Model wycinanej rany u szczura do badania terapii w krytycznych ranach skóry

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje model wycinanej rany skóry u szczura z wykorzystaniem komory wilgotnościowej. System ten umożliwia ocenę miejscowych formulacji płynnych, zawiesin komórkowych, biomateriałów oraz innych środków terapeutycznych stosowanych w leczeniu ran.

Streszczenie

Rany skóry stanowią poważne globalne wyzwanie dla opieki zdrowotnej, generując znaczną zachorowalność i obciążenia ekonomiczne. Wiarygodne i klinicznie istotne modele zwierzęce są niezbędne do badania mechanizmów naprawy tkanek oraz oceny nowych strategii terapeutycznych. Jednak konwencjonalne modele ran wyciętych u gryzoni są ograniczone przez szybki skurcz rany wynikający z obecności mięśnia podskórnego (panniculus carnosus), co znacząco różni się od procesu gojenia ran u ludzi. W tym drugim przypadku gojenie zachodzi przede wszystkim poprzez tworzenie tkanki ziarninowej i reepitelializację. Niniejsze badanie opisuje model rany wyciętej u szczura, zaprojektowany w celu ograniczenia skurczu rany przy jednoczesnym zapewnieniu chronionego środowiska do testowania wrażliwych interwencji terapeutycznych. U szczurów linii Sprague Dawley wykonano pełnościenne rany wycięte o średnicy 10 mm na grzbiecie, które stabilizowano za pomocą o-ringu z gumy nitrylowej (NBR) zabezpieczonego szwami przerywanymi. Aby utrzymać wilgotne środowisko rany, zastosowano spójną uszczelkę Eakin oraz przezroczystą folię przylepną w celu utworzenia komory odpowiedniej do miejscowego podawania komórek, biomateriałów lub związków farmaceutycznych. Dodatkowe warstwy ochronne składające się z opatrunku piankowego, taśmy klejącej, bandaża tubularnego i systemu fiksacji obu barków zostały użyte, aby zapobiec usuwaniu opatrunku przez zwierzęta. Gojenie ran monitorowano przez 14 dni za pomocą cyfrowej planimetrii oraz oceny histologicznej z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną. Procedura zajmowała około 30 min na zwierzę i dostarczyła spójnych wyników gojenia ran. O-ring NBR posłużył jako szyna ograniczająca skurcz rany. Gojenie zachodziło głównie poprzez tworzenie tkanki ziarninowej i reepitelializację. Opatrunki pozostały nienaruszone do siedmiu dni bez oznak infekcji. Analiza histologiczna wykazała aktywną naprawę tkanek charakteryzującą się regeneracją naskórka i naciekiem komórek zapalnych. Model ten stanowi platformę do przedklinicznej oceny leków na rany oraz zaawansowanych metod regeneracyjnych.

Wprowadzenie

Rany skóry, w tym rany trudnogojące, dotykają ponad 40 milionów pacjentów na całym świecie i stanowią znaczne obciążenie dla systemów opieki zdrowotnej, z rocznymi kosztami wynoszącymi 22 miliardy dolarów do 2024 roku. W samej Europie 4 miliony pacjentów rocznie cierpią na rany trudnogojące, które zajmują do połowy dostępnych miejsc w oddziałach ostrego przyjęcia¹. Pomimo postępów w technikach chirurgicznych, praktyce śródoperacyjnej i dostępności zaawansowanych opatrunków, niektóre rany pozostają oporne na leczenie, a ostatecznie rozwijają się powikłania. Dlatego niezbędne jest opracowanie nowych podejść terapeutycznych, co wymaga stworzenia eksperymentalnego modelu zwierzęcego ran skóry w celu przetestowania szerokiej gamy materiałów do zastosowania miejscowego.

Wśród eksperymentalnych zwierzęcych modeli ran skóry, wycięcie skóry jest najbardziej stosowaną techniką tworzenia modelu gojenia ran². Taki model może pomóc w badaniu krwotoku, reakcji zapalnych, ziarninowania, reepitelizacji, angiogenezy oraz przebudowy tkanek³. Rany wycinane tworzy się głównie na grzbiecie zwierzęcia poprzez chirurgiczne usunięcie określonego obszaru skóry. Rana powinna mieć rozmiar krytyczny, aby uniknąć samoistnego gojenia. Taka rana wycinana o rozmiarze krytycznym zapewnia bezpośredni dostęp do badania miejscowej aplikacji różnych substancji chemicznych, komórek lub biomateriałów oraz ich roli w procesie gojenia^4,5.

Gryzonie i ludzka skóra wykazują podobieństwa w fazach komórkowych i molekularnych gojenia ran, w tym w procesach hemostazy, stanu zapalnego, proliferacji i remodelingu. Szczury i myszy są najczęściej wykorzystywanymi gatunkami w modelach ran ze względu na ich dostępność, niewielki rozmiar, wzglatwną łatwość manipulacji genetycznych oraz łatwość obsługi. Szczury oferują kilka praktycznych zalet w stosunku do myszy, w tym większy rozmiar ciała i grubszą skórę, która składa się z większej liczby warstw keratynocytów niż u myszy. Rany u myszy zazwyczaj goją się w ciągu 7 dni, podczas gdy u szczurów proces gojenia można oceniać przez około 12–14 dni⁶.

Głównym wyzwaniem związanym z wykorzystaniem gryzoni o luźnej skórze jest kurczenie się rany³. Skóra gryzoni posiada warstwę panniculus carnosus, która kurczy się po urazie, aby zmniejszyć wystawioną powierzchnię. W przeciwieństwie do nich, rany u ludzi mają ograniczoną zdolność do kurczenia się i w procesie gojenia zależą od granulacji oraz reepitelializacji⁷. Jednym ze sposobów przezwyciężenia ograniczeń modeli zwierzęcych jest fizyczna fiksacja lub szynowanie skóry wokół obszaru rany⁸. Tytanowe komory ranne należały do urządzeń opracowanych z sukcesem w celu zapobiegania kurczeniu się ran⁹, jednak posiadały one wady, takie jak duży stres zwierząt ze względu na wagę komory, skomplikowane umiejscowienie chirurgiczne, ryzyko przemieszczenia urządzenia, potencjał do infekcji oraz wysoki koszt. Koncepcja modelu rany szynowanej została wprowadzona przez Galiano i wsp.¹⁰ w 2004 roku poprzez zaszycie sztywnego silikonowego pierścienia wokół krawędzi rany. Podejście to znacznie zmniejsza kurczenie się rany¹¹, ale posiada kilka wad i ograniczeń, koncentrujących się przede wszystkim na potencjalnym uszkodzeniu tkanek miękkich, wysokim wskaźniku przemieszczania się szyny oraz niespójnym gojeniem rany. Szyny (takie jak sztywne pierścienie silikonowe) mogą powodować nadmierny nacisk na otaczającą skórę, prowadząc do niedokrwienia, podrażnienia i martwicy, szczególnie jeśli zostaną niewłaściwie zastosowane. Silikonowe szyny są często uszkadzane, łamane lub przemieszczane w wyniku ruchu lub pielęgnacji zwierząt ^8,11. Nierówne szwy często powodują nierówności napięcia wokół rany, co prowadzi do niespójnego gojenia. W zaprezentowanym tutaj modelu oring z gumy nitrylowo-butadienowej (NBR) jest przyszywany do krawędzi rany skórnej poprzez rozmieszczenie 8–12 prostych szwów przerywanych z poliamidu równomiernie wokół pierścienia. Oczekuje się, że podejście to zminimalizuje wspomniane ryzyka i w wystarczającym stopniu ograniczy kurczenie się rany, pozwalając jej na zagojenie poprzez tworzenie tkanki ziarninowej i reepitelializację, podobnie jak w procesie gojenia ran u ludzi. Taki mechanizm gojenia ułatwiłby przeniesienie wyników z modeli zwierzęcych do zastosowań klinicznych.

Teoria wilgotnego gojenia ran została wprowadzona przez George'a D. Wintera w 1962 roku jako koncepcja projektowania produktów do pielęgnacji ran¹². W oparciu o tę teorię w ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano różnorodne opatrunki, takie jak gazy, folie przezroczyste, pianki i hydrożele¹³. Z drugiej strony, w 1974 roku zaprojektowano i opracowano formowalny hydrokoloidalny pierścień bariery stomijnej w celu zapobiegania i ochrony przed przeciekami. Można go łatwo kształtować i dopasować do krawędzi rany, szczególnie w zastosowaniach związanych z pielęgnacją stomii. W tym modelu spójna uszczelka jest nakładana na zewnątrz rany i wraz ze sterylnymi, przezroczystymi foliami tworzy wilgotną komorę, która naśladuje sytuację kliniczną pacjentów z ranami skóry poddawanych leczeniu, co sprzyja epitelizacji rany i chroni substancje stosowane miejscowo (np. komórki, biomateriały, związki) przed wyciekiem.

Opatrunek rany jest kluczowy dla ochrony łoża rany przed urazami mechanicznymi i infekcjami mikrobiologicznymi. Nakładanie opatrunków u szczurów zawsze stanowiło wyzwanie ze względu na ich niską tolerancję na takie zabiegi. Szczury często usuwają lub niszczą opatrunki, przegryzając i rozdzierając je niemal natychmiast po wybudzeniu z narkozy. Utrudnia to utrzymanie miejscowych środków terapeutycznych, takich jak komórki i farmaceutyki, oraz uniemożliwia ochronę ran przed zewnętrznymi patogenami i zanieczyszczeniami. Jest to kolejny problem do rozwiązania w modelu gryzoni, szczególnie w badaniach wymagających sterylnego środowiska, takich jak testy produktów biologicznych, terapia komórkowa i zaawansowane produkty lecznicze terapii. W prezentowanym tutaj modelu do przykrycia komory wilgotnościowej zastosowano opatrunek piankowy i taśmę klejącą. Następnie użyto elastycznego bandaża tubularnego, bandaża stabilizującego oraz chirurgicznej taśmy micropore, aby założyć podwójny opatrunek krzyżowy na barki, co zapobiega usuwaniu lub uszkadzaniu bandaży przez szczury.

Opisany tutaj model łączy w sobie kilka elementów z różnych protokołów i był rozwijany przez kilka lat. Celem było opracowanie modelu rany wycinanej u szczurów z wykorzystaniem wilgotnej komory, która jest dobrze tolerowana przez zwierzę i ułatwia testowanie wrażliwych substancji do stosowania miejscowego, zwłaszcza w formie płynnej.

Protokół

Wszystkie przedstawione poniżej procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Linköping Ethical Committee (Dnr 5163-2023), Szwecja. Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Doświadcze​zwierzęta obdarzone świadomością

1. Należy wykorzystać dorosłe samce szczurów Sprague Dawley w wieku od 8 do 14 tygodni.
2. Przed eksperymentem szczury powinny być aklimatyzowane przez co najmniej 1 tydzień w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, przy standardowej diecie.

2. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Uśpij zwierzę, stosując 1,5%–2,5% izofluranu (4,5% do indukcji) zmieszanego z 1,0–1,5 L/min tlenu. Umieść zwierzę w pozycji brzusznej na podkładce grzewczej, aby utrzymać jego ciepłotę. Nałóż smar okulistyczny w celu ochrony oczu i podaj podskórnie na grzbiecie zwierzęcia 0,05 mg/kg masy ciała buprenorfiny rozpuszczonej w soli fizjologicznej w celu przeciwbólowego działania pooperacyjnego.
   UWAGA: Ważne jest, aby między zwierzęciem a podkładką grzewczą znajdowała się cienka warstwa jednorazowej podkładki izolacyjnej.
   OSTRZEŻENIE: Izofluran jest depresantem ośrodkowego układu nerwowego i substancją drażniącą drogi oddechowe. Należy używać skalibrowanego parownika z aktywnym systemem odsysania gazów odpadowych, aby zapobiec ekspozycji na opary.
2. Wygol obszar grzbietu za pomocą strzyżarki elektrycznej od podstawy szyi w dół na około 10 cm. Dokładnie oczyść wygolony obszar dwukrotnie chloreksydyną i 70% etanolem, a następnie przykryj zwierzę fenestrowaną sterylną serwetą chirurgiczną tak, aby odsłonić tylko oczyszczony obszar.

3. Wykonanie rany wycinanej

1. Należy użyć odpowiednich sterylizowanych narzędzi chirurgicznych, takich jak nożyczki i pinceta.
2. Za pomocą szablonu i chirurgicznego markera permanentnego należy narysować okrąg o średnicy 10 mm, około 4 cm w kierunku ogonowym od podstawy szyi.
3. Chwycić pincetą środek zaznaczonej skóry i wyciąć zaznaczoną tkankę skórną nożyczkami. Głębokość rany powinna sięgać powięzi powierzchownej. Można ją zidentyfikować, uwalniając pełną grubość skóry i wizualizując półprzezroczystą powięź pokrywającą mięsień.
4. Przyłożyć o-ring NBR do krawędzi rany skórnej i przymocować go w tej pozycji, wykonując 8–12 szwów. Celem utrwalenia pierścienia jest zapobieganie skurczowi skóry. Należy upewnić się, że pierwsze szwy znajdują się na godzinie 12, następnie na godzinie 6, 3, a potem 9. W przypadku 8 szwów, każdy kolejny szew należy wykonać w połowie przestrzeni między dwoma szwami pierwotnymi (Rysunek 1A).
5. Na zewnątrz o-ringu NBR należy nanieść uszczelniacz kohezyjny, wykorzystując jego właściwości klejące, aby wraz ze sterylną, przezroczystą folią samoprzylepną stworzyć wilgotną komorę (Rysunek 1B). Na tym etapie rana jest usztywniona o-ringiem NBR, a ściany boczne komory aplikacyjnej tworzą krawędź skóry oraz uszczelniacz kohezyjny; dno stanowi odsłonięta powierzchnia rany, natomiast dach tworzy przezroczysta folia.
6. Ranę należy przykryć jedną warstwą folii, a następnie podać roztwór terapeutyczny (zawiesinę komórkową lub roztwór związku) przez folię na powierzchnię rany. Komora o opisanym rozmiarze bez trudu pomieści 100 µL.
7. Miejsce wstrzyknięcia należy przykryć kolejną warstwą folii, aby zapobiec wyciekowi preparatu terapeutycznego (Rysunek 1C).
8. Folię należy przykryć miękkim bandażem silikonowym w celu jej ochrony (Rysunek 1D).
9. Należy zastosować taśmy przylepne (Rysunek 1E), a następnie elastyczny bandaż tubularny w konfiguracji dwuramiennej wokół szczura, z bandażem mocującym i chirurgicznymi taśmami mikroporowymi (Rysunek 1F–H).
10. Należy przyciąć pazury szczurów, aby zapobiec zerwaniu opatrunku przez zwierzęta.
11. Przed wybudzeniem zwierzęcia z narkozy należy podać podskórnie karprofen (5 mg/kg masy ciała) rozcieńczony w soli fizjologicznej.

4. Procedury pooperacyjne

1. Pozostaw zwierzę na podkładce grzewczej, przykryte kocem, aż do wybudzenia z narkozy. Umieść zwierzęta w osobnych klatkach lub w jednej klatce z przegrodą, aby zapobiec wzajemnemu pogryzaniu się oraz usuwaniu opatrunku.
2. Następnego ranka podaj podskórnie karprofen w dawce 5 mg/kg masy ciała rozpuszczonej w soli fizjologicznej w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Szczury należy monitorować codziennie pod kątem bólu pooperacyjnego lub utraty masy ciała; w razie potrzeby można podać dodatkową dawkę leku przeciwbólowego.

5. Pomiary rany i zmiana opatrunków

1. Przez pierwszy tydzień po operacji rany codziennie badać każde zwierzę . Należy sprawdzać opatrunek i poprawić go, jeśli zwierzęta mają trudności z poruszaniem się lub wykazują dyskomfort.
2. W 7. dniu zmienić opatrunek, gdy zwierzę znajduje się pod wpływem znieczulenia, zgodnie z opisem w kroku 2.1.
3. Ostrożnie zdjąć osłonę opatrunku ze skóry. Wykonać zdjęcia rany z przyłożoną linijką w celu zachowania skali. Obrazy przeanalizowano przy użyciu oprogramowania Fiji/ImageJ w celu oceny powierzchni rany.
4. Wykonać pomiary lub inne procedury zgodnie z potrzebami badacza.
5. Nałożyć czysty opatrunek zgodnie z krokami 3.8–3.11 i pozwolić zwierzęciu dojść do siebie, jak opisano w kroku 4.1.

6. Pobieranie ran i eutanazja

1. Zastosuj znieczulenie zgodnie z opisem w punkcie 2.1 w 14. dniu lub według specyficznego planu eksperymentalnego. Usuń opatrunek i wykonaj zdjęcia miejsc zranienia.
2. Usuń opatrunek i wykonaj zdjęcia miejsc zranienia.
3. Pobierz tkankę skóry z rany. Za pomocą skalpela wyciąć skórę wokół rany, obejmując również fragment zdrowej tkanki.
4. Umieść wycięty fragment w probówce 2 mL i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie do późniejszej analizy molekularnej lub przechowuj w 4% buforowanej formaldehydzie w temperaturze pokojowej do badań histologicznych. Alternatywnie można podzielić wycinek na dwie części, aby przeprowadzić obie analizy.
5. Po usunięciu tkanki z rany uśmierć zwierzę poprzez inhalację CO₂ lub inną metodą zgodną z zatwierdzeniem etycznym.
   OSTRZEŻENIE: CO₂ powoduje ból, stres i szybkie zakwaszenie błon śluzowych przed utratą przytomności. Należy używać regulowanego przepływomierza do wypierania powietrza z komory.

7. Barwienie histochemiczne: fiksacja rany, zatapianie i cięcie sekcji

1. Utrwal biopsje tkanki rany w 4% roztworze formaldehydu przez 3 h w temperaturze pokojowej, a następnie przechowuj je w 4 °C przez noc.
   OSTROŻNIE: Formaldehyd jest toksyczny, silnie uczula i jest znanym kancerogenem ludzkim. Roztwór należy przygotowywać w dygestorium, stosując środki ochrony indywidualnej.
2. Przemyj biopsje dwukrotnie w PBS, po 30 min każdego razu.
3. Zastąp PBS etanolem (70%) i przechowuj w 4 °C.
4. Przechowuj biopsje maksymalnie przez 24–48 h przed dalszą obróbką, aby uniknąć utraty antygenów, lub przez 1–2 tygodnie w przypadku prostej charakterystyki histologicznej.
5. Dokładnie wypłucz biopsje pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć pozostałości formaldehydu.
6. Odwodnij tkankę w kąpielach etanolowych w następującej kolejności: 70% etanol przez 20 min; 2 zmiany 95% etanolu po 20 min każda; 2 zmiany 100% etanolu po 20 min każda.
7. Przechowuj biopsje w 65 °C w kąpieli parafinowej.
8. Wlej roztopioną parafinę do odpowiedniej formy, umieszczając biopsje w centrum, a następnie pozostaw do ostygnięcia i zastygnięcia. Biopsje powinny być zorientowane prostopadle do powierzchni formy, aby umożliwić wizualizację wszystkich warstw skóry po wykonaniu przekrojów.
9. Wykonaj przekroje bloku tkankowego zatopionego w parafinie o grubości 5 μm przy użyciu mikrotomu i umieść je w kąpieli wodnej o temperaturze 39 °C zawierającej wodę dejonizowaną.
10. Przenieś przekroje na szkiełka i wysusz je, pozwalając tkance przylgnąć do powierzchni szkiełka. Szkiełka można przechowywać w 4 °C do późniejszego użycia lub poddać natychmiastowej obróbce w celu barwienia histochemicznego.

8. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE)

1. Usuń paraffin z preparatów na płytkach grzejnych w temperaturze 60 °C przez 30 min, następnie w 3 zmianach ksylenu (lub zamiennika) po 5 min każda, a następnie w 1 zmianie PBS przez 2 min.
   OSTROŻNIE: Ksylen jest toksyczny i łatwopalny. Roztwór należy obchodzić się w dygestorium, stosując standardowe środki ochrony osobistej.
2. Przeprowadź rehydratację w 100% etanolu, 96% etanolu, a następnie w dH₂O przez 5 min w każdym etapie.
3. Zastosuj barwienie hematoksyliną przez 5 min, a następnie płucz pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
4. Przeprowadź różnicowanie w 0,3% alkoholu kwasowym (0,3% kwasu solnego w 70% etanolu) poprzez kilkukrotne zanurzenie, a następnie płucz pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
5. Barw w eozynie Y (0,2%) przez 30 s, a następnie płucz pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
6. Odwodnij w 96% etanolu przez 1 min, a następnie w 100% etanolu przez 1 min.
7. Nanieś kilka kropli medium montażowego, a następnie nałóż szkiełko nakrywkę.
8. Obejrzyj preparaty pod mikroskopem świetlnym i wykonaj zdjęcia cyfrowe.

Wyniki

Operacja w modelu wycinanej rany u szczura trwała około 30 min na zwierzę przy sprawnym przeprowadzeniu procedury. Poszczególne etapy tworzenia modelu, mocowania pierścienia O-ring oraz zakładania opatrunku przedstawiono na Rysunku 1.

Rycina 2 przedstawia postępy w gojeniu rany w 7. i 14. dniu. Promień rany mierzono w mm, a powierzchnię obliczono według wzoru (pole = πr²), gdzie r = 5 mm w dniu 0. Postęp zamykania się rany przedstawiono jako procent powierzchni nieprzykrytej w stosunku do powierzchni rany indukowanej w 14. dniu. Za pomocą oprogramowania Fiji/ImageJ przeanalizowano cyfrowy obraz obszaru rany, kalibrując skalę do 10 mm przy użyciu linijki dołączonej do zdjęcia (Rycina 2D). Po obrysowaniu i zmierzeniu obszaru rany, pole powierzchni przedstawiono w mm². Pozostały obszar rany w 14. dniu (29,4% ± 10,1%; n = 7) przedstawiono na Rycynie 3.

Barwienie HE rany skórnej w 14. dniu przedstawiono na Rysunku 4. Przekroje wykazały, że biopsje odzwierciedlały naturalny przebieg gojenia ran skórnych, od obwodu do centrum. Gojenie rany pozostało niepełne, przy czym w centrum brakowało typowej, klasycznej struktury wielowarstwowej z cienką warstwą naskórka. W skórze właściwej widoczna była obfita infiltracja komórek zapalnych, co jest istotne dla procesu fizjologicznego gojenia. Ogólnie model był dobrze tolerowany przez zwierzęta, z ograniczeniem skurczu skóry oraz niepełnym, lecz fizjologicznym gojeniem.

Rysunek 1: Procedura tworzenia rany wycinanej oraz nakładania opatrunku. (A) Rana wycinana stworzona na grzbietowej powierzchni szczura, z zaszytym wokół brzegu rany pierścieniem O-ring. (B) Formowalny pierścień barierowy z hydrokoloidu nałożony wokół pierścienia O-ring. (C) Dwie warstwy przezroczystej folii przylepnej nałożone na pierścień barierowy z hydrokoloidu. (D) Opatrunek piankowy umieszczony na przezroczystej folii przylepnej. (E) Elastyczna taśma przylepna nałożona w celu zabezpieczenia opatrunku. (F–H) Rurkowy bandaż mocujący nałożony wokół szczura, a następnie bandaż stabilizujący i taśma chirurgiczna ułożona w konfiguracji dwuramiennej w celu zabezpieczenia opatrunku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy gojenia rany. (A) Reprezentatywny obraz rany uzyskany w 7. dniu. (B–D) Reprezentatywne obrazy ran uzyskane w 14. dniu, przedstawiające ranę z założonym pierścieniem O-ring (B) oraz po usunięciu pierścienia O-ring (C,D). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ilościowe oznaczenie powierzchni rany w 14. dniu. Procent pozostałej powierzchni rany w 14. dniu, wykazujący redukcję rozmiaru rany. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) (n = 7). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Ocena histologiczna gojenia rany w 14. dniu. Reprezentatywne przekroje tkanki rany barwione hematoksyliną i eozyną (HE) przy powiększeniu 10×, 20× i 40×. W centrum rany stwierdzono niepełną reepitelializację, natomiast na brzegach rany widoczne było fizjologiczne gojenie naskórka. W skórze właściwej obecne były liczne komórki zapalne, co jest zgodne z prawidłową odpowiedzią w procesie gojenia rany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Trudno gojące się rany skóry to rany, które nie przechodzą przez normalne etapy gojenia w oczekiwanym czasie i mogą być następstwem zabiegów chirurgicznych, urazów oraz reakcji alergicznych, a także wtórnym efektem wielu innych problemów zdrowotnych, w tym niewydolności naczyniowej, cukrzycy i otyłości¹⁴. Pomimo dostępności kilku metod leczenia, u wielu pacjentów prawidłowe gojenie nie następuje. Badanie nowych dróg terapeutycznych, takich jak terapie komórkowe, związki chemiczne, ekstrakty roślinne i nowo odkryte substancje, jest kluczowe dla opracowania nowatorskich strategii leczenia. Przedstawiony model można zastosować w szerokim zakresie badań nad gojeniem ran. Ustanowienie zestandaryzowanego protokołu testowania leków, komórek i terapii biologicznych może usprawnić przedkliniczne badania nad gojeniem ran. Model rany wycinanej oraz opisany tutaj protokół rozwiązują główne ograniczenia modelu rany skóry szczura w badaniach, mianowicie: kurczenie się skóry oraz kwestię opatrunku rany.

Szyny tytanowe są powszechnie stosowane w celu ograniczenia kurczenia się rany w mysich modelach ran wycięciowych, jednak ich zastosowanie wiąże się z pewnymi ograniczeniami. Sztywność szyny zmienia środowisko mechaniczne rany i otaczających ją tkanek, co może wpływać na odpowiedzi komórkowe, stan zapalny oraz przebudowę macierzy. W rezultacie gojenie zachodzi w warunkach odmiennych od tych występujących w nieleczonej skórze gryzoni. Choć ograniczenie kurczenia się rany poprawia porównywalność z procesem zamykania się ran u ludzi, ograniczenia mechaniczne narzucone przez szynę mogą również wprowadzać artefakty wpływające na proces gojenia, co należy uwzględnić przy interpretacji wyników eksperymentalnych¹⁵.

W tym celu w modelu zastosowano uszczelki O-ring z NBR w celu ograniczenia skurczu skóry, które przymocowano do oryginalnej krawędzi rany. Pierścienie były dobrze tolerowane przez zwierzęta i pozostawały stabilnie w swojej pozycji przez 14 dni trwania eksperymentu. Chociaż w żadnym z zwierząt jakościowo nie zaobserwowano znaczącego skurczu rany, zastosowanie tatuażu krawędzi rany lub innych metod ilościowych wzmocniłoby ocenę skurczu rany w przyszłych badaniach. Zatem tatuaż może być uznany za opcjonalny krok w niniejszym protokole.

Stosowanie opatrunków chroniło rany przed zanieczyszczeniem i infekcją, zapewniając jednocześnie utrzymanie leczenia w miejscu rany, co jest kluczowe dla modeli gojenia ran skóry. Często jednak zdarza się, że niektóre zwierzęta usuwają różnego rodzaju opatrunki. Szczury często pielęgnują i manipulują obszarem rany, co może prowadzić do przesunięcia lub całkowitego usunięcia opatrunku, mimo zastosowania folii przylepnych lub wtórnych metod mocowania. Utrata pokrycia opatrunkiem może zmienić środowisko rany, wpłynąć na dostarczanie leku i zwiększyć zmienność osobniczą między zwierzętami¹⁶. W prezentowanym tutaj modelu opatrunek pozostał nienaruszony przez maksymalnie 7 dni, nie został usunięty ani uszkodzony przez zwierzęta. U żadnego ze zwierząt doświadczalnych nie stwierdzono oznak zakażenia rany skóry. Zaleca się cotygodniową wymianę opatrunków, ponieważ wraz ze wzrostem i przybieraniem na wadze przez zwierzęta, ich dopasowanie staje się zbyt ciasne. Należy dbać o zachowanie równowagi między pewnym mocowaniem a mobilnością zwierząt, upewniając się jednocześnie, że opatrunek nie jest zbyt luźny, co mogłoby umożliwić jego usunięcie przez zwierzęta.

Protokół jest elastyczny i można go dostosować do własnych potrzeb. Chociaż zalecamy inhalację izofluranem ze względu na szybki powrót do świadomości i wysokie bezpieczeństwo, badacze mogą alternatywnie zastosować znieczulenie w zastrzykach, np. ketaminę/ksylazynę, jeśli parownik do izofluranu nie jest dostępny. Mimo że w badaniu tym wykorzystano wyłącznie samce szczurów, protokół ten ma tak samo zastosowanie do samic szczurów.

Zalecamy podawanie buprenorfiny jako środka przeciwbólowego w połączeniu z karprofenem, co wzmacnia uśmierzanie bólu. Sama buprenorfina może również zapewnić odpowiednią analgezję pooperacyjną ze względu na stosunkowo długi czas działania. Lek ten ma minimalny wpływ na funkcje odpornościowe w porównaniu z innymi opioidami, co stanowi zaletę w procesie gojenia ran zgodnie z przebiegiem stanu zapalnego¹⁷. Niesteroidowych leków przeciwzapalnych, które hamują zapalenie i zmniejszają ból, należy unikać podczas badania procesów zapalnych. Chociaż w niniejszym badaniu u każdego zwierzęcia stworzono jedną ranę, badacze mogą stworzyć dodatkowe rany stosując ten sam protokół, zgodnie z zatwierdzoną zgodą etyczną i planem doświadczalnym. Należy starannie rozważyć kwestie dobrostanu zwierząt oraz zasady 3R. Badacze muszą przestrzegać zasad 3R (zastąpienie, ograniczenie i udoskonalenie) oraz szanować dobrostan zwierząt podczas korzystania z modeli zwierzęcych. Procedury chirurgiczne muszą być zgodne z wytycznymi i ściśle przestrzegać zatwierdzonego protokołu dotyczącego zwierząt. W niniejszym badaniu gojenie ran oceniano poprzez pomiary powierzchni rany oraz ocenę histologiczną, przy czym reepitelializacja stanowiła jeden z elementów odpowiedzi gojenia. Obecność szwów w relacji do pierścienia stabilizującego może zakłócać lokalne gojenie. Liczba szwów musi być spójna u wszystkich zwierząt. Ocena powierzchni rany powinna obejmować wszystkie obszary surowe, w tym miejsca szycia¹⁸. Model ten można rozwinąć, aby uwzględnić różne schorzenia towarzyszące ranom skóry, takie jak niedokrwienie, cukrzyca i starzenie się. Głównymi ograniczeniami niniejszego badania były brak grupy kontrolnej bez szyny, brak ilościowej oceny kurczenia się rany oraz ograniczone ilościowe miary wyników biologicznych poza oceną powierzchni rany i histologią opisową. Podczas opracowywania tego modelu wystąpiły różne wyzwania techniczne i problemy wymagające rozwiązania. Prawidłowe dopasowanie kamizelki ochronnej/opatrunku jest kluczowe dla dobrostanu zwierząt i skutecznego gojenia rany. Luźny opatrunek może zostać usunięty przez zwierzę po wybudzeniu z znieczulenia, natomiast zbyt ciasny opatrunek może ograniczać ruchomość, upośledzać krążenie lub wpływać na oddychanie. Opatrunek powinien pozostawiać wystarczającą przestrzeń na jeden palec (lub mały palec w przypadku mniejszych szczurów) między opatrunkiem a skórą. Zwierzęta należy monitorować codziennie, a opatrunek należy skorygować w przypadku zaobserwowania oznak dyskomfortu, upośledzonej mobilności lub nieprawidłowej postawy. Pooperacyjne zarządzanie bólem może różnić się między poszczególnymi zwierzętami ze względu na różnice w wrażliwości na leki przeciwbólowe. Zwierzęta należy regularnie oceniać pod kątem objawów związanych z bólem, w tym zgarbionej postawy, zmniejszonej aktywności, zmniejszonego apetytu i utraty masy ciała. W razie potrzeby należy podać dodatkowe leki przeciwbólowe zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Spójna stabilizacja pierścienia jest krytyczna dla zapobiegania kurczeniu się rany. 8–12 prostych szwów przerywanych powinno być równomiernie rozmieszczonych wokół pierścienia, aby równomiernie rozłożyć napięcie i zapobiec podnoszeniu się lub odkształcaniu. Każdy szew powinien być zabezpieczony węzłem chirurgicznym, aby zminimalizować ryzyko poluzowania podczas rekonwalescencji. Na koniec zalecamy stosowanie szczurów tej samej szczepu, wieku, masy ciała i płci w ramach danego badania, aby zminimalizować zmienność. Ponadto wszystkie procedury chirurgiczne może przeprowadzić ten sam doświadczony badacz. Aby uniknąć błędów systematycznych, zalecamy stosowanie podwójnie ślepej próby w analizach histologicznych i molekularnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Buprenorfina	Salfarm Scandinavia	451790	Stęż. 0,3 mg/ml
Karprofen	Zoetis Animal Health	191380	Rimadyl 50 mg/ml
uszczelka Eakina	Swemed	2076152	Grubość 3 mm
Stacja do zatapiania	Leica Biosystems	EG1150 H&C
Eozyna	Histolab	1650	0,2% roztwór barwiący
Etanol absolutny	Solveco	1015	Stopień czystości analitycznej
Bandaż mocujący	Swemed	2048934	4 cm x 4 m PA/wiskoza
Formaldehyd	Histolab	2176	4% w PBS, pH 7,2-7,4
Trymer do włosów	Swevet	F95000	Długość cięcia: 0,5 mm
Hematoksylina	Histolab	1800	Harris HTX
Histolab-Clear	Histolab	14250	Zamiennik ksylenu
Izofluran	VM Pharma	448210	Attane vet 1000 mg/g
Lekotape	Swemed	2056774
Mepilex	Swemed	2059125	7,5x8,5 cm
opatrunek filmowy Mepore	Swemed	2057753	6x7 cm z ramką
Chirurgiczna taśma mikroporowata	Swemed	2063856	1,2 cm x 9,1 m
Mikrotom	Thermo Fisher Scientific	387861	Microm HM355S
Medium montażowe	Histolab	00840-05	Pertex
Uszczelka typu O-ring	Ruilogod	B0B1TRQBRT	śr. wewn. 11 mm, śc. 1 mm
Szew (Ethilon 4-0)	Scandivet	21274-A	Poliamid niewchłanialny
Odwadnianie tkanek	Leica Biosystems	Leica TP1020
Tubifast z rozciągliwością w dwóch kierunkach	Swemed	2069292	7,5 cm x 10 m PES/PA