Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Identyfikacja genów węzłowych związanych ze starzeniem i mitochondriami w kardiomiopatii rozstrzeniowej

55 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72286

⸱

25 sierpnia 2026

1Henan University of Chinese Medicine, 2The Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół integruje wielowymiarowe dane transkryptomiczne z uczeniem maszynowym w celu identyfikacji genów związanych ze starzeniem i mitochondriami w kardiomiopatii rozstrzeniowej, co służy odkrywaniu biomarkerów i subtypowniu molekularnemu.

Streszczenie

Kardiomiopatia rozstrzeniowa (DCM) charakteryzuje się rozszerzeniem lewej komory oraz dysfunkcją skurczową i jest powiązana z dysfunkcją mitochondriów oraz aktywacją immunologiczno-zapalną. Jednakże molekularne sygnatury związane ze starzeniem oraz mitochondrialne szlaki regulacyjne w DCM pozostają nie do końca poznane. W niniejszym badaniu przeanalizowano sześć zbiorów danych z transkryptomiki bulk oraz jeden zbiór danych z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) z bazy danych Gene Expression Omnibus. Po normalizacji danych, korekcji efektu serii (batch correction) oraz adnotacji typów komórek, zidentyfikowano geny kandydujące związane ze starzeniem i mitochondriami, wykorzystując analizę różnicowej ekspresji, analizę ważonej sieci koekspresji genów (WGCNA) oraz konstrukcję sieci oddziaływań białko-białko. Geny kluczowe wyłoniono w dalszej kolejności za pomocą regresji LASSO (least absolute shrinkage and selection operator), lasów losowych (random forest) oraz rekurencyjnej eliminacji cech za pomocą maszyn wektorów nośnych (SVM-RFE). W celu charakterystyki immunologicznego mikrośrodowiska serca w DCM przeprowadzono analizy infiltracji komórek odpornościowych, komunikacji międzykomórkowej oraz podtypowania molekularnego. Łącznie z DCM powiązano 66 genów związanych ze starzeniem i 16 genów związanych z mitochondriami, które były głównie wzbogacone w szlak sygnałowy czynnika indukowanego hipoksją 1 (HIF-1), fosforylację oksydacyjną oraz szlaki związane z syntazą tlenku azotu. Analizy uczenia maszynowego i sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek zidentyfikowały SERPINE1, TGFB2, CYBB i TLR2 jako geny kluczowe. CYBB i TLR2 wykazywały wysoką ekspresję w monocytach i makrofagach, podczas gdy SERPINE1 i TGFB2 były wyrażane głównie w komórkach zrębu. Analiza krajobrazu immunologicznego wykazała zwiększoną aktywację prozapalnych makrofagów oraz zmienioną komunikację międzykomórkową w próbkach DCM. Na podstawie ekspresji genów kluczowych próbki DCM podzielono na dwa podtypy molekularne, powiązane odpowiednio z szlakiem sygnałowym czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) oraz biosyntezą pierwotnych kwasów żółciowych. Niniejszy protokół zapewnia zintegrowane ramy dla identyfikacji potencjalnych biomarkerów i podtypów molekularnych w DCM.

Wprowadzenie

Kardiomiopatia rozstrzeniowa (DCM) jest zaburzeniem mięśnia sercowego charakteryzującym się rozszerzeniem lewej komory oraz upośledzeniem funkcji skurczowej. Jest to trzecia najczęstsza przyczyna niewydolności serca i główny powód wskazywany do transplantacji serca na całym świecie1. Badania populacyjne szacują rozpowszechnienie tej choroby na około 1 na 250 dorosłych, przy czym częściej występuje ona u mężczyzn, a znaczna część przypadków wynika z wariantów monogenicznych2. Wyniki te wskazują, że zarówno podatność genetyczna, jak i czynniki środowiskowe przyczyniają się do wystąpienia i progresji DCM.

Patogeneza DCM obejmuje wzajemnie powiązane procesy, w tym aktywację zapalną, stres oksydacyjny, apoptozę kardiomiocytów oraz rozregulowane sygnałowanie profibrotyczne. Polimorfizmy genetyczne związane ze stanem zapalnym, w tym warianty promotora czynnika martwicy nowotworu-α, powiązano z podatnością na wirusową postać DCM3. Zwiększony stres oksydacyjny skorelowano również ze śmiercią kardiomiocytów i dysfunkcją lewej komory w podtypach DCM u ludzi4. Ponadto aberracyjna aktywacja szlaków sygnałowych Wnt/β-catenin oraz kalcyneuryny/jądrowego czynnika aktywowanych limfocytów T promuje przerost mięśnia sercowego i włóknienie śródmiąższowe, przyczyniając się tym samym do progresji choroby5,6. Dysfunkcja mitochondriów jest kolejnym istotnym elementem DCM, ponieważ kardiomiocyty charakteryzują się wysokim zapotrzebowaniem energetycznym. Zaburzenia biogenezy mitochondriów, homeostazy wapnia, mitofagii oraz integralności mitochondrialnego DNA mogą upośledzać fosforylację oksydacyjną i przyczyniać się do postępującej dysfunkcji serca7,8,9,10.

Mimo tych odkryć mechanistycznych, nadal istnieją istotne luki w wiedzy. W szczególności nie zdefiniowano w pełni zależności czasowych i przyczynowych między strukturalnym przebudowaniem mitochondriów a dysfunkcją bioenergetyczną podczas inicjacji i progresji DCM11. Zbadano kilka strategii terapeutycznych. Terapia komórkami macierzystymi wykazała potencjał regeneracyjny poprzez efekty parakrynne, cytoprotekcyjne i immunomodulacyjne, jednak konieczna pozostaje optymalizacja źródeł komórek, dróg podania oraz przeżywalności po transplantacji12. Podejścia z zakresu terapii genowej, w tym dostarczanie oparte na wirusach adeno-zależnych oraz edycja genomu oparta na systemie CRISPR, oferują również potencjalne strategie precyzyjnego leczenia. Niemniej jednak ograniczenia związane z tropizmem kardiologicznym, immunogennością wektorów i długoterminowym bezpieczeństwem pozostają nierozwiązane13.

Publiczne zbiory danych transkryptomicznych z repozytoriów takich jak Gene Expression Omnibus (GEO) są powszechnie wykorzystywane do odkrywania biomarkerów w DCM. Zasoby te zapewniają dostęp do wieloośrodkowych kohort klinicznych, wspierają kosztowo efektywne i powtarzalne badania oraz mogą zwiększyć moc statystyczną poprzez integrację wielu zbiorów danych14. Profilowanie transkryptomiczne umożliwia również przesiewowe poszukiwanie genów kandydatów w całym genomie, subtypownie molekularne oraz analizę na poziomie szlaków sygnałowych15. Jednak publiczne zbiory danych mają swoje ograniczenia, w tym techniczne efekty serii (batch effects), heterogeniczność kliniczną i etiologiczną, ograniczoną możliwość wnioskowania przyczynowo-skutkowego oraz niepełne informacje podłużne lub prognostyczne16. W związku z tym wyniki uzyskane z publicznych zbiorów danych transkryptomicznych są najbardziej odpowiednie do generowania hipotez i priorytetyzacji potencjalnych biomarkerów i wymagają walidacji w niezależnych kohortach oraz modelach eksperymentalnych.

Wiele badań bioinformatycznych nad DCM opiera się głównie na analizie ekspresji różnicowej, która może generować wyniki fałszywie dodatnie i nie charakteryzuje w pełni sieci koekspresji genów ani heterogeniczności komórkowej w obrębie tkanki serca. Aby wyeliminować te ograniczenia, w niniejszym badaniu zastosowano zintegrowaną strategię analityczną łączącą metody komplementarne. Analiza transkryptomiczna bulk dostarcza profili ekspresji na poziomie tkanki, odpowiednich do porównań w układzie przypadek-kontrola. Analiza ważonej sieci koekspresji genów (WGCNA) identyfikuje moduły genowe związane z cechami fenotypowymi i umożliwia priorytetyzację funkcjonalnie powiązanych zestawów genów, a nie pojedynczych genów o różnej ekspresji. Analiza sieci interakcji białko-białko (PPI) identyfikuje geny o wysokim stopniu połączeń na podstawie topologii sieci. Trzy algorytmy uczenia maszynowego — regresja LASSO (least absolute shrinkage and selection operator), lasy losowe (random forest) oraz rekurencyjna eliminacja cech z wykorzystaniem maszyn wektorów wspierających (SVM-RFE) — zostały użyte do identyfikacji potencjalnych biomarkerów w zintegrowanych zbiorach danych¹⁷. Następnie wykorzystano sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) do zbadania wzorców ekspresji specyficznych dla typów komórek oraz sieci komunikacji międzykomórkowej18.

Choć dysfunkcja mitochondriów oraz związane ze starzeniem zmiany molekularne były badane osobno w kontekście DCM, ich wspólne powiązania ze zmianami transkrypcyjnymi związanymi z chorobą pozostają niedostatecznie poznane. W niniejszym badaniu zintegrowano wiele zbiorów danych z sekwencjonowania transkryptomu bulk oraz scRNA-seq, aby zidentyfikować geny hub związane ze starzeniem i mitochondriami w DCM, scharakteryzować immunologiczne mikrośrodowisko serca oraz zbadać podtypy molekularne w oparciu o zidentyfikowane geny. To zintegrowane podejście zostało wykorzystane do wyłonienia priorytetowych potencjalnych biomarkerów i zapewnienia podstawy dla późniejszych badań mechanistycznych i walidacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Drugiego Szpitala Afiliacyjnego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Henan (numer zatwierdzenia HNSZYYYJS2023011150). Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi etycznej oceny dobrostanu zwierząt laboratoryjnych (GB/T 35892-2018) oraz zasadami 3R: zastępowania (Replacement), ograniczania (Reduction) i udoskonalania (Refinement). Odczynniki, bazy danych, oprogramowanie i sprzęt użyte w niniejszym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów. 

1. Zasoby danych i materiały eksperymentalne
Jako grupę modelową wykorzystano samce transgenicznych myszy CTNTR141W klasy SPF o fenotypie spontanicznej kardiomiopatii rozstrzeniowej (DCM) i masie ciała 25 ± 2 g. Jako grupę kontrolną wykorzystano samce myszy C57BL/6J klasy SPF w tym samym wieku i o masie ciała 25 ± 2 g. Każda grupa składała się z 12 myszy. Wszystkie zwierzęta pozyskano z instytucji posiadających aktualne licencje na produkcję zwierząt laboratoryjnych i przetrzymywano w środowisku barierowym klasy SPF w temperaturze 22 ± 2 °C i wilgotności względnej 40%–60% przy 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, z wolnym dostępem do sterylizowanej karmy i wody. Po 1 tygodniu aklimatyzacji wszystkie myszy utrzymywano w tych samych warunkach przez kolejne 4 tygodnie przed oceną funkcji serca i pobraniem próbek. Na początku eksperymentu wszystkie myszy miały od 6 do 8 tygodni. Myszy poddano głębokiej anestezji, a następnie uśmiercono poprzez zwichnięcie stawów szyjnych.

Z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO)19 pobrano siedem publicznych zbiorów danych transkryptomicznych z tkanki mięśnia lewej komory pacjentów z DCM. Zbiory te obejmowały sześć zbiorów transkryptomicznych typu bulk oraz jeden zbiór sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq), GSE145154. W analizie uwzględniono frakcje CD45-dodatnie oraz CD45-ujemne. Obie frakcje komórek, CD45-dodatnie i CD45-ujemne, połączono przed klastrowaniem. Tożsamość próbki wykorzystano jako główną zmienną wsadową (batch variable) dla integracji metodą Harmony. Do analizy włączono próbki lewej komory zdrowej oraz lewej komory z DCM z zestawu GSE145154, a konkretnie: GSM4307515, GSM4307516, GSM4307520 i GSM4307521. Zbiory danych wykorzystane w niniejszym badaniu to GSE145154, GSE5406, GSE42955, GSE57338, GSE79962, GSE116250 oraz GSE141910. Wykluczono wszystkie próbki inne niż DCM, pozostawiając jedynie próbki kontrolne (grupa Control) i próbki DCM (grupa DCM). Po kontroli jakości żadne próbki nie zostały usunięte. Informacje o próbkach z włączonych zbiorów GEO przedstawiają się następująco: GSE5406 zawierał 102 próbki (16 kontrolnych i 86 próbek DCM); GSE42955 zawierał 17 próbek (5 kontrolnych i 12 próbek DCM); GSE57338 zawierał 231 próbek (136 kontrolnych i 95 próbek DCM); GSE79962 zawierał 20 próbek (11 kontrolnych i 9 próbek DCM); GSE116250 zawierał 51 próbek (14 kontrolnych i 37 próbek DCM); a GSE141910 zawierał 322 próbki (161 kontrolnych i 161 próbek DCM).

2. Wstępne przetwarzanie danych transkryptomicznych z próbek zbiorczych
Surowe macierze ekspresji oraz pliki z adnotacjami klinicznymi dla sześciu zbiorów danych zbiorczych pobrano przy użyciu pakietu GEOquery20. Dla zbiorów danych z mikromacierzy Affymetrix pobrano surowe pliki CEL, a dla zbiorów danych RNA-seq pobrano surowe macierze zliczeń. Korekcję tła, normalizację kwantylową oraz obliczenia ekspresji dla danych z mikromacierzy przeprowadzono przy użyciu algorytmu robust multi-array average zaimplementowanego w pakiecie affy21.

Dane zliczeń RNA-seq zostały znormalizowane metodą przyciętej średniej wartości M (trimmed mean of M-values) w pakiecie edgeR22 i przekształcone w wartości log₂-transformowanych zliczeń na milion (counts per million). Identyfikatory sond zostały zamienione na oficjalne symbole genów przy użyciu plików adnotacji specyficznych dla danej platformy. W przypadku przypisania wielu sond do tego samego genu obliczano średnią wartość ekspresji.

Techniczne efekty serii między zbiorami danych usunięto za pomocą algorytmu ComBat w pakiecie sva23. Źródło zbioru danych oraz platformę detekcji określono jako czynniki serii. Przed i po korekcie efektów serii przeprowadzono analizę głównych składowych, aby ocenić skuteczność usuwania tych efektów.

3. Wstępne przetwarzanie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek i adnotacja komórek
Macierz ekspresji genów z GSE145154 została zaimportowana do oprogramowania Seurat w celu utworzenia obiektu Seurat przy użyciu wersji Seurat 524. Komórki niskiej jakości wykluczono, stosując następujące progi: od 200 do 6 000 wykrytych genów na komórkę, całkowita liczba unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) powyżej 500 oraz odsetek genów mitochondrialnych poniżej 25%. Komórki wykraczające poza te progi kontroli jakości zostały odrzucone jako komórki niskiej jakości lub uszkodzone. Wykluczanie komórek niskiej jakości przeprowadzono wyłącznie w oparciu o opisane powyżej progi kontroli jakości.

Normalizację logarytmiczną przeprowadzono przy użyciu funkcji NormalizeData z czynnikiem skalowania wynoszącym 10 000. Wybrano 3 000 najbardziej zmiennych genów za pomocą funkcji FindVariableFeatures z zastosowaniem metody vst. Dane zostały przeskalowane za pomocą ScaleData, a następnie przeprowadzono analizę głównych składowych w celu liniowej redukcji wymiarowości.

Efekty serii korygowano za pomocą algorytmu Harmony25 przy użyciu funkcji RunHarmony, określając tożsamość próbek jako zmienną grupującą. Do klastrowania komórek za pomocą funkcji FindNeighbors i FindClusters wykorzystano pierwsze 15 głównych składowych. Klastrowanie przeprowadzono przy użyciu algorytmu Leiden przy rozdzielczości 0,15. Nieliniowa redukcja wymiarowości oraz wizualizacja zostały wykonane za pomocą metody przybliżonej i rzutowanej jednorodnej rozmaitości (UMAP).

Typy komórek zostały opisane przy użyciu kanonicznych genów markerowych oraz zautomatyzowanej adnotacji z wykorzystaniem pakietu SingleR26. Geny markerowe były następujące: limfocyty B, IGKC, MS4A1 oraz CD79A; kardiomiocyty, TNNI3, MYL2 oraz ACTC1; komórki śródbłonka, VWF, PECAM1 oraz EGFL7; makrofagi, C1QC, C1QB oraz C1QA; monocyty, S100A8, S100A9 oraz G0S2; komórki NK, NKG7, GNLY oraz CCL5; komórki mięśni gładkich, MYL9, TAGLN oraz ACTA2; komórki stromalne, FBLN1, LUM oraz DCN; i limfocyty T, CD3E, CD3G oraz CD3D.

4. Analiza ekspresji różnicowej i punktacja wzbogacenia zestawów genów
Przy użyciu pakietu limma27 skonstruowano model liniowy w celu porównania ekspresji genów między grupą DCM a grupą kontrolną zdrowych osobników. Za istotnie różnicujące się uznano geny o wartości P < 0,05 i bezwzględnej zmianie krotności (fold change) większej niż 1,5, co odpowiada bezwzględnej wartości log₂ fold change większej niż 0,58.

Przeprowadzono analizę wzbogacenia zestawów genów dla pojedynczych próbek (single-sample gene set enrichment analysis), aby obliczyć wyniki wzbogacenia dla zestawów genów związanych ze starzeniem oraz mitochondriami w każdej próbce28. Różnice w wynikach wzbogacenia pomiędzy grupą DCM a grupą zdrowej kontroli oceniono za pomocą testu sum rang Wilcoxona, przyjmując wartość P < 0,05 za statystycznie istotną.

Na poziomie pojedynczych komórek wartości punktowe modułów związanych ze starzeniem oraz mitochondrialnych obliczono za pomocą funkcji AddModuleScore w pakiecie Seurat. Różnice w wartościach punktowych modułów między grupami oceniono przy użyciu testu suma rang Wilcoxona.

Sygnatury genowe związane ze starzeniem pobrano z bazy danych CellAge (https://genomics.senescence.info/cells/), a zestawy genów związanych z mitochondriami uzyskano z GeneCards (https://www.genecards.org/). Pełne listy genów wykorzystane do punktacji znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.

5. Konstrukcja ważonej sieci koekspresji genów
Do konstrukcji sieci wybrano 5000 genów kodujących białka o najwyższej wariancji ekspresji w danych transkrypomicznych z całej tkanki. Funkcję pickSoftThreshold zastosowano do obliczenia indeksu dopasowania topologii bezskalowej dla wielu potęg progu miękkiego. Optymalny próg określono jako minimalną potęgę, która pozwala uzyskać sieć bezskalową z wartością R2 powyżej 0,9. W związku z tym do dalszych analiz sieciowych przyjęto potęgę progu miękkiego β = 5.

Podpisana ważona sieć koekspresji została skonstruowana przy użyciu funkcji blockwiseModules z minimalną wielkością modułu wynoszącą 30. Współczynniki korelacji Pearsona obliczono pomiędzy eigengenem każdego modułu a wynikiem wzbogacenia związanym ze starzeniem lub mitochondriami. Moduły o bezwzględnym współczynniku korelacji większym niż 0,4 i P < 0,001 uznano za moduły istotnie powiązane.

Geny w ramach modułów wykazujących istotne powiązania poddano analizie przecięcia z genami o różnym poziomie ekspresji, aby zidentyfikować geny kandydackie związane ze starzeniem w przebiegu DCM oraz geny kandydackie związane z mitochondriami w przebiegu DCM.

6. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego
Analizy wzbogacenia funkcjonalnego, w tym analizy ontologii genów (GO) oraz ścieżek z bazy Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), przeprowadzono dla genów kandydackich przy użyciu pakietu clusterProfiler29. Wzbogacenie GO obejmowało trzy standardowe kategorie: proces biologiczny, komponent komórkowy oraz funkcję molekularną.

Wszystkie analizy przeprowadzono z wykorzystaniem adnotacji dla gatunku ludzkiego, stosując stopień fałszywych odkryć (FDR) do korekty wartości P oraz próg wartości q wynoszący 0,05. Zbiory genów ograniczono do zakresu wielkości od 10 do 500 genów, a terminy z FDR < 0,05 zdefiniowano jako istotne statystycznie. Na koniec wyniki wzbogacenia GO zwizualizowano za pomocą zgrupowanych wykresów słupkowych, natomiast wyniki wzbogacenia KEGG przedstawiono na wykresach bąbelkowych.

7. Konstrukcja sieci PPI i przesiewanie genów hubowych
Kandydackie geny wprowadzono do bazy danych STRING w wersji 11.530, ustawiając organizm na Homo sapiens oraz próg ufności interakcji na łączny wynik większy niż 0,7. Odłączone węzły zostały ukryte, a dane dotyczące interakcji wyeksportowano w formacie wartości rozdzielanych tabulatorem.

Dane dotyczące oddziaływań zostały zaimportowane do programu Cytoscape w wersji 3.9.1 w celu wizualizacji31. Wyniki topologiczne węzłów obliczono za pomocą wtyczki CytoHubba32, stosując trzy algorytmy: stopień (Degree), maksymalny komponent sąsiedztwa (maximum neighborhood component) oraz centralność maksymalnej kliki (maximal clique centrality).

Podstawowe moduły funkcjonalne w obrębie sieci zidentyfikowano za pomocą wtyczki MCODE33, stosując następujące parametry domyślne: próg stopnia (degree cutoff), 2; k-core, 2; próg oceny węzła (node score cutoff), 0,2 oraz maksymalna głębokość, 100. Geny sklasyfikowane w pierwszej dziesiątce przez wszystkie trzy algorytmy topologiczne zestawiono z genami w rdzeniowej podsieci MCODE, aby wyłonić końcowe geny stanowiące centra (huby) oddziaływań białko-białko.

8. Wybór genów kluczowych w oparciu o uczenie maszynowe i budowa modelu diagnostycznego
Aby zapewnić powtarzalność i zrównoważoną reprezentację, zintegrowany zbiór danych transkryptomicznych bulk podzielono losowo na zbiory treningowy i walidacyjny w stosunku 7:3, stosując stały ziarno losowości (seed = 123456). Podział ten był stratyfikowany według grupy chorobowej (DCM vs. kontrolna), aby zachować spójne proporcje klas w obu zbiorach. Przed podziałem skorygowano efekty serii z różnych źródeł danych za pomocą pakietu sva, a zintegrowane próbki traktowano jako jednolita kohorta podczas losowej alokacji.

Zastosowano trzy algorytmy uczenia maszynowego w celu przesiewowego wyboru genów kandydackich. W pierwszej kolejności przeprowadzono regresję logistyczną LASSO poprzez funkcja cv.glmnet w pakiecie glmnet34Zbudowano model klasyfikacji binarnej z 5-krotną walidacją krzyżową, przyjmując AUC jako metrykę oceny. Geny z niezerowymi współczynnikami przy wartości lambda.min zostały wyselekcjonowane jako geny kandydackie.

Po drugie, z wykorzystaniem pakietu randomForest35 zbudowano model klasyfikacji lasów losowych składający się z 500 drzew decyzyjnych. Liczbę zmiennych próbkowanych dla każdego podziału ustawiono jako pierwiastek kwadratowy całkowitej liczby cech. Istotność genów określono na podstawie współczynnika Giniego, a do dalszej analizy wybrano 10 genów o najwyższych wskaźnikach istotności.

Po trzecie, analizę SVM-RFE przeprowadzono przy użyciu funkcji rfe z pakietu caret36. Liczbę cech ustawiono w zakresie od 1 do 10, a do trenowania modelu zastosowano 5-krotną walidację krzyżową. Ostatecznie wybrano podzbiór genów z optymalną dokładnością walidacji krzyżowej.

Geny zidentyfikowane przez wszystkie trzy algorytmy zdefiniowano jako ostateczne rdzeniowe geny związane ze starzeniem i mitochondriami w DCM. Następnie skonstruowano modele diagnostyczne z wykorzystaniem 10 algorytmów klasyfikacji: drzewa decyzyjnego, maszyny gradient boosting, wzmocnionego uogólnionego modelu liniowego, k-najbliższych sąsiadów, regresji logistycznej, sieci neuronowej, cząstkowych najmniejszych kwadratów, lasu losowego, maszyny wektorów nośnych oraz ekstremalnego gradient boostingu.

Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) zostały wygenerowane przy użyciu pakietu pROC37. Aby ocenić wydajność diagnostyczną w zestawach treningowym i walidacyjnym, obliczono pole pod krzywą (AUC), dokładność, czułość oraz swoistość.

Przeprowadzono analizę SHapley Additive exPlanations w celu obliczenia wkładu każdego z głównych genów w przewidywania modelu38. Wygenerowano wykresy podsumowujące oraz wykresy wodospadowe dla każdej próbki. Przyjęto, że ostateczny model diagnostyczny z polem pod krzywą większym niż 0,8 w zbiorze walidacyjnym wykazuje dobrą wydajność diagnostyczną.

9. Wnioskowanie o komunikacji międzykomórkowej
Sieci komunikacji międzykomórkowej w mikrośrodowisku serca wywnioskowano przy użyciu pakietu CellChat39. Obiekt CellChat skonstruowano w oparciu o bazę danych CellChatDB.human. Ligandy i receptory wykazujące różnicową ekspresję zidentyfikowano za pomocą funkcji identifyOverExpressedGenes, a istotne pary interakcji odfiltrowano przy użyciu funkcji identifyOverExpressedInteractions.

Prawdopodobieństwa komunikacji między typami komórek obliczono przy użyciu funkcji computeCommunProb. Globalna sieć komunikacji na poziomie typów komórek została zagregowana za pomocą aggregateNet. Liczbę interakcji oraz siłę komunikacji między każdą parą typów komórek określono ilościowo i zwizualizowano za pomocą map ciepła oraz wykresów słupkowych.

10. Kwantyfikacja infiltracji komórek odpornościowych
Wskaźniki wzbogacenia dla 28 typów komórek odpornościowych obliczono dla każdej próbki zbiorczej (bulk), wykorzystując analizę wzbogacenia zestawów genów w pojedynczej próbce (single-sample gene set enrichment analysis)28 oraz zestaw genów sygnatury komórek odpornościowych40. Do porównania wskaźników wzbogacenia komórek odpornościowych pomiędzy grupą DCM a grupą zdrowej kontroli zastosowano test suma rang Wilcoxona. Za statystycznie istotne uznano wyniki P < 0,05.

Przeprowadzono analizę korelacji Pearsona w celu oceny związku między poziomami ekspresji genów kluczowych a wynikami wzbogacenia komórek odpornościowych. Wszystkie korelacje z P < 0,05 uznano za istotne statystycznie.

11. Grupowanie konsensusowe w celu podtypowania molekularnego
Nadzorowane grupowanie konsensusowe próbek DCM zostało przeprowadzone na podstawie profili ekspresji genów kluczowych za pomocą pakietu ConsensusClusterPlus41. Parametry grupowania ustawiono na maksymalną liczbę 6 klastrów, 1000 iteracji ponownego próbkowania oraz proporcję ponownego próbkowania wynoszącą 0.8. Do grupowania zastosowano metodę PAM (Partitioning Around Medoids) z wykorzystaniem odległości euklidesowej, a w celu zapewnienia powtarzalności wyników użyto stałego ziarna generatora liczb losowych.

Optymalną liczbę podtypów określono na podstawie wykresu delta area oraz wyników stabilności klastrów konsensusowych, ostatecznie identyfikując K = 2. Następnie przeprowadzono analizę głównych składowych, aby potwierdzić wyraźne rozdzielenie dwóch podtypów molekularnych.

W celu obliczenia wyników wzbogacenia ścieżek KEGG dla poszczególnych próbek zastosowano analizę wariancji zestawów genów (gene set variation analysis)42. Do wykrywania różnic w aktywacji ścieżek między podtypami wykorzystano pakiet limma27, a za statystycznie istotne uznano wartości P mniejsze niż 0,05.

12. Echokardiograficzna ocena funkcji serca
Myszy znieczulono poprzez wykonano dostryk peritonealny 1% pentobarbitalu sodowego (30 mg/kg), a zwierzę unieruchomiono w pozycji grzbietnej na termostatycznym stole operacyjnym. Po usunięciu owłosienia klatki piersiowej w obszarze przedsercowym równomiernie nanesiono żel do badań ultrasonograficznych.

Echokardiografię w trybie M sterowaną obrazowaniem dwuwymiarowym przeprowadzono na poziomie mięśni brodawkowatych lewej komory przy użyciu systemu ultrasonograficznego dla małych zwierząt. Przechwycono trzy kolejne stabilne cykle serca w celu pomiaru końcowego rozkurczowego średnicy lewej komory, końcowej skurczowej średnicy, frakcji wyrzutowej oraz skracania frakcyjnego. Wszystkie oceny echokardiograficzne zostały przeprowadzone w sposób zaślepiony przez profesjonalnego ultrasonografistę.

Z każdej grupy losowo wybrano trzy myszy do badania echokardiograficznego, a następnie te 6 zwierząt łącznie uśmiercono w celu pobrania tkanki mięśnia sercowego i przeprowadzenia pomiarów metodą ELISA. Pozostałe zwierzęta doświadczalne poddano dodatkowym równoległym analizom laboratoryjnym, a ich dane nie zostały uwzględnione w niniejszym badaniu.

13. Pobieranie tkanki mięśnia sercowego, ekstrakcja białek i test immunoenzymatyczny (ELISA)
Po ocenie echokardiograficznej myszy uśmiercono w głębokiej narkozie. Następnie szybko pobrano tkanki serca. poprzez wykonano medianową torakotomię, a następnie wypreparowano mięsień lewej komory serca w warunkach chłodzenia na lodzie. Wyizolowane tkanki dokładnie przemyto lodowatym roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym, aby usunąć pozostałości krwi wewnątrzsercowej. Po odsączeniu nadmiaru płynu jałowym papierem filtracyjnym próbki natychmiast zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze −80 °C do późniejszej ekstrakcji białek, przy ścisłym unikaniu wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.

Zamrożone tkanki mięśnia sercowego zważono i pocięto na lodzie na fragmenty o wielkości około 1 mm3. Tkanki poddano lizie w lodowatym buforze lizującym RIPA zawierającym inhibitory proteaz i fosfataz w zestandaryzowanym stosunku 100 µL buforu na 10 mg tkanki. Próbki w pełni zhomogenizowano mechanicznie na lodzie i inkubowano przez 30 min, aby uzyskać całkowitą lizę komórek.

Lizaty wirowano przy 12,000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Powstałe nadsączki zebrano do probówek wolnych od enzymów, a całkowite stężenie białka określono za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasem bicinchononowym zgodnie z protokołami producenta. Wszystkie próbki znormalizowano do identycznego stężenia białka przy użyciu buforu do lizy.

Poziomy ekspresji białek czterech genów hub w lizatach mięśnia sercowego zmierzono przy użyciu odpowiednich zestawów do testu immunoenzymatycznego (ELISA). Seryjnie rozcieńczone wzorce oraz znormalizowane lizaty tkankowe naniesiono w duplikacie (100 µL na dołek) na wcześniej powlekone mikropłytki. Płytki inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie dokładnie przemyto buforem do mycia dołączonym do zestawu.

Do każdego dołka dodano przeciwciało sprzężone z enzymem i inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie przeprowadzono dokładne przemycie. Następnie dodano roztwór chromogenu substratu, a płytki inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Reakcję barwną przerwano za pomocą roztworu stopującego, a wartości absorbancji zmierzono przy 450 nm (długość fali referencyjnej: 570 nm) przy użyciu pełnofalowego czytnika mikropłytek.

14. Analiza statystyczna
Wszystkie analizy statystyczne oraz wizualizacje danych wykonano przy użyciu programu R w wersji 4.2.3. W przypadku pomiarów stężeń metodą ELISA dla każdego genu docelowego (TGFB2, SERPINE1, CYBB, TLR2), w pierwszej kolejności zastosowano test Shapiro-Wilka w celu oceny normalności rozkładu danych osobno w grupie kontrolnej (Control) i grupie z DCM. Następnie użyto testu F do oceny jednorodności wariancji pomiędzy obiema grupami. Metodę porównania międzygrupowego określono na podstawie wyników testu jednorodności wariancji: jeśli wariancje były jednorodne (P ≥ 0.05), do porównania wartości średnich między grupami zastosowano nieparzysty test t Studenta; jeśli wariancje były niejednorodne (P < 0.05), do analizy wykorzystano poprawiony test t Welcha. Wszystkie testy były dwustronne, a próg istotności statystycznej ustalono na poziomie P < 0.05. Dane przedstawiono w formie wykresów pudełkowych z nałożonymi rozproszonymi punktami danych indywidualnych. Wartości P dla wszystkich testów oraz rodzaj zastosowanego testu t zostały szczegółowo opisane na każdym wykresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Preprocessing danych i analiza różnicowej ekspresji
Wszystkie sześć zbiorów danych transkryptomicznych poddano standaryzowanemu preprocessingowi oraz korekcie efektu seryjnego przed analizą końcową. Dane z mikromacierzy znormalizowano przy użyciu algorytmu robust multi-array average, natomiast dane liczbowe z RNA-seq znormalizowano metodą trimmed mean of M-values. Zastosowano algorytm ComBat w celu usunięcia technicznych efektów seryjnych związanych z pochodzeniem zbioru danych i platformą detekcji. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zintegrowany wielowarstwowy schemat postępowania połączył bulkową metaanalizę transkryptomiczną, konstrukcję ważonej sieci koekspresji genów, zespołowe uczenie maszynowe, walidację transkryptomiczną pojedynczych komórek oraz weryfikację na modelu zwierzęcym in vivo. Cztery powiązane ze starzeniem i mitochondriami geny hubowe CYBB, SERPINE1, TGFB2 oraz TLR2 zostały zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery diagnostyczne kardiomiopatii rozstrzeniowej (DCM). Integracja sześciu niezależnych zbiorów danych transkry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor oświadcza, że nie ma żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Wyrażamy wdzięczność za udostępnienie publicznych danych za pośrednictwem bazy danych Gene Expression Omnibus. Dziękujemy również recenzentom oraz redaktorom za konstruktywne uwagi do manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Projekt Badawczy na Poziomie Departamentu Prowincjonalnego (Grant nr 2021JDZX2026), pt. „Mechanizm formuły Yiqi Huoxue w łagodzeniu aterosklerotycznego przebudowywania naczyń poprzez regulację zapalną zależną od KLF2-Nrf2”.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żel do ultradźwięków Aquasonic ClearParker Laboratories, Inc.Mar-34Stosowany do obrazowania echokardiograficznego małych zwierząt.
Zestaw do oznaczania białka BCAThermo Fisher Scientific23227Detekcja przy 562 nm; zakres 20–2 000 µg/mL; stosowany do ilościowego oznaczania całkowitej zawartości białka w lizatach serca myszy.
Baza danych CellAgeHuman Ageing Genomic Resourceshttps://genomics.senescence.info/cells/Źródło sygnatur genów związanych ze starzeniem.
CytoHubba, wtyczka do CytoscapeCytoscape App StoreVersion 0.1Stosowana do oceny topologii węzłów w sieciach oddziaływań białko-białko.
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.9.1Stosowany do wizualizacji sieci oddziaływań białko-białko.
Pełnozakresowy czytnik mikropłytekThermo Fisher ScientificMultiskan FCStosowany do pomiaru absorbancji w testach ELISA.
Gene Expression OmnibusNational Center for Biotechnology Informationhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Publiczne repozytorium wykorzystywane do pozyskiwania zbiorów danych transkryptomicznych.
GeneCardsWeizmann Institute of Sciencehttps://www.genecards.org/Źródło zestawów genów związanych z mitochondriami.
Koktajl inhibitorów proteaz i fosfataz Halt, 100×, bez EDTAThermo Fisher Scientific78441Przechowywany w 4 °C; dodawany do buforu RIPA w stężeniu 10 µL/mL bezpośrednio przed użyciem.
Ciekły azotLokalny dostawca gazów laboratoryjnychNot applicableStosowany do błyskawicznego zamrażania tkanki mięśnia sercowego.
Samce myszy C57BL/6J klasy SPF, wiek 6–8 tygodni, masa 25 ± 2 gBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.Not applicableLicencja na produkcję zwierząt nr SCXK (Jing) 2021-0006; stosowane jako kontrole prawidłowe.
Samce transgenicznych myszy DCM CTNTR141W klasy SPF, wiek 6–8 tygodni, masa 25 ± 2 gInstitute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical SciencesNot applicableLicencja na produkcję zwierząt nr SCXK (Jing) 2021-0065; stosowane jako spontaniczny model DCM.
MCODE, wtyczka do CytoscapeCytoscape App StoreVersion 2.0.2Stosowana do identyfikacji kluczowych funkcjonalnych podsieci w sieciach oddziaływań białko-białko.
Zestaw ELISA dla mysiego CYBBBiogradetechA-QEK09250-96wellsStosowany w niniejszym badaniu do pomiaru CYBB w lizatach tkanki mięśnia sercowego myszy.
Zestaw ELISA dla mysiego PAI-1EK-BIOML30970Stosowany w niniejszym badaniu do pomiaru PAI-1 (białka kodowanego przez SERPINE1) w lizatach tkanki mięśnia sercowego myszy.
Zestaw ELISA dla mysiego TGF-β2ElaBoXSEKM-0036Stosowany w niniejszym badaniu do pomiaru TGF-β2 w lizatach tkanki mięśnia sercowego myszy.
Zestaw ELISA dla mysiego TLR-2SolarbioSEKM-0163Stosowany w niniejszym badaniu do pomiaru TLR-2 w lizatach tkanki mięśnia sercowego myszy.
Fosforanowy bufor solny, pH 7.4, bez wapnia i magnezuBiological Industries02-024-1ACSSterylny roztwór 1×; przechowywany w 4 °C; stosowany do płukania tkanek i rozcieńczeń.
Pakiet R: caretCRANVersion 6.0-94Stosowany do rekurencyjnej eliminacji cech w maszynach wektorów nośnych (SVM-RFE).
Pakiet R: CellChatCellChat developersVersion 1.6.1Stosowany do wnioskowania o komunikacji międzykomórkowej na podstawie danych z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
Pakiet R: clusterProfilerBioconductorVersion 4.8.3Stosowany do analizy wzbogacenia funkcjonalnego.
Pakiet R: ConsensusClusterPlusBioconductorVersion 1.64.0Stosowany do nienadzorowanego klastrowania konsensusowego.
Pakiet R: edgeRBioconductorVersion 3.42.4Stosowany do normalizacji danych z sekwencjonowania RNA metodą uśrednionej wartości M (TMM).
Pakiet R: GEOqueryBioconductorVersion 2.68.0Stosowany do pobierania danych z Gene Expression Omnibus.
Pakiet R: glmnetCRANVersion 4.1-8Stosowany do regresji logistycznej metodą LASSO.
Pakiet R: limmaBioconductorVersion 3.56.2Stosowany do analizy różnicowej ekspresji i modelowania statystycznego.
Pakiet R: pROCCRANVersion 1.18.5Stosowany do analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC).
Pakiet R: randomForestCRANVersion 4.7-1.2Stosowany do uczenia maszynowego metodą lasów losowych.
Pakiet R: SeuratCRANVersion 5.0.1Stosowany do analizy danych z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
Pakiet R: SingleRBioconductorVersion 2.2.0Stosowany do zautomatyzowanej adnotacji typów komórek.
Pakiet R: svaBioconductorVersion 3.48.0Stosowany do korekcji efektu serii za pomocą metody ComBat.
Wirówka chłodzącaSigma-AldrichSIGMA 3-KStosowana do wirowania lizatów tkanki mięśnia sercowego.
Bufor do lizy i ekstrakcji RIPAThermo Fisher Scientific89900Gotowy do użycia roztwór 1×; przechowywany w 4 °C; przed użyciem uzupełniany inhibitorami proteaz i fosfataz.
System obrazowania ultradźwiękowego dla małych zwierzątVINNO Technology Co., Ltd.VINN06LABStosowany do echokardiograficznej oceny funkcji serca.
Pentobarbital soduSinopharm Chemical Reagent Co.20040428Przygotowany jako roztwór 1%, 10 mg/mL, w sterylnej soli fizjologicznej; stosowany do znieczulenia domięśniowego w dawce 30 mg/kg.
Baza danych STRINGSTRING ConsortiumVersion 11.5Stosowana do konstrukcji sieci oddziaływań białko-białko.
Homogenizator tkanek TGrinder H24TIANGENOSE-TH-01Stosowany do homogenizacji tkanki mięśnia sercowego myszy w buforze RIPA z prędkością 6,0 m/s przez 30–60 s w ciągu 2–3 cykli.
Termostatyczna platforma dla zwierząt/podgrzewany stół operacyjny dla małych zwierzątShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.T-30350Stosowany do utrzymania myszy w temperaturze 37 °C podczas echokardiografii; zakres pracy od temperatury pokojowej do 50 °C.

Bibliografia

  1. Pinto YM et al. Proposal for a revised definition of dilated cardiomyopathy, hypokinetic non-dilated cardiomyopathy, and its implications for clinical practice: a position statement of the ESC working group on myocardial and pericardial diseases. Eur Heart J. 2016;37(23):1850-1858. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehv727
  2. Newman NA, Burke MA. Dilated Cardiomyopathy: A Genetic Journey from Past to Future. Int J Mol Sci. 2024;25(21):11460. https://doi.org/10.3390/ijms252111460
  3. Mishra B et al. Tumour necrosis factor-alpha promoter polymorphism and its association with viral dilated cardiomyopathy in Indian population: a pilot study. Indian J Med Microbiol. 2015;33(1):16–20. https://doi.org/10.4103/0255-0857.148368
  4. Frustaci A et al. Oxidative myocardial damage in human cocaine-related cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 2015;17(3):283-290. https://doi.org/10.1002/ejhf.219
  5. Ni B et al. The role of β-catenin in cardiac diseases. Front Pharmacol. 2023;14:1157043. https://doi.org/10.3389/fphar.2023.1157043
  6. Kuwahara K et al. TRPC6 fulfills a calcineurin signaling circuit during pathologic cardiac remodeling. J Clin Invest. 2006;116(12):3114-3126. https://doi.org/10.1172/JCI27702
  7. He SL et al. Mitochondrial-related gene expression profiles suggest an important role of PGC-1alpha in the compensatory mechanism of endemic dilated cardiomyopathy. Exp Cell Res. 2013;319(17):2604–2616. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2013.07.017
  8. Luczak ED et al. Mitochondrial CaMKII causes adverse metabolic reprogramming and dilated cardiomyopathy. Nat Commun. 2020;11(1):4416. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18165-6
  9. Li E et al. BMAL1 regulates mitochondrial fission and mitophagy through mitochondrial protein BNIP3 and is critical in the development of dilated cardiomyopathy. Protein Cell. 2020;11(9):661–679. https://doi.org/10.1007/s13238-020-00713-1
  10. Alila-Fersi O et al. First description of a novel mitochondrial mutation in the MT-TI gene associated with multiple mitochondrial DNA deletion and depletion in family with severe dilated mitochondrial cardiomyopathy. Biochem Biophys Res Commun. 2018;497(4):1049-1054. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.02.162
  11. Ramaccini D et al. Mitochondrial Function and Dysfunction in Dilated Cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 2020;8:624216. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.624216
  12. Yang J et al. Stem cells in the treatment of myocardial injury-induced cardiomyopathy: mechanisms and efficient utilization strategies. Front Pharmacol. 2025;16:1600604. https://doi.org/10.3389/fphar.2025.1600604
  13. Van Linthout S et al. State of the art and perspectives of gene therapy in heart failure. A scientific statement of the Heart Failure Association of the ESC, the ESC Council on Cardiovascular Genomics and the ESC Working Group on Myocardial & Pericardial Diseases. Eur J Heart Fail. 2025;27(1):5–25. https://doi.org/10.1002/ejhf.3516
  14. Alimadadi A, Munroe PB, Joe B, Cheng X. Meta-Analysis of Dilated Cardiomyopathy Using Cardiac RNA-Seq Transcriptomic Datasets. Genes (Basel). 2020;11(1):60. https://doi.org/10.3390/genes11010060
  15. Verdonschot J et al. Clustering of Cardiac Transcriptome Profiles Reveals Unique Subgroups of Dilated Cardiomyopathy Patients. JACC Basic Transl Sci. 2023;8(4):406–418. https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2022.10.007
  16. Zhu T et al. Identification and Verification of Feature Biomarkers Associated With Immune Cells in Dilated Cardiomyopathy by Bioinformatics Analysis. Front Genet. 2022;13:874544. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.874544
  17. Li H et al. Identification of Centrosome Duplication-Related Biomarkers in Hypertrophic Cardiomyopathy Through Integrative Multi-Omics, Single-Cell Transcriptomics, and Experimental Validation. J Am Heart Assoc. 2026;15(12):e047416. https://doi.org/10.1161/JAHA.125.047416
  18. Ni L et al. Dissecting and validation the biomarker of heart failure progression in patients with atherosclerosis by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Genet. 2025;16:1587274. https://doi.org/10.3389/fgene.2025.1587274
  19. Barrett T et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 2013;41(Database issue):D991–D995. https://doi.org/10.1093/nar/gks1193
  20. Davis S, Meltzer PS. GEOquery: a bridge between the Gene Expression Omnibus (GEO) and BioConductor. Bioinformatics. 2007;23(14):1846-1847. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btm254
  21. Irizarry RA et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003;4(2):249-264. https://doi.org/10.1093/biostatistics/4.2.249
  22. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 2010;26(1):139–140. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp616
  23. Leek JT et al. The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics. 2012;28(6):882–883. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts034
  24. Butler A et al. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420. https://doi.org/10.1038/nbt.4096
  25. Korsunsky I et al. Fast, sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat Methods. 2019;16(12):1289-1296. https://doi.org/10.1038/s51592-019-0619-0
  26. Aran D et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 2019;20(2):163-172. https://doi.org/10.1038/s41590-018-0276-y
  27. Ritchie ME et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47. https://doi.org/10.1093/nar/gkv007
  28. Barbie DA et al. Systematic RNA interference reveals that oncogenic KRAS-driven cancers require TBK1. Nature. 2009;462(7269):108-112. https://doi.org/10.1038/nature08460
  29. Yu G et al. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287. https://doi.org/10.1089/omi.2011.0118
  30. Szklarczyk D et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607–D613. https://doi.org/10.1093/nar/gky1131
  31. Shannon P et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003;13(11):2498-2504. https://doi.org/10.1101/gr.1239303
  32. Chin CH et al. cytoHubba: identifying hub objects and sub-networks from complex interactome. BMC Syst Biol. 2014;8(Suppl 4):S11. https://doi.org/10.1186/1752-0509-8-S4-S11
  33. Bader GD, Hogue CW. An automated method for finding molecular complexes in large protein interaction networks. BMC Bioinformatics. 2003;4:2. https://doi.org/10.1186/1471-2105-4-2
  34. Friedman J, Hastie T, Tibshirani R. Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. J Stat Softw. 2010;33(1):1-22. https://doi.org/10.18637/jss.v033.i01
  35. Touw WG et al. Data mining in the Life Sciences with Random Forest: a walk in the park or lost in the jungle. Brief Bioinform. 2013;14(3):315-326. https://doi.org/10.1093/bib/bbs034
  36. Chicco D. Ten quick tips for machine learning in computational biology. BioData Min. 2017;10:35. https://doi.org/10.1186/s13040-017-0155-3
  37. Robin X et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77. https://doi.org/10.1186/1471-2105-12-77
  38. Lundberg SM et al. From Local Explanations to Global Understanding with Explainable AI for Trees. Nat Mach Intell. 2020;2(1):56-67. https://doi.org/10.1038/s42256-019-0138-9
  39. Jin S et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat Commun. 2021;12(1):1088. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21246-9
  40. Charoentong P et al. Pan-cancer Immunogenomic Analyses Reveal Genotype-Immunophenotype Relationships and Predictors of Response to Checkpoint Blockade. Cell Rep. 2017;18(1):248–262. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.12.019
  41. Wilkerson MD, Hayes DN. ConsensusClusterPlus: a class discovery tool with confidence assessments and item tracking. Bioinformatics. 2010;26(12):1572–1573. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btq170
  42. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14:7. https://doi.org/10.1186/1471-2105-14-7
  43. Zheng Y et al. Exploring Key Genes to Construct a Diagnosis Model of Dilated Cardiomyopathy. Front Cardiovasc Med. 2022;9:865096. https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.865096
  44. Johnson WE, Li C, Rabinovic A. Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics. 2007;8(1):118-127. https://doi.org/10.1093/biostatistics/kxj037
  45. Koslow M, Mondaca-Ruff D, Xu X. Transcriptome studies of inherited dilated cardiomyopathies. Mamm Genome. 2023;34(2):312-322. https://doi.org/10.1007/s00335-023-09978-z
  46. Zhang B, Horvath S. A general framework for weighted gene co-expression network analysis. Stat Appl Genet Mol Biol. 2005;4:Article17. https://doi.org/10.2202/1544-6115.1128
  47. Lin M et al. Machine learning and multi-omics integration: advancing cardiovascular translational research and clinical practice. J Transl Med. 2025;23(1):388. https://doi.org/10.1186/s12967-025-06425-2
  48. Climente-González H et al. Interpretable machine learning leverages proteomics to improve cardiovascular disease risk prediction and biomarker identification. Commun Med (Lond). 2025;5(1):170. https://doi.org/10.1038/s43856-025-00872-0
  49. Shah P et al. Predicting cardiovascular risk with hybrid ensemble learning and explainable AI. Sci Rep. 2025;15(1):17927. https://doi.org/10.1038/s41598-025-01650-7
  50. Chaffin M et al. Single-nucleus profiling of human dilated and hypertrophic cardiomyopathy. Nature. 2022;608(7921):174-180. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04817-8
  51. Juan F et al. The changes of the cardiac structure and function in cTnTR141W transgenic mice. Int J Cardiol. 2008;128(1):83-90. https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2008.03.006
  52. Russell-Hallinan A et al. Single-Cell RNA Sequencing Reveals Cardiac Fibroblast-Specific Transcriptomic Changes in Dilated Cardiomyopathy. Cells. 2024;13(9):752. https://doi.org/10.3390/cells13090752
  53. Knowlton KU. Dilated Cardiomyopathy. Circulation. 2019;139(20):2339-2341. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.119.040037
  54. Smith GD, Ebrahim S. Mendelian randomization: prospects, potentials, and limitations. Int J Epidemiol. 2004;33(1):30-42. https://doi.org/10.1093/ije/dyh132
  55. Chen R et al. Macrophages in cardiovascular diseases: molecular mechanisms and therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):130. https://doi.org/10.1038/s41392-024-01840-1
  56. Liu R et al. Tead1 is essential for mitochondrial function in cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2020;319(1):H89-H99. https://doi.org/10.1152/ajpheart.00732.2019
  57. Sharma S et al. SOD2 deficiency in cardiomyocytes defines defective mitochondrial bioenergetics as a cause of lethal dilated cardiomyopathy. Redox Biol. 2020;37:101740. https://doi.org/10.1016/j.redox.2020.101740

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

dysfunkcja mitochondriówgeny związane ze starzeniemtranskryptomika bulkjednokomórkowe RNAkoekspresja genówsieć oddziaływań białekinfiltracja komórek odpornościowychbiomarkery uczenia maszynowegosubtypowanie molekularne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.