Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model mysi uszkodzenia płuc związanego z chorobą koronawirusową 2019 indukowanego przez koronawirusa zespołu ostrych naczyń oddechowych 2 i lipopolisacharyd

109 wyświetleń

⸱

11 września 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Sichuan Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje model mysi uszkodzenia płuc powiązanego z chorobą koronawirusową 2019, indukowane poprzez połączoną podaż donosową koronawirusa SARS-CoV-2 oraz lipopolisarydu. Model ten umożliwia badanie płucnych odpowiedzi zapalnych, upośledzonych odpowiedzi interferonów typu I oraz potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Streszczenie

Mimo powszechnego wdrażania szczepień i terapii przeciwwirusowych, zakażenia SARS-CoV-2 nadal powodują znaczną zachorowalność i śmiertelność wśród populacji wrażliwych, co podkreśla pilną potrzebę opracowania wiarygodnych modeli eksperymentalnych do badania patogenezy COVID-19, wyjaśniania mechanizmów działania leków oraz oceny potencjalnych strategii terapeutycznych. Zakażenie SARS-CoV-2 może prowadzić do ciężkiego uszkodzenia płuc, charakteryzującego się nadmierną odpowiedzią zapalną i upośledzoną odpornością przeciwwirusową zależną od interferonu typu I (IFN-I); jednak obecne modele zwierzęce mają ograniczone możliwości odwzorowania rozregulowanych odpowiedzi immunologiczno-zapalnych związanych z COVID-19. Opracowano mysi model uszkodzenia płuc związanego z COVID-19, indukowany przez SARS-CoV-2 i LPS, aby odwzorować kluczowe cechy immunopatologiczne COVID-19. Model ten indukuje wyraźne zmiany patologiczne w tkance płucnej, w tym nacieki komórek zapalnych, zniszczenie struktury pęcherzyków płucnych oraz podwyższoną ekspresję cytokin prozapalnych, którym towarzyszy upośledzona odpowiedź IFN-I. Niniejsze badanie zawiera szczegółowy opis procedur wykorzystanych do ustanowienia mysiego modelu uszkodzenia płuc indukowanego przez SARS-CoV-2 i LPS oraz systematycznie charakteryzuje ten model poprzez analizy zmian histopatologicznych w płucach, miana wirusa, cytokin zapalnych i poziomów IFN-I. Model ten stanowi platformę eksperymentalną do badania mechanizmów immunologiczno-zapalnych leżących u podstaw uszkodzenia płuc związanego z COVID-19 oraz procesów uczestniczących w regeneracji tkanki płucnej, zapewniając jednocześnie podstawę do oceny strategii terapeutycznych mających na celu złagodzenie rozregulowania immunologiczno-zapalnego i promowanie powrotu funkcji płucnych.

Wprowadzenie

Od czasu swojego pojawienia się pod koniec 2019 roku, SARS-CoV-2 wywołał globalny kryzys w obszarze zdrowia publicznego, a nieustająca ewolucja wirusa nadal stanowi wyzwanie dla istniejących szczepionek i strategii terapeutycznych1,2,3. Dlatego też dalsze badania nad uszkodzeniami płuc powiązanymi z COVID-19 są niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów choroby i rozwoju strategii terapeutycznych.

Zakażenie SARS-CoV-2 może powodować ciężkie uszkodzenia płuc, a nawet prowadzić do zespołu ostrą niewydolności oddechowej (ARDS) i zespołu wielonarządowej niewydolności4,5. Rosnąca liczba dowodów sugeruje, że patogeneza uszkodzenia płuc powiązanego z COVID-19 jest bardzo złożona, a jej kluczową cechą jest dysregulacja odpowiedzi immunologicznej i zapalnej6,7,8,9. Z jednej strony zakażenie SARS-CoV-2 może indukować nadmierną odpowiedź zapalną, prowadząc do masowego uwalniania cytokin prozapalnych, takich jak interleukina-6 (IL-6), interleukina-1β (IL-1β) oraz czynnik martwiczy nowotworów-α (TNF-α), co wywołuje tak zwaną „burzę cytokinową”10,11, uznawaną za główny czynnik uszkodzenia płuc i progresji choroby. Z drugiej strony, w wczesnej fazie zakażenia, SARS-CoV-2 może tłumić odpowiedź IFN-I gospodarza poprzez wiele mechanizmów, co skutkuje upośledzeniem odporności przeciwwirusowej zależnej od IFN-I12,13,14. W związku z tym opóźniona odpowiedź interferonowa, której towarzyszy podwyższony poziom cytokin prozapalnych, jest uważana za charakterystyczną cechę COVID-196,15.

Obecnie dostępne modele zwierzęce COVID-19 opierają się w dużej mierze na myszach transgenicznych hACE2, szczepach wirusa zaadaptowanych do myszy lub innych gatunkach, takich jak fretki i naczelne16,17. Jednak konwencjonalne modele infekcji SARS-CoV-2 u myszy często nie odzwierciedlają w pełni cech nadmiernego stanu zapalnego charakterystycznego dla COVID-1918,19,20. LPS, agonista TLR4, indukuje silne odpowiedzi zapalne i jest powszechnie stosowany w modelach ostrego uszkodzenia płuc21. Zatem opisany w niniejszym badaniu model indukowany SARS-CoV-2 i LPS został zaprojektowany do analiz koncentrujących się na uszkodzeniu płuc związanym z COVID-19, w szczególności na mechanizmach leżących u podstaw nadmiernej aktywacji zapalnej i upośledzonych odpowiedzi immunologicznych przeciwwirusowych. W porównaniu z modelami opartymi wyłącznie na SARS-CoV-2, podejście to uwypukla cechy immunozapalne, zachowując jednocześnie kontekst infekcji wirusowej. Model ten posiada znaczny potencjał w badaniu mechanizmów immunozapalnych, a nie w modelowaniu transmisji wirusa lub pełnego naturalnego przebiegu infekcji SARS-CoV-2.

Niniejszy protokół opisuje procedurę opracowania modelu mysiego uszkodzenia płuc związanego z COVID-19, indukowanego przez SARS-CoV-2 oraz LPS. Ze względu na ograniczenia istniejących modeli w odtwarzaniu immunologiczno-zapalnej dysregulacji związanej z COVID-19, podejście to zapewnia praktyczną platformę do badania mechanizmów choroby i oceny potencjalnych strategii terapeutycznych. Model został systematycznie oceniony poprzez histopatologię płuc, miano wirusa, poziom cytokin zapalnych oraz odpowiedzi IFN-I.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W niniejszym badaniu opracowano model mysi uszkodzenia płuc powiązanego z COVID-19 poprzez donosowe podanie SARS-CoV-2 i LPS, co stanowi stabilną i kosztowo efektywną alternatywę dla transgenicznych modeli mysich. Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Sichuan Center for Disease Control and Prevention i otrzymał zgodę komisji etyki ds. zwierząt [Sichuan CDC (Animal Ethics) Approval No. 005 (2025)]. Wszystkie procedury były przeprowadzane w ścisłej zgodności z odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

Szczegółowe informacje na temat głównych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabela materiałów.

1. Projekt protokołu badania

  1. Losowo przydziel myszy BALB/c do grupy kontrolnej lub grupy modelowej.
  2. W dniu 0 podaj SARS-CoV-2 donosowo myszom w grupie modelowej.
  3. W dniu 2 podaj LPS donosowo myszom w grupie modelowej.
  4. W odpowiednich punktach czasowych podaj donosowo myszom kontrolnym równą objętość soli fizjologicznej.
  5. W 3. dobie po zakażeniu SARS-CoV-2 uśmierć wszystkie myszy i pobierz tkankę płucną w celu walidacji modelu.
    UWAGA: Schemat doświadczalny przedstawiono na Rysunku 1A.

2. Przygotowanie

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Należy użyć samic myszy BALB/c wolnych od swoistych patogenów (SPF) w wieku 6–8 miesięcy i o masie około 25–30 g.
    2. Myszy należy przypisać losowo do grupy kontrolnej lub grupy modelowej za pomocą tablicy liczb losowych, tak aby w każdej grupie znalazło się cztery zwierzęta.
    3. Myszy należy utrzymywać w standardowych warunkach laboratoryjnych z wolnym dostępem do pokarmu i wody.
      UWAGA: Wcześniejsze badania wykazały, że starsze myszy są bardziej podatne na donosową infekcję SARS-CoV-2 niż myszy młodsze18,22. Dlatego w niniejszym badaniu wybrano starsze myszy BALB/c, aby ułatwić stworzenie modelu uszkodzenia płuc związanego z SARS-CoV-2.
    4. Każdą mysz należy zaszczepić donosowo 100 µL zawiesiny wirusowej, co odpowiada końcowej dawce zakaźnej 4.5 x 105 TCID₅₀ na mysz.
      UWAGA: Wirus SARS-CoV-2 został dostarczony przez Sichuan Center for Disease Control and Prevention. Szczepem wykorzystanym w tym badaniu był wariant Omicron SARS-CoV-2 o mianie zapasu wirusa 4.5 x 106 TCID₅₀/mL.
      OSTRZEŻENIE: Ponieważ SARS-CoV-2 jest mikroorganizmem o wysokiej patogenności, wszystkie procedury związane z wirusem należy przeprowadzać w placówce o poziomie bezpieczeństwa biologicznego dla zwierząt 3 (ABSL-3). W przypadku stosowania różnych wariantów wirusa lub modeli zwierzęcych należy zoptymalizować dawkę zakaźną na podstawie wstępnych eksperymentów.
  2. Przygotowanie roztworów roboczych
    1. Przygotowanie roztworu zapasowego LPS: Odważyć 3 mg proszku LPS i rozpuścić go w 1 mL soli fizjologicznej. Mieszać delikatnie lub w wytrząsarce wirowej (vortex) do całkowitego rozpuszczenia, aby uzyskać roztwór zapasowy o stężeniu 3 mg/mL. Przed podaniem roztwór zapasowy należy dodatkowo rozcieńczyć solą fizjologiczną do pożądanego stężenia roboczego, zależnie od masy ciała myszy.
    2. Przygotowanie roztworu anestetyka: Proszek należy zrekonstytuować sterylną wodą do iniekcji dołączoną do opakowania Zoletil, aby przygotować roztwór o wymaganym stosunku masy do objętości do późniejszego użycia.
    3. Przygotowanie roboczego roztworu wirusa: Przed użyciem należy powoli rozmrozić 1 mL zawiesiny wirusowej SARS-CoV-2 na lodzie w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Podczas przygotowywania i stosowania wszystkich roztworów roboczych należy postępować zgodnie z instrukcjami odpowiednich producentów.

3. Podanie donosowe u myszy

  1. Zważ każdą mysz przed podaniem preparatów i zapisz masę ciała.
  2. Oblicz dawki Zoletilu oraz LPS na podstawie masy ciała każdej myszy.
  3. Przygotuj odpowiednie roztwory robocze i pobierz wymagane objętości za pomocą odpowiedniej strzykawki w celu ich późniejszego podania.
  4. Unieruchomienie myszy: Delikatnie chwyć mysz za kark kciukiem i palcem wskazującym lewej ręki, trzymając skórę za uszami i na szyi.
  5. Umieść zwierzę na dłoni, używając palca serdecznego i małego do zabezpieczenia grzbietu i ogona. Ułóż mysz w pozycji grzbietnej z całkowicie odsłoniętym brzuchem i ustabilizowanym ciałem.
  6. Dezynfekcja: Zdezynfekuj miejsce wstrzyknięcia w obszarze brzucha 75% etanolem za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego.
  7. Znieczulenie: Wprowadź igłę strzykawki zawierającej Zoletil (25mg/kg) około 0,5 cm bocznie od linii środkowej dolnej części brzucha. Wprowadź igłę pod kątem 45° do jamy otrzewnej na głębokość około 2–3 mm po przebiciu skóry. Wykonaj aspirację, aby upewnić się, że w strzykawce nie ma krwi, a następnie powoli podaj środek znieczulający.
    UWAGA: Zoptymalizuj dawkę środka znieczulającego na podstawie eksperymentów pilotażowych, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie i zminimalizować śmiertelność. Unikaj wielokrotnego nakłuwania, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek.
  8. Potwierdzenie znieczulenia: Potwierdź stan znieczulenia, obserwując stabilny i regularny oddech bez oznak duszności lub niewydolności oddechowej.
  9. Instylacja donosowa SARS-CoV-2 (dzień 0): Podaj 100 µL zawiesiny wirusa SARS-CoV-2 (50 µL na każdą nozdrze) powoli, kroplami, na otwory nosowe za pomocą mikropipety lub strzykawki podczas stabilnego cyklu oddechowego i na początku wdechu.
  10. Zmieniaj nozdrza, aby ułatwić równomierne wdychanie. Myszy z grupy kontrolnej potraktuj taką samą objętością soli fizjologicznej, stosując tę samą procedurę.
    UWAGA: Podawaj roztwór kroplami, upewniając się, że każda kropla zostanie wciągnięta do jamy nosowej przed podaniem kolejnej, aż do osiągnięcia docelowej objętości.
  11. Postępowanie po podaniu: Utrzymuj głowę myszy w lekko uniesionej pozycji przez około 30–60 s po instylacji donosowej, aby ułatwić dostarczenie roztworu do dolnych dróg oddechowych. Wróć myszy do klatek po zaobserwowaniu oznak wybudzania ze znieczulenia i monitoruj je do pełnego odzyskania przytomności.
  12. Rejestracja i monitorowanie: Zapisz objętość podanego preparatu oraz numer identyfikacyjny każdej myszy. Monitoruj zwierzęta w sposób ciągły przez cały okres eksperymentalny pod kątem przeżywalności i ogólnego stanu fizjologicznego.
  13. Instylacja donosowa LPS (dzień 2): Podaj LPS myszom w 2. dniu po zakażeniu SARS-CoV-2. Przeprowadź podanie donosowe LPS (5 mg/kg) zgodnie z tym samym protokołem, który zastosowano przy podawaniu SARS-CoV-2. Podaj taką samą objętość soli fizjologicznej myszom kontrolnym, stosując tę samą procedurę.
    UWAGA: Na tym etapie LPS oraz sól fizjologiczną podano według tej samej procedury, co inokulację SARS-CoV-2, wliczając znieczulenie i podanie donosowe.

4. Sekcja myszy i pobieranie tkanki płucnej

  1. W 3. dobie po infekcji SARS-CoV-2 przeprowadzić eutanazję myszy w celu pobrania tkanek. Najpierw zanieistezować zwierzęta, a następnie uśmiercić je poprzez zwichnięcie szyi. Myszy kontrolne poddać tej samej procedurze.
    UWAGA: Szczegółowe procedury dotyczące zwichnięcia szyi znajdują się w Supplementary File 1.
  2. Utrwalić eutanatyzowaną mysz w pozycji na plecach na stole sekcyjnym, tak aby obszary brzuszny i klatki piersiowej były w pełni odsłonięte. Nawilżyć futro na brzuchu 75% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
  3. Za pomocą sterylnych nożyczek ostrożnie przeciąć mostek wzdłuż obustronnych krawędzi żebrowych i stopniowo otworzyć jamę klatki piersiowej. Używając pęsety, delikatnie odsunąć tkanki i etapami wypreparować płuca z otaczających struktur klatki piersiowej, minimalizując uszkodzenia mechaniczne tkanki płucnej.
    UWAGA: Należy dokładnie kontrolować orientację końcówek nożyczek podczas cięcia, aby uniknąć uszkodzenia serca, płuc i głównych struktur naczyniowych.
  4. Wycięte tkanki płuc natychmiast umieścić w schłodzonym PBS lub soli fizjologicznej i delikatnie wypłukać 2–3 razy, aby usunąć resztki krwi i zanieczyszczenia. Nadmiar płynu z powierzchni tkanki ostrożnie osuszyć papierem filtrowanym beztkanym, unikając uciskania, aby zapobiec uszkodzeniom strukturalnym tkanki.
  5. Przetworzone tkanki płuc niezwłocznie zważyć na wadze elektronicznej i zapisać wyniki pomiarów.
  6. Wyciąć prawy płat ogonowy i natychmiast utrwalić go w 4% paraformaldehydzie w objętości 10-krotnie przekraczającej objętość tkanki w celu późniejszej analizy histopatologicznej.
    OSTRZEŻENIE: Paraformaldehyd jest toksyczny; należy go obchodzić zgodnie z instytucyjnymi wytycznymi bezpieczeństwa.
  7. Pozostałe tkanki płuc zebrać, podzielić na aликwoty do probówek kriogenicznych, szybko zamrozić w ciekłym azotcie i przechowywać w temperaturze −80 °C w celu konserwacji. Prawy płat głowowy, prawy płat środkowy oraz płat dodatkowy przeznaczyć do oznaczenia ładunku wirusowego SARS-CoV-2 i cytokin prozapalnych, a lewe płuco zarezerwować do analizy ELISA.
    OSTRZEŻENIE: Ciekły azot ma ekstremalnie niską temperaturę; podczas pracy z nim należy używać odpowiednich rękawic kriogenicznych i gogli ochronnych, aby zapobiec odmrożeniom.
  8. Po zakończeniu sekcji dokładnie oczyścić i wysterylizować wszystkie narzędzia zgodnie ze standardowymi procedurami. Padłe zwierzęta oraz odpady biologiczne zutylizować zgodnie z instytucyjnymi i regulacyjnymi wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.

5. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE)23

  1. Utkawalaj świeże tkanki płuc w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 24 h.
    UWAGA: Starannie kontroluj czas utrwalania. Unikaj niewystarczającego utrwalenia, co może prowadzić do niepełnej konserwacji tkanek, oraz zbyt długiego utrwalania, które może spowodować nadmierne sieciowanie białek i wpłynąć na jakość barwienia.
  2. Przetwarzaj utrwalone tkanki przy użyciu automatycznego procesora do tkanek w celu stopniowego odwodnienia, klarowania i infiltracji parafiną.
    UWAGA: Protokół dla automatycznego procesora do tkanek znajduje się w Supplementary File 2.
  3. Umieść tkanki zinfiltrowane parafiną w formach do zatopienia. Dodaj roztopioną parafinę i starannie zorientuj tkankę.
  4. Przenieś formy na płytkę chłodzącą w celu zestalenia. Wyjmij bloki parafinowe z form po całkowitym utwardzeniu.
  5. Zamocuj bloki parafinowe w mikrotomie i ustaw powierzchnię cięcia równolegle do noża. Wykonaj skrawki seryjne o grubości około 3–5 µm.
  6. Przenieś skrawki natychmiast do kąpieli wodnej o temperaturze około 45 °C w celu ich rozwinięcia i całkowitego rozprostowania.
  7. Pobierz skrawki na szkiełka, zanurzając pionowo jeden koniec szkiełka w wodzie; użyj pęsety, aby pomóc w prawidłowym przyleganiu skrawków do powierzchni szkiełka.
  8. Umieść szkiełka w suszarce do szkiełkek w temperaturze 65 °C przez około 1 h, aby zwiększyć przyczepność tkanki.
    UWAGA: Dostosuj czas suszenia do rodzaju tkanki, grubości skrawka i parametrów urządzenia. Unikaj przegrzania, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki.
  9. Wykonaj barwienie HE wysuszonych skrawków przy użyciu automatycznego barwiarza.
    UWAGA: Protokół dla automatycznego barwiarza znajduje się w Supplementary File 3.
  10. Wyjmij zabarwione skrawki i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Nałóż kroplę neutralnego medium montażowego i przykryj szkiełka szkiełkiem pokrywowym. Obejrzyj skrawki pod mikroskopem świetlnym po zastygnięciu medium montażowego.

6. Ekspresja ładunku wirusowego SARS-CoV-2 oraz cytokin prozapalnych w tkance płuc

  1. Homogenizacja tkanki płucnej
    1. Przygotować probówki do homogenizacji wolne od RNaz, dodając 4–5 stalowych kulek (o średnicy 3 mm) oraz 900 µL schłodzonego buforu do lizy jako medium homogenizującego.
      UWAGA: Dostosować objętość buforu do lizy do masy tkanki, zazwyczaj w stosunku około 9 mL na 1 g tkanki.
    2. Zważyć około 50 mg tkanki płucnej, drobno posiekać tkankę i przenieść ją do probówki do homogenizacji.
    3. Zhomogenizować tkankę za pomocą homogenizatora tkankowego (60 Hz, 60 s, przez 2–3 cykle z 10 s odstępami między cyklami).
      UWAGA: Zoptymalizować parametry homogenizacji w zależności od urządzenia i rodzaju tkanki.
    4. Po homogenizacji sprawdzić próbkę, aby upewnić się, że doszło do całkowitego rozbicia tkanek. Powtórzyć proces homogenizacji, jeśli widoczne są fragmenty tkanki, aż do uzyskania jednorodnego lizatu.
  2. Ekstrakcja całkowitego RNA z tkanki płucnej metodą kolumnową
    ​UWAGA: Ekstrahować całkowite RNA z tkanki płucnej, stosując metodę oczyszczania kolumnowego zgodnie z instrukcjami producenta. W razie potrzeby zastosować alternatywne metody ekstrakcji RNA zgodnie z odpowiednimi instrukcjami do produktu.
    1. Przenieść homogenat do nowej, wolnej od RNaz probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Dodać 100 µL roztworu gDNA Eliminator. Szczelnie zamknąć probówkę i energicznie wstrząsać przez 15–20 s.
    2. Krótko otworzyć nakrętkę, dodać 180 µL chloroformu i dokładnie wymieszać na wortexie przez 15 s.
      OSTRZEŻENIE: Chloroform jest lotny i toksyczny; należy go używać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub w dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, aby uniknąć wdychania i kontaktu ze skórą.
    3. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 2 min, a następnie wirować przy 12 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
    4. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną do nowej probówki. Dodać taką samą objętość 70% etanolu i dokładnie wymieszać na wortexie.
      UWAGA: Podczas pobierania fazy wodnej unikać naruszania interfazy i warstwy organicznej, aby zapewnić czystość RNA. Przejść do następnego kroku bezpośrednio po dodaniu 70% etanolu, bez wirowania.
    5. Przenieść mieszaninę do kolumny wirówkowej i wirować przy 8 000 x g przez 15 s. Odrzucić przefiltrowany roztwór.
    6. Dodać 700 µL buforu płuczącego do kolumny wirówkowej i wirować przy 8 000 x g przez 15 s. Odrzucić przefiltrowany roztwór.
    7. Dodać 500 µL buforu płuczącego do kolumny wirówkowej i wirować przy 8 000 x g przez 15 s. Powtórzyć ten krok płukania raz.
    8. Przenieść kolumnę wirówkową do nowej probówki zbiorczej i wirować przy 12 000 x g przez 1 min, aby usunąć resztki buforu płuczącego.
    9. Umieścić kolumnę wirówkową w nowej, wolnej od RNaz probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Dodać 30 µL wody wolnej od RNaz bezpośrednio na środek membrany i wirować przy 8 000 x g przez 1 min, aby eluować RNA.
      UWAGA: Dostosować objętość wody wolnej od RNaz w zakresie 30–50 µL w zależności od dalszych zastosowań. Użyć mniejszej objętości elucji, gdy wymagane jest wyższe stężenie RNA.
  3. Wykrywanie ładunku wirusowego SARS-CoV-2 za pomocą cyfrowego PCR z odwrotną transkrypcją (RT-dPCR)
    ​UWAGA: Do absolutnego ilościowego oznaczenia RNA SARS-CoV-2 zastosowano jednokrokowy test RT-dPCR. Aby określić liczbę kopii RNA wirusa, użyto specyficznych zestawów starterów i sond celujących w gen nukleokapsydu (N).
    1. Rozmrozić próbki RNA i odczynniki na lodzie.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną RT-dPCR zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Połączyć 20 µL mieszaniny reakcyjnej RT-dPCR z 20 µL matrycy RNA. Krótko wymieszać na wortexie, krótko odwirować i przechowywać na lodzie.
    4. Nanieść 40 µL mieszaniny reakcyjnej do dołków chipa do cyfrowego PCR i zamknąć chip zgodnie z protokołem urządzenia.
    5. Przeprowadzić amplifikację, stosując następujące warunki cyklu termicznego: 50 °C przez 40 min (1 cykl), 95 °C przez 2 min (1 cykl), a następnie 40 cykli: 95 °C przez 15 s i 57 °C przez 60 s. Ustawić kanały detekcji na GREEN (250 ms) i RED (150 ms).
  4. Wykrywanie ekspresji cytokin zapalnych za pomocą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)
    1. Wyznaczyć stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru UV.
    2. Do odwrotnej transkrypcji w celu syntezy komplementarnego DNA (cDNA) użyć 1 000 ng całkowitego RNA na reakcję, zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Przeprowadzić RT-qPCR, używając 100 ng cDNA na reakcję jako matrycy, z zastosowaniem master mixu SYBR Green PCR i specyficznych dla genów starterów. Zastosować następujące warunki cyklu: 95 °C przez 2 min, a następnie 40 cykli: 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 10 s. Sekwencje starterów wymieniono w Tabeli 1.
      UWAGA: Zoptymalizować warunki reakcji w zależności od zastosowanych odczynników i urządzeń oraz postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami producenta.
    4. Użyć GAPDH jako wewnętrznego genu referencyjnego i obliczyć względne poziomy ekspresji genów metodą 2−ΔΔCt.

7. Wykrywanie cytokin prozapalnych w tkance płucnej za pomocą enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA)24

UWAGA: Zestawy ELISA należy stosować zgodnie z konkretnymi protokołami dostarczonymi przez poszczególnych producentów. W przypadku korzystania z zestawów od alternatywnych dostawców należy ściśle przestrzegać odpowiadających im instrukcji producenta.

  1. Zhomogenizować tkankę płuc zgodnie z powyższym opisem. Jako medium do homogenizacji należy użyć PBS lub buforu do lizy tkanek dedykowanego dla testu ELISA.
  2. Odwirować zhomogenizowane próbki (np. 12 000 x g, 4 °C, 10 min) i zebrać nadsącz do dalszej analizy.
  3. Przed użyciem doprowadzić zestaw ELISA do temperatury pokojowej przez 30 min. Wyjąć wymagane paski mikropłytki z aluminiowej folii.
  4. Przygotować standardy, dołki dla próbek oraz dołki kontrolne (blank) zgodnie z instrukcją producenta. Do dołków dla standardów dodać 50 µL standardów, a do dołków dla próbek 10 µL próbki oraz 40 µL buforu do rozcieńczania próbek. Dla każdego standardu i próbki wykonać dwa powtórzenia techniczne.
  5. Do każdego dołka dla standardu i próbki, z wyjątkiem dołków kontrolnych, dodać 100 µL przeciwciała detekcyjnego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP). Zamknąć płytkę folią przylepną i inkubować w 37 °C przez 60 min.
  6. Po inkubacji usunąć ciecz z każdego dołka i delikatnie opukać płytkę o papier chłonny, aby usunąć pozostałości płynu.
  7. Do każdego dołka dodać bufor myjący, pozostawić na 1 min, a następnie usunąć bufor. Osuszyć płytkę. Powtórzyć ten etap mycia łącznie pięć razy.
  8. Do każdego dołka dodać sekwencyjnie 50 µL roztworu substratu A oraz 50 µL roztworu substratu B. Delikatnie wymieszać płytkę i inkubować w 37 °C w ciemności przez 15 min w celu wywołania zabarwienia.
  9. Zatrzymać reakcję, dodając 50 µL roztworu stopującego do każdego dołka. W ciągu 10 min zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 450 nm przy użyciu czytnika mikropłytek.
  10. Wyznaczyć krzywą wzorcową, nanosząc koncentracje standardów (oś x) względem wartości OD (oś y), i dopasować krzywą. Obliczyć stężenia docelowych cytokin w próbkach, podstawiając wartości OD do równania krzywej wzorcowej i mnożąc przez odpowiednie czynniki rozcieńczenia.
  11. Wyznaczyć całkowite stężenie białka w tkance płuc za pomocą zestawu do oznaczania białek metodą BCA. Znormalizować końcowe poziomy cytokin do całkowitej zawartości białka i wyrazić wyniki jako ilość docelowej cytokiny na miligram całkowitego białka (np. pg/mg białka).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidację modelu przeprowadzono poprzez ocenę zmian histopatologicznych w płucach, miana wirusa SARS-CoV-2 oraz poziomów cytokin prozapalnych i interferonów typu I w grupach kontrolnej i modelowej.

Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy (SE). Do porównań między grupą modelową a kontrolną zastosowano nieparzysty test t Studenta. Test ten wybrano, ponieważ jest on odpowiedni do porównywania średnich zmiennych ciągłych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu opracowano mysi model uszkodzenia płuc związanego z COVID-19 poprzez donosową aplikację SARS-CoV-2 i LPS. Wyniki wykazały, że donosowe podawanie SARS-CoV-2 i LPS indukuje silną odpowiedź zapalną połączoną z supresją sygnalizacji IFN-I. Myszy w grupie modelowej wykazywały znaczną utratę masy ciała oraz zwiększony indeks płuc, co wskazuje na wyniszczenie systemowe i zaostrzenie uszkodzenia płuc. Barwienie HE dodatkowo potwierdziło, że w grupie modelowej wystąpiło typowe rozlane uszkodzenie płuc, charak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Naturalnych Chin (82374291); Program Nauki i Technologii prowincji Sichuan (2024NSFJQ0059); Specjalny przedmiot badań naukowych Administracji Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Sichuan (2024zd005); Projekt wiodących talentów naukowo-technologicznych „Tianfu Qingcheng Plan” z 2022 r. (Chuan Qingcheng nr 1090); Wspólny Fundusz Innowacji Komisji Zdrowia Chengdu i Uniwersytetu Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Chengdu (WXLH202403091).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Automatyczna kasiecia do obróbki tkanekDakewe Biotech Co., Ltd.HP300Stosowane do odwadniania tkanek.
Automatyczny barwarkaLeica BiosystemsLEICA ST5010Stosowane do barwienia HE.
WirówkaDLAB Scientific D3024RStosowane do wirowania próbek lub odczynników.
Kąpiel wodna o stałej temperaturzeShanghai LICHEN-BX Instrument Technology Co., Ltd.HH-6Stosowane w łaźniach wodnych o stałej temperaturze.
System cyfrowego PCRQIAGENQIAcuity OneStosowane w RT-dPCR.
TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix do qPCR (jednoetapowe usuwanie gDNA)TransGen Biotech Co., Ltd.AT341Stosowane do odwrotnej transkrypcji.
Roztwór eozynyBASOBA4024Stosowane do barwienia histologicznego.
System do fluorescencyjnego ilościowego PCRRocgene (Beijing) Technology Co., Ltd.Archimed X6Stosowane do RT-qPCR.
Roztwór hematoksylinyBASOBA4041Stosowane do barwienia histologicznego.
oprogramowanie IBM SPSS StatisticsIBM Corp., Armonk, NY, USAwersja 22.0Wykorzystywane do analizy statystycznej.
Lipopolisacharydy z Escherichia coli O55:B5Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.L2880Stosowane w modelowaniu mysim.
Czytnik płytek mikrotytułowychMolecular Devices SpectraMax Plus 384Stosowane do testu ELISA.
mysi IFN-α ZESTAW DO TESTU ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37863WStosowane do wykrywania IFN-α poziomy w tkance płuc myszy.
mysi IFN-β Zestaw ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37887WStosowane do wykrywania IFN-β poziomy w tkance płucnej myszy.
Mysia IL-1β ZESTAW ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37974WStosowane do wykrywania IL-1β poziomy w tkance płucnej myszy.
Zestaw ELISA dla mysiej IL-6ZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-37988WStosowane do oznaczania poziomu IL-6 w tkance płuc myszy.
TNF myszy-α ZESTAW DO TESTU ELISAZCIBIO Technology Co., Ltd.ZC-39024WStosowane do wykrywania TNF-α poziomy w tkance płucnej myszy.
Zestaw do jednoetapowej RT-PCR dla cyfrowego PCRQIAGEN4829104Stosowane do cyfrowego PCR.
Urządzenie do zatapiania w parafinieHubei Aristion Medical Industrial Co., Ltd.ABM-7LStosowane do zatapiania tkanki płuca myszy w parafinie.
Zestaw QuantiNova SYBR PCR Mix KitQIAGEN1129280Stosowane do RT-qPCR.
Zestaw RNeasy Plus Universal Mini KitQIAGEN1062832Stosowany do całkowitej ekstrakcji RNA.
KrojarkaLeica BiosystemsLEICA RM2235Stosowane do skrawków parafinaowych.
Kule ze stali nierdzewnej do homogenizatora tkanekBeyotime BiotechnologyF6621Stosowane do homogenizacji tkanki płucnej.
Kumpulan starterów XG Pool 1.0 do cyfrowego PCRQIAGEN4828104Stosowane do cyfrowego PCR.
Zoletil 50VIRBACBN9VS7AStosowane do znieczulania myszy.

Bibliografia

  1. Zhang X, et al. SARS-CoV-2 Evolution: Immune Dynamics, Omicron Specificity, and Predictive Modeling in Vaccinated Populations. Adv Sci (Weinh). 2024;11(40):e2402639.
  2. Yu Y, et al. COVID-19 Serum Drives Spike-Mediated SARS-CoV-2 Variation. Viruses. 2024;16(5):763.
  3. Alhamlan FS, Al-Qahtani AA. SARS-CoV-2 Variants: Genetic Insights, Epidemiological Tracking, and Implications for Vaccine Strategies. Int J Mol Sci. 2025;26(3):1263.
  4. Habashi NM, Camporota L, Gatto LA, Nieman G. Functional pathophysiology of SARS-CoV-2-induced acute lung injury and clinical implications. J Appl Physiol (1985). 2021;130(3):877-891.
  5. Nie X, et al. Multi-organ proteomic landscape of COVID-19 autopsies. Cell. 2021;184(3):775-791.e14.
  6. Blanco-Melo D, et al. Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of COVID-19. Cell. 2020;181(5):1036-1045.e9.
  7. Wang J, Li Q, Qiu Y, Lu H. COVID-19: imbalanced cell-mediated immune response drives to immunopathology. Emerg Microbes Infect. 2022;11(1):2393-2404.
  8. Sa Ribero M, Jouvenet N, Dreux M, Nisole S. Interplay between SARS-CoV-2 and the type I interferon response. PLoS Pathog. 2020;16(7):e1008737.
  9. El-Saber Batiha G, Al-Gareeb AI, Saad HM, Al-Kuraishy HM. COVID-19 and corticosteroids: a narrative review. Inflammopharmacology. 2022;30(4):1189-1205.
  10. Ye Q, Wang B, Mao J. The pathogenesis and treatment of the 'Cytokine Storm' in COVID-19. J Infect. 2020;80(6):607-613.
  11. Jiang Y, et al. Cytokine storm in COVID-19: from viral infection to immune responses, diagnosis and therapy. Int J Biol Sci. 2022;18(2):459-472.
  12. Zhang S, Wang L, Cheng G. The battle between host and SARS-CoV-2: Innate immunity and viral evasion strategies. Mol Ther. 2022;30(5):1869-1884.
  13. Beyer DK, Forero A. Mechanisms of Antiviral Immune Evasion of SARS-CoV-2. J Mol Biol. 2022;434(6):167265.
  14. Lei X, et al. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020;11(1):3810.
  15. Mostafa-Hedeab G, et al. A raising dawn of pentoxifylline in management of inflammatory disorders in Covid-19. Inflammopharmacology. 2022;30(3):799-809.
  16. Chen Z, et al. SARS-CoV-2 immunity in animal models. Cell Mol Immunol. 2024;21(2):119-133.
  17. Johansen MD, et al. Animal and translational models of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Mucosal Immunol. 2020;13(6):877-891.
  18. Zhang Y, et al. SARS-CoV-2 rapidly adapts in aged BALB/c mice and induces typical pneumonia. J Virol. 2021;95(11):e02477-20.
  19. Sun SH, et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host Microbe. 2020;28(1):124-133.e4.
  20. Muñoz-Fontela C, et al. Animal models for COVID-19. Nature. 2020;586(7830):509-515.
  21. Liu T, et al. Therapeutic potential of inosine in acute lung injury: mechanistic insights into TLR4 suppression and macrophage polarization. Phytomedicine. 2025;143:156854.
  22. Powers JM, et al. Divergent pathogenetic outcomes in BALB/c mice following Omicron subvariant infection. Virus Res. 2024;341:199319.
  23. Fan F, et al. Association between systemic immune-inflammation indexes and Nuodikang capsule's protection in LPS-induced acute lung injury in mice. Phytomedicine. 2025;147:157229.
  24. Xie N, et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 2022;103:154240.
  25. Jiang S, et al. Generic Diagramming Platform (GDP): a comprehensive database of high-quality biomedical graphics. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D1670-D1676.
  26. Onohuean H, et al. Covid-19 and development of heart failure: mystery and truth. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2021;394(10):2013-2021.
  27. Zarrilli G, et al. The Immunopathological and Histological Landscape of COVID-19-Mediated Lung Injury. Int J Mol Sci. 2021;22(2):974.
  28. Fernandes de Souza WD, et al. Lung Inflammation Induced by Inactivated SARS-CoV-2 in C57BL/6 Female Mice Is Controlled by Intranasal Instillation of Vitamin D. Cells. 2023;12(7):1092.
  29. Ciesielska A, Matyjek M, Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021;78(4):1233-1261.
  30. Brandenburg K, et al. A Comparison between SARS-CoV-2 and Gram-Negative Bacteria-Induced Hyperinflammation and Sepsis. Int J Mol Sci. 2023;24(20):15169.
  31. Samsudin F, et al. SARS-CoV-2 spike protein as a bacterial lipopolysaccharide delivery system in an overzealous inflammatory cascade. J Mol Cell Biol. 2023;14(9):mjac058.
  32. Petruk G, et al. SARS-CoV-2 spike protein binds to bacterial lipopolysaccharide and boosts proinflammatory activity. J Mol Cell Biol. 2020;12(12):916-932.
  33. Martin-Sancho L, et al. Functional landscape of SARS-CoV-2 cellular restriction. Mol Cell. 2021;81(12):2656-2668.e8.
  34. Minkoff JM, tenOever B. Innate immune evasion strategies of SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol. 2023;21(3):178-194.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

zakażenie SARS-CoV-2uszkodzenie płuc w przebiegu COVID-19indukcja lipopolisacharydemodpowiedź immunozapalnahistopatologia płuccytokiny prozapalneodpowiedź interferonowaanaliza ładunku wirusowegofunkcja płuc
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.