Wolontariusze Zgodne ze zgrupowaniem Fekalne Próbki Zbierania Myszy Za Pomocą Niestandardowego Systemu Klatek

Podsumowanie

Ten protokół opisuje niestandardowy system klatek do dobrowolnego, przyjaznego dla dobrostanu zwierząt, jednoczesnego i indywidualnego pobierania próbek kału od myszy trzymanych w grupach.

Streszczenie

Niezawodne pomiary metabolitów kortykosteronu w kale wymagają próbek kałowych, które można przypisać pojedynczym zwierzętom i zebrać w określonym oknie czasowym. Jest to wyzwanie w przypadku myszy trzymanych w grupach, gdzie połączone próbki z klatki domowej nie pozwalają na indywidualne przypisanie, a tymczasowe rozdzielenie może zakłócić dobrostan zwierząt i wyniki badań. Celem tego protokołu jest przedstawienie prostego, niedrogiego systemu klatek, który umożliwia dobrowolne, jednoczesne i indywidualne pobieranie próbek kałowych od myszy trzymanych w grupach. System składa się z klatki domowej z poliwęglanu z drucianym szczytem połączonej z trzema indywidualnymi pudełkami do pobierania. Po przyzwyczajeniu i treningu myszy dobrowolnie wchodzą do pudełek, aby uzyskać małą nagrodę w postaci pokarmu. Drzwi mogą następnie zostać zamknięte bez pościgu, obchodzenia się z nimi czy przymusowego przeniesienia. Kula kałowa jest zbierana z każdego pudełka osobno, co pozwala na przypisanie próbek do pojedynczych zwierząt przy zachowaniu spółkowego trzymania poza okresem pobierania. Ten protokół wspiera nieinwazyjne długotrwałe pobieranie próbek i nadaje się do badań mierzących metabolity kortykosteronu w kale lub inne biomarkery w kale. Konstrukcja jest łatwa do zbudowania ze standardowych materiałów na klatki i szkła akrylowego, można ją demontować do czyszczenia i pozwala na równoległe pobieranie próbek z kilku klat. Poprzez zmniejszenie zakłóceń związanych z obsługą i poprawę standaryzacji okna pobierania, metoda zapewnia praktyczną poprawę monitorowania endokrynologicznego u myszy trzymanych w grupach.

Wprowadzenie

Głównym wyzwaniem w ocenie stężenia kortykosterononu w osoczu jest to, że sam zabieg pobierania próbek może wywołać ostre zwiększenie stężenia kortykosterononu, co może wywołać wątpliwości co do pomiaru i potencjalnie wpłynąć na interpretację wyników badania^1,2,3. Pomiar metabolitów kortykosterononu w kale (FCM) zapewnia nieinwazyjną alternatywę, ponieważ stężenie FCM odzwierciedla stężenie glikokortykoidów krążących w organizmie na kilka godzin przed pobraniem próbki, w zależności od gatunku, odmiany, płci i czasu przejścia przez przewód pokarmowy^4,5. Jednakże, wiarygodna analiza FCM u myszy hodowanych w grupach nadal stanowi wyzwanie. Zbiorcze próbki kału pobrane z klatki domowej nie mogą być przypisane do poszczególnych zwierząt i mogą wykazywać dużą zmienność z powodu międzyosobniczych różnic w wydzielania glikokortykoidów oraz niepewności co do dokładnego okresu pobierania próbek. Długotrwała separacja zwierząt może zakłócić cele badań, podczas gdy krótkotrwała separacja w celu pobrania indywidualnych próbek jest pracochłonna, ogranicza przepustowość i sama może powodować stres².

Aby umożliwić pobieranie indywidualnych próbek kału od myszy hodowanych w grupach przy minimalnym manipulowaniu, opracowano niestandardową klatkę do pobierania kału (Rysunek 1A-E). Konstrukcja została dostosowana z wcześniej opisanej klatki do pobierania kału u myszy kolczastych⁶ i zmodyfikowana do użycia z myszami laboratoryjnymi. System składa się ze standardowej klatki poliwęglanowej typu III połączonej z trzema indywidualnymi skrzynkami do pobierania, do których zwierzęta mogą dobrowolnie wchodzić i zamykać za pomocą przesuwnych drzwi. Takie rozwiązanie pozwala na pobieranie próbek kału od poszczególnych myszy bez bezpośredniego manipulowania podczas okresu pobierania i umożliwia jednoczesne pobieranie próbek od wielu zwierząt. Klatka zapewnia zatem praktyczne podejście do nieinwazyjnego, indywidualnie przypisywalnego pobierania FCM u myszy hodowanych w grupach.

Poniższy protokół opisuje system pobierania kału, który umożliwia pobieranie i identyfikację próbek kału od poszczególnych myszy, zachowując środowisko hodowania grupowego, z wykorzystaniem niestandardowych klatek do bezdotykowego pobierania kału.

Protokół

Przez komitet etyki dla zwierząt uczelni Medical University of Vienna przeprowadzono konsultacje przed przeprowadzeniem badania i otrzymano informację, że nie jest wymagana formalna licencja na eksperymenty na zwierzętach; dlatego nie ma dostępnej zgody ani numeru protokołu. Badanie obejmowało jedynie ustanowione praktyki hodowania i utrzymania, wraz z nieinwazyjnym pobieraniem próbek kału. Nie wykonywano żadnych inwazyjnych procedur. Zgodnie z Dyrektywą 2010/63/UE, spodziewana obciążalność dla zwierząt została oszacowana na niższą od progu bólu, cierpienia, udręki lub trwałego szkodzenia, równoważnego lub wyższego niż spowodowany wprowadzaniem igły zgodnie z dobrą praktyką weterynaryjną. Wszystkie zwierzęta były przetrzymywane i opiekowały się nimi zgodnie z instytucjonalnymi standardami dobrostanu zwierząt.

1. Budowa klatek (patrz lista materiałów)

1. Wytnij części 1-4 z 5 mm plexi/szkła akrylowego zgodnie ze szablonami przedstawionymi na Rysunku 2A-C.
   UWAGA: Szablony o dokładnych wymiarach można wydrukować w formacie DIN A3 (Dodatkowy Rysunek 1 i Dodatkowy Rysunek 2).
2. Odciąć dno klatki z poliwęglanu typu II (PTII), jak wskazano na Rysunku 2D. Ta część będzie później służyć jako wierzchni pokryw klatki do zbierania kału.
3. Wiertło otwory i szczeliny w dawnym dnie klatki PTII, jak wskazano na Rysunku 2D.
   UWAGA: Dokładne wymiary są podane w Dodatkowym Rysunku 3.
4. Wiertło otwory w przedniej ścianie i krótkiej ścianie klatki PTIII, jak wskazano na Rysunku 2E.
   UWAGA: Dokładne wymiary są podane w Dodatkowym Rysunku 4.
5. Użyć części 2 jako szablonu do zaznaczenia odpowiadających otworów wiertarek na krótkiej ścianie klatki PTIII i długiej ścianie klatki PTII.
6. Wiertło zaznaczone otwory i zamocować klatkę PTIII, klatkę PTII i część 2 za pomocą śrub gwintowanych, jak pokazano na Rysunku 2F.
7. Włożyć część 1 jako dno klatki PTII. Umieścić części 4a i 4b tak, aby trzymać część 1 na miejscu i dzielić klatkę do pobierania próbek na oddzielne pudełka do pobierania. Użyć pistoletu termoaktywnego, aby je zamocować.
8. Włożyć dolne wystające części 4a i 4b do szczelin części 1. Te wystające części tworzą nogi pudełek do pobierania.
9. Włożyć górną wystającą część 4a i 4b przez górny pokryw, dawne dno klatki PTII, aby je zamocować.
10. Włożyć drewniane patyczki lub pręty przez otwory w wystających częściach, używając jednego pręta na górze i dwóch prętów na dole, aby ustabilizować i zamocować konstrukcję.
    UWAGA: Materiały drewniane należy używać w klatkowych laboratoriach tylko wtedy, gdy są jednorazowego użytku, ponieważ nie można ich wyczyścić. Jeśli tak nie jest, należy użyć prętów o alternatywnej kompozycji.
11. Zamknięcie pozostałych szczelin lub drobnych niedokładności za pomocą pistoletu termoaktywnego. Użyć części 3a, 3b i 3c (Rysunek 2B) jako suwnic do drzwi pomiędzy klatką domową a pudełkami do pobierania.
    UWAGA: Upewnić się, że żadne ostre krawędzie, resztki kleju lub wystający materiał nie pozostają dostępne dla zwierząt. Użyte w tym prototypie komponenty ze szkła akrylowego/plexiglasu nie nadają się do sterylizacji w autoklawie parowym. Dlatego, jeśli system jest używany w zakładach SPF wymagających wysterylizowanych materiałów związanych z klatkami, należy użyć zatwierdzonej przez instytucję procedury dezynfekcji bez autoklawu, lub zastąpić komponenty akrylowe materiałem nadającym się do sterylizacji w autoklawie, zachowując te same wymiary.

2. Przygotowanie zwierząt i przetrzymywanie

1. Uzyskać wymaganą liczbę myszy odpowiednich ras(ek) na badanie.
   UWAGA: Przedstawione dane zostały uzyskane od 30 ośmiotygodniowych myszy C57BL/6J, składających się z 20 samic i 10 samców. Myszy były wolne od specyficznych patogenów zgodnie ze standardami FELASA i zostały uzyskane od Charles River Laboratories, Sulzfeld, Niemcy.
2. Przetrzymywać zwierzęta w warunkach konwencjonalnych w przystosowanych klatkach z poliwęglanu typu III z maksymalnie trzema dorosłymi myszami na klatkę.
   UWAGA: Oddzielonych samców przetrzymywano w standardowych klatkach z poliwęglanu typu II w tym badaniu.
3. Utrzymywać pokój dla zwierząt w temperaturze 22 ± 2 °C i wilgotności względnej 55 ± 10% podczas 12-godzinnego cyklu światło/ciemność z włączeniem światła o godzinie 6:00 rano.
4. Dostarczać standardową dietę utrzymaniową i wodę ad libitum.
5. Dodać śció

Wyniki

Metabolity kaczorkowe (FCM) zostały pomyślnie zmierzone na próbkach zebranych za pomocą niestandardowych klatwek do pobierania kału w badaniu podłużnym porównującym myszy hodowane na stałe i okresowo. Reprezentatywna analiza FCM obejmowała 30 zwierząt: grupa hodowana na stałe, n = 15 zwierząt w 5 klatkach; grupa hodowana okresowo, n = 10 zwierząt w 5 klatkach, przy czym 5 samców było hodowanych pojedynczo, z wyjątkiem 3 wydarzeń rozrodczych, gdzie były współmieszkane z samicami. Próbki były zbierane w 19 dwutygodniowych punktach czasowych w dniach zmiany klatki, jak również w weekendy. Średni czas, w którym większość zwierząt weszła do pudełka, wynosił 7,5 min (SD = 3,07), przy czym większość zwierząt obejmowała średnio 27,6 (SD = 1,44) z 30 myszy w sumie. Wszystkie myszy weszły do pudełka po średnio 11,69 min (SD = 3,29). Średnia długość ograniczenia dla wszystkich myszy wynosiła 24,56 min (SD = 15,51), a średni czas od wejścia pierwszej myszy do pudełka do rozpoczęcia uwolnienia wynosił 43,14 min (SD = 8,51). Średnia długość uwolnienia wynosiła 14,86 min (SD = 22,82), a średnia długość całej procedury wynosiła 68,00 min (SD = 11,87). Z 19 pobierań (3 próbne + 16 regularnych), oczekując 480 próbek, dwie próbki były zaginione, ponieważ myszy nie defekowały podczas ograniczenia, trzy próbki nie mogły zostać zebrane, ponieważ myszy były albo bardzo ciężarne, albo krótko po porodzie, a 5 myszy potrzebowało delikatnego wsparcia, aby wejść. Średnia waga próbek zebranych z pierwszych trzech pobierań wynosiła 51,16 mg (SD = 25,39). Ze wszystkich zebranych próbek (475), 473 mogło zostać zbadane i dało wyniki.

Indywidualne zwierzęta były uważane za biologiczne repliki. Powtarzające się próbki kału pobrane od tych samych zwierząt w ciągu ośmiotygodniowego okresu badania były traktowane jako powtórzone pomiary podłużne, a nie jako niezależne biologiczne repliki. Analiza została przeprowadzona przy użyciu liniowego mieszanego modelu efektów z płcią, grupą hodowlańczą, dniem pobierania i liczbą myszy na klatkę jako efektami fiksowanymi oraz klatką jako przypadkową przechwytującą. W modelu uwzględniono interakcje między płcią, grupą hodowlańczą i dniem pobierania. Liczbę myszy na klatkę uwzględniono jako dodatkowy efekt fiksowany, ale nie testowano w terminach interakcji, ponieważ ta zmienna była częściowo pomieszana z projektem eksperymentalnym, szczególnie w przypadku samców hodowanych okresowo.

Model wykazał wyraźny wpływ płci na stężenia FCM (Rysunek 3A-D). Samice miały wyższe stężenia FCM niż samce w różnych warunkach hodowlany i dniach pobierania, estymacja = 28,30, SE = 2,58, t = 10,98, P < 0,0001. Porównania post hoc potwierdziły tę różnicę płci zarówno w grupach hodowlanych, jak i w obu dniach pobierania. W zwierzętach hodowlanych na stałe, samice miały wyższe stężenia FCM niż samce w niedziele, estymacja = 53,41, SE = 8,28, P < 0,0001, i w środy, estymacja = 55,27, SE = 8,37, P < 0,0001. Ten sam wzór obserwowano u zwierząt hodowanych okresowo w niedziele, estymacja = 58,04, SE = 12,00, P < 0,0001, i w środy, estymacja = 59,68, SE = 9,88, P < 0,0001.

Model wskazał również istotny główny efekt grupy hodowlany, estymacja = 11,59, SE = 4,65, t = 2,49, P = 0,0227. Jednak porównania post hoc skorygowanych według Tukeya nie wykazały istotnych różnic między zwierzętami hodowlanym na stałe i okresowo w pojedynczych kombinacjach płci/dnia. U samic, zwierzęta hodowane na stałe i okresowo nie różniły się istotnie w niedziele, estymacja = 24,51, SE = 12,20, P = 0,2085, ani w środy, estymacja = 17,31, SE = 12,20, P = 0,4950. Podobnie, u samców nie wykryto istotnej różnicy między grupami hodowlanymi w niedziele, estymacja = 29,14, SE = 14,00, P = 0,1708, ani w środy, estymacja = 21,72, SE = 13,30, P = 0,3682. Istotny główny efekt grupy hodowlany powinien zatem być interpretowany jako ogólny efekt na poziomie modelu, podczas gdy bardziej szczegółowe porównania post hoc skorygowanych według Tukeya w obrębie płci i dnia pobierania nie wykazały wyraźnej różnicy między grupami.

Brak istotnej różnicy między grupami hodowlanymi u samców

Dyskusja

Ten protokół opisuje prosty system klatek do zbierania indywidualnie przypisywalnych próbek kału od myszy hodowanych w grupach. Główną zaletą metody jest to, że łączy indywidualne przypisanie próbek z utrzymaniem kluczowych aspektów ssącego zamieszkania, szczególnie kontaktu wzrokowego i węchowego z towarzyszami z klatki. Jest to istotne, ponieważ grupowanie jest często wymagane dla dobrostanu zwierząt i może być również częścią projektu eksperymentalnego¹⁰. W przeciwieństwie do pobierania próbek zbiorczych z klatki macierzystej, system pozwala na przypisanie wartości FCM do poszczególnych zwierząt, unikając jednocześnie przedłużonego indywidualnego zamieszkania przed lub w czasie pobierania próbek.

Powszechnie stosowane podejścia do pobierania próbek kału u myszy laboratoryjnych obejmują pobieranie próbek zbiorczych z klatki macierzystej, tymczasowe indywidualne zamieszkanie w czystych klatkach, klatki metaboliczne i bezpośrednie pobieranie po obsłudze lub transferze. Zbiorcze próbki z klatki macierzystej są łatwe do uzyskania, bezinwazyjne, niedrogie i kompatybilne z równoległym pobieraniem próbek z wielu klatki, ale nie pozwalają na indywidualne przypisanie w zwierzętach hodowanych w grupach. Tymczasowe indywidualne zamieszkanie lub przeniesienie do czystych klatki umożliwia indywidualne przypisanie próbek, ale usuwa zwierzęta z ich grupy społecznej i może wywoływać ostry stres związany z obsługą, nowością lub separacją społeczną. Jest to szczególnie istotne dla analizy FCM, ponieważ miary związane z kortykosteronem są wrażliwe na stres spowodowany samym postępowaniem pobierania próbek¹¹. Klatki metaboliczne zapewniają kontrolowane pobieranie próbek i pozwalają na oddzielenie kału i moczu, ale wymagają specjalistycznego sprzętu, są mniej kompatybilne z rutynową hodowla i zwykle obejmują indywidualne zamieszkanie. Pobieranie próbek na podstawie bezpośredniej obsługi może również dostarczyć indywidualnie przypisywalne próbki, ale wymaga wielokrotnego przenoszenia lub manipulacji zwierzętami i może w związku z tym wpływać na wyniki związane ze stresem.

W porównaniu z istniejącymi podejściami, obecny system został zaprojektowany jako ulepszenie kompatybilne z grupowaniem do wielokrotnego, nieinwazyjnego, indywidualnego pobierania próbek kału. Po przyzwyczajeniu i treningu myszy wchodzą do pudełek pobierających dobrowolnie w odpowiedzi na małą nagrodę w postaci pokarmu. Próbki mogą więc być pobieranie bez ścigania, obsługiwania lub przymusowego przeniesienia do osobnej klatki. System nie powinien być interpretowany jako udowodniony poprawiający dobrostan lub zmniejszający stres w ścisłym sensie eksperymentalnym, ponieważ bezpośrednie miary dobrostanu nie zostały uwzględnione w obecnym badaniu. Jednak został zaprojektowany, aby zmniejszyć stopień separacji społecznej podczas pobierania próbek i może w związku z tym być mniej burzliwych niż konwencjonalne metody pobierania indywidualnego. Ponadto kilka zwierząt i kilka klatki może być pobieranie równocześnie, co pomaga w standaryzacji okna pobierania, co jest ważne, ponieważ stężenia FCM zależą od rytmu dobowego i odzwierciedlają wydzielania glukokortykoidów kilka godzin przed pobieraniem próbek^5,12.

Reprezentatywne wyniki pokazują, że system nadaje się do zbierania próbek kału, które mogą być analizowane pod kątem stężeń FCM. Wymierne stężenia FCM zostały uzyskane w całym badaniu i w punktach czasowych, a metoda wykryła oczekiwaną wyraźną różnicę płci, z wyższymi stężeniami FCM u samic niż u samców. Badanie obejmowało również wewnętrzne porównanie z konwencjonalnym pojedynczym zamieszkaniem samców. W niedzielę, samce z grupy okresowo hodowanych były zamieszkane pojedynczo, podczas gdy samce trwale hodowane były pobieranie próbek za pomocą nowo opracowany system pobierania. Stężenia FCM nie różniły się istotnie między tymi grupami w niedzielę. Sugeruje to, że dobrowolne wejście do klatki pobierającej i krótkotrwały pobyt w pudełku pobierającym nie zwiększyło znacząco stężeń FCM w porównaniu z konwencjonalnym pobieraniem próbek w pojedynczym zamieszkaniu. Niemniej jednak, to porównanie było ograniczone do samców i nie było zaprojektowane jako dedykowane badanie równoważności lub crossover. Dalsze badania powinny więc porównać system z ugruntowanymi podejściami indywidualnego zamieszkania lub klatki metabolicznej w wyważonych warunkach eksperymentalnych i uwzględnić behawioralne wskaźniki ostrego stresu podczas pobierania próbek.

Oprócz oceny metabolitów kortykosteronu w kału, system może być również przydatny w innych zastosowaniach wymagających krótkotrwałego pobierania indywidualnych próbek kału. Potencjalne zastosowania obejmują badania parazytologiczne, analizy mikrobiomu, badania trawienia lub inne badania biomarkerów kału. Z niewielkimi modyfikacjami technicznymi system mógłby być potencjalnie dostosowany do pobierania moczu, na przykład poprzez wprowadzenie dziurkowanego podłoża i odpowiedniego pojemnika do pobierania pod zwierzęciem. Dla tych zastosowań możliwość utrzymania bliskiej bliskości z towarzyszami z klatki podczas pobierania próbek może być korzystna w porównaniu z konwencjonalnym indywidualnym zamieszkanie

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drill bit 5 mm	Craftomat	22380487	5mm średnica; Ilość 1
Drill bits 60 mm	Bosch	32064647	60 mm średnica; Ilość 1
Drill bits 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm średnica; Ilość 1
Drilling machine	Makita	25730054	Standardowa ręczna lub stolarzowska wiertnica; Ilość 1
Hot glue gun	Einhell	29051207	Do montażu klatki; Ilość 1
Hot glue sticks	Einhell	29049664	Kompatybilne z pistoletem termoklejowym; Ilość 5-10
Makrolon cage	Animalab	31200129	Standardowa klatka typu II; Ilość 1
Makrolon cage	Animalab	31200256	Standardowa klatka typu III; Ilość 1
Plexiglass / acrylic glass	Bauhaus	29122352	Około 0,25 m² łącznie; Grubość 5 mm; Ilość  2 arkusze A3
Saw or milling device	Scheppach	32079641	Mała pilarka taśmowa, wyrzynarka lub frezarka CNC; Ilość 1
Threaded screws	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Ilość 4
Wooden chopsticks / rods	Ikea	903.429.71	Okrągłe drewniane różdżki; Ilość 3