Ten protokół opisuje niestandardowy system klatek do dobrowolnego, przyjaznego dla dobrostanu zwierząt, jednoczesnego i indywidualnego pobierania próbek kału od myszy trzymanych w grupach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wolontariusze Zgodne ze zgrupowaniem Fekalne Próbki Zbierania Myszy Za Pomocą Niestandardowego Systemu Klatek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niezawodne pomiary metabolitów kortykosteronu w kale wymagają próbek kałowych, które można przypisać pojedynczym zwierzętom i zebrać w określonym oknie czasowym. Jest to wyzwanie w przypadku myszy trzymanych w grupach, gdzie połączone próbki z klatki domowej nie pozwalają na indywidualne przypisanie, a tymczasowe rozdzielenie może zakłócić dobrostan zwierząt i wyniki badań. Celem tego protokołu jest przedstawienie prostego, niedrogiego systemu klatek, który umożliwia dobrowolne, jednoczesne i indywidualne pobieranie próbek kałowych od myszy trzymanych w grupach. System składa się z klatki domowej z poliwęglanu z drucianym szczytem połączonej z trzema indywidualnymi pudełkami do pobierania. Po przyzwyczajeniu i treningu myszy dobrowolnie wchodzą do pudełek, aby uzyskać małą nagrodę w postaci pokarmu. Drzwi mogą następnie zostać zamknięte bez pościgu, obchodzenia się z nimi czy przymusowego przeniesienia. Kula kałowa jest zbierana z każdego pudełka osobno, co pozwala na przypisanie próbek do pojedynczych zwierząt przy zachowaniu spółkowego trzymania poza okresem pobierania. Ten protokół wspiera nieinwazyjne długotrwałe pobieranie próbek i nadaje się do badań mierzących metabolity kortykosteronu w kale lub inne biomarkery w kale. Konstrukcja jest łatwa do zbudowania ze standardowych materiałów na klatki i szkła akrylowego, można ją demontować do czyszczenia i pozwala na równoległe pobieranie próbek z kilku klat. Poprzez zmniejszenie zakłóceń związanych z obsługą i poprawę standaryzacji okna pobierania, metoda zapewnia praktyczną poprawę monitorowania endokrynologicznego u myszy trzymanych w grupach.
Wprowadzenie
Głównym wyzwaniem w ocenie stężenia kortykosterononu w osoczu jest to, że sam zabieg pobierania próbek może wywołać ostre zwiększenie stężenia kortykosterononu, co może wywołać wątpliwości co do pomiaru i potencjalnie wpłynąć na interpretację wyników badania1,2,3. Pomiar metabolitów kortykosterononu w kale (FCM) zapewnia nieinwazyjną alternatywę, ponieważ stężenie FCM odzwierciedla stężenie glikokortykoidów krążących w organizmie na kilka godzin przed pobraniem próbki, w zależności od gatunku, odmiany, płci i czasu przejścia przez przewód pokarmowy4,5. Jednakże, wiarygodna analiza FCM u myszy hodowanych w grupach nadal stanowi wyzwanie. Zbiorcze próbki kału pobrane z klatki domowej nie mogą być przypisane do poszczególnych zwierząt i mogą wykazywać dużą zmienność z powodu międzyosobniczych różnic w wydzielania glikokortykoidów oraz niepewności co do dokładnego okresu pobierania próbek. Długotrwała separacja zwierząt może zakłócić cele badań, podczas gdy krótkotrwała separacja w celu pobrania indywidualnych próbek jest pracochłonna, ogranicza przepustowość i sama może powodować stres2.
Aby umożliwić pobieranie indywidualnych próbek kału od myszy hodowanych w grupach przy minimalnym manipulowaniu, opracowano niestandardową klatkę do pobierania kału (Rysunek 1A-E). Konstrukcja została dostosowana z wcześniej opisanej klatki do pobierania kału u myszy kolczastych6 i zmodyfikowana do użycia z myszami laboratoryjnymi. System składa się ze standardowej klatki poliwęglanowej typu III połączonej z trzema indywidualnymi skrzynkami do pobierania, do których zwierzęta mogą dobrowolnie wchodzić i zamykać za pomocą przesuwnych drzwi. Takie rozwiązanie pozwala na pobieranie próbek kału od poszczególnych myszy bez bezpośredniego manipulowania podczas okresu pobierania i umożliwia jednoczesne pobieranie próbek od wielu zwierząt. Klatka zapewnia zatem praktyczne podejście do nieinwazyjnego, indywidualnie przypisywalnego pobierania FCM u myszy hodowanych w grupach.
Poniższy protokół opisuje system pobierania kału, który umożliwia pobieranie i identyfikację próbek kału od poszczególnych myszy, zachowując środowisko hodowania grupowego, z wykorzystaniem niestandardowych klatek do bezdotykowego pobierania kału.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przez komitet etyki dla zwierząt uczelni Medical University of Vienna przeprowadzono konsultacje przed przeprowadzeniem badania i otrzymano informację, że nie jest wymagana formalna licencja na eksperymenty na zwierzętach; dlatego nie ma dostępnej zgody ani numeru protokołu. Badanie obejmowało jedynie ustanowione praktyki hodowania i utrzymania, wraz z nieinwazyjnym pobieraniem próbek kału. Nie wykonywano żadnych inwazyjnych procedur. Zgodnie z Dyrektywą 2010/63/UE, spodziewana obciążalność dla zwierząt została oszacowana na niższą od progu bólu, cierpienia, udręki lub trwałego szkodzenia, równoważnego lub wyższego niż spowodowany wprowadzaniem igły zgodnie z dobrą praktyką weterynaryjną. Wszystkie zwierzęta były przetrzymywane i opiekowały się nimi zgodnie z instytucjonalnymi standardami dobrostanu zwierząt.
1. Budowa klatek (patrz lista materiałów)
- Wytnij części 1-4 z 5 mm plexi/szkła akrylowego zgodnie ze szablonami przedstawionymi na Rysunku 2A-C.
UWAGA: Szablony o dokładnych wymiarach można wydrukować w formacie DIN A3 (Dodatkowy Rysunek 1 i Dodatkowy Rysunek 2). - Odciąć dno klatki z poliwęglanu typu II (PTII), jak wskazano na Rysunku 2D. Ta część będzie później służyć jako wierzchni pokryw klatki do zbierania kału.
- Wiertło otwory i szczeliny w dawnym dnie klatki PTII, jak wskazano na Rysunku 2D.
UWAGA: Dokładne wymiary są podane w Dodatkowym Rysunku 3. - Wiertło otwory w przedniej ścianie i krótkiej ścianie klatki PTIII, jak wskazano na Rysunku 2E.
UWAGA: Dokładne wymiary są podane w Dodatkowym Rysunku 4. - Użyć części 2 jako szablonu do zaznaczenia odpowiadających otworów wiertarek na krótkiej ścianie klatki PTIII i długiej ścianie klatki PTII.
- Wiertło zaznaczone otwory i zamocować klatkę PTIII, klatkę PTII i część 2 za pomocą śrub gwintowanych, jak pokazano na Rysunku 2F.
- Włożyć część 1 jako dno klatki PTII. Umieścić części 4a i 4b tak, aby trzymać część 1 na miejscu i dzielić klatkę do pobierania próbek na oddzielne pudełka do pobierania. Użyć pistoletu termoaktywnego, aby je zamocować.
- Włożyć dolne wystające części 4a i 4b do szczelin części 1. Te wystające części tworzą nogi pudełek do pobierania.
- Włożyć górną wystającą część 4a i 4b przez górny pokryw, dawne dno klatki PTII, aby je zamocować.
- Włożyć drewniane patyczki lub pręty przez otwory w wystających częściach, używając jednego pręta na górze i dwóch prętów na dole, aby ustabilizować i zamocować konstrukcję.
UWAGA: Materiały drewniane należy używać w klatkowych laboratoriach tylko wtedy, gdy są jednorazowego użytku, ponieważ nie można ich wyczyścić. Jeśli tak nie jest, należy użyć prętów o alternatywnej kompozycji. - Zamknięcie pozostałych szczelin lub drobnych niedokładności za pomocą pistoletu termoaktywnego. Użyć części 3a, 3b i 3c (Rysunek 2B) jako suwnic do drzwi pomiędzy klatką domową a pudełkami do pobierania.
UWAGA: Upewnić się, że żadne ostre krawędzie, resztki kleju lub wystający materiał nie pozostają dostępne dla zwierząt. Użyte w tym prototypie komponenty ze szkła akrylowego/plexiglasu nie nadają się do sterylizacji w autoklawie parowym. Dlatego, jeśli system jest używany w zakładach SPF wymagających wysterylizowanych materiałów związanych z klatkami, należy użyć zatwierdzonej przez instytucję procedury dezynfekcji bez autoklawu, lub zastąpić komponenty akrylowe materiałem nadającym się do sterylizacji w autoklawie, zachowując te same wymiary.
2. Przygotowanie zwierząt i przetrzymywanie
- Uzyskać wymaganą liczbę myszy odpowiednich ras(ek) na badanie.
UWAGA: Przedstawione dane zostały uzyskane od 30 ośmiotygodniowych myszy C57BL/6J, składających się z 20 samic i 10 samców. Myszy były wolne od specyficznych patogenów zgodnie ze standardami FELASA i zostały uzyskane od Charles River Laboratories, Sulzfeld, Niemcy. - Przetrzymywać zwierzęta w warunkach konwencjonalnych w przystosowanych klatkach z poliwęglanu typu III z maksymalnie trzema dorosłymi myszami na klatkę.
UWAGA: Oddzielonych samców przetrzymywano w standardowych klatkach z poliwęglanu typu II w tym badaniu. - Utrzymywać pokój dla zwierząt w temperaturze 22 ± 2 °C i wilgotności względnej 55 ± 10% podczas 12-godzinnego cyklu światło/ciemność z włączeniem światła o godzinie 6:00 rano.
- Dostarczać standardową dietę utrzymaniową i wodę ad libitum.
- Dodać śció
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kortykosteronowe metabolity fekalne (FCMs) zostały pomyślnie zmierzone w próbkach pobranych za pomocą specjalnie wykonanych klatek do pobierania odchodów w badaniu podłużnym porównującym myszy rozmnażane stale i przerywanie. Reprezentatywna analiza FCM objęła 30 zwierząt: grupę rozmnażaną stale (n = 15 zwierząt w 5 klatkach) oraz grupę rozmnażaną przerywanie (n = 10 zwierząt w 5 klatkach), z czego 5 samców przebywało w pojedynczych klatkach z wyjątkiem 3 zdarzeń rozrodczych, podczas których przebywały razem z samicami. P...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten protokół opisuje prosty system klatek do zbierania indywidualnie przypisywalnych próbek kału od myszy hodowanych w grupach. Główną zaletą metody jest to, że łączy indywidualne przypisanie próbek z utrzymaniem kluczowych aspektów ssącego zamieszkania, szczególnie kontaktu wzrokowego i węchowego z towarzyszami z klatki. Jest to istotne, ponieważ grupowanie jest często wymagane dla dobrostanu zwierząt i może być również częścią projektu eksperymentalnego10. W przeciwieństwie do pobierania próbek ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Prof. Pollakowi za wsparcie publikacji tego artykułu.
Katharina Tillmann wdzięcznie wyraża uznanie za wsparcie swojego nieżyjącego dziadka, Bruno Wochnera, który, mając 99 lat, przyczynił się do planowania systemu klatek, udostępnił swoją warsztat stolarski i pomagał w szlifowaniu i budowie. Jego entuzjazm dla rzemiosła i budowy był trwałą źródłem inspiracji i jest tu wdzięcznie wspominany.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Drill bit 5 mm | Craftomat | 22380487 | 5mm średnica; Ilość 1 |
| Drill bits 60 mm | Bosch | 32064647 | 60 mm średnica; Ilość 1 |
| Drill bits 7 mm | Craftomat | 22380520 | 7 mm średnica; Ilość 1 |
| Drilling machine | Makita | 25730054 | Standardowa ręczna lub stolarzowska wiertnica; Ilość 1 |
| Hot glue gun | Einhell | 29051207 | Do montażu klatki; Ilość 1 |
| Hot glue sticks | Einhell | 29049664 | Kompatybilne z pistoletem termoklejowym; Ilość 5-10 |
| Makrolon cage | Animalab | 31200129 | Standardowa klatka typu II; Ilość 1 |
| Makrolon cage | Animalab | 31200256 | Standardowa klatka typu III; Ilość 1 |
| Plexiglass / acrylic glass | Bauhaus | 29122352 | Około 0,25 m² łącznie; Grubość 5 mm; Ilość 2 arkusze A3 |
| Saw or milling device | Scheppach | 32079641 | Mała pilarka taśmowa, wyrzynarka lub frezarka CNC; Ilość 1 |
| Threaded screws | Profi Depot | 10807533 | 20 mm × 3 mm; Ilość 4 |
| Wooden chopsticks / rods | Ikea | 903.429.71 | Okrągłe drewniane różdżki; Ilość 3 |
Bibliografia
- Abelson KS, Adem B, Royo F, Carlsson HE, Hau J. High plasma corticosterone levels persist during frequent automatic blood sampling in rats. In vivo (Athens, Greece) 2005; 19(5): 815-819.
- Kim S, Foong D, Cooper MS, Seibel MJ, Zhou H. Comparison of blood sampling methods for plasma corticosterone measurements in mice associated with minimal stress-related artefacts. Steroids 2018; 135: 69-72.
- Teilmann AC, Kalliokoski O, Sorensen DB, Hau J, Abelson KS. Manual versus automated blood sampling: impact of repeated blood sampling on stress parameters and behavior in male NMRI mice. Lab Anim 2014; 48(4): 278-291.
- Thanos PK, Cavigelli SA, Michaelides M, Olvet DM, Patel U, Diep MN et al. A non-invasive method for detecting the metabolic stress response in rodents: characterization and disruption of the circadian corticosterone rhythm. Physiological research 2009; 58(2): 219-228.
- Touma C, Sachser N, Möstl E, Palme R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and Comparative Endocrinology 2003; 130(3): 267-278.
- Frynta D, Nováková M, Kutalová H, Palme R, Sedláček F. Apparatus for Collection of Fecal Samples from Undisturbed Spiny Mice (Acomys cahirinus) Living in a Complex Social Group. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS 2009; 48(2): 196-201.
- Meyer N, Kroger M, Thummler J, Tietze L, Palme R, Touma C. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: Taking the animal's perspective. PLoS One 2020; 15(9): e0238895.
- Touma C, Palme R, Sachser N. Analyzing corticosterone metabolites in fecal samples of mice: a noninvasive technique to monitor stress hormones. Hormones and Behavior 2004; 45(1): 10-22.
- Müller K, Lengheimer T, Kral-Pointner JB, Wojta J, Yeghiazaryan L, Krall C et al. Exposure to soiled bedding reduces abnormal repetitive behaviors in mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience 2022; 16.
- Cinque C, Zinni M, Zuena AR, Giuli C, Alemà SG, Catalani A et al. Faecal corticosterone metabolite assessment in socially housed male and female Wistar rats. Endocrine connections 2018; 7(2): 250-257.
- Palme R. Monitoring stress hormone metabolites as a useful, non-invasive tool for welfare assessment in farm animals. Animal Welfare 2012; 21(3): 331-337.
- Kalliokoski O, Jacobsen KR, Teilmann AC, Hau J, Abelson KSP. Quantitative Effects of Diet on Fecal Corticosterone Metabolites in Two Strains of Laboratory Mice. In vivo (Athens, Greece) 2012; 26(2): 213.
- Rowland NE, Toth LA. Analytic and Interpretational Pitfalls to Measuring Fecal Corticosterone Metabolites in Laboratory Rats and Mice. Comparative medicine 2019; 69(5): 337-349.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
