Niniejsze badanie przedstawia zintegrowany schemat wizualizacji łączący standaryzowany pobór i przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, siedmioznacznikowy panel cytometrii przepływowej, multipleksowy test cytokinowy obejmujący 13 analitów oraz ujednolicony potok analizy.
Artykuł badawczy
Zintegrowana wizualizacja rekrutacji neutrofili oraz profilowania cytokin zapalnych w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) jest najłatwiej dostępną macierzą próbek do badania stanu zapalnego dolnych dróg oddechowych, jednak konwencjonalne analizy opierają się na cytometrii przepływowej z użyciem pojedynczych markerów w połączeniu z enzymatycznym testem immunoabsorpcyjnym (ELISA) przeprowadzanym dla każdego analitycznie osobno, co ogranicza gęstość informacji i zaciera powiązania między komórkami a czynnikami. Niniejsze badanie przedstawia zintegrowany schemat wizualizacji, który łączy standaryzowane pobieranie i wstępne przetwarzanie z siedmiomarkerowym panelem cytometrii przepływowej dla neutrofili i monocytów, multipleksowym testem cytokinowym dla 13 analitytów oraz jednolitym potokiem analizy opartym na jednorodnej aproksymacji i projekcji rozmaitości (UMAP), metaklastrowaniu FlowSOM, klastrowaniu hierarchicznym, sieciach korelacji Spearmana oraz analizie głównych składowych (PCA).
Przepływ pracy zastosowano w prospektywnej kohorcie jednocentrycznej obejmującej 12 dorosłych poddawanych bronchoskopii, w tym 64 pacjentów z mikrobiologicznie potwierdzoną infekcją płuc oraz 48 kontrolnych osób bez infekcji. Odczyty cytologiczne i cytometryczne z przepływem wykazały wyraźne przejście z profilu pęcherzykowego z dominacją makrofagów na profil z dominacją neutrofili podczas infekcji, przy czym odsetek neutrofili wzrósł z mediany 3,2% do 68,4%, a bezwzględna koncentracja neutrofili zwiększyła się około 50-krotnie. Profilowanie multipleksowe ujawniło skoordynowaną odpowiedź cytokinową składającą się z trzech modułów, w której moduły chemokin, prozapalne i regulacyjne były wszystkie upregulowane, a CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α i G-CSF wykazywały najsilniejszą dyskryminację pojedynczego markera w badanej kohorcie (pole pod krzywą [AUC] od 0,89 do 0,94). Zintegrowana wizualizacja z wykorzystaniem PCA, macierzy korelacji i grafu sieciowego ujawniła ściśle powiązaną oś neutrofile–chemokiny na poziomie uczestników, przy czym liczba neutrofili w BALF okazała się centralnym węzłem sieci.
Przepływ pracy wykorzystuje wyłącznie materiał rutynowo pozyskiwany podczas klinicznie wskazanych BAL, nie wymaga dodatkowej objętości próbki i zapewnia gęstą informacyjnie strukturę do analizy stanu zapalnego dróg oddechowych w infekcjach układu oddechowego, co może być możliwe do wdrożenia w laboratoriach opieki trzeciego stopnia wyposażonych w wieloparametrową cytometrię przepływową oraz platformy multiplex bead-array, z możliwością rozszerzenia na podłużne badania jednokomórkowe i oceny terapeutycznej. Szersze zastosowanie kliniczne poszczególnych analitytów jako biomarkerów będzie wymagało prospektywnej walidacji w niezależnych kohortach wieloośrodkowych.
Wprowadzenie
Zgony z powodu infekcji dolnych dróg oddechowych pozostają istotną przyczyną śmiertelności na świecie, mimo postępów w strategiach szczepień i metodach leczenia; dotyczy to zwłaszcza populacji dziecięcej i osób starszych1. Neutrofile są głównymi komórkami pojawiającymi się we wczesnych etapach wrodzonej odpowiedzi odpornościowej w dotkniętym układzie oddechowym, co jest procesem kluczowym dla eliminacji wnikającego patogenu; jednak niekontrolowany stan zapalny z udziałem neutrofili prowadzi do przerwania bariery włośniczkowo-pęcherzykowej, uszkodzeń oksydacyjnych tkanek oraz rozwoju zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS)2,3. Neutrofile w przestrzeni powietrznej płuc wykazują również kinetykę rekrutacji, wzorce retencji oraz zachowanie efektorowe, które różnią się od tych w innych tkankach, a różnice te wpływają na to, czy infekcja ustąpi, czy rozwinie się w ciężkie zapalenie płuc4.
Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) stanowi ważne źródło informacji o mikrośrodowisku pęcherzyków płucnych i oferuje najbliższe odwzorowanie odporności klinicznej w tym obszarze5. Chemokina CXCL8 odgrywa kluczową rolę w rekrutacji neutrofili do płuc za pośrednictwem swoich receptorów, CXCR1 i CXCR2, wraz z innymi chemokinami, w tym CXCL1, CXCL2 i CXCL56. Cytokiny IL-1β, IL-6 i TNF-α dodatkowo wzmacniają ten proces, podczas gdy IL-10 działa jako cytokina przeciwstawna. Wykazano, że ich poziomy w BALF korelują z ciężkością infekcji płuc oraz rozwojem powikłań płucnych wynikających z bakteryjnego, wirusowego i atypowego zapalenia płuc7, a multipleksowe profile biomarkerów BALF są wdrażane w celu wcześniejszej diagnostyki i różnicowania patogenów w infekcjach dolnych dróg oddechowych8.
Rutynowe badania BALF zazwyczaj nie obejmują w pełni biologii leżącej u podstaw testu. Liczbę komórek można oszacować poprzez manualne różnicowanie komórek w próbkach z cytocentryfugi, podczas gdy mediatorów rozpuszczalnych mierzy się za pomocą poszczególnych testów enzymatycznych ELISA, a wyniki przedstawia w formie wykresu słupkowego. Chemokiny, cytokiny i każdy typ komórek są oceniane osobno, bez ustanowienia korelacji między konkretnym gradientem stężenia chemokiny a populacjami komórek, na które ona wpływa w próbce. Połączenie modułów cytokin, relacji dawka-odpowiedź między chemokinami a neutrofilami oraz subpopulacji pacjentów z ich własnymi sygnaturami zapalnymi jest często pomijane w przypadku braku analizy wielowymiarowej9.
Postępy w dziedzinie obliczeń sprawiają, że takie holistyczne podejście staje się coraz bardziej realistyczne. Połączenie wieloparametrycznej cytometrii przepływowej i spektralnej cytometrii przepływowej z metodami redukcji wymiarowości, takimi jak t-rozproszone osadzanie sąsiadów stochastycznych (t-SNE) lub jednolita aproksymacja i projekcja rozmaitości (UMAP), pozwala na mapowanie wysokowymiarowych fenotypów immunologicznych w przestrzeni dwuwymiarowej, przy czym UMAP wykazuje lepsze zachowanie topologii globalnej i powtarzalność w zastosowaniach do danych cytometrycznych10. Panele wieloanalityczne cytokin, a następnie klasteryzacja hierarchiczna i sieci korelacyjne, pomagają w identyfikacji sygnatur skorelowanych z ciężkością stanu, których nie można wykryć za pomocą podejść opartych na pojedynczych cytokinach1. Pomimo postępów w tej dziedzinie, żaden schemat postępowania nie łączy jeszcze tych metod w celu badania rekrutacji neutrofili i sygnatur cytokin z tych samych próbek BALF w przebiegu infekcji dróg oddechowych. Niniejsze badanie opisuje zintegrowany schemat wizualizacji do badania rekrutacji neutrofili z wykorzystaniem cytologii i wieloparametrycznej cytometrii przepływowej, a następnie analiz UMAP i sygnatur cytokin za pomocą wieloparametrycznego testu immunoenzymatycznego, wraz z klasteryzacją hierarchiczną, macierzami korelacji i analizą głównych składowych. Schemat ten pozwala na uzyskanie zintegrowanej wizualizacji, która obejmuje komórkowe i rozpuszczalne odczyty immunologiczne dróg oddechowych na jednym wykresie, z wykorzystaniem próbek BALF rutynowo pobieranych podczas klinicznie wskazanej bronchoskopii w zakażeniach dolnych dróg oddechowych.
Protokół
Populacja badana i etyka
Było to jednocentrowe prospektywne badanie obserwacyjne przeprowadzone w klinicznym szpitalu dydaktycznym między styczniem 2026 a kwietniem 2026 roku. Protokół został zatwierdzony pod numerem 2026HL-038, a od każdego uczestnika uzyskano pisemną świadomą zgodę przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury badawczej.
Konsekuentnie rekrutowano osoby dorosłe w wieku od 18 do 75 lat, u których w ramach rutynowej opieki klinicznej przeprowadzano diagnostyczną elastyczną bronchoskopię z płukaniem pęcherzykowym (BAL), a następnie przydzielano je do grupy z infekcją lub kontrolnej grupy bez infekcji na podstawie ostatecznych diagnoz klinicznych i mikrobiologicznych. Przegląd zintegrowanego procesu wizualizacji, od rekrutacji pacjentów po zintegrowane wyniki wizualne, przedstawiono na Rysunku 1.
Rycina 1Przegląd zintegrowanego procesu wizualizacji dla profilowania rekrutacji neutrofili i odpowiedzi cytokin zapalnych w płyku z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF). Pięć etapów podsumowuje, od lewej do prawej: prospektywną rekrutację grup zakażonej i kontrolnej z wykorzystaniem bronchoskopii i BAL, przygotowanie BALF poprzez wydzielenie osadu komórkowego i frakcji nadsączu, równoległe pomiary komórkowe (cytologia Wrighta–Giemsy i wieloparametrowa cytometria przepływowa) oraz rozpuszczalne (13-pleksowy test immunoologiczny oparty na kuleczkach), ujednolicony potok wizualizacji (UMAP z meta-klastrowaniem FlowSOM, hierarchiczna mapa ciepła, analiza głównych składowych i sieć korelacji Spearmana) oraz zintegrowany wynik wizualny. Skróty: BAL = przemywanie pęcherzykowo-oskrzelowe; BALF = płyn z BAL; UMAP = jednorodna aproksymacja i projekcja rozmaitości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Kryteria włączenia do grupy zakażonej były następujące: (1) pacjenci z rozpoznanym zapaleniem płuc nabytym w społeczności (CAP), zapaleniem płuc szpitalnym (HAP) lub zapaleniem płuc związanym z wentylacją mechaniczną (VAP) zgodnie z wytycznymi Infectious Diseases Society of America (IDSA) oraz American Thoracic Society (ATS); (2) wykrycie jednego lub więcej patogenów w posiewie BALF w ilości ≥104 jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL, w oddechowym multipleksowym badaniu PCR, w metagenomicznym sekwencjonowaniu następnej generacji BALF lub w badaniu specyficznych antygenów/przeciwciał z parowanych próbek z dróg oddechowych i surowicy.
Kryteria grupy kontrolnej były następujące: (1) nieinfekcyjne wskazania do bronchoskopii, obejmujące ocenę niejednoznacznego guzka płuca, nieprawidłowe wyniki badań radiologicznych niewskazujące na infekcję lub badanie w kierunku przewlekłego kaszlu; (2) brak ostrej infekcji płuc potwierdzony ujemnymi wynikami badań mikrobiologicznych oraz brak jakichkolwiek oznak stanu zapalnego lub zakażenia systemowego w momencie wykonywania bronchoskopii; oraz (3) brak stosowania antybiotyków na 30 dni przed udziałem w badaniu. Osoby do grupy kontrolnej rekrutowano spośród pacjentów poddawanych bronchoskopii z powodu innych klinicznie uzasadnionych schorzeń płuc, a nie spośród zdrowych ochotników, co odzwierciedla populację, z której rutynowo pobiera się BAL ze wskazań klinicznych w ośrodku badawczym.
Kryteria wykluczenia obejmowały: (1) nowotwór złośliwy i/lub chemioterapię cytotoksyczną w ciągu ostatnich sześciu miesięcy; (2) seropozytywność pod kątem HIV; (3) przeszczep narządu litego lub hematopoetycznych komórek macierzystych; (4) trwałą terapię immunosupresyjną z codzienną dawką ekwiwalentu prednizonu > 0,3 mg/kg przez ponad 3 tygodnie; (5) kobiety w ciąży/karmiące piersią; (6) występującą w wywiadzie skłonność do krwawień lub jakiekolwiek przeciwwskazania do elastycznej bronchoskopii; (7) istniejącą ciężką przewlekłą chorobę układu oddechowego (przewlekłą obturacyjną chorobę płuc [COPD] w stadium III/IV według Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD], idiopatyczną włóknienie płuc, ciężką astmę przetrwałą lub klinicznie istotne rozstrzenie oskrzeli); (8) aktywną gruźlicę; (9) udział w innym badaniu interwencyjnym w ciągu ostatnich 30 dni. BAL wykonano podczas pierwszej bronchoskopii, w ciągu 72 h od przyjęcia z powodu infekcji oraz w ciągu 48 h od intubacji u pacjentów z infekcjami wentylowanych mechanicznie.
Obliczenia wielkości próby koncentrowały się na głównym punkcie końcowym dla komórek: liczbie neutrofili w BALF pomiędzy grupami. Przy przewidywanej wielkości efektu wynoszącej 0,6 SD pomiędzy drogami oddechowymi zainfekowanymi a niezainfekowanymi oraz uwzględniając 15% margines na utratę uczestników, do osiągnięcia dwustronnej wartości α = 0,05 przy mocy statystycznej 80% wymagana była minimalna liczebność próby wynosząca 45 osób na grupę. Spośród 156 kwalifikujących się kandydatów 27 nie spełniło wymogów kwalifikacyjnych (18 nie spełniło kryteriów włączenia, głównie ze względu na niemożność zidentyfikowania czynnika patogennego odpowiedzialnego za chorobę w określonym czasie lub brak zgody na samą procedurę; 9 spełniło kryteria wykluczenia, przede wszystkim z powodu aktywnego procesu nowotworowego lub przebytej chemioterapii, przewlekłego stosowania kortykosteroidów, ciężkiej istniejącej wcześniej przewlekłej choroby płuc lub skłonności do krwawień). Pozostałych 129 uczestników poddano bronchoskopii. Następnie 17 osób wycofano z badania (7 z powodu niewystarczającej wydajności BALF < 40%; 4 z powodu wycofania zgody podczas hospitalizacji oraz 6 z powodu reklasyfikacji uczestników po końcowej ocenie mikrobiologicznej – 4 kandydatów do grupy kontrolnej zdiagnozowano jako osoby z utajoną infekcją na podstawie wyników posiewów, a u 2 kandydatów do grupy infekcyjnej zabrakło dowodów zakażenia po analizie posiewów). Ostateczna grupa badawcza obejmowała 12 uczestników: 64 z infekcją i 48 bez infekcji.
Pobieranie i wstępna obróbka BALF
Bronchoskopię przeprowadzili doświadczeni operatorzy zgodnie ze standardowym protokołem instytucjonalnym, spójnym z opublikowanymi rekomendacjami technicznymi dotyczącymi płukania oskrzelowo-pęcherzykowego12. Lidokainę zastosowano miejscowo, a pacjenci otrzymali umiarkowaną sedację dożylną przy jednoczesnym podawaniu tlenu wspomagającego w celu utrzymania saturacji tlenem (SpO₂) >92%. Elastyczny bronchoskop wprowadzono i ustawiono w segmencie oskrzelowo-płucnym z widocznymi zmianami radiologicznymi. W przypadkach, gdy zmiany radiologiczne były rozlane lub niemożliwe do zlokalizowania, wybrano środkowy płat prawy lub segmenty języczkowe lewego płata. Po każdym wlewie wykonywano delikatne manualne odsysanie przy podciśnieniu < 10 mmHg. Podano łącznie od trzech do pięciu wlewów sterylnej soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C, po 20–40 mL każdy, co dało łączną objętość 10–150 mL. Współczynnik odzysku oszacowano jako objętość odzyskaną w stosunku do objętości wlanej; do analizy zakwalifikowano jedynie próbki o odzysku ≥40%.
Próbki zebranego z drugiego i kolejnych płukań połączono w celu zmniejszenia zanieczyszczenia oskrzelowego i uzyskania próbki wzbogaconej w komórki pęcherzykowe. Połączony płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) przechowywano w lodzie i przetwarzano w ciągu 2 h od pobrania, uwzględniając niedawne doniesienia dotyczące zmian w składzie komórkowym i różnicowaniu komórek po przedłużonym przechowywaniu i ogrzewaniu ludzkich próbek BALF13. Po filtracji przez sterylną siatkę nylonową o rozmiarze oczek 70 micronów w celu usunięcia śluzu, przeprowadzonej wyłącznie poprzez mechaniczne przejście bez dodatku środków mukolitycznych lub przeciwagregacyjnych, takich jak ditiotreitol (ponieważ testy pilotażowe wykazały, że jest to wystarczające do usunięcia skupisk śluzu bez mierzalnej utraty integralności epitopów powierzchniowych w dalszych etapach analizy), płyn poddano wirowaniu z prędkością 40 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Nadosad zniesiono i rozdzielono do krio probówek o niskim wiązaniu białek w celu analizy cytokin, a komórki zawieszono w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem 0,5% albuminy surowicy bydlęcej oraz 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), przy czym część z nich zachowano do badań cytologicznych i cytometrii przepływowej. Próbki cytokin zamrożono w ciekłym azocie, przechowywano w temperaturze –80 °C i nie poddano więcej niż jednemu cyklowi zamrażania i rozmrażania przed użyciem.
Cytologia neutrofili i kwantyfikacja metodą cytometrii przepływowej
W zakresie cytopatologii 10 µL zawiesiny komórek BALF naniesiono na szkiełko przedmiotowe za pomocą cytocentryfugi (patrz Tabela materiałów) przy 30 × g przez 5 min, wysuszono na powietrzu i zabarwiono metodą Wrighta-Giemsy. Rozpływy różnicowe zostały wykonane przez technika hematologii nieznającego historii choroby pacjenta, który policzył minimum 40 komórek na szkiełko i obliczył procentowy udział makrofagów, limfocytów, neutrofili oraz eozynofilów. Procentowy udział neutrofili w BALF uznano za główny miernik wyniku dla cytopatologii, biorąc pod uwagę aktualne dowody sugerujące ich użyteczność w rozróżnianiu zakaźnych i niezakaźnych chorób płuc u pacjentów z naciekami płucnymi14.
Protokół ilościowego oznaczania metodą cytometrii przepływowej oparto na niedawnej walidacji protokołu różnicowania leukocytów w płyknie z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BALF) z wykorzystaniem czterech kolorów15, uzupełniając go o dodatkowe markery w celu identyfikacji neutrofili. W szczególności około 5 × 105 komórek wyizolowanych z BALF blokowano za pomocą ludzkiego odczynnika blokującego receptory Fc (patrz Tabela materiałów) przez 10 min w 4 °C, a następnie barwiono przez 20 min w 4 °C przeciwciałami przeciwko CD45 (klon HI30), CD6b (klon G10F5), CD15 (klon HI98), CD16 (klon 3G8), CD1b (klon ICRF4), CD14 (klon M5E2) i HLA-DR (klon L243), a także barwnikiem do oceny żywotności komórek możliwym do utrwalenia (patrz Tabela materiałów). Do lizy erytrocytów zastosowano komercyjny roztwór do lizy erytrocytów (patrz Tabela materiałów) przez 10 min w temperaturze pokojowej. Po lizie erytrocytów komórki przemyto dwukrotnie w PBS uzupełnionym o 2% płodowej surowicy cielęcej i zawieszono ponownie w buforze do cytometrii, a następnie przeanalizowano za pomocą wielokolorowego cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów). Kompensację przeprowadzono z użyciem kuleczek kompensacyjnych barwionych pojedynczo (patrz Tabela materiałów), a dla każdego panelu uwzględniono próbki z kontrolą fluorescence-minus-one oraz próbki niebarwione.
Dla każdej próbki zarejestrowano co najmniej 1 × 105 zdarzeń CD45⁺. W pierwszej kolejności na wykresie FSC-A/FSC-H wyznaczono bramkę dla singletów, a następnie dla żywych (barwnik żywotności⁻) leukocytów CD45⁺, po czym przeprowadzono wykluczenie monocytów i makrofagów CD14⁺HLA-DR⁺ w celu wyselekcjonowania granulocytów CD6b⁺ o wysokim rozproszeniu bocznym (side scatter). Neutrofile zdefiniowano następnie w populacji granulocytów jako zdarzenia CD15⁺CD16⁺CD1b⁺. Główna bramka dla granulocytów CD6b⁺ została wyznaczona szeroko wokół wszystkich zdarzeń o wysokim rozproszeniu bocznym, zamiast ograniczać ją do granic CD15⁺CD16⁺CD1b⁺, aby aktywowane neutrofile CD16-dim, CD1b-high oraz inne, mniej dojrzałe formy granulocytów pozostały w całkowitej zautomatyzowanej liczbie neutrofili; bardziej rygorystyczna definicja CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ została zastosowana wyłącznie do charakterystyki podgrupy dojrzałych neutrofili, raportowanej oddzielnie w dalszych analizach klastrowania. Liczbę neutrofili w BALF (komórki/µL) oszacowano na podstawie procentowego udziału neutrofili oraz całkowitej liczby komórek jądrzastych, wyznaczonej przy użyciu automatycznego analizatora hematologicznego (patrz Tabela materiałów). Macierze kompensacji, strategia bramkowania oraz indywidualne raporty kontroli jakości próbek zostały zarchiwizowane, a analitycy pozostawali w ślepej próbie względem przydziału uczestników do grup podczas akwizycji i analizy.
Multipleksowe profilowanie cytokin zapalnych
Nadnadczynie BALF rozmrożono jednokrotnie na wilgotnym lodzie, a następnie krótko wymieszano w wortexie i klarowano poprzez wirowanie przy 10,0 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C bezpośrednio przed analizą. Pomiar 13 analitów w trzech kategoriach funkcjonalnych przeprowadzono przy użyciu platformy do multipleksowego immunoanalizy opartej na kuleczkach z zastosowaniem niestandardowego panelu kuleczek magnetycznych (patrz Tabela materiałów). Grupę prozapalną stanowiły IL-1β, IL-6, IL-17A i TNF-α; grupę chemokin stanowiły CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 i CCL3/MIP-1α; natomiast grupę regulacyjną stanowiły IL-10, IFN-γ, IL-1RA i G-CSF. Wybór analitów oparto na tych, które najczęściej zgłaszano jako informacyjne w analizach multipleksowych cytokin w BALF lub surowicy w badaniach nad zapaleniem płuc/ciężkimi infekcjami dróg oddechowych7,1. Współczynnik rozcieńczenia (1:2 w buforze do analizy) określono na podstawie eksperymentu pilotażowego przeprowadzonego na reprezentatywnym podzbiorze próbek zakażonych i kontrolnych, aby zapewnić, że >90% pomiarów mieściło się w zakresie krzywej wzorcowej.
Krzywe wzorcowe wyznaczono przy użyciu siedmiopunktowych rozcieńczeń seryjnych rekombinowanych wzorców producenta, przygotowanych w dubletach na każdej płytce, wraz z jedną kontrolą pustą w celu odjęcia tła. Dopasowanie krzywej przeprowadzono za pomocą regresji logistycznej pięcioparametrowej (5PL) przy użyciu autorskiego oprogramowania do akwizycji i analizy instrumentu (patrz Tabela materiałów). Dolną granicę oznaczalności (LLOQ) obliczono jako najmniejszą ilość wzorca dającą odzysk z dopasowania wstecznego między 80% a 120% oraz wewnątrzseryjny współczynnik zmienności (CV) ≤ 20%. Wartości poniżej LLOQ zastąpiono wartością LLOQ/√2. Dwie zpoolowane próbki kontroli jakości płynu z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), każda pochodząca od reprezentatywnego pacjenta zakażonego oraz od osoby zdrowej, zostały podzielone na aliquoty i dodane do każdej płytki w celu monitorowania długoterminowej wydajności. Standardy zapewnienia jakości oparto na zaleceniach dotyczących najlepszych praktyk wynikających z 12-letniego wieloośrodkowego programu oceny biegłości w testach typu multiplex bead-based16, obejmujących wymagania dotyczące CV wewnątrzanalizy ≤ 10% w dubletach, CV między płytkami ≤ 20% dla kontroli jakości oraz minimalnej liczby koralików ≥ 50 na analityt na dołek. Płytki, które nie spełniły powyższych kryteriów, poddano ponownemu badaniu. Analizę przeprowadzono w jednej partii w ciągu czterech tygodni, korzystając z jednej serii zestawu, z randomizacją próbek zakażonych i kontrolnych.
Procedura analizy wizualizacji
Pliki w formacie Flow Cytometry Standard (FCS) poddano wstępnej analizie przy użyciu komercyjnego oprogramowania do cytometrii przepływowej (patrz Tabela materiałów>) w celu kompensacji i bramkowania żywych singletów CD45⁺, a następnie wyeksportowano je do obiektywnej analizy w programie R v4.4. Dla każdej próbki pobrano podpróbkę 10 0 zdarzeń CD45⁺ i połączono je, a intensywności sygnałów przekształcono za pomocą funkcji arcsinh z współczynnikiem 150. Redukcję wymiarowości i projekcje UMAP przeprowadzono przy użyciu pakietu uwot dla 15 najbliższych sąsiadów i minimalnej odległości 0,1, wraz z równoległymi osadzeniami t-SNE przy użyciu pakietu Rtsne z perpleksją 3010. Klastry fenotypowe zidentyfikowano za pomocą FlowSOM z 100 węzłami mapy samoorganizującej, a następnie podzielono na 12–15 klastrów poprzez meta-klastrowanie, stosując podejście oparte na optymalizacji, które zostało niedawno zwalidowane dla wielowymiarowych danych cytometrycznych17. Każdy klaster opisano na podstawie mediany ekspresji markerów linii i aktywacji, a następnie zweryfikowano w odniesieniu do bram ustawianych ręcznie.
W celu analizy danych z multipleksowej analizy cytokin, wartości surowe poddano najpierw transformacji log₁₀, a następnie standaryzacji pomiędzy analitykami za pomocą z-score przed przeprowadzeniem dalszych analiz. Zarówno analityki, jak i pacjenci zostali poddani klastrowaniu hierarchicznemu z wykorzystaniem odległości euklidesowej i metody łączenia Ward.D2; wyniki przedstawiono na mapie ciepła z klastrowaniem wierszy i kolumn. Takie podejście zastosowano w celu wykrycia współwyrażanych modułów cytokin oraz klasyfikacji podgrup pacjentów w multipleksowych kohortach zapalnych9. Macierze korelacji dla wszystkich komórkowych i rozpuszczalnych biomarkerów wygenerowano przy użyciu parzystych korelacji rang Spearmana. Mapy ciepła macierzy korelacji wykreślono wraz z siecią, w której węzły odpowiadają biomarkerom, a krawędzie wskazują korelacje, które przetrwały korekcję wielokrotnego testowania metodą Benjamini-Hochberga (BH). Szerokość krawędzi skalowano zgodnie z wartością bezwzględną współczynnika korelacji |ρ|, a krawędzie uwzględniano tylko wtedy, gdy |ρ| ≥ 0.30 i p < 0.05 po korekcji. Analizę głównych składowych (PCA) przeprowadzono na standaryzowanej macierzy zawierającej komórki i cytokiny przy użyciu funkcji prcomp() ze skalowaniem wariancji jednostkowej. Uczestników rzutowano na dwie pierwsze główne składowe z nałożeniem grup zakażonych i kontrolnych. Spójny downsampling i standaryzacja wszystkich analiz zapewniły porównywalność odczytów biomarkerów komórkowych i rozpuszczalnych we wszystkich wizualizacjach.
Analiza statystyczna
Zmienne ciągłe opisywano za pomocą mediany (rozstęp międzykwartylowy, IQR) w przypadku rozkładu nienormalnego według testów Shapiro-Wilka oraz średniej (odchylenie standardowe, SD) w przeciwnym razie. Zmienne kategoryczne opisywano za pomocą liczebności i proporcji. Porównania między grupami przeprowadzano za pomocą testu U Manna-Whitneya, gdy zmienne ciągłe miały rozkłady nienormalne, testu t Welcha, gdy zmienne ciągłe miały rozkład normalny, oraz testu chi-kwadrat/dokładnego testu Fishera w przypadku zmiennych kategorycznych, gdy było to właściwe. Powiązania między zmiennymi ciągłymi oceniano za pomocą współczynnika korelacji rang Spearmana. Aby uwzględnić stopień fałszywych odkryć (FDR) w analizach korelacji i wielipleksowych analizach cytokin, wartości p skorygowano metodą Benjamini-Hochberga z punktem odcięcia q < 0,05. Dwustronne p < 0,05 uznano za statystycznie istotne we wszystkich analizach głównych. Tam, gdzie było to możliwe, przypadki z brakującymi danymi w poszczególnych zmiennych zachowano i analizowano metodą analizy kompletnych przypadków dla danej zmiennej, natomiast w celu przeprowadzenia analiz wrażliwości zastosowano wielokrotną imputację przy użyciu równań łańcuchowych (m = 20). Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika oraz odpowiadająca im powierzchnia pod krzywą (AUC) zostały wygenerowane dla poszczególnych cytokin z użyciem pakietu pROC w obrębie pełnej kohorty badania; nie zastosowano oddzielnej zewnętrznej kohorty walidacyjnej. Wstępnie określone analizy wrażliwości powtórzyły główne porównania grup po wykluczeniu uczestników, którzy otrzymali antybiotyki w ciągu 72 h przed bronchoskopią, oraz po stratyfikacji grupy z infekcją ze względu na status wentylacji mechanicznej i podtyp zapalenia płuc (pozyszpitalne, szpitalne lub związane z wentylacją mechaniczną). Analizy przeprowadzono przy użyciu pakietów rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC oraz mice w programie R v4.4. Rysunki wygenerowano przy użyciu komercyjnego oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych (patrz Tabela materiałów).
Wyniki
Populacja badana i charakterystyka próbek
W końcowej kohorcie analizy znalazło się 12 osób, z czego 64 osoby w grupie zakażeń i 48 osób w kontrolnej grupie bez zakażeń. Demografia wyjściowa była podobna w obu grupach, natomiast parametry laboratoryjne związane z zakażeniem były wyższe w grupie zakażeń, co przedstawiono w Tabeli 1. Zakażenia były wywoływane głównie przez bakterie Gram-ujemne, a głównymi patogenami bakteryjnymi były Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa oraz Acinetobacter baumannii. Pozostałe patogeny to Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, czynniki atypowe, wirusy oraz zakażenia mieszane.
Wskaźniki odzysku BALF spełniły z góry określony próg ≥40% dla wszystkich zachowanych próbek, przy czym wartości te były nieco niższe w grupie zakażonej w porównaniu z grupą kontrolną (mediana 48,3% vs 53,3%, p = 0,03), co jest zgodne ze zwiększonym stanem zapalnym dróg oddechowych i przekrwieniem błony śluzowej w zakażonych drogach oddechowych. Ponieważ odzyskana objętość również różniła się między grupami (58 mL vs 64 mL, p = 0,04), wszystkie zgłaszane stężenia cytokin mogą podlegać niewielkiej różnicy w czynniku rozcieńczenia między grupami; z góry określona analiza wrażliwości ograniczona do próbek o wskaźniku odzysku ≥50% (n = 42 zakażone, n = 34 kontrolne) potwierdziła kierunek i wielkość każdego porównania międzygrupowego (największa zmiana wielkości efektu < 8%), co wskazuje, że błąd rozcieńczenia prawdopodobnie nie odpowiada za zaobserwowane różnice. Czas pomiędzy pobraniem a procesowaniem wynosił 65 min dla grupy zakażonej i 62 min dla grupy kontrolnej, mieszcząc się w 2 h oknie czasowym. Kryteria kontroli jakości (QC) na poziomie próbek wskazały na wysoką jakość wyników. Różnicowe obliczenia cytologiczne uzyskano na podstawie ≥40 policzonych komórek we wszystkich 112/12 próbkach (10%). Akwizycje z cytometrii przepływowej spełniły z góry określone kryterium ≥1 × 105 zdarzeń CD45⁺ we wszystkich 12/112 próbkach (10%), przy medianie żywotności żywych komórek wynoszącej 89,4% (IQR 85,6–92,8%). Wszystkie płytki do multipleksowej analizy cytokin spełniły kryteria QC po pojedynczym powtórzeniu analizy. Dla wszystkich 13 analitów wewnątrzassayowy współczynnik zmienności (CV) wynosił 4,7% (2,1–9,3%, wszystkie <10%), między płytkami CV dla połączonych próbek QC wynosiło 1,2% (6,8–18,4%, wszystkie <20%), a mediana liczby kuleczek wynosiła 78 zdarzeń/analit/dołek (53–142, wszystkie ≥ 50).
| Zmienna | Zakażenie (n = 64) | Kontrola (n = 48) | wartość p |
| Wiek, lata, mediana [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| Mężczyźni, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BMI, kg/m2, mediana [IQR] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.6 |
| Wywiad nikotynowy, n (%) | 0.52 | ||
| Nigdy nie palili | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| Byli palacze | 2 (34.4) | 16 (3.3) | |
| Obecni palacze | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| Nadciśnienie tętnicze, n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| Cukrzyca, n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| Choroba wieńcowa, n (%) | 1 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| Przewlekła choroba nerek, n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| Wskazanie do bronchoskopii, n (%) | — | ||
| Pozaszpitalne zapalenie płuc | 35 (54.7) | — | |
| Szpitalne zapalenie płuc | 19 (29.7) | — | |
| Wentylatorowe zapalenie płuc | 10 (15.6) | — | |
| Guz płuca o nieustalonym charakterze | — | 23 (47.9) | |
| Utrzymujące się zmiany radiologiczne | — | 15 (31.3) | |
| Diagnostyka przewlekłego kaszlu | — | 10 (20.8) | |
| Patogen sprawczy, n (%) | — | ||
| Bakterie Gram-ujemne | 28 (43.8) | ||
| Bakterie Gram-dodatnie | 16 (25.0) | ||
| Patogeny atypowe | 7 (10.9) | ||
| Wirusy układu oddechowego | 8 (12.5) | ||
| Zakażenie mieszane | 5 (7.8) | ||
| Wentylacja mechaniczna podczas BAL, n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| Stosowanie antybiotyków w ciągu 72 h przed BAL, n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.01 |
| Objętość wprowadzonej cieczy, mL, mediana [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| Objętość odzyskanej cieczy, mL, mediana [IQR] | 58 [49–68] | 64 [5–73] | 0.04 |
| Wskaźnik odzysku BALF, %, mediana [IQR] | 48.3 [42.5–5.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| Czas do opracowania próbki, min, mediana [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.5 |
| WBC we krwi, × 10⁹/L, mediana [IQR] | 1.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.01 |
| Neutrofile we krwi, %, mediana [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.01 |
| Białko C-reaktywne, mg/L, mediana [IQR] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| Prokalcytonina, ng/mL, mediana [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.01 |
Tabela 1: Charakterystyka demograficzna, kliniczna oraz parametry przetwarzania BALF w kohorcie badawczej. Porównano bazowe cechy demograficzne, choroby współistniejące, wskazania do bronchoskopii, patogeny sprawcze, parametry procedury oraz laboratoryjne wartości krwi obwodowej pomiędzy 64 uczestnikami w grupie z zakażeniem a 48 uczestnikami w kontrolnej grupie bez zakażenia. Zmienne ciągłe przedstawiono jako medianę [rozstęp międzykwartylny] i porównano za pomocą testu U Manna–Whitneya; zmienne kategoryczne przedstawiono jako n (%) i porównano za pomocą testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera, w zależności od zastosowania. Skróty: BAL = płukanie pęcherzyków płucnych; BALF = płyn z płukania pęcherzyków płucnych; BMI = wskaźnik masy ciała; IQR = rozstęp międzykwartylny; WBC = liczba białych krwinek.
Wizualizacja rekrutacji neutrofili do BALF
U osobników zakażonych zaobserwowano wyraźną zmianę stosunku populacji zdominowanej przez makrofagi na populację zdominowaną przez neutrofile, co przedstawiono na Rysunku 2. Preparaty z cytocentryfugi barwiono metodą Wrighta–Giemsy; barwienie wykazało wyraźną różnicę między dwiema grupami: w grupie kontrolnej stwierdzono więcej makrofagów pęcherzykowych, niektóre limfocyty i nieliczne neutrofile, natomiast w grupie zakażonej dominowały neutrofile z często występującymi bakteriami wewnątrzkomórkowymi, zdegenerowanymi jądrami i granulacjami toksycznymi. W celu weryfikacji różnic wykonano rozliczenia różnicowe na podstawie co najmniej 40 policzonych komórek, w wyniku których odsetek neutrofili wzrósł z wartości mediany 3,2% (IQR: 1,8–5,6%) w grupie kontrolnej do 68,4% (IQR: 49,2–82,5%) w grupie zakażonej (p < 0,01), natomiast odsetek makrofagów pęcherzykowych spadł z 8,2% (IQR: 82,4–92,5%) do 2,6% (IQR: 12,3–38,5%) (p < 0,01). Procentowa zawartość limfocytów była podobna w obu grupach (7,4% [4,8–1,3%] vs 6,5% [3,4–1,2%], p = 0,42).
Analizy bramkowania i redukcji wymiarowości potwierdziły i rozszerzyły fenotypy komórkowe zaobserwowane podczas mikroskopii. Po wykluczeniu debris, dubletów i martwych komórek, granulocyty CD45⁺CD66b⁺ stanowiły medianę 65,8% (IQR: 46,2–79,4%) leukocytów CD45⁺ w grupie zakażonej w porównaniu do 4,1% (IQR: 2,3–6,8%) w grupie kontrolnej (p < 0,01). W populacji granulocytów, dojrzałe neutrofile CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ stanowiły 92,4% (IQR: 87,5–95,8%) wszystkich granulocytów w grupie zakażonej w porównaniu do 88,6% (IQR: 82,3–93,5%) w grupie kontrolnej, co wskazuje, że zrekrutowana pula neutrofili składała się w dużej mierze z dojrzałych, w pełni zróżnicowanych komórek, a nie z wczesnych prekursorów. Projekcje UMAP i t-SNE oparte na macierzy białek powierzchniowych przekształconej za pomocą funkcji arcsinh wykazały niemal identyczne topologie, w których przypadki zakażeń zajmowały wyraźną wyspę dojrzałych neutrofili CD15⁺CD16⁺CD1b⁺, która była słabo zasiedlona w próbkach kontrolnych, podczas gdy wyspa makrofagów pęcherzykowych HLA-DR⁺CD14⁺ wykazała odwrotny wzorzec, będąc gęsto zasiedloną w grupie kontrolnej i słabo zasiedloną w grupie zakażonej. Meta-klastrowanie za pomocą FlowSOM zidentyfikowało 13 subpopulacji, wśród których subpopulacja dojrzałych neutrofili (38,4% [2,6–56,2%] vs 2,8% [1,5–4,6%], p < 0,01) oraz klaster aktywowanych neutrofili CD16-dim CD1b-high (2,6% [1,4–32,5%] vs 0,4% [0,1–1,2%], p < 0,01) wykazały największe ekspansje międzygrupowe.
W odniesieniu do bezwzględnej liczby neutrofili, w grupie z infekcją odnotowano około 50-krotny wzrost liczby neutrofili w BALF w porównaniu z grupą kontrolną. Całkowita liczba komórek jądrzastych na µL BALF wzrosła ze 156 cells/µL (IQR 8–232) w grupie kontrolnej do 384 cells/µL (IQR 180–712) w grupie z infekcją (p < 0,01), a liczba neutrofili wzrosła z 5 cells/µL (IQR 2–13) w grupie kontrolnej do 262 cells/µL (IQR 89–578) w grupie z infekcją (p < 0,01). Różnice parzyste w procencie i bezwzględnej liczbie neutrofili między grupami pozostały wysoce istotne po korekcie Benjamini’ego-Hochberga (BH) (q < 0,001).
Rycina 2Wizualizacja rekrutacji neutrofili do BALF. Reprezentatywne pola cytospinowe barwione metodą Wrighta-Giemsy, pochodzące od uczestnika z grupy kontrolnej oraz uczestnika zakażonego, ilustrują przejście z profilu komórkowego BALF z przewagą makrofagów do profilu z przewagą neutrofili. Czterostopniowa strategia bramkowania w cytometrii przepływowej (singlety FSC → żywe CD45+⁺ leukocyty → CD6b⁺ granulocyty po CD14⁺HLA-DR⁺ wykluczenie → CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ dojrzałe neutrofile), rzutowanie UMAP danych z cytometrii przepływowej przekształconych za pomocą funkcji arcsinh z nałożonymi 13 metaklastrami FlowSOM, pokolorowane zgodnie z adnotacją biologiczną, oraz wykresy pudełkowe procentowego udziału neutrofili w BALF oraz bezwzględnego stężenia neutrofili (komórki/µL, skala logarytmiczna) przedstawiono obok siebie, aby umożliwić bezpośrednie porównanie fenotypów komórkowych zidentyfikowanych w grupach zakażonych i kontrolnych. Skróty: BALF = płyn z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego; FSC = rozproszenie przednie; UMAP = jednorodna aproksymacja i projekcja rozmaitości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Wizualizacja profili cytokin zapalnych w BALF
Wzorzec skoordynowanych odpowiedzi w obrębie wielu osi cytokinowych odróżniał grupę z infekcją od grupy kontrolnej, a cytokiny zostały podzielone na trzy spójne moduły funkcjonalne, jak pokazano na Rysunku 3. Klasteryzacja log₁₀-transformowanych i znormalizowanych stężeń cytokin z wykorzystaniem metody Ward.D2 pozwoliła na uzyskanie wyraźnego dendrogramu próbek z podziałem na dwie grupy, w którym próbki z infekcją oraz próbki kontrolne znajdowały się po przeciwnych stronach dendrogramu; odnotowano jedynie siedem błędnie sklasyfikowanych uczestników (sześć kontroli zgrupowano z próbkami z infekcją, głównie w przypadkach przewlekłego kaszlu z łagodnym neutrofilowym zapaleniem dróg oddechowych, oraz jedną próbkę z infekcją zgrupowano z kontrolami, co odpowiadało wczesnemu atypowemu zapaleniu płuc). Dendrogram analitytów zdefiniował trzy klastry cytokin. Klaster chemokin, obejmujący CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 i CCL3, wykazał największą krotność zmiany (fold change) między grupą z infekcją a grupą kontrolną oraz najwyższą korelację wewnątrzmodułową. Klaster prozapalny, zawierający IL-1β, IL-6, IL-17A i TNF-α, wykazał podobne kierunkowe wzrosty, choć nieco mniej wyraźne. Klaster regulacyjny, obejmujący IL-10, IL-1RA, IFN-γ i G-CSF, był również podwyższony w próbkach z infekcją, co wskazuje, że odpowiedź nie miała charakteru wyłącznie prozapalnego, lecz równolegle angażowała mechanizmy przeciwregulacyjne i przeciwwirusowe.
Mediany (IQR) wszystkich badanych analitów były wyższe w grupie z infekcją w porównaniu z grupą kontrolną, a skorygowana wartość p była mniejsza niż 0,001 dla wszystkich 13 analitów po korekcie tempa fałszywych odkryć w oparciu o metodę Benjamini-Hochberga (BH-FDR). Wśród analitów CXCL8/IL-8 osiągnął najwyższe stężenie i największą krotność zmiany (od 68 [32–142] pg/mL w grupie kontrolnej do 2 485 [842–6 520] pg/mL w grupie z infekcją, co stanowi wzrost około 36-krotny). Podobny wzorzec zaobserwowano dla CXCL1/GRO-α, ze wzrostem około 21-krotnym (78 [36–148] vs 1 672 [524–3 890] pg/mL). IL-1β wykazał wzrost około 13-krotny (5,8 [2,6–1,4] vs 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA oraz G-CSF wykazały wzrosty od 13- do 16-krotnych (odpowiednio: 16,4 [7,8–30,5] vs 248 [82–612] pg/mL; 12 [48–258] vs 1 748 [658–3 964] pg/mL; 24 [10–52] vs 384 [125–912] pg/mL). Inne mniejsze wzrosty dotyczyły TNF-α (~8-krotny), CXCL10/IP-10 (~9-krotny), CCL2/MCP-1 (~8-krotny), CCL3/MIP-1α (~10-krotny), IL-10 (~10-krotny), IFN-γ (~6-krotny) oraz IL-17A (~4-krotny).
Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) w obrębie kohorty wykazała, że IL-8 (AUC 0,94), IL-1β (AUC 0,92), IL-6 (AUC 0,91), CXCL1 (AUC 0,91) oraz G-CSF (AUC 0,89) są analitytami o najsilniejszej zdolności dyskryminacyjnej pojedynczego markera pomiędzy grupą zakażoną a grupą kontrolną; wartości AUC te podsumowują dyskryminację w obrębie analizowanej kohorty w przypadku braku oddzielnego zewnętrznego zestawu walidacyjnego. Analiza wrażliwości z zastosowaniem wielokrotnej imputacji za pomocą równań łańcuchowych (m = 20) dała oszacowania w granicach 5% median dla przypadków kompletnych dla każdego analitytu i nie zmieniła kolejności rang wielkości efektu.
W celu oceny wpływu wcześniejszej antybiotykoterapii oraz podtypu zapalenia płuc na zaobserwowane różnice w stężeniu cytokin zastosowano predefiniowane analizy wrażliwości. Po powtórzeniu głównych porównań grup z wyłączeniem 41 uczestników z grupy zakażonej (64,1%), którzy otrzymali antybiotyki w ciągu 72 h przed BAL, wszystkie 13 analizowanych parametrów pozostało istotnie wyższe w pozostałych 23 przypadkach zakażeń niż w grupie kontrolnej po korekcie BH-FDR (skorygowane p < 0,01 dla pięciu głównych dyskryminatorów). Estymacje punktowe były nieco wyższe, a nie niższe od median dla całej kohorty (na przykład CXCL8/IL-8 2 860 [980–7 10] pg/mL oraz IL-1β 92 [34–210] pg/mL), co jest zgodne z częściowym tłumieniem cytokin w drogach oddechowych wskutek antybiotykoterapii przed BAL. Stratyfikacja grupy zakażonej według podtypu zapalenia płuc wykazała tę samą kolejność rang chemokin i cytokin prozapalnych w zapaleniu płuc nabytym w społeczności (n = 35), zapaleniu płuc nabytym w szpitalu (n = 19) oraz zapaleniu płuc związanym z wentylacją mechaniczną (n = 10). W podgrupie z zapaleniem płuc związanym z wentylacją mechaniczną odnotowano najwyższe wartości median dla CXCL8, CXCL1, IL-6 oraz G-CSF, a status wentylacji mechanicznej nie zmienił kierunku żadnego porównania międzygrupowego.
Rycina 3Wizualizacja profili cytokin zapalnych w BALF. Mapa ciepła z klastrowaniem hierarchicznym wartości logarytmicznych₁₀stężenia 13 mierzonych analitów u wszystkich 12 uczestników, poddane transformacji logarytmicznej i standaryzacji (z-score), z kolorowymi paskami adnotacji nad mapą ciepła wskazującymi przynależność do grupy (kontrolna, zakażona), podtyp zapalenia płuc (CAP, HAP lub VAP) oraz kategorię patogenu etiologicznego (zakażenie Gram-ujemne, Gram-dodatnie, atypowe, wirusowe lub mieszane). Wykresy pudełkowe dla głównych cytokin o różnym stopniu obfitości (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF oraz TNF-αdziennik₁₀ skala, pg/ml) porównuje grupy zakażoną i kontrolną. *** p < 0,01 po korekcie poziomu fałszywych odkryć metodą BH. Skróty: BALF = płyn z przemywania oskrzelowo-pęcherzykowego; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = pozaszpitalne zapalenie płuc; HAP = szpitalne zapalenie płuc; VAP = respiratorowe zapalenie płuc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Zintegrowana wizualizacja rekrutacji neutrofili i profili cytokin
Połączenie frakcji komórkowej i rozpuszczalnej ujawniło silny związek biologiczny między rekrutacją neutrofili a układem chemokin, co przedstawiono na Ryc. 4. Dwuwymiarowy obraz uzyskano na podstawie analizy głównych składowych (PCA) zestandaryzowanej macierzy komórek i cytokin, gdzie PC1 odpowiadała za 51,1% całkowitej wariancji, a PC2 za kolejne 12,7%, co łącznie daje 63,8%. PC1 oddzieliła grupę zakażoną od grupy kontrolnej, charakteryzując się wysokimi dodatnimi ładunkami dla neutrofili w BALF, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β oraz G-CSF, a wysokimi ujemnymi ładunkami dla makrofagów. PC2 dokonała podziału między trajektorią bogatą w chemokiny (wysokie dodatnie ładunki dla CXCL8 i CXCL1) a trajektorią bogatą w czynniki regulacyjne (dodatnie ładunki dla IL-10, IL-1RA i IFN-γ), w związku z czym w grupie zakażonej uczestnicy mieli tendencję do podziału zgodnie z ciężkością stanu, przy czym przypadki respiratorowego zapalenia płuc wymagające wentylacji mechanicznej trafiały do kwadrantu o wysokim stężeniu chemokin.
Korelacje rang Spearmana pomiędzy 17 cechami komórkowymi i rozpuszczalnymi wykazały silną dodatnią korelację między liczbą neutrofili w BALF a ogólną osią chemokin (CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; wszystkie skorygowane p < 0.01). Drugi poziom istotnych korelacji stwierdzono pomiędzy liczbą neutrofili a osią prozapalną (G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51), a następnie umiarkowane korelacje dodatnie z osią regulatorową (IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48). Procent makrofagów wykazał odzwierciedloną korelację ujemną zarówno z osią chemokin, jak i osią prozapalną o podobnej sile. Korelacje wewnątrzosiowe były znacznie silniejsze niż korelacje międzyosiowe (mediana |ρ| wewnątrzosiowa = 0.68 vs. mediana |ρ| międzyosiowa = 0.3), co wspiera koncepcję wspólnych nadrzędnych szlaków regulacyjnych kontrolujących osie chemokin, prozapalną i regulatorową.
Sieć korelacji odwzorowała to sprzężenie na grafie, w którym neutrofile w BALF stanowiły najbardziej centralny węzeł hub, przy czym wszystkie 13 krawędzi łączących je z cytokinami przetrwało korekcję BH dla wielokrotnego testowania. Spośród 136 możliwych połączeń parzystych między 17 cechami, 9 spełniło wspólne kryterium |ρ| ≥ 0.30 oraz skorygowaną wartość p BH < 0.05 i zostało zachowanych. Graf sieci korelacji wykazał wyraźną trójblokową architekturę modułową, która odzwierciedlała klastry uzyskane z analizy hierarchicznej: najgęstsze i najsilniejsze połączenia występowały między modułem chemokin a liczbą i procentem neutrofili w BALF, połączenia o średniej wadze łączyły moduł prozapalny zarówno z neutrofilami, jak i modułem chemokin, natomiast cienkie połączenia z modułu regulacyjnego spajały bloki chemokin i prozapalny. Węzeł procentowy makrofagów znajdował się naprzeciwko bloku neutrofil-chemokina i był z nim połączony wachlarzem krawędzi o ujemnych wagach. Wspólnie analiza PCA, macierz korelacji oraz graf sieci ujawniły spójny wzorzec, w którym infiltracja neutrofili w BALF i odpowiedź chemokinowa są silnie powiązane na poziomie poszczególnych uczestników, a szlaki prozapalne i regulacyjne pełnią funkcję dobrze zdefiniowanych, lecz wzajemnie połączonych modułów wokół tej osi neutrofil-chemokina.
Rycina 4Zintegrowana wizualizacja rekrutacji neutrofili i profili cytokin zapalnych. Biplot analizy głównych składowych wystandaryzowanej macierzy komórkowej i cytokinowej z uczestnikami wyróżnionymi kolorami według grup, mapa ciepła korelacji Spearmana oraz graf sieciowy wszystkich 17 cech komórkowych i rozpuszczalnych (rozmiar węzłów zależny od stopnia, skala krawędzi zależna od |ρ| i przefiltrowane przy użyciu korekty BH p < 0,05 i |ρ| ≥ 0,30), co podkreśla hub neutrofili i chemokin. Skróty: BH = Benjamini–Hochberg; PC = główna składowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Zanonimizowany zbiór danych na poziomie uczestników oraz kod analizy w języku R wykorzystany w niniejszym badaniu zostały udostępnione jako Tabela uzupełniająca S1 oraz Plik uzupełniający 1. Inne dane wspierające wyniki tego badania są dostępne od autora korespondencyjnego na uzasadnioną prośbę.
Tabela uzupełniająca S1: Zbiór danych BALF. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 1: Plik ZIP zawierający kody analityczne. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Niezawodność niniejszego protokołu zależy od kilku decyzji podjętych przed i w trakcie analizy. Ustalenie dolnej granicy wskaźnika odzysku na poziomie 40% oraz łączenie drugiej i kolejnych alikwotów było zamierzoną decyzją, ponieważ pierwszy alikwot zawiera większe wzbogacenie materiałów z dróg oddechowych oskrzeli, natomiast wskaźnik odzysku systematycznie różni się w zależności od wieku, płci, historii palenia tytoniu oraz analizowanego oskrzela18. Blokowanie receptorów Fc oraz miareczkowanie przeciwciał przeciwko poszczególnym klonom w celu zapewnienia prawidłowych granic bramkowania pomiędzy dojrzałymi neutrofilami CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ a makrofagami pęcherzykowymi CD14⁺HLA-DR⁺ (dominującymi komórkami w próbce BALF o najwyższym nieswoistym barwieniu i tle autofluorescencji) jest kluczowe dla zachowania spójności pomiędzy dwiema grupami19,20. Ograniczenie cykli zamrażania i rozmrażania oraz 2-godzinny ramy czasowe dla analizy multipleksowej również nie są przypadkowe. Dane dotyczące ludzkiego BALF wykazały znaczną redukcję odsetka neutrofili w czasie od 6 do 24 h, nawet przy przechowywaniu w 4 °C, podczas gdy odsetki makrofagów i limfocytów pozostały stałe13. Parametry dla algorytmów t-SNE i UMAP, a także parametry dla siatki FlowSOM o 10 węzłach i dla 12–15 metaklastrów, zostały ustalone przed analizą grup, aby zapobiec dostrojeniu post hoc, co jest jedną z znanych przyczyn braku powtarzalności potoków analitycznych w cytometrii16. Informacje o operatorach oraz identyfikacja płyt/pomiarów mogą zostać zachowane dla każdego zdarzenia komórkowego, aby umożliwić zastosowanie metod korekcji efektu serii (batch-correction) w przyszłych analizach na dużą skalę21.
Istnieje kilka typowych przyczyn niepowodzeń, które nie wymagają zmian w protokole. Niska wydajność odzysku (<40%) wynika zazwyczaj z niewłaściwego ułożenia klina lub zbyt silnego ssania; problem ten należy rozwiązać poprzez skorygowanie pozycji bronchoskopu i zmniejszenie ssania do <10 mmHg przed aspiracją kolejnej porcji. Nadmierną autofluorescencję makrofagów pęcherzykowych, która jest głównym czynnikiem zakłócającym w analizie cytometrycznej komórek płuc, można ograniczyć poprzez uwzględnienie niebarwionych kontroli komórek płuc w każdej serii oraz precyzyjne zdefiniowanie bramki makrofagów o wysokim rozproszeniu bocznym (side-scatter), zamiast polegania wyłącznie na barwnikach żywotności19. Panele multipleksowe są często obciążone niską liczbą kulek lub występowaniem wartości odstających. Wykonanie wstępnej krzywej rozcieńczeń dla podzbioru próbek zainfekowanych i kontrolnych przed ustaleniem rozcieńczenia 1:2 pozwala uniknąć nasycenia sygnału CXCL8, CXCL1 oraz G-CSF, które w próbkach z zapaleniem płuc znajdują się w najwyższej części krzywej standardowej ze względu na wcześniej odkryty efekt macierzy w próbkach BALF2. Protokół można dodatkowo dostosować w zależności od specyfiki kohorty. W przypadku, gdy próbki zawierają głównie jeden typ patogenu, ograniczenie panelu podstawowego do samych chemokin i mediatorów prozapalnych pozwoli zachować wystarczającą moc statystyczną. W przypadku populacji mieszanej, zawierającej bakterie, wirusy i patogeny atypowe, korzystne będzie również pomiar mediatorów regulacyjnych, ponieważ niedawno udowodniono istnienie specyficznego dla patogenów sygnatury w neutrofilach i makrofagach pęcherzykowych23, a wykazano, że kombinacja cytokin prozapalnych i regulacyjnych w BALF odzwierciedla ciężkość przebiegu pozaszpitalnego zapalenia płuc24.
Wkładem niniejszego schematu postępowania nie jest pojedyncza obserwacja napływu neutrofili czy podwyższenia poziomu chemokin i cytokin prozapalnych w infekcji dróg oddechowych, co jest szeroko udokumentowane, lecz połączenie siedmioznacznikowego panelu cytometrii przepływowej dla neutrofili i monocytów z multiplexowym testem immunoologicznym na 13 analitów w ramach wspólnego potoku wizualizacji zastosowanego do tej samej próbki BALF. Wdrożenie siedmioznacznikowego panelu ukierunkowanego na neutrofile i monocyty, wraz z multiplexowym testem immunoologicznym na 13 analitów, pozwala uchwycić złożoność fenotypową i cytokinową; bez tego analiza wymagałaby kilku niezależnych testów przy znacznie większej objętości BALF, niż można uzyskać z typowej próbki pobranej podczas bronchoskopii. Pierwsze z tych rozwiązań jest spójne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że wielobarwna cytometria przepływowa jest tak samo niezawodna jak manualna mikroskopia w identyfikacji typów komórek w próbkach BALF15, natomiast kryteria akceptacji dla drugiego rozwiązania odzwierciedlają najlepsze praktyki uznanego wieloośrodkowego programu oceny kompetencji w zakresie multiplexowych testów opartych na koralikach16. W szczególności, połączony heatmap, wykres sieciowy oraz analiza PCA stworzone przy użyciu identycznych znormalizowanych danych wejściowych ujawniają relacje między typami komórek a ich powiązanymi czynnikami, które wcześniej można było jedynie wnioskować poprzez sumowanie niezależnych wykresów słupkowych. Jest to istotne, ponieważ pochodzące z BALF chemokiny CXCL8, CCL2 i CCL3 współpracują w celu rekrutacji neutrofili i monocytów ze wspólnego łożyska naczyniowego, a ich wspólna struktura niesie informacje, których nie da się uzyskać z niezależnych odczytów pojedynczych analitów9,10. BALF jest już rutynowo pobierany w celach klinicznych i nie wymaga dodatkowej objętości, zatem proponowany schemat postępowania może zostać wprowadzony jako translacyjne rozszerzenie istniejących usług bronchoskopowych, a nie jako samodzielna procedura diagnostyczna.
Praktyczny czas realizacji całego procesu, obejmującego transport próbek, barwienie, akwizycję w cytometrii przepływowej, inkubację i odczyt testu multipleksowego oraz późniejszą analizę obliczeniową, wynosi około 24 h w warunkach laboratorium badawczego. W związku z tym proces ten jest pozycjonowany jako narzędzie do głębokiego fenotypowania w celu charakterystyki mechanistycznej i monitorowania odpowiedzi na leczenie, a nie jako szybki test triage przy łóżku pacjenta do podejmowania decyzji krytycznych czasowo, takich jak natychmiastowe rozróżnienie między zapaleniem płuc związanym z wentylacją mechaniczną a sterylnym ostrym zespołem niewydolności oddechowej, w przypadku których standardem opieki pozostają szybsze badania mikrobiologiczne i testy z pojedynczymi biomarkerami.
Należy wspomnieć o kilku ograniczeniach. BALF jest pobierany z dróg oddechowych i reprezentuje bezpośrednie interakcje powierzchniowe w przestrzeni powietrznej, jednak nie zawiera komórek zlokalizowanych w ścianie pęcherzyków płucnych i przegrodach, gdzie znajduje się wiele aktywowanych makrofagów i limfocytów tkankowych. W związku z tym nie występuje relacja jeden do jednego między stanem immunologicznym przestrzeni powietrznej a miąższem, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi25. Detekcja oparta na wieloparametrycznych koralikach jest podatna na reaktywność krzyżową przeciwciał, a także na efekty macierzy, które są szczególnie powszechne w środowisku BALF zawierającym mucyny i surfaktant w porównaniu do surowicy krwi; dodatkowo, procesu rozcieńczania płynu wyścielającego nabłonek roztworem soli fizjologicznej nie można skorygować za pomocą żadnego z markerów endogennych, takich jak mocznik, co jest zgodne z niedawno opublikowanymi krytykami26. Odzyskana objętość płynu z płukania była średnio o 6 mL niższa w grupie zakażonej niż w grupach kontrolnych, zatem raportowane tutaj stężenia bezwzględne podlegają niewielkiej różnicy w czynniku rozcieńczenia między grupami, a nie zastosowano żadnego endogennego markera rozcieńczenia. Wcześniejsza ekspozycja na antybiotyki u 41 z 64 uczestników grupy zakażonej (64,1%) może osłabiać stężenia cytokin w drogach oddechowych i odzysk patogenów. Co ważne, protokół stanowi jedynie obraz z jednego punktu czasowego podczas wskazanego klinicznie badania bronchoskopowego, co uniemożliwia analizę kinetyki rekrutacji neutrofili, maksymalnej sekrecji chemokin oraz ich ustępowania u poszczególnych pacjentów. Wartości AUC dla pojedynczych analitów zostały wyprowadzone z tej samej kohorty, która posłużyła do identyfikacji biomarkerów, wobec braku niezależnej kohorty walidacyjnej, i powinny być interpretowane jako miary dyskryminacji wewnątrz kohorty, a nie jako zewnętrznie zwalidowana wydajność diagnostyczna; przyjęcie jakiegokolwiek punktu odcięcia dla pojedynczego markera w praktyce klinicznej wymagałoby prospektywnej walidacji w niezależnej kohorcie wieloośrodkowej. Wstępnie określone analizy wrażliwości, ograniczone do próbek o wyższym odzysku, uczestników nieleczonych antybiotykami oraz stratyfikowane według stanu wentylacji mechanicznej i podtypu zapalenia płuc (pozyszpitalne, szpitalne lub związane z respiratorem), nie zmieniły kierunku porównań między grupami.
W przyszłości ograniczenia te można będzie wyeliminować poprzez zastosowanie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek lub CITE-seq do tych samych osadów BALF wykorzystywanych do ilościowego oznaczania białek i komórek, co zostało z sukcesem wdrożone w dużych kohortach pacjentów z bakteryjnym zapaleniem płuc oraz pediatrycznym zapaleniem płuc wywołanym przez Mycoplasma pneumoniae, aby zidentyfikować podgrupy neutrofili pęcherzykowych i makrofagów nierozróżnialne za pomocą tradycyjnej cytometrii przepływowej27,28. Uzupełnienie informacji uzyskanych z analiz przestrzeni pęcherzykowych o dane dostarczone przez obrazową cytometrię masową lub transkryptomikę przestrzenną dopasowanych biopsji, a nawet materiału z sekcji zwłok, pozwoliłoby na kontekstualizację tych informacji29. Powiązanie podłużnego pobierania próbek BALF z oceną antagonistów CXCR1/CXCR2 oraz blokady receptora IL-6, z których oba podejścia wykazały korzyść w zakresie przeżywalności lub wsparcia narządowego w ciężkim zapaleniu płuc i zespole ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), pozwoliłoby również na przetestowanie osi neutrofile–chemokiny, uwydatnionej w tym schemacie postępowania, jako narzędzia wspomagającego decyzje terapeutyczne30,31.
Podsumowując, niniejsze badanie opisuje zintegrowany schemat wizualizacji składający się ze zstandaryzowanych procedur pobierania i przygotowania BALF, siedmioznacznikowego panelu cytometrii przepływowej kwantyfikującego skład neutrofili i monocytów, wielopleksowego testu cytokinowego mierzącego 13 cytokin oraz wspólnej platformy wizualizacji obejmującej analizy UMAP, klasteryzację hierarchiczną, sieć korelacji i PCA. Dzięki zastosowaniu tego schematu w prospektywnej kohorcie 12 dorosłych pacjentów poddawanych klinicznie wskazanej bronchoskopii, analiza wykazała wyraźne przejście w składzie immunologicznych komórek pęcherzyków płucnych z makrofagów na neutrofile u pacjentów z infekcją, wykryła trzymodułowy wzorzec odpowiedzi cytokinowej oraz ujawniła silnie sprzężoną oś neutrofil-chemokina, której nie można zaobserwować przy użyciu pomiarów pojedynczych znaczników. Procedura opiera się wyłącznie na materiale pobranym podczas diagnostyki klinicznej, nie wymaga dodatkowej objętości próbki i może być wykonalna w laboratoriach trzeciego stopnia opieki wyposażonych w aparaturę do wieloparametrowej cytometrii przepływowej i wielopleksowej analizy koralikowej. Szersze zastosowanie oraz jakiekolwiek wykorzystanie poszczególnych analitów jako biomarkerów diagnostycznych będzie wymagało prospektywnej walidacji w niezależnych kohortach wieloośrodkowych. Badanie to przedstawia zatem powtarzalną i bogatą w dane metodologię charakterystyki stanu zapalnego dróg oddechowych w infekcjach oddechowych i stanowi podstawę do jej dalszego rozwoju w ramach badań podłużnych, analiz pojedynczych komórek i analiz przestrzennych oraz oceny terapeutycznej immunomodulacji celowanej w oś neutrofil-chemokina.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Szczerze dziękujemy wszystkim pacjentom i ochotnikom, którzy wzięli udział w tym badaniu, za ich cenny wkład. Wyrażamy wdzięczność Komisji Etycznej za wydanie zgody etycznej (nr zgody 2026HL-038) oraz wytyczne normatywne podczas całego procesu badawczego.
Dziękujemy personelowi medycznemu Oddziału Pulmonologii, Centrum Bronchoskopii oraz Laboratorium Klinicznego za wsparcie w pobieraniu próbek klinicznych, przetwarzaniu płynu z płukania pęcherzyków płucnych oraz detekcji mikrobiologicznej. Jesteśmy również wdzięczni za wsparcie platformy technicznej centralnego laboratorium szpitalnego w zakresie wielowymiarowej cytometrii przepływowej oraz eksperymentów z profilowaniem cytokin metodą multipleksową.
Badania te nie otrzymały żadnego konkretnego grantu z agencji finansujących w sektorach publicznym, komercyjnym ani non-profit.
Dziękujemy wszystkim badaczom, technikom oraz personelowi pielęgniarskiemu zaangażowanemu w ten projekt za ich wysiłki w zakresie przesiewowej kwalifikacji pacjentów, zarządzania próbkami, prowadzenia eksperymentów i opracowania danych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało anty-CD1b przeciwko ludzkim komórkom, Brilliant Violet 421, klon ICRF44 | BioLegend | Nr kat. 301323 | Marker aktywacji neutrofili; kanał lasera fioletowego Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD14, APC/Cyanine7, klon M5E2 | BioLegend | Nr kat. 301820 | Marker wykluczający monocyty i makrofagi; kanał lasera czerwonego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało anty-CD15 przeciwko ludzkiemu antygenowi, PE, klon HI98 | BioLegend | Nr kat. 301906 | Marker linii neutrofilowej; kanał lasera niebieskiego Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało anty-CD16 ludzkie, Brilliant Violet 510, klon 3G8 | BioLegend | Nr kat. 302048 | Dojrzewanie neutrofili i marker komórek NK; kanał lasera fioletowego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało anty-CD45 przeciwko ludzkim komórkom, PerCP, klon HI30 | BioLegend | Nr kat. 304026 / RRID: AB_8938 | Marker panleukocytowy; kanał lasera niebieskiego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://antibodyregistry.org/AB_89338 |
| Przeciwciało przeciwko ludzkiemu CD66b, FITC, klon G10F5 | BioLegend | Nr kat. 305103 | Marker granulocytów; kanał lasera niebieskiego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Przeciwciało przeciwko ludzkiemu HLA-DR, PerCP/Cyanine5.5, klon L243 | BioLegend | Nr kat. 307629 | Marker komórki prezentującej antygen; kanał lasera niebieskiego Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.biolegend.com |
| Automatyczny analizator hematologiczny (Sysmex XN-10) | Sysmex Corporation | Urządzenie (model XN-10) | Stosowane do oznaczenia całkowitej liczby komórek jądrzastych w celu obliczenia bezwzględnej liczby neutrofili Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.sysmex.com |
| Seryjowa albumina wołowa | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Nr kat. A7906 | Stosowany w buforze do barwienia w cytometrii przepływowej (0,5% m/v w PBS z 2 mM EDTA) Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.sigmaaldrich.com/US/pl/product/sigma/a7906 |
| pakiet ComplexHeatmap (R/Bioconductor) | Projekt Bioconductor | v2.20 (otwarte oprogramowanie) | Stosowane do tworzenia map ciepła z grupowaniem hierarchicznym dla danych o cytokinach z analiz multipleksowych Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Cytocentryfuga (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Nr kat. A78303 | Służy do przygotowania preparatów cytologicznych z zawiesiny komórkowej płynu zpłukanego z oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BALF) Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Komplet do izolacji i oczyszczania DNA z tkanek roślinnych Ten komplet umożliwia szybką i łatwą izolację DNA o wysokiej jakości z szerokiej gamy tkanek roślinnych. Metoda ta opiera się na wykorzystaniu kolumienek z krzemionką, co pozwala na skuteczne usunięcie zanieczyszczeń, takich jak wielocukry i polifenole, które często utrudniają dalsze analizy molekularne. Cechy produktu: - Szybki i wydajny protokół izolacji. - Wysoka czystość i wydajność uzyskanego DNA. - Zgodność z wymaganiami dla aplikacji takich jak PCR, sekwencjonowanie i klonowanie. - Zoptymalizowany dla różnych rodzajów tkanek roślinnych. Zawartość zestawu: - Bufory lityczne i oczyszczające. - Kolumienki do wiązania DNA. - Centryfugówki do zbierania ekstraktu. - Instrukcja obsługi. Zastosowania: - Badania genomiki roślin. - Analizy markerów molekularnych. - Diagnostyka fitopatologiczna. - Badania nad ekspresją genów. |
| Roztwór do lizy erytrocytów (BD FACS Lysing Solution, koncentrat 10X) | BD Biosciences | Nr kat. 349202 | Stosowany do lizy erytrocytów po barwieniu powierzchniowym Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.bdbiosciences.com |
| Kwas etylendiaminotetraoctowy (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Nr kat. AM9260G | Stosowany w buforze do barwienia w cytometrii przepływowej w stężeniu 2 mM Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Zestaw do izolacji RNA z tkanek i komórek roślinnych (Plant RNA Isolation Kit) |
| Barwnik do oceny żywotności z możliwością utrwalania (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Nr kat. 423105 | Wykluczanie komórek żywych i martwych przed bramkowaniem; kanał lasera czerwonego URL: https://www.biolegend.com |
| Elastyczny wideobronchoskop | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Instrument (model BF-1TQ290) | Stosowane do BAL w warunkach sedacji umiarkowanej Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.olympus-global.com |
| Cytometr przepływowy, wielokolorowy (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Przyrząd (model CytoFLEX LX, konfiguracja sześciu laserów) | Stosowane do akwizycji siedmiomarkerowego panelu przepływowego dla neutrofili/monocytów Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.beckman.com |
| Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Służy do kompensacji i manualnego bramkowania plików FCS Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.flowjo.com |
| Pakiet FlowSOM (R/Bioconductor) | Projekt Bioconductor | v2.12 (otwarte oprogramowanie) | Stosowane do klastrowania metodą samoorganizujących się map oraz metaklastrowania danych z cytometrii przepływowej Adres URL: https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (oprogramowanie do analizy statystycznej i tworzenia wykresów) | Oprogramowanie GraphPad (Dotmatics) | v10 | Wykorzystano do wygenerowania końcowych rycin Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.graphpad.com |
| Odczyn blokujący ludzkie receptory Fc (Human TruStain FcX) | BioLegend | Nr kat. 42301 / RRID: AB_2818986 | Blokowanie receptorów Fc przed barwieniem przeciwciałami Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| pakiet igraph (R) | CRAN | v2.0 (otwarte oprogramowanie) | Służy do konstruowania i wizualizacji grafu sieci korelacji Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Probówki kriogeniczne o niskim wiązaniu białek, 2,0 ml | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Nr kat. 375418 | Wykorzystywane do aliquotów nadsączu BALF do analizy cytokin URL: Zestaw do wyodrębniania RNA z tkanek i komórek (Invitrogen PureRNA Mini Kit) |
| Platforma do wieloanalitycznego immunoanalizy opartej na koralikach Luminex (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Instrument (model MAGPIX) | Wykorzystywane do akwizycji danych w multipleksowym analizie cytokin Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.luminexcorp.com |
| May-Grüroztwór barwiący Giemsa-Wrwald | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Nr kat. GS50 | Stosowane do różnicowego liczenia komórek metodą cytospinowania Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.sigmaaldrich.com/US/pl/product/sigma/gs50 |
| pakiet mice (R) | CRAN | v3.16 (otwarte oprogramowanie) | Stosowane do wielokrotnej imputacji za pomocą łańcuchowych równań w analizie wrażliwości Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=mice |
| Multiplexowy panel cytokin/chemokin oparty na koralikach magnetycznych (13-plex, niestandardowy; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Nr kat. HCYTOMAG-60K | Niestandardowy panel pomiarowy dla 13 analitów opisanych w sekcji 2.4 Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.merckmillipore.com |
| sitko do komórek z nylonowej siatki, 70 µm | Corning (Falcon) | Nr kat. 352350 | Stosowane do filtracji mechanicznej BALF w celu usunięcia grudek śluzu Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. https://www.corning.com |
| Bufor fosforanowy (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Nr kat. 1010023 | Bufor podstawowy do resuspensji i barwienia komórek Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. Zestaw do izolacji RNA i DNA z tkanek zwierzęcych (Animal Tissue RNA and DNA Isolation Kit) |
| pakiet pROC (R) | CRAN | v1.18 (otwarte oprogramowanie) | Służy do generowania krzywych ROC oraz wartości AUC Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (środowisko obliczeń statystycznych) | R Core Team | v4.4 (otwarte oprogramowanie) | Platforma do analiz statystycznych i wizualizacji Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.r-project.org |
| pakiet rstatix (R) | CRAN | v0.7 (open source) | Stosowane do porównań grupowych i statystyk korelacji Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| pakiet Rtsne (R) | CRAN | v0.17 (otwarte oprogramowanie) | Wykorzystywane do osadzeń t-SNE Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Kulek kompensacyjnych barwionych pojedynczo (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Nr kat. 01-22-42 | Stosowane jako kontrole kompensacji jednobarwnej Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Zestaw do izolacji RNA z tkanek i komórek zwierzęcych (TRIzol) Przeznaczenie: Zestaw TRIzol jest przeznaczony do izolacji wysokiej jakości RNA całkowitego z szerokiej gamy tkanek i komórek zwierzęcych. Metoda ta opiera się na jednoczesnej lizie komórek, denaturacji białek i izolacji RNA w jednym kroku, co zapewnia wysoką wydajność i czystość uzyskanego materiału genetycznego. Zalety: - Szybka i efektywna izolacja RNA z różnych rodzajów próbek. - Wysoka czystość i integralność wyizolowanego RNA, odpowiednia do analizy RT-qPCR, Northern blotting oraz sekwencjonowania. - Skuteczne usuwanie zanieczyszczeń białkowych i genomicznego DNA. - Standaryzowana procedura zapewniająca powtarzalność wyników. Zawartość zestawu: - Odczynnik TRIzol - Instrukcja obsługi Warunki przechowywania: Przechowywać w temperaturze od 4°C do -20°C zgodnie ze wskazaniami producenta. |
| Roztwór chlorku sodu do zastrzyków, 0,9% (sterylna sól fizjologiczna) | Baxter International | Nr kat. 2B1324 | Stosowane do instylacji BAL (10–150 ml, 20–alikwoty o objętości 40 mL w 37 °C) Adres URL: https://www.baxter.com |
| pakiet uwot (R) | CRAN | v0.2 (otwarte oprogramowanie) | Stosowane do redukcji wymiarowości UMAP Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (oprogramowanie do akwizycji danych z testów multipleksowych i dopasowywania krzywych) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Oprogramowanie producenta urządzenia do dopasowania krzywej wzorcowej modelem 5PL Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. https://www.luminexcorp.com |
Bibliografia
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.