Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Układ optyczny do oceny mechaniki przedsionków i komór w sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa

66 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 sierpnia 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje procedurę wycięcia i kaniulacji serca myszy, a także przygotowanie i konfigurację systemu retrospektuwną perfuzji Langendorffa. Układ eksperymentalny jest sprzężony z wysokorozdzielczym systemem optycznym, zaprojektowanym do oceny odpowiedzi mechanicznych przedsionków i komór przy jednoczesnym zachowaniu ich naturalnej dynamiki.

Streszczenie

Serce myszy służy jako szeroko stosowany model w badaniach sercowo-naczyniowych, co jest możliwe dzięki postępom w technologiach inżynieryjnych. Jednak ocena kurczliwości przedsionków i komór pozostaje wyzwaniem ze względu na niewielki rozmiar serca myszy. Niniejsze badanie wprowadza nową metodologię oceny kurczliwości i częstotliwości akcji serca w nienaruszonym, izolowanym narządzie. Wykorzystanie serca myszy perfundowanego metodą Langendorffa w połączeniu z wysokorozdzielczym systemem optycznym umożliwia ocenę kurczliwości przedsionków i komór. Układ eksperymentalny rozwiązuje problemy związane z małym rozmiarem serca i wysoką częstotliwością skurczów, zapewniając jednocześnie pozyskiwanie sygnałów o wysokiej rozdzielczości. Synchronizacja między częstotliwością stymulacji a częstotliwością skurczów serca w zakresie od 420 do 660 uderzeń na minutę (bpm) była zgodna z wynikami uzyskanymi metodą aukotoniczną. Dodatkowo pomiary skrócenia komór oraz dynamiczne sygnały z przedsionków pozwalają na określenie skurczu przedsionkowo-komorowego. Metoda ta jest odpowiednia do oceny kurczliwości i częstotliwości akcji w nienaruszonym, izolowanym sercu, bez wpływów farmakologicznych lub systemowych. Wyniki te dowodzą, że system optyczny umożliwia pomiar odpowiedzi skrócenia komór i przedsionków.

Wprowadzenie

Fizjologia serca kryje w sobie wiele nieodkrytych aspektów; kluczowe procesy, takie jak rozrusznikowa aktywność serca oraz sprzężenie pobudzenie-skurcz, stanowią centralne zagadnienia, które są przedmiotem ciągłych badań1. Choć wpływ szumu biologicznego na kurczliwość serca2 oraz aktywność rozrusznikową pozostaje słabo poznany1, nowe metody obrazowania optycznego pozwoliły na przedstawienie nowych paradygmatów3,4.

Dwie metodologie eksperymentalne z wykorzystaniem układu Langendorffa wniosły nieoceniony wkład w pomiar funkcji serca. Pierwszą z nich jest metoda skurczu izowolumetrycznego, w której sygnał uzyskuje się za pomocą niewielkiego balonu wprowadzonego do lewej komory5,6,7. Drugą jest metoda rejestracji aukotonicznej, polegająca na uzyskaniu sygnału poprzez przyszycie jednego końca nici do wierzchołka serca, a drugiego do mechanicznego urządzenia rejestrującego, w celu pomiaru skurczów aukotonicznych wzdłuż osi serca2,8. Niemniej jednak ocena kurczliwości przedsionków i komór serca myszy jest trudna ze względu na jego niewielki rozmiar. Co więcej, preparatyka wymaga pewnego stopnia delikatności, ponieważ serce jest podatne na uszkodzenia9,10,11,12,13.

System optyczny do oceny dynamiki mechanicznej serca myszy posiada kilka nowatorskich cech i zalet. Po pierwsze, metoda ta nadaje się do oceny kurczliwości i częstotliwości akcji serca w nienaruszonym, izolowanym sercu, bez wpływu czynników farmakologicznych lub systemowych. Protokół ten można również skutecznie zastosować w eksperymentach oceniających uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjne podczas badania terapii farmakologicznych, regeneracyjnych lub opartych na tlenoterapii.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół rejestracji parametrów biofizycznych funkcji skurczowej serca myszy z wykorzystaniem wysokorozdzielczego systemu optycznego. Metoda ta pozwala na ocenę kurczliwości i częstotliwości akcji serca w nienaruszonym, izolowanym sercu. Ponadto umożliwia ona ocenę kurczliwości przedsionków i komór. Preparat serca myszy w układzie Langendorffa zawiera udoskonalenie obejmujące niewielką modyfikację, która minimalizuje spadek temperatury perfuzatu oraz artefakty ruchowe, nie hamując przy tym skurczów mięśni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Federalnymi Przepisami dotyczącymi Eksperymentów i Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Meksyk). W niniejszym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J o masie 28–34 g i wieku 8–14 tygodni. Wszystkie materiały i urządzenia użyte w protokole są wymienione w Tabeli Materiałów. Pliki Uzupełniające 1–11 zawierają pomocnicze schematy, instrukcje do oprogramowania, programy analityczne, dane dotyczące stymulacji oraz pliki aplikacyjne do protokołu.

1. Przygotowanie roztworów stokowych

  1. Przygotuj wcześniej dwa roztwory stokowe i przechowuj je w lodówce w temperaturze 4 °C: (1) Roztwór stokowy I, 1 L (w wodzie dejonizowanej; w g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) oraz (2) Roztwór stokowy II, 0,1 L (w wodzie dejonizowanej; w g/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    UWAGA: Roztwory można stosować do 30 dni od momentu przygotowania. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Podłączenie i czyszczenie układu Langendorffa

  1. Połączyć zbiornik (1), łaźnię termostatyczną zbiornika (2), pompę perfuzyjną (3), wężownicę (4), recyrkulator wężownicy (5), system monitorujący (6) oraz system drenażu (8), zgodnie z przedstawionym na Rycina 1A.
    UWAGA: Połączenie między systemem monitorowania a systemem drenażu zostało przedstawione bardziej szczegółowo w Plik uzupełniający 1.
  2. Napełnić układ Langendorffa 1 l wody dejonizowanej o temperaturze 50 °Cnastępnie uruchomić pompy perfuzyjne i drenażowe (Plik uzupełniający 1, system drenażu)Po około 20–30 min usunąć ciecz z układu, a następnie przejść do następnego kroku.
    UWAGA: Należy upewnić się, że w układzie nie występują wycieki ani spadki ciśnienia. W przypadku ich wystąpienia nie należy kontynuować eksperymentu.
  3. Napełnij system 1 l 1% kwasu octowego (rozpuszczonego w wodzie dejonizowanej), następnie wyłącz pompy perfuzyjne i drenujące i odczekaj 60 min, po czym włącz pompy, aby usunąć ciecz.
  4. Powtórz krok 2.2 dwukrotnie.
  5. Napełnić układ 70% etanolem (rozpuszczonym w wodzie dejonizowanej), aby zapobiec przyleganiu składników roztworu.
    UWAGA: System perfuzji Langendorffa należy czyścić co dziesięć eksperymentów lub raz w miesiącu. Protokół czyszczenia przed eksperymentem został wyjaśniony w sekcja 4Podczas gdy protokół czyszczenia po zakończeniu eksperymentu został szczegółowo opisany w sekcja 8.

3. Przygotowanie roztworu Tyrode'a w trakcie eksperymentu

  1. Przygotować 1 L roztworu o stężeniach w mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucose, 10 HEPES, z pH skorygowanym do 7,35 ± 0,05 za pomocą NaOH.
    1. Wymieszać 100 mL Stock I z 700 mL wody dejonizowanej przy stałym mieszaniu, a następnie podnieść temperaturę roztworu do 37 °C; utrzymać natlenienie roztworu, podłączając butlę z O2 do kamienia napowietrzającego, jak pokazano na Rysunku 1A (1).
    2. Dodać 3,6 mL Stock II oraz 96,4 mL wody dejonizowanej, aby uzyskać stężenie 1,8 mM CaCl2(2H2O), a następnie dodać NaOH w celu skorygowania pH do 7,35 ± 0,05.
    3. Uzupełnić wodą dejonizowaną do objętości 1 L, aby otrzymać roztwór Tyrode'a.
      UWAGA: Zaleca się przechowywanie 100 mL roztworu w lodówce w temperaturze 4 °C; objętość ta będzie potrzebna później w kroku 6.

4. Przygotowanie układu Langendorffa

UWAGA: Jeśli w dniu eksperymentu układ Langendorffa nie został napełniony etanolem, nie zaleca się kontynuowania procedury; zamiast tego należy powtórzyć sekcję 2.

  1. Włącz pompy perfuzyjne i drenażowe. Ustaw przepływ pompy perfuzyjnej na 3 mL/min, a pompy drenażowej na 10 mL/min. Opróżnij system.
  2. Wypełnij system 1 L wody dejonizowanej o temperaturze 37 °C, a następnie spuść wodę.
  3. Wypełnij system roztworem Tyrode'a przygotowanym w kroku 3 i utrzymuj roztwór w temperaturze fizjologicznej oraz przy stałym natlenieniu.
  4. Włącz łaźnie termostatyczne zbiornika i rekursulator wężownicowy. Ustaw temperaturę zbiornika (Rysunek 1A (2)) na 38 °C, aby utrzymać roztwór w warunkach fizjologicznych. Ustaw temperaturę wężownicy (Rysunek 1A (5)) na 40 °C. Pozwala to zrekompensować spadek temperatury roztworu w systemie Langendorffa.
    UWAGA: Jeśli temperatura roztworu Tyrode'a na wylocie z systemu nie jest fizjologiczna (37 ± 0,5 °C), dostosuj temperaturę rekursulatora wężonicowego. Nie zaleca się przechodzenia do kroku 6 do momentu ustabilizowania się temperatury na odpowiednim poziomie.
  5. Włącz monitor ciśnienia (Plik uzupełniający 1, system monitorowania) i skalibruj go w zakresie 0–200 mmHg. Do kalibracji systemu dostępna jest aplikacja do monitorowania i stymulacji (Plik uzupełniający 3 oraz Plik uzupełniający 11).
    UWAGA: Niezbędne jest sprawdzenie, czy w systemie nie występują spadki ciśnienia ani pęcherzyki powietrza. Jeśli w systemie znajdują się pęcherzyki, tymczasowo zablokuj dolny wylot wężownicy i otwórz górny zawór; spowoduje to wypełnienie kolumny, co umożliwi usunięcie pęcherzyków na zewnątrz. Nie zaleca się kontynuowania eksperymentu do czasu zweryfikowania tego stanu.

5. Układ optyczny14

  1. Zmontuj kamerę CMOS (Rysunek 1A, 10), regulowany obiektyw kamery (LC) oraz system oświetlenia.
    UWAGA: System oświetlenia składa się z dwóch diod LED (Rysunek 1A, 9), dwóch plano-konweksyjnych soczewek oświetlających (LI), sterownika oświetlenia (Rysunek 1A, 11), karty akwizycyjnej (Plik uzupełniający 1, system monitorowania) oraz elementów wsporczych zaprojektowanych w 3D (Plik uzupełniający 1).
  2. Umieść obiekt referencyjny o objętości około 1,000 mm3 w odległości 100–200 mm od obiektywu kamery (centrum Rysunku 1A).
    UWAGA: Obiekt musi zostać umieszczony w pozycji serca w układzie Langendorffa. Pozycję tę można zaobserwować na Rysunku 1B, a konkretnie w centrum obrazu, w miejscu padania wiązek światła.
  3. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu z kamery, a następnie ustaw kamerę z podpróbkowaniem 4x (4 piksele = 1 subpiksel). Ustaw obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 200 x 200 subpikseli (Plik uzupełniający 2).
    UWAGA: Przy tej konfiguracji możliwa jest rozdzielczość czasowa wynosząca 750 klatek na sekundę (fps).
  4. Włącz system oświetlenia (Plik uzupełniający 1), wyreguluj wiązki światła tak, aby skupiały się na obiekcie referencyjnym, i uzyskaj jednorodne oświetlenie (Rysunek 1B).
  5. Dostosuj natężenie światła padającego na obiekt referencyjny, aby uniknąć prześwietlenia obrazu.
    UWAGA: Obraz powinien wyglądać jak na Rysunku 2A (lub Rysunku 1C, PC sterujący). Odblaski na powierzchni obiektu (serca) należy zminimalizować w możliwie największym stopniu, nie tracąc przy tym definicji jego konturów. Można to osiągnąć poprzez regulację mocy sterownika oświetlenia lub skrócenie czasu ekspozycji w ustawieniach kamery.
  6. Ustaw ostrość obiektywu kamery, aby uzyskać wyraźny obraz obiektu referencyjnego (Rysunek 1C, PC sterujący). Upewnij się, że obiekt referencyjny zajmuje 80% pola widzenia (Rysunek 2A), aby uzyskać skalę przeliczeniową wynoszącą około 61 µm na subpiksel.
    UWAGA: Układ optyczny automatycznie aktywuje system oświetlenia, gdy kamera zostanie ustawiona w trybie akwizycji (Rysunek 1A oraz Plik uzupełniający 2). Zaleca się utrzymywanie kamery w trybie czuwania, aby system oświetlenia pozostał wyłączony i był aktywowany tylko podczas okresów gromadzenia danych eksperymentalnych, co pozwoli uniknąć przegrzania.

6. Procedury chirurgiczne i kaniulacyjne

  1. Heparynizacja i znieczulenie
    1. Przygotować mieszankę znieczulającą zawierającą tiletaminę-zolazepam (40 mg/kg masy ciała myszy) oraz ksylazynę (10 mg/kg masy ciała myszy), a następnie rozcieńczyć do 200 µL roztworem soli fizjologicznej.
    2. Wstrzyknąć mieszankę znieczulającą dootrzewnowo za pomocą igły 27 G. Odczekać, aż mysz wejdzie w stan głębokiej narkozy.
      UWAGA: Zweryfikować brak odruchu w odpowiedzi na bodziec w kończynach lub ogonie (zazwyczaj wystarcza 10 min).
    3. Wstrzyknąć 200 UI niefrakcjonowanej heparyny dootrzewnowo za pomocą igły 27 G i odczekać około 5 min przed kontynuacją eksperymentu.
  2. Ekstrakcja i kaniulacja
    1. Umieścić mysz w pozycji na plecach, usunąć sierść i skórę z obszaru klatki piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    2. Wykonać nacięcie brzuszne poniżej przepony, dbając o zachowanie jej integralności.
    3. Kontynuować nacięcie poprzeczne przepony i szybko przeprowadzić obustronną torakotomię wstępującą przez żebra, a następnie usunąć ścianę żebrową.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić serca. Jeśli serce zostanie naruszone lub uszkodzone podczas procedury, zaleca się przerwanie eksperymentu.
    4. Ostrożnie uchwycić górne struktury serca za pomocą pęsety precyzyjnej: łuk aorty oraz naczynia przyległe. Delikatnie unieść, aby wykonać cięcie od dołu ku górze, a następnie usunąć serce wraz z płucami.
    5. Szybko przenieść serce do szalki Petriego zawierającej 50 mL roztworu Tyrode'a w temperaturze 4 °C w celu wstępnego płukania.
      UWAGA: Od momentu nacięcia przepony zwierzę zacznie odczuwać duszność; od tego punktu istnieje 60 s okna czasowego na wykonanie kroków 6.2.3–6.2.6. Przekroczenie tego limitu czasu może spowodować uszkodzenia niedokrwienne.
    6. Usunąć płuca i nadmiar tkanki tłuszczowej, aby odsłonić łuk aorty, korzystając z mikroskopu stereoskopowego i nożyczek precyzyjnych.
      UWAGA: Podczas oczyszczania tkanki należy upewnić się, że łuk aorty nie został uszkodzony. Jeśli aorta zostanie przecięta poniżej tętnicy szyjno-głowowej, kaniulacja będzie utrudniona, co może prowadzić do nieszczelności ciśnienia.
    7. Przenieść serce do specjalnie przygotowanej podstawy do kaniulacji zawierającej 50 mL buforu Tyrode'a w temperaturze 4 °C i wprowadzić koniec aorty do kaniuli wykonanej z igły 20 G (Supplementary File 1).
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić zastawki aortalnej. Jeśli zastawka zostanie naruszona, serce spuchnie, a ukrwienie wieńcowe nie zostanie prawidłowo przepłukane.
    8. Zawiązać dwa węzły kaniulacyjne przy użyciu szwu jedwabnego 4/0: pierwszy w wgłębieniu dystalnie od końcówki kaniuli, a drugi przed pniem szyjno-głowowym (Supplementary File 1).
    9. Powoli podawać roztwór Tyrode'a za pomocą strzykawki 1 mL wypełnionej buforem w temperaturze pokojowej. Zweryfikować, czy tkanka wieńcowa staje się przejrzysta, aby potwierdzić prawidłową kaniulację.
    10. Usunąć tkankę tłuszczową, aby uzyskać dostęp do komór i przedsionków.
      UWAGA: Należy unikać przekraczania 5 min kaniulacji, aby zachować żywotność serca.
    11. Przenieść serce do systemu Langendorffa i pozostawić do stabilizacji na 30 min.
      UWAGA: Serce umieszcza się w centrum systemu (Ryc. 1A,B), zawieszając je pionowo. Podczas zawieszania serca należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Jeśli do tego dojdzie, ciśnienie wzrośnie powyżej 140 mmHg, serce zacznie puchnąć i przestanie być żywotne.
      UWAGA: Montaż w systemie Langendorffa jest zakończony, gdy serce wykazuje stabilną mechanicznie odpowiedź, naturalną częstotliwość oscylacji wynoszącą około 360 uderzeń na minutę (BPM) oraz ciśnienie perfuzji między 60 a 110 mmHg.

7. Protokół tempa i rejestracja wideo

  1. Żywotność serca
    1. Zweryfikować, czy ciśnienie w tętnicach wieńcowych mieści się w zakresie 60–110 mmHg przy użyciu pompy perfuzyjnej o wydajności 3 mL/min. Jeśli ciśnienie perfuzji wieńcowej spadnie poniżej 60 mmHg, należy nieznacznie zwiększyć natężenie przepływu pompy perfuzyjnej (niskie ciśnienie spowoduje, że serce stanie się blade i wiotkie). I odwrotnie, jeśli ciśnienie przekroczy 110 mmHg, należy nieznacznie zmniejszyć natężenie przepływu pompy (nadmierne ciśnienie wywoła obrzęk tkanek i progresywny wzrost ciśnienia, aż do wystąpienia zatrzymania akcji serca).
      UWAGA: Utrzymywanie ciśnienia perfuzji poza wspomnianym optymalnym zakresem przez dłuższy czas doprowadzi do nieodwracalnego naruszenia żywotności serca.
    2. Umieścić serce w pozycji frontalnej tak, aby w kamerze uzyskano pełny widok z przodu. Dostosować pozycję tak, aby oba przedsionki były widoczne w kamerze (Rysunek 2A).
    3. Ostrożnie umieścić elektrody platynowe powierzchniowo na górnej części prawego przedsionka w miejscu węzła zatokowego. Wykorzystać podgląd z kamery jako przewodnik, aby wprowadzić elektrody w pole widzenia. Upozycjonować elektrodę tak, aby nie zasłaniała prawego przedsionka. Monitorując podgląd na żywo z kamery, powoli posuwać elektrodę, aż zetknie się ona z tkanką przedsionka, uważając, aby nie wywrzeć nadmiernego nacisku (co spowodowałoby spłaszczenie prawego przedsionka na obrazie).
      UWAGA: Jeśli czynność zostanie wykonana prawidłowo, obraz z kamery będzie przypominał Rysunek 2A.
    4. Uruchomić aplikację do monitorowania i stymulacji (Plik uzupełniający 11) i włączyć kartę akwizycji danych (Rysunek 1A (6)). Ustawić wartości parametrów bodźca: amplitudę na 2 V, częstotliwość na 420, 540 i 720 impulsów na minutę (PPM) z prostokątnym impulsem o cyklu pracy 7 ms (wstawka na Rysunku 2A).
    5. Przeprowadzić stymulacje sprawdzające żywotność, zaczynając od najniższej częstotliwości, stosując czas stymulacji 20 s, po którym następuje 20 s okresu regeneracji (czasu spoczynku) między zdarzeniami.
      UWAGA: Żywotność serca należy ocenić za pomocą monitorowania kamerą. Jeśli organ jest funkcjonalnie sprawny fizjologicznie, zaobserwowana zostanie synchronizacja między zastosowanym bodźcem a odpowiedzią serca, czemu towarzyszyć będzie prawidłowa koordynacja między jamami serca. I odwrotnie, brak żywotności objawi się utratą koordynacji jam lub wyłącznie obecnością izolowanych skurczów przedsionków.
    6. Zamknąć drzwi komory, ponieważ eksperyment jest wrażliwy na światło w pomieszczeniu i wahania termiczne (Rysunek 1C).
      UWAGA: Drzwi komory muszą pozostać zamknięte podczas czasu trwania eksperymentu. Monitorować żywotność serca za pomocą kamery oraz ciśnienie perfuzji.
  2. Rejestracja danych
    1. Zastosować protokół stymulacji, który składa się z serii impulsów prostokątnych o czasie trwania 30 s, po których następuje 30 s przerwy w sygnale. W każdej serii stymulacji ustawić następujące wartości parametrów bodźca: amplitudę 2 V, cykl pracy 7 ms oraz częstotliwość w zakresie od 360 do 720 PPM.
      UWAGA: Protokół stymulacji rozpoczyna się od 360 PPM i wzrasta o 60 PPM w każdym punkcie czasowym (wstawka na Rysunku 2A).
    2. Stale rejestrować filmy z dynamiki widoku frontalnego serca w formacie .avi za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu z kamery (Plik uzupełniający 2). Wykonać 20 s nagranie wideo dla każdej serii stymulacji. Nagrać 20 s segment rozpoczynający się 5 s po rozpoczęciu stymulacji. Reprezentatywne surowe nagranie znajduje się w Filmie uzupełniającym 1.
      UWAGA: Komputer jednocześnie rejestruje zastosowaną serię stymulacji (.xls, Plik uzupełniający 9) do każdego nagranego filmu (.avi), generowane odpowiednio przez aplikację do monitorowania i stymulacji oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu z kamery (Plik uzupełniający 2 i Plik uzupełniający 3).
    3. Zweryfikować żywotność serca poprzez porównanie pierwszego filmu, nagranego przed rozpoczęciem protokołu stymulacji, z drugim filmem, nagranym po zastosowaniu protokołu (Rysunek 2B).

8. Czyszczenie systemu perfuzyjnego Langendorffa po zakończeniu eksperymentu

  1. Usuń stymulator i platynowe elektrody EKG. Wyjmij serce z układu i odlej wszystkie pozostałości roztworu Tyrode'a.
  2. Wyłącz system optyczny i zamknij zawór O2.
  3. Przepłucz układ 1 L dejonizowanej wody o temperaturze 37 °C, a następnie opróżnij go z płynu.
  4. Powtórz kroki 2.4 i 2.5.
  5. Wyłącz wszystkie systemy i urządzenia.

9. Przetwarzanie wideo

  1. Rozpocznij od zaimportowania każdego filmu do oprogramowania obliczeniowego i zastosowania funkcji normalizacji wideo15.
  2. Wybierz obszar zainteresowania (ROI), który obejmuje obszar serca. Przeprowadź segmentację obrazu w celu usunięcia szumów tła, elektrod oraz kaniuli (Supplementary File 4).
    UWAGA: Aby prawidłowo wybrać obszar obrazu do usunięcia, należy zapoznać się z Supplementary File 10.
  3. Przeprowadź globalną analizę dynamiki mechanicznej (Supplementary File 5). Przykłady zmienności i sygnałów pomocniczych przedstawiono na Supplementary Figure S1, Supplementary Figure S2 oraz Supplementary Figure S3.
    1. Zastosuj operatory morfologiczne do każdej klatki filmu, aby wykryć obrys serca, a następnie zastosuj algorytm wypełniania klatki w celu wygenerowania maski15.
    2. Policz piksele w obrębie segmentowanego obszaru w każdej klatce, a następnie znormalizuj tę liczbę przez całkowitą liczbę pikseli w obrazie, aby uzyskać sygnał dynamiczny (wstawka w Figure 2B oraz Supplementary Figure S3).
    3. Zastosuj dwukierunkowy filtr Butterwortha 5. rzędu w zakresie od 3 do 100 Hz do otrzymanego sygnału, aby stłumić szumy wysokiej częstotliwości oraz artefakty wynikające z kapania perfuzji15.
    4. Znormalizuj sygnały we wszystkich filmach, korzystając z zarejestrowanych wartości maksymalnych i minimalnych.
    5. Wyznacz częstotliwość akcji serca, obliczając odstęp między dwiema wartościami o maksymalnej amplitudzie (IAA (s)) dla każdego sygnału dynamicznego i stymulacyjnego.
    6. Oblicz częstotliwość w BPM za pomocą następującego wzoru:
      Równanie obliczania częstotliwości pokazujące, że częstotliwość akcji serca jako BPM równa się 60 podzielone przez IAA.
    7. Wygeneruj mapy Poincarégo z danych IAA, aby zilustrować zmienność w okresach krótkoterminowych i długoterminowych16,17,18 (Supplementary Figure S1 oraz Supplementary Figure S2).
      UWAGA: Więcej szczegółowych informacji znajduje się w Supplementary File 10.
  4. Przeprowadź analizę segmentową dynamiki mechanicznej komór (Supplementary File 6).
    1. Zastosuj binaryzację obrazu. Użyj operatorów morfologicznych do wyznaczenia obszaru komór, dostosowując go do geometrii eliptycznej bez naruszania ROI15.
    2. Dopasuj minimalną elipsę do obszaru komór w każdej klatce. Wyodrębnij współrzędne zestawu punktów dystalnych w klatce. Użyj zestawu 10–20 punktów w każdym ekstremum wzdłuż osi Y (Figure 3A). Reprezentatywny wynik szacowania elipsy przedstawiono w Supplementary Movie 2.
    3. Oblicz skrócenie komór jako średnią odległość między punktami ekstremalnymi wzdłuż osi Y w każdym filmie19.
    4. Zastosuj dwukierunkowy filtr Butterwortha 5. rzędu w zakresie od 3 do 100 Hz do otrzymanego sygnału, aby stłumić szumy wysokiej częstotliwości oraz artefakty wynikające z kapania perfuzji15.
    5. Znormalizuj sygnał skrócenia komór względem wszystkich filmów uzyskanych dla każdego stymulowania oraz oblicz częstotliwość akcji serca i opóźnienie zgodnie z krokami 9.3.5–9.3.6.
      UWAGA: Wyznaczane są parametry, takie jak czas trwania cyklu komorowego (DVE), czas trwania rozkurczu (DVW), odstęp międzykomorowy (IVV) oraz amplituda komorowa (VA) (Figure 3A).
      UWAGA: Więcej szczegółowych informacji znajduje się w Supplementary File 10.
  5. Przeprowadź analizę segmentową dynamiki mechanicznej przedsionków (Supplementary File 7).
    1. Użyj dwóch ROI do wyznaczenia przedsionków (Figure 3C).
    2. Analizuj każdy przedsionek oddzielnie.
      1. Użyj operatorów morfologicznych do obrysowania przedsionków, dostosowując je bez naruszania ROI15. Zastosuj algorytm zwiększania kontrastu w celu obrysowania każdego przedsionka20,21.
      2. Zastosuj binaryzację obrazu i określ liczbę pikseli różniących się od zera na klatkę, aby uzyskać sygnał dynamiczny przedsionków.
      3. Zastosuj dwukierunkowy filtr Butterwortha 5. rzędu w zakresie od 3 do 100 Hz do otrzymanych sygnałów, aby stłumić szumy wysokiej częstotliwości oraz artefakty wynikające z kapania perfuzji15.
      4. Oblicz średnią z dwóch sygnałów przedsionkowych (Figure 3D).
    3. Znormalizuj sygnał skrócenia przedsionków względem wszystkich filmów uzyskanych dla każdego stymulowania oraz oblicz częstotliwość akcji serca i opóźnienie zgodnie z krokami 9.3.5–9.3.6.
      UWAGA: Wyznaczane są parametry, takie jak czas trwania cyklu przedsionkowego (DAE), odstęp przedsionkowo-przedsionkowy (IAT) oraz amplituda przedsionkowa (AA) (Figure 3D). Więcej szczegółowych informacji znajduje się w Supplementary File 10.
  6. Przeprowadź analizę elektromechaniczną13,22 (Supplementary File 8).
    1. Porównaj dane stymulacji z sygnałami przedsionkowymi i komorowymi (Figure 3D).
    2. Oblicz czas propagacji w systemie przewodzącym serca, wyznaczając opóźnienie między zdarzeniami przedsionkowymi a komorowymi (AVD), przyjmując zastosowany bodziec jako punkt odniesienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eksperymenty dotyczące funkcji mechanicznych serca są przeprowadzane przy użyciu aparatu Langendorffa, jak pokazano na Rysunku 1A (góra). Systemy monitorowania i optyczne umożliwiają rejestrację wideo po uruchomieniu sterowania oświetleniem, co przedstawiono na Rysunku 1A (dół). Rysunek 1C ilustruje widok zewnętrzny szafki z termostatem, zaprojektowanej w celu odizolowania serca od wahań temperatury...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Serce myszy jest bardzo wrażliwe na wahania temperatury2,9,10,11,22. W tym eksperymencie perfundowane serce zostało umieszczone w pozycji pionowej. Wprowadziliśmy niewielką modyfikację metody perfuzji Langendorffa, aby zminimalizować spadek temperatury perfuzatu oraz artefakty ruchowe. Do układu wężowatego dodano pompę recyrkulacyjną w celu zminimalizowania ut...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez grant nr LN-2025-C-23 finansowany przez Sekretariat Nauki, Humanistyki, Technologii i Innowacji (SECIHTI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
strzykawka 1 mLBD Plastipak302485procedura chirurgiczna
igła 20 GNIPROAH-2032kaniula aortalna
regulowana soczewka 25 mm z powiększeniem 8x-100xGenericN/Asoczewka kamery systemu optycznego; określona ogólnie jako regulowana soczewka kamery
igła 27 GBD PrecisionGlide302358procedura chirurgiczna
elementy wspierające projektowane w 3DCINVESTAVN/Aniestandardowe elementy wspierające projektowane w 3D
szew jedwabny 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901kaniula aortalna
zasilacz 40-ASTERENPRL-25zasilacz LED
kamień napowietrzającyN/AN/Anatlenianie roztworu Tyroda
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306roztwór Tyroda
D-glukozaJ.T. Baker1916-01roztwór Tyroda
pompa drenażowaCINVESTAVN/Aniestandardowa pompa drenażowa; określona ogólnie jako pompa drenażowa
soczewka plano-konweksowa, F = 25,4 mmTHORLABSLA1951-Asoczewka oświetlająca systemu optycznego; określona ogólnie jako plano-konweksowa soczewka oświetlająca
lodowaty kwas octowySigma-Aldrich695092czyszczenie systemu Langendorffa
heparynaPiSA060M91antykoagulant
HEPESSigma-AldrichH3375roztwór Tyroda
diody LED o wysokiej mocyLuminiusCBT-90-G-L11-C12źródło światła LED
system oświetleniaCINVESTAVN/Aniestandardowy system oświetlenia; określony ogólnie jako system oświetlenia
KClCTR SCIENTIFICCTR02196roztwór Tyroda
oprogramowanie LabVIEW wersja 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aoprogramowanie użyte do aplikacji monitorowania i stymulacji; określone ogólnie jako aplikacja monitorowania i stymulacji
oprogramowanie MATLABThe MathWorksN/Aoprogramowanie obliczeniowe dla programów normalizacji, segmentacji i analizy wideo; określone ogólnie jako oprogramowanie obliczeniowe
tlen medycznyGRUPO INFRAN/Anatlenianie roztworu Tyroda
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104roztwór Tyroda
mini-pompa o zmiennym przepływieCONTROL COMPANY3385pompa perfuzyjna
zestaw chirurgiczny do myszyKent ScientificINSMOUSEKITprocedura chirurgiczna
NaClSigma-AldrichS5886roztwór Tyroda
NaH2PO4DEQDEQF290400250roztwór Tyroda
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108regulacja pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01karta akwizycyjna
elektrody platynowe, średnica 0,25 mmSigma-Aldrich349402elektrody do stymulacji elektrycznej
zasilacz (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30Azasilacz recyrkulatora
monitor ciśnieniaCINVESTAVN/Aniestandardowy monitor ciśnienia; określony ogólnie jako monitor ciśnienia
przetwornik ciśnieniaLA BOUVETB17295monitor ciśnienia systemu Langendorffa
czysty alkohol etylowySigma-Aldrich493511etanol do czyszczenia systemu
recyrkulacyjna kąpiel termostatyczna (LXC)PolyScienceL113A0412recyrkulator zbiornika
roztwór soli fizjologicznejPiSA1118480,9% roztwór chlorku sodu (NaCl)
serpentynowa kąpiel termostatycznaCINVESTAVN/Aniestandardowy recyrkulator serpentynowy/kąpiel termostatyczna
stereomikroskopN/AN/Aprocedura chirurgiczna
oświetlenie stereomikroskopuN/AN/Aprocedura chirurgiczna
oprogramowanie uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/Aoprogramowanie do akwizycji obrazu z kamery; określone ogólnie jako oprogramowanie do akwizycji obrazu z kamery
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624szybka kamera CMOS; określona ogólnie jako kamera CMOS
ksylazynaPiSA4001211środek anestetyczny
Zoletil 100Virbac83048907środek anestetyczny tiletamina-zolepazem; określony ogólnie jako mieszanka anestetyczna

Bibliografia

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Serca w perfuzji wed ug metody Langendorffamodel serca mysiegoocena optycznakurczliwo przedsionk wkurczliwo kom rpomiar cz stotliwo ciy rytmu sercaobrazowanie o wysokiej rozdzielczo ciskr cenie kom rdynamika przedsionk wmechanika serca

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.