych i stanowi podstawę do jej dalszego rozwoju w ramach badań podłużnych, analiz pojedynczych komórek i analiz przestrzennych oraz oceny terapeutycznej immunomodulacji celowanej w oś neutrofil-chemokina.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Szczerze dziękujemy wszystkim pacjentom i ochotnikom, którzy wzięli udział w tym badaniu, za ich cenny wkład. Wyrażamy wdzięczność Komisji Etycznej za wydanie zgody etycznej (nr zgody 2026HL-038) oraz wytyczne normatywne podczas całego procesu badawczego.
Dziękujemy personelowi medycznemu Oddziału Pulmonologii, Centrum Bronchoskopii oraz Laboratorium Klinicznego za wsparcie w pobieraniu próbek klinicznych, przetwarzaniu płynu z płukania pęcherzyków płucnych oraz detekcji mikrobiologicznej. Jesteśmy również wdzięczni za wsparcie platformy technicznej centralnego laboratorium szpitalnego w zakresie wielowymiarowej cytometrii przepływowej oraz eksperymentów z profilowaniem cytokin metodą multipleksową.
Badania te nie otrzymały żadnego konkretnego grantu z agencji finansujących w sektorach publicznym, komercyjnym ani non-profit.
Dziękujemy wszystkim badaczom, technikom oraz personelowi pielęgniarskiemu zaangażowanemu w ten projekt za ich wysiłki w zakresie przesiewowej kwalifikacji pacjentów, zarządzania próbkami, prowadzenia eksperymentów i opracowania danych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało anty-CD1b przeciwko ludzkim komórkom, Brilliant Violet 421, klon ICRF44 | BioLegend | Nr kat. 301323 | Marker aktywacji neutrofili; kanał lasera fioletowego Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD14, APC/Cyanine7, klon M5E2 | BioLegend | Nr kat. 301820 | Marker wykluczający monocyty i makrofagi; kanał lasera czerwonego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało anty-CD15 przeciwko ludzkiemu antygenowi, PE, klon HI98 | BioLegend | Nr kat. 301906 | Marker linii neutrofilowej; kanał lasera niebieskiego Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało anty-CD16 ludzkie, Brilliant Violet 510, klon 3G8 | BioLegend | Nr kat. 302048 | Dojrzewanie neutrofili i marker komórek NK; kanał lasera fioletowego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało anty-CD45 przeciwko ludzkim komórkom, PerCP, klon HI30 | BioLegend | Nr kat. 304026 / RRID: AB_8938 | Marker panleukocytowy; kanał lasera niebieskiego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://antibodyregistry.org/AB_89338 |
| Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD66b, FITC, klon G10F5 | BioLegend | Nr kat. 305103 | Marker granulocytów; kanał lasera niebieskiego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało przeciwko ludzkiemu HLA-DR, PerCP/Cyanine5.5, klon L243 | BioLegend | Nr kat. 307629 | Marker komórki prezentującej antygen; kanał lasera niebieskiego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Automatyczny analizator hematologiczny (Sysmex XN-10) | Sysmex Corporation | Urządzenie (model XN-10) | Stosowane do oznaczenia całkowitej liczby komórek jądrzastych w celu obliczenia bezwzględnej liczby neutrofili Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.sysmex.com |
| Seryjowa albumina wołowa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Nr kat. A7906 | Stosowany w buforze do barwienia w cytometrii przepływowej (0,5% m/v w PBS z 2 mM EDTA) Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.sigmaaldrich.com/US/pl/product/sigma/a7906 |
| pakiet ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Projekt Bioconductor | v2.20 (otwarte oprogramowanie) | Stosowane do tworzenia map ciepła z grupowaniem hierarchicznym dla danych o cytokinach z analiz multipleksowych Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Cytocentryfuga (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Nr kat. A78303 | Służy do przygotowania preparatów cytologicznych z zawiesiny komórkowej płynu zpłukanego z oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BALF) Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Komplet do izolacji i oczyszczania DNA z tkanek roślinnych Ten komplet umożliwia szybką i łatwą izolację DNA o wysokiej jakości z szerokiej gamy tkanek roślinnych. Metoda ta opiera się na wykorzystaniu kolumienek z krzemionką, co pozwala na skuteczne usunięcie zanieczyszczeń, takich jak wielocukry i polifenole, które często utrudniają dalsze analizy molekularne. Cechy produktu: - Szybki i wydajny protokół izolacji. - Wysoka czystość i wydajność uzyskanego DNA. - Zgodność z wymaganiami dla aplikacji takich jak PCR, sekwencjonowanie i klonowanie. - Zoptymalizowany dla różnych rodzajów tkanek roślinnych. Zawartość zestawu: - Bufory lityczne i oczyszczające. - Kolumienki do wiązania DNA. - Centryfugówki do zbierania ekstraktu. - Instrukcja obsługi. Zastosowania: - Badania genomiki roślin. - Analizy markerów molekularnych. - Diagnostyka fitopatologiczna. - Badania nad ekspresją genów. |
| Roztwór do lizy erytrocytów (BD FACS Lysing Solution, koncentrat 10X) | BD Biosciences | Nr kat. 349202 | Stosowany do lizy erytrocytów po barwieniu powierzchniowym Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.bdbiosciences.com |
| Kwas etylendiaminotetraoctowy (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Nr kat. AM9260G | Stosowany w buforze do barwienia w cytometrii przepływowej w stężeniu 2 mM Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Zestaw do izolacji RNA z tkanek i komórek roślinnych (Plant RNA Isolation Kit) |
| Barwnik do oceny żywotności z możliwością utrwalania (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Nr kat. 423105 | Wykluczanie komórek żywych i martwych przed bramkowaniem; kanał lasera czerwonego URL: https://www.biolegend.com |
| Elastyczny wideobronchoskop | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Instrument (model BF-1TQ290) | Stosowane do BAL w warunkach sedacji umiarkowanej Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.olympus-global.com |
| Cytometr przepływowy, wielokolorowy (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Przyrząd (model CytoFLEX LX, konfiguracja sześciu laserów) | Stosowane do akwizycji siedmiomarkerowego panelu przepływowego dla neutrofili/monocytów Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.beckman.com |
| Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Służy do kompensacji i manualnego bramkowania plików FCS Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.flowjo.com |
| Pakiet FlowSOM (R/Bioconductor) | Projekt Bioconductor | v2.12 (otwarte oprogramowanie) | Stosowane do klastrowania metodą samoorganizujących się map oraz metaklastrowania danych z cytometrii przepływowej Adres URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (oprogramowanie do analizy statystycznej i tworzenia wykresów) | Oprogramowanie GraphPad (Dotmatics) | v10 | Wykorzystano do wygenerowania końcowych rycin Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.graphpad.com |
| Odczyn blokujący ludzkie receptory Fc (Human TruStain FcX) | BioLegend | Nr kat. 42301 / RRID: AB_2818986 | Blokowanie receptorów Fc przed barwieniem przeciwciałami Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| pakiet igraph (R) | CRAN | v2.0 (otwarte oprogramowanie) | Służy do konstruowania i wizualizacji grafu sieci korelacji Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Probówki kriogeniczne o niskim wiązaniu białek, 2,0 ml | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Nr kat. 375418 | Wykorzystywane do aliquotów nadsączu BALF do analizy cytokin URL: Zestaw do wyodrębniania RNA z tkanek i komórek (Invitrogen PureRNA Mini Kit) |
| Platforma do wieloanalitycznego immunoanalizy opartej na koralikach Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Instrument (model MAGPIX) | Wykorzystywane do akwizycji danych w multipleksowym analizie cytokin Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.luminexcorp.com |
| May-Grüroztwór barwiący Giemsa-Wrwald | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Nr kat. GS50 | Stosowane do różnicowego liczenia komórek metodą cytospinowania Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.sigmaaldrich.com/US/pl/product/sigma/gs50 |
| pakiet mice (R) | CRAN | v3.16 (otwarte oprogramowanie) | Stosowane do wielokrotnej imputacji za pomocą łańcuchowych równań w analizie wrażliwości Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=mice |
| Multiplexowy panel cytokin/chemokin oparty na koralikach magnetycznych (13-plex, niestandardowy; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Nr kat. HCYTOMAG-60K | Niestandardowy panel pomiarowy dla 13 analitów opisanych w sekcji 2.4 Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.merckmillipore.com |
| sitko do komórek z nylonowej siatki, 70 µm | Corning (Falcon) | Nr kat. 352350 | Stosowane do filtracji mechanicznej BALF w celu usunięcia grudek śluzu Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.corning.com |
| Bufor fosforanowy (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Nr kat. 1010023 | Bufor podstawowy do resuspensji i barwienia komórek Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. Zestaw do izolacji RNA i DNA z tkanek zwierzęcych (Animal Tissue RNA and DNA Isolation Kit) |
| pakiet pROC (R) | CRAN | v1.18 (otwarte oprogramowanie) | Służy do generowania krzywych ROC oraz wartości AUC Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (środowisko obliczeń statystycznych) | R Core Team | v4.4 (otwarte oprogramowanie) | Platforma do analiz statystycznych i wizualizacji Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.r-project.org |
| pakiet rstatix (R) | CRAN | v0.7 (open source) | Stosowane do porównań grupowych i statystyk korelacji Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| pakiet Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (otwarte oprogramowanie) | Wykorzystywane do osadzeń t-SNE Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Kulek kompensacyjnych barwionych pojedynczo (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Nr kat. 01-22-42 | Stosowane jako kontrole kompensacji jednobarwnej Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Zestaw do izolacji RNA z tkanek i komórek zwierzęcych (TRIzol) Przeznaczenie: Zestaw TRIzol jest przeznaczony do izolacji wysokiej jakości RNA całkowitego z szerokiej gamy tkanek i komórek zwierzęcych. Metoda ta opiera się na jednoczesnej lizie komórek, denaturacji białek i izolacji RNA w jednym kroku, co zapewnia wysoką wydajność i czystość uzyskanego materiału genetycznego. Zalety: - Szybka i efektywna izolacja RNA z różnych rodzajów próbek. - Wysoka czystość i integralność wyizolowanego RNA, odpowiednia do analizy RT-qPCR, Northern blotting oraz sekwencjonowania. - Skuteczne usuwanie zanieczyszczeń białkowych i genomicznego DNA. - Standaryzowana procedura zapewniająca powtarzalność wyników. Zawartość zestawu: - Odczynnik TRIzol - Instrukcja obsługi Warunki przechowywania: Przechowywać w temperaturze od 4°C do -20°C zgodnie ze wskazaniami producenta. |
| Roztwór chlorku sodu do zastrzyków, 0,9% (sterylna sól fizjologiczna) | Baxter International | Nr kat. 2B1324 | Stosowane do instylacji BAL (10–150 ml, 20–alikwoty o objętości 40 mL w 37 °C) Adres URL: https://www.baxter.com |
| pakiet uwot (R) | CRAN | v0.2 (otwarte oprogramowanie) | Stosowane do redukcji wymiarowości UMAP Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (oprogramowanie do akwizycji danych z testów multipleksowych i dopasowywania krzywych) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Oprogramowanie producenta urządzenia do dopasowania krzywej wzorcowej modelem 5PL Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.luminexcorp.com |
Bibliografia
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.