Precyzyjne podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej z wykorzystaniem punktów orientacyjnych anatomii w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Podsumowanie

Niniejszy protokół indukuje zawał mięśnia sercowego u myszy poprzez trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej, wykorzystując bruzdę międzykomorową przednią jako powtarzalny punkt orientacyjny na powierzchni ciała w celu precyzyjnego umieszczenia szwu. Zawał jest potwierdzany za pomocą elektrokardiografii, echokardiografii, barwienia histologicznego oraz analizy biomarkerów w surowicy.

Streszczenie

Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej (LAD) tętnicy wieńcowej jest najpowszechniej stosowaną metodą tworzenia mysich modeli zawału mięśnia sercowego (MI) w przedklinicznych badaniach sercowo-naczyniowych. Jednak w konwencjonalnych protokołach miejsce podwiązania znajduje się zazwyczaj 1–2 mm poniżej uszka lewego przedsionka, co jest punktem orientacyjnym często trudnym do wiarygodnego zidentyfikowania podczas operacji. W połączeniu ze znaczną zmiennością osobniczą anatomii tętnic wieńcowych myszy prowadzi to często do nieprecyzyjnej lokalizacji LAD, niespójnych miejsc podwiązania oraz ograniczonej odtwarzalności wyników między operatorami. Aby rozwiązać te problemy, niniejszy protokół wprowadza przednią bruzdę międzykomorową (AIS) jako punkt orientacyjny dla podwiązania LAD. AIS jest płytkim wgłębieniem powierzchniowym, bezpośrednio widocznym pod mikroskopem, pod którym przebiega LAD. W przeciwieństwie do konwencjonalnych podejść, zapewnia ona stabilny punkt odniesienia anatomicznego, który pozwala na bardziej spójny wybór miejsca podwiązania i jest łatwiejszy do zidentyfikowania dla mniej doświadczonych operatorów. Protokół łączy standaryzowaną anestezyjną inhalację izofluranem z nieinwazyjną intubacją tchawiczą i weryfikuje wystąpienie MI za pomocą elektrokardiografii, echokardiografii, testu ELISA, barwienia histopatologicznego oraz trójwymiarowego obrazowania tętnic wieńcowych. Niniejszy protokół zapewnia niezawodną i odtwarzalną metodę eksperymentalną indukowania MI u myszy w celu badania zmian patofizjologicznych i immunologicznych następujących po zawale.

Wprowadzenie

Zawał mięśnia sercowego (MI), będący jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności z powodów sercowo-naczyniowych na całym świecie, stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi¹. Charakteryzujący się nagłym początkiem, krytycznym przebiegiem klinicznym i wysokim wskaźnikiem śmiertelności, MI jest wywoływany przede wszystkim przez zakrzepową okluzję tętnic wieńcowych i może prowadzić do głębokiego niedokrwienia mięśnia sercowego, następczej nekrozy kardiomiocytów oraz kaskady powikłań, w tym arytmii, niewydolności serca i nagłego zgonu sercowego². Pomimo znaczących postępów w kardiologii klinicznej, ograniczony dostęp do ludzkiej tkanki mięśnia sercowego nadal utrudnia badanie leżących u podstaw patofizjologicznych mechanizmów MI oraz opracowywanie skutecznych strategii terapeutycznych³. W związku z tym niezawodne, powtarzalne i klinicznie istotne modele zwierzęce in vivo, które wiernie odtwarzają cechy kliniczne i progresję MI, pozostają niezbędne do badań mechanistycznych oraz przedklinicznej oceny terapeutycznej.

Od czasu, gdy Johns i Olson opracowali pierwszy mysi model MI w 1954 roku, metodologie indukowania MI u myszy podlegały ciągłemu udoskonalaniu⁴. Trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej (LAD) tętnicy wieńcowej pod bezpośrednią kontrolą mikroskopową stało się najszerzej stosowaną techniką, ponieważ odtwarza ono kluczowe cechy patologiczne ludzkiego MI, w tym zlokalizowane niedokrwienie mięśnia sercowego, martwicę mięśnia sercowego oraz pozawałową przebudowę komór⁵. Jednak konwencjonalne podwiązanie LAD wymaga znacznej wiedzy z zakresu mikrochirurgii, którą zazwyczaj nabywa się jedynie poprzez rozbudowane szkolenie, co ogranicza spójność i powtarzalność procedury pomiędzy operatorami i laboratoriami⁶. Ponadto powikłania śródoperacyjne i pooperacyjne — w tym krwotoki, uszkodzenia lub zapadnięcie płuc, błędne umiejscowienie ligatury oraz mechaniczne uszkodzenia tkanek wynikające z niewłaściwej wentylacji — przyczyniają się do stosunkowo wysokiej śmiertelności okołooperacyjnej, co dodatkowo ogranicza powszechne zastosowanie tego modelu⁷. W odpowiedzi na te ograniczenia Gao i wsp. wprowadzili zmodyfikowaną technikę obejmującą podwiązanie LAD poprzez wywinięcie serca, co upraszcza procedurę chirurgiczną i obniża barierę techniczną w tworzeniu modelu⁸. Opracowano również dodatkowe podejścia eksperymentalne, w tym krio-uszkodzenia tętnic wieńcowych oraz farmakologiczną indukcję uszkodzenia mięśnia sercowego, przeznaczone do specyficznych zastosowań badawczych^9,10. Niemniej jednak trwałe podwiązanie LAD pod bezpośrednią kontrolą wizyjną pozostaje preferowaną metodą, ponieważ najdokładniej odtwarza główne cechy patofizjologiczne ludzkiego MI, umożliwiając jednocześnie kontrolowaną indukcję wielkości i lokalizacji zawału.

Pomimo powszechnego zastosowania, konwencjonalne podwiązanie LAD jest ograniczone przez zmienną identyfikację miejsca ligacji, niespójność proceduralną, stosunkowo wysoką śmiertelność okołooperacyjną oraz zmienność międzylaboratoryjną w zakresie odtwarzalności, co może wpływać na wiarygodność i porównywalność wyników eksperymentalnych¹¹. Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opracowanie bardziej ustandaryzowanej i odtwarzalnej metody trwałego podwiązania LAD u myszy poprzez wykorzystanie przedniej bruzdy międzykomorowej (AIS) jako zewnętrznego punktu orientacyjnego do lokalizacji naczynia. Zamiast szacować miejsce ligacji w stałej odległości poniżej uszka lewego przedsionka, protokół ten wykorzystuje AIS — płytkie wgłębienie powierzchniowe, bezpośrednio widoczne pod mikroskopem i znajdujące się nad LAD — jako stabilny punkt odniesienia prowadzący proces podwiązania. W porównaniu z konwencjonalną estymacją opartą na punktach orientacyjnych, podejście to ma na celu ułatwienie bardziej spójnego wyboru miejsca ligacji, zmniejszenie zmienności zależnej od operatora oraz poprawę dostępności metody dla mniej doświadczonych chirurgów, przy jednoczesnym zachowaniu zgodności ze standardowymi procedurami MI u myszy. Protokół ten jest zatem odpowiedni dla badaczy poszukujących odtwarzalnej metody chirurgicznej do tworzenia trwałych modeli MI na potrzeby badań nad uszkodzeniem mięśnia sercowego, przebudową komór, stanami zapalnymi oraz powiązanymi mechanizmami chorób układu sercowo-naczyniowego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Centrum Eksperymentów na Zwierzętach Southwest Medical University (nr zgody SWMU20240146). W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J (wolne od specyficznych patogenów [SPF]) w wieku 8–10 tygodni o masie ciała 20,0 ± 3,0 g. Przed rozpoczęciem eksperymentów myszy aklimatyzowano przez 1 tydzień w standardowych warunkach laboratoryjnych (22°C ± 2°C; cykl 12 h światła/12 h ciemności).

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. W dniu operacji przygotować i wysterylizować wszystkie instrumenty chirurgiczne, w tym pęsety, nożyczki okulistyczne, igłotrzymacz, mikro-zacisk hemostatyczny (typu mosquito), retraktor powiek w kształcie litery V, nici nylonowe 7-0 z igłą (zakrzywienie 3/8 koła), nici nylonowe 6-0 oraz nici nylonowe 5-0. Wszystkie metalowe instrumenty wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121°C przez 20 min przed zabiegiem, a pomiędzy zwierzętami ponownie sterylizować przy użyciu sterylizatora koralikowego (250°C przez 15 s), a następnie schłodzić na sterylnym podkładzie. Używać nici z zapieczętowanych, sterylnych opakowań.
2. Przygotować dwa oddzielne obszary robocze w celu zachowania techniki aseptycznej. W jednym obszarze przygotować pęsety, zestaw do intubacji tchawiczej myszy oraz aparat do znieczulenia, a w drugim sterylnym obszarze chirurgicznym przygotować wysterylizowane instrumenty, patyczki bawełniane, povidon-jod oraz sterylną gazę.
3. Nałożyć krem depilacyjny na obszar klatki piersiowej na 1 min. Ostrożnie usunąć krem i włosy za pomocą sterylnej gazy zwilżonej sterylną wodą lub solą fizjologiczną.
   1. Sama depilacja nie stanowi chirurgicznego przygotowania skóry. Ostateczną aseptyczną dezynfekcję skóry i sterylne odizolowanie pola operacyjnego należy przeprowadzić dopiero po znieczuleniu, intubacji i unieruchomieniu myszy na platformie chirurgicznej, bezpośrednio przed nacięciem skóry (Krok 2.6).
4. Podać cefazolinę (300 mg/kg) w zastrzyku dosytronikowym na 1 h przed operacją. Odtworzyć cefazolinę sodową do wstrzykiwań w sterylnej 0,9% soli fizjologicznej do stężenia roboczego 30 mg/mL i podać około 0,2 mL na 20 g masy ciała, aby osiągnąć docelową dawkę. Kontynuować podawanie raz dziennie przez 5 kolejnych dni po operacji.
   UWAGA: W tym protokole nie stosować systemicznych ani miejscowych farmakologicznych środków hemostatycznych. Hemostazę śródoperacyjną należy uzyskać poprzez wywieranie delikatnego, ciągłego nacisku sterylnym patyczkiem bawełnianym przez 10–30 s lub do momentu ustąpienia krwawienia.

2. Indukcja znieczulenia i intubacja tchawicy

1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej (16 × 10 × 11 cm) podłączonej do aparatu do znieczulenia. Ustaw przepływ gazu nośnego na 0,5 L/min i przeprowadź indukcję znieczulenia izofluranem w stężeniu 3,5%–4,0%.
   UWAGA: Poprawność znieczulenia potwierdź brakiem odruchu wycofania kończyny. Przy takich ustawieniach mysz zazwyczaj osiąga chirurgiczną głębokość znieczulenia w ciągu 2–4 min.
2. Ułóż znieczuloną mysz na plecach na platformie do intubacji tchawiczej gryzoni. Zawieś mysz, zaczepiając górne siekacze o gumkę platformy, tak aby głowa i szyja były wyprostowane pod kątem około 45°. Wyrównaj osie jam ustnej, gardła i krtani, aby głośnia była bezpośrednio widoczna.
3. Wykonaj intubację przezrotną
   1. Wykonaj intubację przezrotną w warunkach bezpośredniej laryngoskopii bez tracheotomii w celu wprowadzenia kontrolowanej wentylacji mechanicznej. Jako rurkę endotrachealną zastosuj kaniulę dożylną 20 G (średnica zewnętrzna około 0,9 mm; długość około 15 mm).
   2. Otwórz pysk i delikatnie odsuń język na bok za pomocą pęsety. Wprowadź zgłębnik laryngoskopu dla małych zwierząt wzdłuż grzbietu języka i dociśnij nasadę języka.
   3. Przesuwaj laryngoskop, aż pojawi się nagłośnia. Unieś laryngoskop do góry i do przodu wzdłuż osi rękojeści, aby unieść nagłośnię i odsłonić V-kształtny otwór głośni oraz blade fałdy głosowe.
   4. Wprowadź kaniulę przez otwartą głośnię podczas wdechu, utrzymując bezpośrednią wizualizację fałdów głosowych. Wyjmij laryngoskop po przejściu kaniuli przez głośnię.
   5. Wprowadź kaniulę na głębokość około 5–7 mm. Wyjmij prowadnik i podłącz kaniulę do respiratora.
      UWAGA: Prawidłowe umieszczenie rurki endotrachealnej potwierdź, obserwując symetryczne, obustronne ruchy ścian klatki piersiowej zsynchronizowane z respiratorem. Jeśli ruchy ścian klatki piersiowej są minimalne, a zamiast nich występują rytmiczne ruchy brzucha, którym towarzyszy stopniowe spłycanie znieczulenia, wyjmij kaniulę z przełyku i powtórz intubację.
   6. Jeśli głośnia nie jest widoczna, wyjmij laryngoskop i ponownie ułóż mysz na platformie do intubacji z głową i szyją wyprostowanymi pod kątem około 45°. Ponownie wyrównaj osie jam ustnej, gardła i krtani, usuń wszelkie wydzieliny z gardła za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego i powtórz laryngoskopię. Jeśli u myszy wystąpią oznaki wybudzania ze znieczulenia, umieść ją ponownie w komorze indukcyjnej, pogłęb znieczulenie, a następnie powtórz próbę intubacji.
   7. Przerwij procedurę, jeśli u myszy wystąpi sinica, krwawienie z krtani lub uporczywa bezdech. Zaprzestań podawania izofluranu i umieść mysz na podgrzewaczu z kontrolą temperatury (37°C) aż do pełnego wybudzenia.
   8. Nie przystępuj do torakotomii, jeśli intubacja tchawicy nie powiodła się. Przełóż procedurę na późniejszy termin lub wyklucz zwierzę z badania i odnotuj to jako niepowodzenie proceduralne.
      UWAGA: Powtarzane próby intubacji mogą spowodować obrzęk krtani, zwiększając ryzyko pooperacyjnego stresu oddechowego. W większości przypadków udana intubacja zostaje osiągnięta w ciągu pierwszych dwóch prób po bezpośredniej wizualizacji głośni. Biegłość w intubacji przezrotnej wymaga praktyki i zapoznania się z techniką.
4. Podawaj powietrze jako gaz nośny z przepływem 0,5 L/min i utrzymuj znieczulenie izofluranem w stężeniu 1,5%–2,0%. Ustaw respirator na częstotliwość oddechów 130 breaths/min, objętość oddechową 2 mL i stosunek czasu wdechu do wydechu 5:4.
   UWAGA: Objętość oddechowa ustawiona na respiratorze przekracza wartość teoretyczną szacowaną na podstawie masy ciała, ponieważ kompensuje ona objętość ściśliwą układu respiratora oraz przestrzeń martwą rurki endotrachealnej. Oceniaj wentylację przez całą procedurę, monitorując zwierzę pod kątem sinicy i oznak barotraumy, w tym odmy opłucnowej i obrzęku podskórnego.
   1. Nieprzerwanie monitoruj głębokość znieczulenia przez cały czas trwania procedury. Co 2 min oceniaj wzorzec oddychania i odruch wycofania kończyny. Stale monitoruj częstość akcji serca za pomocą elektrokardiogramu (EKG) i dostosuj stężenie izofluranu tak, aby utrzymać tętno na poziomie 400–500 beats/min; zazwyczaj wystarczające jest stężenie izofluranu 1,5%–2,0%. Przez cały czas trwania procedury obserwuj występowanie spontanicznych wysiłków oddechowych przeciwko respiratorowi, ruchy wibrysów oraz zmiany koloru błon śluzowych.
   2. Zwiększaj stężenie izofluranu w krokach o 0,5%, maksymalnie do 3,0%, jeśli ponownie pojawi się odruch wycofania kończyny, zaobserwujesz ruchy wibrysów lub wystąpią spontaniczne wysiłki oddechowe przeciwko respiratorowi. Zmniejszaj stężenie izofluranu w krokach o 0,5%, minimalnie do 1,0%, jeśli tętno spadnie poniżej 350 beats/min. W przypadku zaobserwowania tych oznak przerwij procedurę chirurgiczną, kontynuuj monitorowanie tętna, wzorca oddychania, koloru błon śluzowych i ruchów wibrysów, a do zabiegu powróć dopiero po stabilizacji parametrów fizjologicznych.
5. Przechyl mysz na prawy bok, tak aby lewa strona była u góry, w celu odsłonięcia lewej ściany klatki piersiowej. Przymocuj cztery kończyny i ogon do platformy za pomocą taśmy klejącej.
6. Zdezynfekuj pole operacyjne, aplikując trzy razy z rzędu powidon z jodem. Przy każdej aplikacji użyj nowego sterylnego patyczka bawełnianego, zaczynając od planowanego miejsca nacięcia i przesuwając się na zewnątrz spiralnie do około 1 cm poza zamierzone nacięcie we wszystkich kierunkach. Usuwaj patyczek po każdej aplikacji i nie wracaj używanym patyczkiem do centrum pola operacyjnego. Pozostaw ostatnią aplikację do całkowitego wyschnięcia, a następnie załóż sterylny obłoż, odsłaniając tylko pole operacyjne przed wykonaniem nacięcia skóry.

3. Torakotomia i odsłonięcie serca

UWAGA: Cały przebieg procedury chirurgicznej, w tym pozycjonowanie zwierzęcia, torakotomia, odsłonięcie serca, podwiązanie tętnicy wieńcowej LAD, zamknięcie klatki piersiowej oraz rekonwalescencja pooperacyjna, został przedstawiony na Rysunku 1 oraz Rysunku 2.

Rysunek 1: Lokalizacja anatomiczna miejsca ligacji lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej z wykorzystaniem przedniej bruzdy międzykomorowej. (A) Widok brzuszny odsłoniętego serca myszy przed ligacją, przedstawiający przednią bruzdę międzykomorową (AIS). (B) Widok tego samego obszaru po ligacji lewej przedniej zstępującej (LAD) tętnicy wieńcowej; zakreślony obszar wskazuje miejsce ligacji. (C) Schemat przedstawiający relacje przestrzenne między AIS a tętnicami wieńcowymi. LAD przebiega wzdłuż AIS, a punkt ligacji znajduje się w górnej jednej trzeciej bruzdy. RCA, prawa tętnica wieńcowa; LCA, lewa tętnica wieńcowa; LCX, lewa tętnica okalająca. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Procedura chirurgiczna ligacji lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy, prowadzonej wzdłuż przedniej bruzdy międzykomorowej. (A) Ułożenie i unieruchomienie znieczulonej myszy z depilacją lewego regionu klatki piersiowej. (B) Wykonanie nacięcia skóry nad lewą ścianą klatki piersiowej. (C) Rozsunięcie mięśni piersiowych i zidentyfikowanie odpowiedniej przestrzeni międzyżebrowej do torakotomii. (D,E) Wprowadzenie i ustawienie rozwieracza klatki piersiowej w celu poszerzenia przestrzeni międzyżebrowej i odsłonięcia pola operacyjnego. (F) Wizualizacja odsłoniętego serca i identyfikacja przedniej bruzdy międzykomorowej (AIS). (G) Przeciągnięcie nici nylonowej 7-0 przez AIS i pod lewą przednią zstępującą (LAD) tętnicę wieńcową. (H) Zawiązanie nici w celu wykonania trwałej ligacji LAD. (I) Usunięcie rozwieracza klatki piersiowej i zamknięcie ściany klatki piersiowej. (J,K) Sekwencyjne zamknięcie warstw mięśni i skóry. (L) Pozostawienie myszy do wybudzenia w warunkach ogrzewania po operacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Za pomocą nożyczek okulistycznych wykonaj 1 cm podłużne nacięcie skóry na lewej ścianie klatki piersiowej, równolegle do długiej osi mostka i około 2 mm bocznie od lewej krawędzi mostka. Obnaż leżące pod spodem mięśnie piersiowe.
2. Używając cienkich pęset, rozdziel tępo mięsień piersiowy większy i mięsień piersiowy mniejszy wzdłuż kierunku przebiegu ich włókien. Odsunie mięśnie bocznie, aby odsłonić żebra i przestrzenie międzyżebrowe, unikając przecinania mięśni w celu zminimalizowania krwawienia.
3. Zidentyfikuj odpowiednią przestrzeń międzyżebrową przed otwarciem jamy klatki piersiowej. Zlokalizuj przednią tętnicę międzyżebrową, będącą odgałęzieniem wewnętrznej tętnicy piersiowej, która biegnie w przestrzeni międzyżebrowej równolegle do żeber, i zidentyfikuj trzecią przestrzeń międzyżebrową, znajdującą się bezpośrednio kranialnie względem najczęściej widocznej tętnicy w czwartej przestrzeni międzyżebrowej.
4. Jeśli przednia tętnica międzyżebrowa nie jest wyraźnie widoczna, zbadaj palpacyjnie pierwsze żebro i odliczaj w kierunku kaudalnym, aby zidentyfikować przestrzeń między trzecim a czwartym żebrem. Przed kontynuacją upewnij się, że wybrana przestrzeń międzyżebrowa zapewnia bezpośredni, niezakłócony widok na uszko lewego przedsionka oraz przednią ścianę wolną lewej komory.
   UWAGA: Precyzyjna identyfikacja trzeciej przestrzeni międzyżebrowej jest kluczowa, ponieważ błędne miejsce torakotomii może ograniczyć wizualizację serca i utrudnić przeprowadzenie procedury.
5. Wykonaj torakotomię przez lewą trzecią przestrzeń międzyżebrową. Ostrożnie rozszerz przestrzeń międzyżebrową za pomocą V-kształtnego retraktora powiek, aż uszko lewego przedsionka i górna jedna trzecia lewej komory zostaną wyraźnie odsłonięte w polu operacyjnym.
   UWAGA: Na tym etapie serce pozostaje pokryte osierdziem; w związku z tym AIS nie można zidentyfikować w sposób wiarygodny. Zidentyfikuj AIS dopiero po otwarciu osierdzia (Krok 3.6), zgodnie z opisem w Krokach 4.2–4.3.
6. Chwyć delikatnie osierdzie jedną cienką pęsetą i unieś je znad mięśnia sercowego. Użyj drugiej cienkiej pęsety, aby powoli rozerwać osierdzie i całkowicie odsłonić serce.

4. Ligacja lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej z wykorzystaniem punktów orientacyjnych

1. Przeciągnij szew nylonowy 6-0 przez ścianę klatki piersiowej i zastosuj delikatną trakcję, aby poszerzyć pole operacyjne. Całkowicie odsłoń AIS przed zidentyfikowaniem miejsca ligacji (Rycina 1A).
2. Zidentyfikuj AIS jako płytką bruzdę biegnącą ukośnie od podstawy serca w stronę wierzchołka, wyznaczającą granicę powierzchniową między komorą lewą a prawą (Rycina 1C). Pod mikroskopem zidentyfikuj ją jako quasi-koliste wgłębienie znajdujące się około 1–2 mm poniżej dolnej krawędzi uszka lewego przedsionka.
3. Jeśli AIS jest trudna do zidentyfikowania, delikatnie przemyj powierzchnię epikardium patyczkiem bawełnianym zwilżonym ciepłą solą fizjologiczną. Ponownie obejrzyj pole operacyjne pod mikroskopem, aby wyraźniej zidentyfikować bruzdę.
   UWAGA: Pod mikroskopem sekcyjnym AIS jest łatwo identyfikowalną płytką bruzdą, która anatomicznie wyznacza granicę międzykomorową, a bezpośrednio pod nią przebiega tętnica wieńcowa LAD. Jeśli AIS pozostaje niewyraźna po przemyciu, najpierw upewnij się, że torakotomia zapewnia odpowiednią ekspozycję. Następnie zidentyfikuj bezpośrednio LAD zgodnie z wcześniej opisanymi metodami: w stosunku do towarzyszącej jej żyły serca, tętnica ma bardziej różowy kolor, mniejszy kaliber i wyraźne tętno¹².
   1. Jeśli nie można zidentyfikować AIS lub tętnicy wieńcowej LAD, najpierw sprawdź, czy torakotomia została wykonana przez lewą trzecią przestrzeń międzyżebrową. W razie potrzeby zmień położenie torakotomii zgodnie z opisem w krokach 3.3–3.5, a następnie powtórz identyfikację AIS i LAD zgodnie z opisem w krokach 4.1–4.3.
   2. Przerwij procedurę, jeśli AIS lub LAD nie zostaną zidentyfikowane po 10 min uważnej inspekcji, jeśli wystąpi niekontrolowany krwotok, jeśli całkowity czas procedury z otwartą klatką piersiową przekroczy 20 min lub jeśli częstość akcji serca pozostanie poniżej 300 uderzeń/min mimo dostosowania głębokości znieczulenia. Głęboko znieczul mysz 5% izofluranem, uśmierć ją poprzez zwichnięcie szyi i odnotuj zwierzę jako niepowodzenie proceduralne do analizy wyników chirurgicznych.
4. Przeciągnij szew nylonowy 7-0 przez bruzdę w górnej jednej trzeciej AIS (Rycina 1B). Wprowadź igłę prostopadle do powierzchni epikardium na głębokość około 0,5–1 mm, tak aby punkty wejścia i wyjścia znajdowały się po przeciwnych stronach bruzdy i obejmowały w przybliżeniu jej maksymalną szerokość.
5. Zabezpiecz ligaturę za pomocą węzła chirurgicznego. Dostosuj ligaturę do momentu, gdy po pierwszym zaciągnięciu nastąpi natychmiastowe zblednięcie mięśnia sercowego dystalnie od miejsca ligacji, bez wyraźnego wcięcia w tkankę lokalną.
   UWAGA: Zaciśnij szew tylko na tyle, aby zamknąć przepływ krwi w tętnicy wieńcowej. Nadmierne napięcie może uszkodzić sąsiedni mięsień sercowy lub spowodować przecięcie naczynia i otaczającej tkanki przez szew.
6. Potwierdź pomyślną okluzję wieńcową w ciągu 1 min od ligacji, obserwując plamiste, niedokrwienne zblednięcie mięśnia sercowego dystalnie od miejsca ligacji¹². Dalszego potwierdzenia okluzji dokonaj poprzez zidentyfikowanie uniesienia odcinka ST w EKG.
7. Jeśli obszar niedokrwienia jest zbyt mały lub zblednięcie nie występuje, poluzuj ligaturę i powtórz procedurę ligacji.

5. Zamknięcie i rekonwalescencja pooperacyjna

1. Ostrożnie usuń rozwieracz powiek w kształcie litery V. Zamknij torakotomię pojedynczym szwem przerywanym z nylonu 5-0, prowadząc igłę wokół sąsiednich trzeciego i czwartego żebra, aby ponownie zbliżyć trzecią przestrzeń międzyżebrową. Prowadź igłę blisko powierzchni żebra, aby uniknąć uszkodzenia pęczka naczyniowo-nerwowego międzyżebrowego. Przed zawiązaniem szwu delikatnie uciśnij klatkę piersiową w końcowej fazie wydechu, aby usunąć resztkowe powietrze wewnątrzklatkowe, a następnie utrzymuj ucisk podczas zabezpieczania szwu węzłem chirurgicznym.
2. Zamknij nacięcie skóry warstwowo, używając szwów z nylonu 5-0. Przed kontynuacją upewnij się, że brzegi rany są całkowicie zbliżone.
3. Umieść mysz na podgrzewaczu z kontrolowaną temperaturą (37°C), przerwij podawanie izofluranu i kontynuuj wentylację mechaniczną aż do momentu powrotu spontanicznego oddychania. Obserwuj zwierzę podczas wybudzania z anestezji, zwracając uwagę na ruchy ogona lub wibrysów oraz przywrócenie regularnego rytmu oddechowego wynoszącego około 150 breaths/min.
4. Potwierdź gotowość do ekstubacji, weryfikując regularne oddychanie spontaniczne, widoczny ruch ścian klatki piersiowej zsynchronizowany z cyklem respiratora oraz celowe ruchy kończyn lub wibrysów. Powoli wyjmij rurkę endotrachealną podczas fazy wydechu, a następnie kontynuuj monitorowanie myszy na podgrzewaczu przez 3–5 min, aby potwierdzić brak duszności.
   UWAGA: Duszność po ekstubacji jest najczęściej spowodowana odmą opłucnową wynikającą z niepełnego zamknięcia przestrzeni międzyżebrowej. W przypadku wystąpienia duszności tymczasowo ponownie znieczul i wentyluj mysz, rozetnij szwy skórne, sprawdź zamknięcie przestrzeni międzyżebrowej i nałóż dodatkowe szwy w każdym miejscu wycieku powietrza przed ponowieniem procedury ekstubacji.
5. Po wybudzeniu z anestezji przenieś mysz do klatki macierzystej. Podaj buprenorfinę (0.1 mg/kg, podskórnie) bezpośrednio po operacji oraz co 4–6 h przez pierwsze 48 h.
6. Monitoruj każdą mysz co najmniej dwa razy dziennie przez pierwsze 3 dni po operacji, a następnie raz dziennie. Oceniaj masę ciała, postawę, aktywność, rytm oddechowy oraz ranę pooperacyjną; przeprowadź eutanazję każdego zwierzęcia, u którego wystąpią zdefiniowane wcześniej humanistyczne punkty końcowe, w tym uporczywy utrudniony oddech, brak możliwości dostępu do pokarmu lub wody bądź zgarbiona, nieruchoma postawa nieod reagująca na bodźce.

6. Ocena elektrokardiograficzna (EKG)

1. Zarejestruj sygnały elektrokardiograficzne przy użyciu wielokanałowego systemu rejestracji fizjologicznej wyposażonego w wzmacniacz EKG. Wprowadź do myszy trzy podskórne elektrody odprowadzeń kończynowych, podłączając wejście dodatnie (VIN+) do lewej kończyny tylnej, wejście ujemne (VIN−) do prawej kończyny przedniej oraz masę (GND) do prawej kończyny tylnej.
2. Podłącz moduł wzmacniacza EKG do jednostki akwizycji danych. Ustaw filtr notch na 50 Hz (lub 60 Hz, zgodnie z lokalną częstotliwością sieci elektrycznej), następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji i dodaj nowy moduł wzmacniacza EKG w ustawieniach kanałów analogowych.
   1. Skonfiguruj wzmacniacz z następującymi parametrami: wzmocnienie = 2000, tryb = normal, filtr dolnoprzepustowy = 150 Hz oraz filtr górnoprzepustowy = 0.05 Hz. Otwórz ustawienia akwizycji, ustaw częstotliwość próbkowania na 1 kHz i zamknij okno konfiguracji.
   2. Po umieszczeniu elektrod kliknij Start, aby rozpocząć rejestrację. Ustaw bazę czasu wyświetlania na 0.5 s na główny podział oraz skalę pionową na 0.25 mV na główny podział, a następnie rejestruj EKG w sposób ciągły przez co najmniej 30 s. Wybierz stabilny segment pozbawiony artefaktów do analizy i reprezentatywnej prezentacji.
3. Zarejestruj EKG bezpośrednio po ligaturze, utrzymując mysz w znieczuleniu izofluranem w stężeniu 1.5% oraz w normotermii na podgrzewaczu. Rejestruj EKG zarówno z grupy MI, jak i z grupy kontrolnej (NC) w tym samym punkcie czasowym, w porównywalnych warunkach znieczulenia.

7. Echokardiografia

1. Na 1 dzień przed obrazowaniem usuń owłosienie z przedniej części klatki piersiowej za pomocą kremu depilacyjnego. Przez cały czas trwania badania znieczul mysz 1,5% izofluranem.
2. Umieść mysz w pozycji grzbietnej na podgrzewanej platformie, przymocuj cztery kończyny do elektrod EKG i nałóż żel do USG na okolicę przedserca. Dostosuj stężenie izofluranu w razie potrzeby, aby utrzymać częstotliwość akcji serca powyżej 400 beats/min.
3. Ustaw głowicę ultradźwiękową w trzeciej lub czwartej przestrzeni międzyżebrowej wzdłuż lewej krawędzi mostka. Skieruj znacznik głowicy w stronę prawej kończyny przedniej pod kątem około 30° i wyrównaj głowicę z długą osią serca.
4. Wszystkie obrazy uzyskaj za pomocą przetwornika liniowego o środkowej częstotliwości nadawczej 30 MHz, szerokości pasma 20–46 MHz i rozdzielczości osiowej 50 μm. Ustaw moc nadawania na 100%, głębokość obrazowania na 13 mm, szerokość obrazu na 11 mm, zakres dynamiczny na 60 dB oraz wzmocnienie dwuwymiarowe na 40 dB. Nagraj pętle cine w trybie B z częstotliwością odświeżania 210 frames/s.
5. Zapisz te parametry akwizycji jako ustawienia wstępne systemu. Stosuj ten sam przetwornik, ustawienia wstępne, moc nadawania, zakres dynamiczny, głębokość i szerokość obrazu dla wszystkich zwierząt i wszystkich sesji obrazowania; nie zmieniaj głębokości obrazowania pomiędzy grupą NC a MI.
6. W tym samym widoku wzdłuż osi długiej ustaw linię próbkowania w trybie M na poziomie środkowym komór, prostopadle do przegrody międzykomorowej i tylnej ściany lewej komory, tak aby brama próbkowania obejmowała pełną średnicę przednio-tylną lewej komory. Zarejestruj zapis w trybie M do późniejszej analizy.
7. Uzyskaj obrazy w trybie B, na których wyraźnie widoczne są lewa komora, lewy przedsionek i pierścień aorty, a następnie nagraj pętle cine do późniejszej analizy. Uzyskaj odpowiadające im obrazy w trybie M w tej samej płaszczyźnie obrazowania.
8. Z uzyskanych obrazów zmierz końcową rozkurczową średnicę wewnętrzną lewej komory (D_d), końcową skurczową średnicę wewnętrzną lewej komory (Ds) oraz grubość przegrody międzykomorowej. zarejestruj pięć kolejnych cykli pracy serca i podaj wartości średnie.
   UWAGA: Oblicz końcową objętość rozkurczową lewej komory (LVEDV) oraz końcową objętość skurczową lewej komory (LVESV) automatycznie przy użyciu oprogramowania do obrazowania. Oblicz skrócenie frakcyjne (FS) według wzoru FS = (D_d − D_s) / D_d × 100% oraz frakcję wyrzutową (EF) według wzoru EF = (LVEDV − LVESV) / LVEDV × 100%.

8. Pobieranie tkanek, barwienie histologiczne i test ELISA

1. Pobieranie tkanek
   1. W 7. dniu po indukcji MI przeprowadzić echokardiografię u każdej myszy. Zznieczylić mysz 4% izofluranem, pobrać około 1,5 mL krwi poprzez upust z żyły zakątka ocznego, uśmiercić mysz przez zwichnięcie stawów szyjnych i wyciąć serce.
   2. Pozostawić próbki krwi do skrzepnięcia przez noc w temperaturze 4°C. Odwirować próbki przy 2000 × g przez 10 min w 4°C, zebrać surowicę i przechowywać ją w temperaturze −80°C do czasu analizy.
2. Test immunoenzymatyczny (ELISA)
   1. Oznaczyć ilościowo poziom peptydu natriuretycznego typu B (BNP), interleukiny-1β (IL-1β), czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) oraz jądrowego czynnika κB p65 (NF-κB p65) w surowicy przy użyciu zestawów do testów ELISA.
      1. Dostosować wszystkie odczynniki i próbki surowicy do temperatury pokojowej i przygotować roztwory robocze zgodnie z instrukcją zestawu. Rozcieńczyć próbki surowicy 1:5 w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), czyli jednej objętości surowicy dodać cztery objętości PBS.
      2. Dodać 50 μL wzorców, PBS i rozcieńczonych próbek surowicy odpowiednio do dołków wzorcowych, zerowych i badawczych, pozostawiając dołek kontrolny (blank) pusty. Do wszystkich dołków, z wyjątkiem kontrolnego, dodać 100 μL przeciwciała detekcyjnego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), szczelnie zamknąć płytkę i inkubować w 37°C przez 60 min w ciemności.
      3. Odrzucić zawartość każdego dołka i pięciokrotnie przemyć płytkę buforem myjącym, pozwalając buforowi pozostać w każdym dołku przez 20 s podczas każdego cyklu płukania. Osuszyć płytkę na papierze bezochłapowym.
      4. Do każdego dołka dodać 100 μL świeżo przygotowanego substratu (roztwory A i B zmieszane w stosunku objętości 1:1). Inkubować zamkniętą płytkę w 37°C przez 15 min w ciemności, dodać 50 μL roztworu stopującego i zmierzyć gęstość optyczną przy 450 nm.
   2. Odjąć gęstość optyczną dołka kontrolnego od każdego pomiaru i wyznaczyć krzywą wzorcową przy użyciu modelu regresji logistycznej czteroparametrowej (4PL). Obliczyć stężenie każdej próbki na podstawie dopasowanej krzywej, pomnożyć wartość przez czynnik rozcieńczenia 5 i podać wartość średnią z dwóch powtórzeń.
3. Obróbka, zatapianie i krojenie tkanek
   1. Krótko wypłukać każde wycięte serce w lodowatym buforze fosforanowym (PBS), aby usunąć resztki krwi. Utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie przez co najmniej 24 h w temperaturze pokojowej.
   2. Przyciąć każde serce tak, aby odsłonić płaską powierzchnię osi krótkiej, i umieścić je w opisanej kasecie do tkanek. Odwodnić tkankę w szeregu stężeń etanolu (75% etanol przez 4 h, 85% etanol przez 2 h, 90% etanol przez 2 h, 95% etanol przez 1 h oraz dwie zmiany etanolu absolutnego po 30 min każda). Przenieść tkankę do mieszaniny etanol-ksylen na 5–10 min, przejrzyścić w dwóch zmianach ksylenu po 10 min każda i infiltrować w trzech zmianach roztopionej parafiny po 1 h każda.
   3. Zatopić każde serce w parafinie, kierując oś krótką w stronę powierzchni bloku. Wyciąć seryjne skrawki o grubości 3 μm na poziomie środkowym mięśni papilarnych, wypłynąć skrawki w kąpieli wodnej o temperaturze 40°C, nanieść je na szkiełka przedmiotowe i wysuszyć w 60°C.
   4. Odparafinizować skrawki w dwóch zmianach ksylenu (po 15 min każda), a następnie w trzech zmianach etanolu absolutnego (po 5 min każda), 75% etanolu (5 min) i wodzie z odwróconej osmozy (RO) (5 min).
      UWAGA: Paraformaldehyd jest prawdopodobnym kancerogenem oraz substancją drażniącą drogi oddechowe i skórę, a ksylen jest łatwopalny i neurotoksyczny. Odczynniki te należy stosować w dygestorium chemicznym, nosząc sterylne rękawiczki medyczne, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu, a odpady utylizować zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych. Etanol i n-butanol są łatwopalne; należy je trzymać z dala od źródeł zapłonu.
4. Barwienie histologiczne
   1. Barwienie hematoksyliną i eozyną
      1. Zanurzyć odparafinizowane i rehydratyzowane skrawki w hematoksylinie na 3–5 min. Wypłukać skrawki w wodzie.
      2. Różnicować skrawki w 1% alkoholu kwasowym, a następnie wypłukać w wodzie. Błękitnić skrawki w 0,5% wodnym roztworze amoniaku i ponownie wypłukać.
      3. Przenieść skrawki sekwencyjnie przez 85% etanol, 95% etanol i etanol absolutny po 5 min każdy. Barwić kontrastowo skrawki eozyną przez 3–5 min.
      4. Odwodnić skrawki w trzech zmianach etanolu absolutnego po 5 min każda, a następnie w n-butanolu przez 5 min. Przejrzyścić skrawki w trzech zmianach ksylenu po 5 min każda i zamontować w żywicy neutralnej.
         UWAGA: Jądra komórkowe barwią się na niebiesko, natomiast cytoplazma i macierz pozakomórkowa na czerwono.
   2. Barwienie trichromem Massona
      1. Trawić odparafinizowane i rehydratyzowane skrawki w 2,5% roztworze dichromianu potasu przez noc, przez około 15 h w temperaturze pokojowej. Płukać skrawki pod bieżącą wodą przez około 30 s, aż zniknie żółty odcień.
      2. Barwić skrawki w roztworze Ponceau–kwasowej fuksyny przez 6 min, aż tkanka stanie się jaskrawoczerwona. Wydłużyć czas barwienia, jeśli kolor pozostaje blady, i płukać skrawki pod bieżącą wodą, aż spływająca woda będzie bezbarwna.
      3. Odlać nadmiar wody, nie dopuszczając do wyschnięcia skrawków. Różnicować skrawki w wodnym kwasie fosfomolibdowym przez 1–2 min, aż kolagen stanie się blady, a włókna mięśniowe pozostaną czerwone.
      4. Przenieść skrawki bezpośrednio do roztworu błękitu anilinowego bez płukania. Inkubować skrawki przez 6–30 s.
      5. Różnicować skrawki w trzech do pięciu zmianach 1% kwasu octowego przez około 8 s na każdą zmianę. Odwodnić je szybko w trzech zmianach etanolu absolutnego przez odpowiednio około 3, 5 i 5 s.
      6. Przejrzyścić skrawki w n-butanolu przez 5 min, a następnie w ksylenie przez 5 min. Zamontować skrawki w żywicy neutralnej.
         UWAGA: Włókna kolagenu barwią się na niebiesko, natomiast włókna mięśniowe, fibryna i erytrocyty na czerwono.
   3. Barwienie czerwienią Sirius Red
      1. Inkubować odparafinizowane i rehydratyzowane skrawki w roztworze A Sirius Red w piecu w temperaturze 65°C przez 30 min. Myć skrawki pod bieżącą wodą, aż zniknie żółty odcień.
      2. Osuszyć nadmiar cieczy i zanurzyć skrawki w roztworze B Sirius Red na 2 min. Krótko umyć skrawki i osuszyć nadmiar cieczy.
      3. Zanurzyć skrawki w roztworze C Sirius Red na 30 min. Płukać je krótko przez 1–2 s.
      4. Odwodnić skrawki w trzech zmianach etanolu absolutnego przez około 3 s każda. Przejrzyścić je w trzech zmianach ksylenu po 5 min każda i zamontować w żywicy neutralnej.
         UWAGA: W oświetleniu w polu jasnym włókna kolagenu barwią się na czerwono na żółtym tle.
5. Pozyskiwanie obrazów i kwantyfikacja
   1. Pozyskać wszystkie obrazy histologiczne za pomocą cyfrowego skanera preparatów. Zastosować identyczne ustawienia oświetlenia, balansu bieli, ekspozycji i powiększenia dla wszystkich skrawków ze wszystkich grup oraz dołączyć skalę kalibracyjną do każdego obrazu.
   2. Zkalibrować skalę przestrzenną przed analizą obrazu. Wczytać obraz referencyjny zawierający pasek skali, pozyskany w tej samej rozdzielczości i wymiarach pikseli co obrazy badawcze. W menu Measure > Calibration > Set System utworzyć nową kalibrację przestrzenną, ustawić jednostkę na μm, zdefiniować konwersję pikseli na mikrometry poprzez dopasowanie punktów kalibracyjnych do paska skali, zapisać kalibrację i zastosować ją do wszystkich obrazów.
   3. Wczytać skrawka zabarwionego trichromem Massona i obrysować lewą komorę za pomocą narzędzia nieregularnego obszaru zainteresowania (AOI). Wykluczyć jamę komory, prawą komorę oraz artefakty obróbki tkanki, a następnie zapisać całkowitą powierzchnię lewej komory.
   4. Otworzyć Measure > Count/Size i wybrać Select Colors, aby otworzyć okno segmentacji. Wybrać segmentację opartą na sześcianie kolorów (Color Cube Based) i ustawić parametry w następujący sposób: czułość (sensitivity) = 4, rozszerzenie zaznaczenia o 1 indeks kolorów, minimalny rozmiar koloru = 1 piksel, rozmiar jądra (kernel size) = 3 × 3. Zastosować te same ustawienia segmentacji do wszystkich skrawków.
   5. Wybrać niebieskie piksele dodatnie pod kątem kolagenu, używając narzędzia zakraplacza jako punktów nasion (seed points). Próbkować tylko wyraźne obszary kolagenowo-dodatnie, wygenerować obraz podglądu i potwierdzić, że maska obejmuje obszary kolagenowo-dodatnie, wykluczając czerwone mięsień sercowy, jamę komory i tło. W razie potrzeby dostosować punkty nasion przed zastosowaniem maski.
      UWAGA: Ponownie wybierać piksele nasion dla każdego skrawka, aby uwzględnić niewielkie różnice w intensywności barwienia między skrawkami. Zachować identyczne parametry segmentacji (czułość, stopień rozszerzenia, minimalny rozmiar koloru i rozmiar jądra) dla wszystkich obrazów i zaakceptować segmentację tylko wtedy, gdy podgląd wykazuje pełne pokrycie obszarów kolagenowo-dodatnich z wykluczeniem struktur niekolagenowych.
   6. Zastosować maskę segmentacji i zamknąć okno. W menu Measure > Select Measurements wybrać Area, kliknąć Count, otworzyć View > Statistics i zapisać sumaryczną powierzchnię kolagenowo-dodatnią.
   7. Obliczyć ułamkową objętość kolagenu (CVF), dzieląc powierzchnię kolagenowo-dodatnią przez całkowitą powierzchnię lewej komory, i wyrazić wynik w procentach.

9. Przezroczystość tkanek i trójwymiarowe obrazowanie tętnic wieńcowych

1. Fluorescencyjne znakowanie naczyń wieńcowych
   1. Wstrzyknąć 200 µL 2% roztworu błękitu Evansa do bocznej żyły ogonowej w celu oznakowania naczyń wieńcowych. Umieścić mysz w klatce na 60 min, aby umożliwić systemową cyrkulację barwnika.
   2. Umieścić mysz w komorze indukcyjnej (16 × 10 × 11 cm) podłączonej do aparatury do znieczulania i przeprowadzić znieczulenie 4% izofluranem. Uśmiercić mysz poprzez zwichnięcie stawów szyjnych, otworzyć jamę klatki piersiowej, wyciąć nienaruszone serce, wypłukać je w PBS i utrwalić w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 24 h w temperaturze 4°C.
      OSTRZEŻENIE: PFA jest prawdopodobnym kancerogenem oraz substancją drażniącą drogi oddechowe i skórę. PFA należy obsługiwać w dygestorium chemicznym, stosując aseptyczne rękawice medyczne, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu, a odpady utylizować zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.
   3. Przygotować 3% roztwór agarozy w wodzie RO i zatopić utrwalone serce, odpowiednio orientując miejsce podwiązania pod kątem obrazowania. Wstrzyknąć 1 µL roztworu DAPI w każde z ośmiu miejsc wokół obszaru podwiązania za pomocą strzykawki mikrolitrowej i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 2 dni.
2. Przezroczystowanie tkanek
   1. Przeprowadzić przezroczystowanie tkanek przy użyciu zestawu do przezroczystowania tkanek FDISCO (trójwymiarowe obrazowanie organów przezroczystych w rozpuszczalniku z wysoką zdolnością zachowania fluorescencji) zgodnie z instrukcjami producenta. Zestaw składa się z sześciu odczynników (A–F): odczynniki A, B, C, D i E zawierają odpowiednio 50%, 70%, 80%, 100% i 100% tetrahydrofuranu (THF) w wodzie, a odczynnikiem F jest eter dibenylowy.
      OSTRZEŻENIE: THF jest wysoce łatwopalny, podczas przechowywania tworzy wybuchowe nadtlenki i jest substancją drażniącą drogi oddechowe i skórę. Eter dibenylowy jest substancją drażniącą skórę i oczy. Wszystkie odczynniki należy obsługiwać w dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym aseptyczne rękawice medyczne, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu. Odpady utylizować zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.
   2. Inkubować każde serce sekwencyjnie w odczynnikach A, B, C, D i E przez 6 h na każdy odczynnik. Użyć 10 mL każdego odczynnika na jedno serce, co odpowiada minimalnemu stosunkowi objętości próbki do odczynnika wynoszącemu 1:5.
   3. Przenieść próbkę do odczynnika F i kontynuować inkubację do momentu, aż tkanka stanie się optycznie przezroczysta, zazwyczaj przez około 1 h.
   4. Wszystkie etapy przezroczystowania przeprowadzać w temperaturze 6°C–8°C przy łagodnym mieszaniu. Umieścić próbkę w szklanym pojemniku owiniętym w folię aluminiową i chronić przed światłem przez cały czas trwania procedury, aby zachować fluorescencję.
3. Fluorescencyjne obrazowanie arkuszem światła
   1. Zamontować przezroczystą próbkę w uchwycie do próbek. Użyć fluorescencyjnego mikroskopu arkuszowego wyposażonego w obiektyw 4× (apertura numeryczna = 0.28; odległość robocza = 20.0 mm).
   2. Zanurzyć zamontowaną próbkę w eterze dibenylowym wewnątrz komory obrazowania. Oświetlić preparat z obu stron i sekwencyjnie wzbudzać DAPI przy 405 nm oraz błękit Evansa przy 647 nm.
   3. Ustawić parametry akwizycji w następujący sposób: dla kanału 405 nm użyć natężenia lasera 3 000 jednostek umownych i czasu ekspozycji 30 ms; dla kanału 647 nm użyć natężenia lasera 4 000 jednostek umownych i czasu ekspozycji 30 ms. Pozyskać wszystkie obrazy, stosując wielkość kroku z wynoszącą 6 μm i rozdzielczość obrazu 1 024 × 1 024 pikseli.
   4. Ustawić tryb akwizycji kamery na XYCZT, w którym najpierw pozyskiwane są obrazy boczne (XY), a następnie następuje sekwencyjna akwizycja kanałów (C), przesuwanie osiowe (Z) i akwizycja punktów czasowych (T), zgodnie z konfiguracją oprogramowania do obrazowania.
4. Przetwarzanie danych obrazowych i rekonstrukcja trójwymiarowa
   1. Połączyć surowe pliki obrazów TIFF (stitching) za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów dostarczonego z mikroskopem. Przekonwertować połączone pliki obrazów na format IMS, wybierając File > Convert to Imaris.
   2. Zaimportować przekonwertowane pliki IMS do oprogramowania do analizy trójwymiarowej. Wygenerować rekonstrukcje z renderowaniem objętościowym (volume-rendering) przy użyciu domyślnych ustawień renderowania i wyeksportować reprezentatywne obrazy za pomocą modułu Snapshot.
      UWAGA: Rekonstrukcje trójwymiarowe są generowane przy użyciu domyślnego potoku renderowania oprogramowania bez modyfikacji. Nie stosuje się segmentacji obrazu, progowania, odszumiania, odejmowania tła ani innego wstępnego przetwarzania. Zrekonstruowane obrazy służą do jakościowej wizualizacji naczyń wieńcowych i nie są przeznaczone do analizy ilościowej.

10. Analiza statystyczna

1. Wszystkie dane należy przedstawić jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Analizy statystyczne należy przeprowadzić przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism (wersja 5.0).
2. Jednostkę eksperymentalną należy zdefiniować jako pojedyncze zwierzę. Dla wszystkich punktów końcowych funkcjonalnych, biomarkerów i parametrów histomorfometrycznych należy przeanalizować n = 8 myszy na grupę.
3. Gromadzenie i analizę danych należy przeprowadzić przy użyciu zakodowanych identyfikatorów próbek, zachowując ślepą próbę badacza względem przydziału do grup. Przypisanie do grup należy ujawnić dopiero po zakończeniu wszystkich analiz ilościowych.
4. Przed wyborem odpowiedniego testu statystycznego należy ocenić normalność rozkładu danych za pomocą testu Shapiro–Wilka oraz jednorodność wariancji za pomocą testu Levene'a w programie GraphPad Prism (wersja 5.0).
5. W przypadku spełnienia założeń o normalności rozkładu i równości wariancji, dwie grupy należy porównać za pomocą dwustronnego nieparzystego testu t Studenta. W przeciwnym razie należy przeprowadzić test U Manna–Whitneya.
6. Wartość P < 0.05 należy uznać za istotną statystycznie. Istotność statystyczną należy oznaczać jako P < 0.05, P < 0.01 oraz P < 0.001.

Wyniki

Sutura interventricularis anterior (AIS) służyła jako punkt orientacyjny w celu lokalizacji tętnicy wieńcowej LAD oraz identyfikacji miejsca podwiązania (Rysunek 1A–C). Po zidentyfikowaniu AIS przeprowadzono sekwencyjną procedurę chirurgiczną indukcji MI, obejmującą torakotomię, odsłonięcie serca, podwiązanie LAD, zamknięcie klatki piersiowej oraz rekonwalescencję pooperacyjną, zgodnie z ilustracją na Rysunku 2A–L. Uproszczony protokół umożliwił szybką i powtarzalną indukcję MI u myszy. Protokół ten wymaga przedłużonego okresu praktycznego szkolenia przed możliwością jego niezawodnego wykonania; intubacja tchawicy oraz podwiązanie prowadzone pod kontrolą AIS są dwoma etapami z najtrudniejszą krzywą uczenia się. W początkowej fazie szkolenia śmiertelność okołooperacyjna w ciągu pierwszych 7 dni po operacji może osiągnąć 50% lub więcej, a wskaźnik sukcesu indukcji modelu może spaść do 30% lub mniej. Po opanowaniu tych technik wskaźnik sukcesu chirurgicznego konsekwentnie przekracza 90%. W niniejszym badaniu nie wystąpiły zgony okołooperacyjne w ciągu pierwszych 7 dni po operacji. Wszystkie procedury szkoleniowe zostały przeprowadzone zgodnie z tym samym zatwierdzonym instytucjonalnym protokołem wykorzystania zwierząt.

Po podwiązaniu LAD zaobserwowano charakterystyczne nieprawidłowości elektrokardiograficzne, w tym wyraźne pogłębienie załamka Q, uniesienie odcinka ST o morfologii wypukłej do góry, hiperostre zaostrzenie załamka T (które zazwyczaj przekształca się w odwrócenie załamka T w fazie podostrej), zwiększone napięcie zespołu QRS z poszerzoną amplitudą oraz wyraźną tachykardię (Rysunek 3A). Badanie makroskopowe wykazało miejscowe blaknięcie mięśnia sercowego i rozszerzenie komory dystalnie względem miejsca podwiązania w grupie MI w porównaniu z grupą NC (Rysunek 3B). Badanie histopatologiczne wykazało dezorganizację włókien mięśni sercowych, poszerzenie przestrzeni międzykomórkowych, naciek komórek zapalnych, odkładanie kolagenu oraz zaburzenia struktury mięśnia sercowego w grupie MI, co wykazano w barwieniach hematoksyliną i eozyną (H&E), trichromem Massona oraz Sirius Red (Rysunek 3C). Analiza ilościowa przekrojów barwionych trichromem Massona wykazała znacznie większą CVF w grupie MI niż w grupie NC (18,24% ± 1,67% vs 0,05% ± 0,01%; P < 0,001; Rysunek 3D).

Rycina 3: Zmiany elektrokardiograficzne, anatomiczne i histopatologiczne po podwiązaniu lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. (A) Reprezentatywne zapisy elektrokardiograficzne (EKG) zarejestrowane bezpośrednio po operacji w grupie kontrolnej (NC) oraz grupie z zawałem mięśnia sercowego (MI). (B) Reprezentatywne obrazy makroskopowe serc z grup NC i MI. Paski skali = 1 mm. (C) Reprezentatywne przekroje poprzeczne serca z grup NC i MI barwione hematoksyliną i eozyną (H&E; lewo), trichromem Massona (środek) oraz Sirius Red (prawo). W przekrojach barwionych trichromem Massona kolagen jest niebieski, a mięsień sercowy czerwony; w przekrojach barwionych Sirius Red kolagen jest czerwony na żółtym tle. Paski skali = 1,000 µm. (D) Ułamk objętości kolagenu (CVF), obliczony jako obszar kolagenu dodatni podzielony przez całkowity obszar lewej komory i wyrażony w procentach, w grupach NC i MI. Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM); n = 8 myszy na grupę. Istotność statystyczna względem grupy NC oznaczona jest jako **P < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Upośledzenie funkcji serca potwierdzono za pomocą echokardiografii. Reprezentatywne obrazy w trybie M wykazały obniżoną kurczliwość lewej komory w grupie MI (Rysunek 4A). Analiza ilościowa wykazała znacząco obniżoną frakcję wyrzutową (EF) oraz frakcję skracania (FS) lewej komory w grupie MI w porównaniu z grupą NC (Rysunek 4B,C). Metoda ELISA wykazała znacząco podwyższone stężenia BNP, TNF-α, NF-κB p65 i IL-1β w surowicy w grupie MI (Rysunek 4D–G), co jest zgodne z upośledzeniem funkcji serca i reakcją zapalną.

Rycina 4: Zmiany czynnościowe serca i poziomy biomarkerów w surowicy po podwiązaniu lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej. (A) Reprezentatywne obrazy echokardiograficzne w trybie M z grup kontrolnej (NC) i zawału mięśnia sercowego (MI). (B) Frakcja wyrzutowa lewej komory (EF). (C) Frakcyjne skrócenie lewej komory (FS). (D–G) Stężenia w surowicy (D) BNP (peptydu natriuretycznego typu B), (E) TNF-α (czynnika martwicy nowotworu α), (F) NF-κB p65 (jądrowego czynnika κB p65) oraz (G) IL-1β (interleukiny-1β), zmierzone za pomocą testu ELISA. EF i FS wyrażono w procentach; BNP, TNF-α i IL-1β wyrażono w pg/mL, a NF-κB p65 w ng/mL. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM); n = 8 myszy na grupę. Istotność statystyczną względem grupy NC oznaczono jako *P < 0.01 i **P < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Trójwymiarowe obrazowanie fluorescencyjne serc po procesie utrudniania tkanki (tissue clearing) wykazało przebieg LAD pod AIS i dowiodło, że podwiązanie w anatomicznie zdefiniowanym miejscu spowodowało okluzję tętnic wieńcowych (Rycina 5A–F). Łącznie wyniki te świadczą o pomyślnej indukcji fenotypu MI w tej wstępnej serii ośmiu zwierząt na grupę, charakteryzującej się dysfunkcją lewej komory, włóknieniem mięśnia sercowego i zapaleniem ogólnoustrojowym. Niniejsze badanie zostało zaprojektowane w celu ustanowienia i wykazania wykonalności modelu MI kierowanego przez AIS, a nie w celu zapewnienia kompleksowej walidacji wielkości próby, długoterminowej stabilności modelu czy zgodności anatomicznej między AIS a LAD. Odpowiednio, aspekty te są uznane za ograniczenia niniejszego badania i zostały omówione w sekcji Dyskusja. W szczególności oceny funkcjonalne i biochemiczne ograniczono do fazy ostrej po MI, a związek między AIS a LAD wykazano jakościowo, jednak nie został on jeszcze ilościowo określony w wystarczająco licznej kohorcie.

Rycina 5: Trójwymiarowe obrazowanie fluorescencyjne oczyszczonego układu naczyniowego wieńcowego myszy. Oczyszczone całe serca zostały oznakowane barwnikiem Evans Blue w celu wizualizacji naczyń wieńcowych oraz 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) w celu wizualizacji jąder komórkowych, a następnie poddane obrazowaniu fluorescencyjnemu metodą arkusza światła (light-sheet) i rekonstrukcji trójwymiarowej. (A–C) Rekonstrukcje całego serca przedstawiające (A) kanał DAPI, (B) kanał Evans Blue oraz (C) kanały połączone. Paski skali = 1,000 µm. (D–F) Powiększone widoki obszaru naczyń wieńcowych przedstawiające (D) kanał DAPI, (E) kanał Evans Blue oraz (F) kanały połączone. Paski skali = 400 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nie każda procedura pozwala na uzyskanie optymalnego modelu, a rozpoznanie nieoptymalnych wyników jest istotne dla rozwiązywania problemów. Podwiązanie wykonane zbyt proksymalnie lub zbyt głębokie wprowadzenie igły może spowodować powstanie nadmiernie dużego zawału, któremu towarzyszy ciężka niewydolność serca, arytmia lub pęknięcie komory, co prowadzi do wczesnej śmiertelności. I odwrotnie, podwiązanie wykonane zbyt dystalnie lub zbyt powierzchownie może spowodować powstanie jedynie małego zawału lub nie doprowadzić do indukowania zawału. Dlatego pomyślną indukcję modelu należy oceniać w oparciu o wiele kryteriów. Podczas operacji bladość mięśnia sercowego dystalnie względem miejsca podwiązania stanowi natychmiastowy wskaźnik zamknięcia tętnicy wieńcowej, choć znalezisko to nie zawsze jest łatwo dostrzegalne. Pooperacyjne badanie echokardiograficzne oraz badanie histopatologiczne stanowią dodatkowe potwierdzenie pomyślnego ustanowienia modelu. Rycina uzupełniająca 1 przedstawia reprezentatywny nieudany model, w którym badanie histopatologiczne nie wykazuje wyraźnej infiltracji komórek zapalnych ani włóknienia.

Rycina uzupełniająca 1. Reprezentatywne znaleziska histologiczne z nieudanego modelu zawału mięśnia sercowego. Reprezentatywne poprzeczne przekroje serca myszy, w której indukcja zawału mięśnia sercowego nie powiodła się, barwione (A) hematoksyliną i eozyną (H&E), (B) trichromem Massona oraz (C) czerwienią siriusową (Sirius Red). W porównaniu z udaną indukcją zawału mięśnia sercowego, przekroje te nie wykazują wyraźnej infiltracji komórek zapalnych ani przebudowy włóknistej w mięśniu lewej komory, co jest zgodne z nieudanym zamknięciem tętnicy wieńcowej. Paski skali = 1,000 µm.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W ostatnich latach kliniczne i eksperymentalne modele zawału mięśnia sercowego (MI) stały się coraz bardziej istotne w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym, jednak wiele pytań dotyczących patogenezy MI i strategii jego leczenia pozostaje nierozstrzygniętych. Niniejszy artykuł opisuje udoskonaloną metodę tworzenia mysiego modelu MI, w której kilka krytycznych etapów procedury wymaga szczególnej uwagi. Pierwszym krytycznym krokiem jest intubacja tchawicy. Niektóre wcześniejsze protokoły zakładają udrożnienie dróg oddechowych poprzez tracheotomię, co wymaga nacięcia skóry szyi i rozcięcia tkanek w celu odsłonięcia tchawicy przed intubacją¹³; inne stosują intubację orotrakealną, lecz zalecają nacięcie szyi w linii środkowej, aby poprawić widoczność podczas procedury¹⁴. W przeciwieństwie do obu tych podejść, niniejszy protokół wykorzystuje laryngoskop do oświetlenia gardła i przeprowadza intubację orotrakealną pod bezpośrednią kontrolą wzrokową głośni, bez konieczności nacinania szyi. Chociaż podejście to stawia większe wymagania co do biegłości technicznej operatora, pozwala uniknąć urazu tkanek szyi, zmniejsza ryzyko infekcji i bólu pooperacyjnego oraz skraca czas operacji. Najczęstszym błędem podczas intubacji jest przypadkowe wprowadzenie rurki do przełyku. Jeśli podczas wentylacji klatka piersiowa nie unosi się, a w rurce endotrachealnej nie pojawia się kondensacja podczas wydechu, należy natychmiast wycofać rurkę i powtórzyć intubację. Podłącz respirator dopiero po potwierdzeniu symetrycznego, obustronnego ruchu ścian klatki piersiowej.

Drugim i najważniejszym krokiem jest identyfikacja tętnicy wieńcowej LAD oraz precyzyjne umieszczenie ligatury. Konwencjonalne metody napotykają na tym etapie szereg trudności. Spoczynkowa częstość akcji serca myszy wynosi około 500–600 uderzeń/min, a LAD przebiega w sąsiedztwie kilku towarzyszących żył wieńcowych, co sprawia, że śródoperacyjna identyfikacja tętnicy w czasie rzeczywistym jest z natury trudna. Co więcej, nawet w optymalnych warunkach znaczna część tętnic LAD nie może być wyraźnie zwizualizowana pod mikroskopem stereoskopowym¹⁵. W tym kontekście wcześniejsze protokoły, w których miejsce ligacji szacowano jako punkt 1–2 mm poniżej uszka lewego przedsionka, są ograniczone przez niespójną śródoperacyjną identyfikację tego punktu odniesienia anatomicznego^12,14, podczas gdy złożony wzór rozgałęzień lewej tętnicy wieńcowej może dodatkowo obniżać powtarzalność wyników¹⁶. Aby rozwiązać te problemy, niniejszy protokół wykorzystuje AIS jako punkt orientacyjny dla rozmieszczenia ligatury. Pod mikroskopem stereoskopowym AIS przejawia się jako płytka bruzda na brzusznej powierzchni serca, pod którą bezpośrednio przebiega LAD. Stanowi on zatem stosunkowo stabilny punkt odniesienia anatomicznego, który jest w mniejszym stopniu zależny od doświadczenia operatora. Umieszczenie ligatury w górnej jednej trzeciej AIS zapewnia spójny cel anatomiczny dla okluzji wieńcowej. Reprezentatywne wyniki pokazują, że podejście to pozwoliło na pomyślne wywołanie oczekiwanego fenotypu ostrego MI u badanych zwierząt.

Punkt orientacyjny AIS nie jest niezawodny w każdych okolicznościach. Gdy ekspozycja klatki piersiowej jest ograniczona lub krwawienie z osierdzia przysłania powierzchnię serca i utrudnia identyfikację AIS, należy delikatnie przetrzeć pole operacyjne patyczkiem bawełnianym zwilżonym solą fizjologiczną i ponownie ocenić bruzdę przed podwiązaniem. Jeśli AIS nadal nie można zidentyfikować z pewnością, należy bezpośrednio zidentyfikować LAD zgodnie z opisem w protokole i przeprowadzić podwiązanie pod bezpośrednią kontrolą wzrokową, zamiast polegać na AIS. W razie potrzeby należy potwierdzić właściwą przestrzeń międzyżebrową, licząc w kierunku ogonowym od pierwszego żebra, aby zapewnić odpowiednią ekspozycję uszka lewego przedsionka oraz przedniej ściany lewej komory.

Wśród powikłań pooperacyjnych najczęstszym jest odma opłucnowa, która zazwyczaj objawia się niewydolnością oddechową po ekstubacji. Kluczem do zapobiegania odmie jest całkowite usunięcie resztek powietrza z jamy klatki piersiowej przed zamknięciem przestrzeni międzyżebrowych. W przypadku podejrzenia odmy należy krótko ponowić znieczulenie i wentylację myszy, rozciąć szwy skórne i sprawdzić szczelność zamknięcia przestrzeni międzyżebrowych. Jeśli zidentyfikowano jedno lub więcej miejsc nieszczelnego zamknięcia, należy nałożyć dodatkowe szwy w miejscu wycieku powietrza przed powtórzeniem procedury ekstubacji. Innym potencjalnym powikłaniem jest krwawienie śródoperacyjne, które najczęściej występuje, gdy igła przebije małe naczynie epikardialne lub towarzyszącą żyłę wieńcową podczas podwiązywania. Krwawienie jest zazwyczaj ograniczone i można je zazwyczaj opanować, przykładając przez kilka sekund delikatny ucisk za pomocą nasączonego solą fizjologiczną tamponu bawełnianego. Przed zamknięciem jamy klatki piersiowej należy potwierdzić brak aktywnego krwawienia w polu operacyjnym, aby zminimalizować powikłania pooperacyjne. Ponadto u myszy podczas lub bezpośrednio po zabiegu mogą wystąpić arytmie, w tym dodatkowe skurcze komór lub przejściowe migotanie komór. Arytmie te często ustępują po utrzymaniu temperatury ciała, ustabilizowaniu głębokości znieczulenia i tymczasowym przerwaniu procedury w celu umożliwienia spontanicznego powrotu rytmu serca. Wreszcie, powikłania anestezjologiczne najczęściej wynikają z braku niezwłocznego obniżenia stężenia izofluranu po udanej intubacji tchawicy. Należy obniżyć stężenie izofluranu do poziomu podtrzymującego natychmiast po podłączeniu rurki endotrachealnej do respiratora oraz stale monitorować oddychanie i częstość akcji serca przez cały czas trwania procedury.

Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta wymaga znacznych umiejętności mikrochirurgicznych i, podobnie jak inne modele permanentnego podwiązania tętnicy wieńcowej LAD, pozostaje podatna na zmienność wynikającą z różnic anatomicznych naczyń wieńcowych oraz doświadczenia operatora. Niemniej jednak, dzięki odpowiedniemu przeszkoleniu i konsekwentnej technice chirurgicznej, badacze mogą tworzyć model MI z zadowalającą powtarzalnością, poprawiając jednocześnie odtwarzalność procedury i przeżywalność pooperacyjną.

Należy uznać kilka ograniczeń tej metody. Po pierwsze, oceny funkcjonalne i biochemiczne zostały przeprowadzone w ciągu jednego tygodnia po indukowaniu MI, a zatem odzwierciedlają one jedynie fazę ostrą MI, bez systematycznej oceny długofalowych wyników, takich jak przebudowa komory w 4–8 tygodniach po zabiegu. Po drugie, podobnie jak w innych modelach MI z permanentnym podwiązaniem z użyciem niewchłanialnych szwów, ten protokół może prowadzić do przewlekłych zrostów osierdziowych. Stanowi to immanentną cechę modelu podwiązania, a nie ograniczenie specyficzne dla podejścia z prowadzeniem przez AIS. Niemniej jednak stopień nasilenia tych zrostów oraz ich wpływ na długofalową funkcję serca nie zostały ilościowo określone w niniejszym badaniu. Przyszłe badania mogłyby zbadać zastosowanie szwów wchłanialnych i ocenić ich wpływ na powstawanie zrostów oraz skuteczność modelu. Po trzecie, choć trójwymiarowe obrazowanie tętnic wieńcowych wykazało jakościowo, że LAD przebiega pod AIS, zgodność anatomiczna między tymi strukturami nie została jeszcze ilościowo określona w wystarczająco licznej kohorcie. Po czwarte, w badaniu uwzględniono wyłącznie samce myszy C57BL/6J. Chociaż oczekuje się, że AIS będzie stanowił spójny punkt orientacyjny anatomiczny, jego przydatność u samic myszy, innych szczepów myszy oraz innych gatunków wymaga dalszej walidacji. Wreszcie, potencjalne zalety tego protokołu w odniesieniu do spójności miejsca podwiązania i odtwarzalności procedury opierają się na doświadczeniu jednego laboratorium i nie zostały ocenione w bezpośrednim porównaniu z konwencjonalnymi metodami podwiązania LAD ani w badaniach przeprowadzonych przez wielu operatorów i w wielu instytucjach. W związku z tym wymagane będą dodatkowe badania walidacyjne, aby ustanowić szerszą generalizowalność tej metody.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
sterylna sól fizjologiczna 0,9%	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.	-	Rekonstytucja cefazoliny
3% agaroza	Sigma-Aldrich	A0169	Zatopienie próbki
4% paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127	Fiksacja tkanek
Etanol bezwodny	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0170A	Odwadnianie tkanek; łatwopalne
Fuksyna kwaśna	Aladdin	A104916-100g	Przygotowanie barwnika Ponceau–roztwór fuksyny kwaśnej do barwienia trichromem Massona
oprogramowanie AcqKnowledge	BIOPAC Systems	AcqKnowledge 4.0	Rejestracja i analiza elektrokardiogramu
Roztwór amoniaku, 0,5% w wodzie	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.2528A	Krok niebieski podczas barwienia hematoksyliną i eozyną
Błękit anilinowy, rozpuszczalny w kwasach	Aladdin	A111200-100g	Przygotowanie roztworu błękitu anilinowego do barwienia trichromowego Massona
Sterylne rękawiczki medyczne	Nanchang Feixiang Latex Products Co., Ltd.	-	Ochrona chemiczna i biologiczna
Buprenorfina	Qinghai Pharmaceutical Factory Co., Ltd.	H10940181	Analgezja pooperacyjna
Cefazolina sodowa do wstrzyknięć	CSPC Zhongnuo Pharmaceutical (Shijiazhuang) Co., Ltd.	-	Perioperacyjna profilaktyka antybiotykowa
Patyczki bawełniane	Shijiazhuang Kangertai Medical Equipment Co., Ltd.	-	Wymaz z epikardium i przygotowanie aseptyczne
roztwór barwiący DAPI	Thermo Fisher	D1306	Znakowanie jąder komórkowych
Krem do depilacji	Veet	-	Usuwanie owłosienia klatki piersiowej
Cyfrowy skaner preparatów	3DHISTECH	Pannoramic MIDI II	Obrazowanie całych preparatów
Wzmacniacz EKG	BIOPAC Systems	ECG100C	Wzmocnienie sygnału elektrokardiograficznego
System zapisu elektrokardiograficznego	BIOPAC Systems	MP160	Rejestracja elektrokardiogramu
zestaw ELISA, mysi peptyd natriuretyczny typu B	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RXW202726M	Oznaczanie ilościowe BNP w surowicy
zestaw ELISA, interleukina-1 mysiaβ	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX203063M	IL-1 w surowicyβ ilościowe oznaczenie
zestaw ELISA, mysi czynnik jądrowy-κB p65	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX201879M	Serum NF-κIlościowe oznaczenie p65
zestaw ELISA, czynnik martwicy nowotworu mysi-α	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	RX202412M	TNF-α w surowicyα ilościowe oznaczenie
Kasety do zatapiania	Jiangsu Shitai	22022	Zatapianie tkanek
Cewnik endotrachealny, 20 G	Shenzhen Bailide Biotechnology Co., Ltd.	B11103	Intubacja przezrotnicza; średnica zewnętrzna ok. 0,9–1,0 mm; przycięte do około 15 mm przed użyciem
Eozyna Y, rozpuszczalna w alkoholu	Hefei BASF Biotechnology Co., Ltd.	Y0310-100G	Kontrastowanie cytoplazmy podczas barwienia hematoksyliną i eozyną
Błękit Evansa	Jarvisbio	A312001	Etykietowanie naczyń wieńcowych
Pinceta precyzyjna	RWD Life Science	F12011-10	Obróbka tkanek i otwarcie osierdzia
Pęseta precyzyjna, mikrochirurgiczna	RWD Life Science	FC12002T-08	Mikrosurgicalna obsługa tkanek
Nożyczki precyzyjne	RWD Life Science	S12000-09	Nożyczki okulistyczne do nacięć skóry i dyssekcji
Kwas octowy lodowaty	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	-	Przygotowanie 1% kwasu octowego do różnicowania w barwieniu trichromem Massona
Lamelki szklane	Jiangsu Shitai	80312/80302	Montowanie preparatów przekrojowych
Sterylizator kulkowy	RWD Life Science	RS3002	Sterylizacja instrumentów pomiędzy zwierzętami
oprogramowanie GraphPad Prism	Oprogramowanie GraphPad	Wersja 5.0	Analiza statystyczna
Podkładka grzewcza	RWD Life Science	69020	Pooperacyjna termoregulacja
Roztwór barwiący hematoksyliną	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Barwienie jąder podczas barwienia hematoksyliną i eozyną
Przeciwciało detekcyjne sprzężone z peroksydazą chrzanową	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Dołączone do zestawów ELISA	Detekcja metodą ELISA
Kwas solny	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.1337A	Przygotowanie alkoholu kwasowego do różnicowania hematoksyliny
oprogramowanie Image-Pro Plus	Cybernetyka Mediów	Wersja 6.0	Ilościowe oznaczenie frakcji objętościowej kolagenu
oprogramowanie Imaris	Płaszczyzna bitowa	Wersja 7.2.3	Rekonstrukcja i analiza trójwymiarowa
Izofluran	RWD Life Science	R510-22-10	Anestetyk wziewny
System znieczulenia izofluranem	RWD Life Science	TAIJI-IE	Podawanie izofluranu
Laryngoskop do małych zwierząt	Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.	SR310-MR	Bezpośrednia wizualizacja podczas intubacji
Mikroskop fluorescencyjny z arkuszem światła	Innowacyjna Technologia Świetlna	LiToneXL	Trójwymiarowe obrazowanie fluorescencyjne
oprogramowanie LitScan	Technologia Innowacyjnego Oświetlenia	Wersja 3.31	Szycie i konwersja obrazów
Respirator mechaniczny	Chengdu Taimeng Software Co., Ltd.	HX-101E	Wentylacja mechaniczna; 130 oddechów/min; objętość oddechowa 2 ml
Mikrokleszczyki hemostatyczne	RWD Life Science	FC21001R-12	Trzymanie igły podczas ligacji i zamykania rany
Strzykawka mikrolitrowa	Shanghai Gaoge Industry and Trade Co., Ltd.	-	Lokalna iniekcja DAPI
Czytnik mikropłytek	Molecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.	SpectraMax iD5	Pomiar gęstości optycznej przy 450 nm
Mikroskop stereoskopowy	Maishidi (Dongguan) Technology Co., Ltd.	MSD204	Wizualizacja śródoperacyjna
Mikroskop świetlny, pionowy	Leica	DM500	Obrazowanie histologiczne
Noże do mikrotomu	Epredia	MX35 ULTRA	Krojenie sekcji parafinowych
Zestaw do modyfikowanego barwienia Sirius Red	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1078	Barwienie kolagenu; zawiera roztwory A, B i C
n-Butanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0886A	Odwodnienie i przejaśnianie histologiczne; łatwopalne
Neutralna żywica montażowa	Shanghai Yiyang	YSQN41-91	Montowanie preparatów na szkiełkach
Szew nylonowy, igła 3/8 okręgu 7-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej
Szew nylonowy, 5-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Zamknięcie klatki piersiowej i skóry
Szew nylonowy, 6-0	Ningbo Medical Needle Co., Ltd.	-	Ekspozycja i trakcja ściany klatki piersiowej
Stacja do zatapiania w parafinie	Wuhan Junjie Electronics	JB-L5	Zatapianie tkanek
Parafina	NA	Nie dotyczy	Infiltracja i zatapianie tkanek
Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem	Sigma-Aldrich	P3813	Przemywanie tkanek i rozcieńczanie odczynników
Kwas fosfomolibdowy	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.	-	Dyferencjacja w barwieniu trichromem Massona
Ponceau 2R	Aladdin	P104989-25g	Przygotowanie Ponceau–roztwór fuksyny kwasowej do barwienia trichromowego Massona
Dichromian potasu	Zhengzhou Paini Chemical Reagent Factory	7778-50-9	zaprawa do barwienia trichromowego Massona
Powidona–jod	SingleLady	GB26368-2010	Dezynfekcja skóry
Woda z odwróconej osmozy	Oczyszczony laboratoryjnie	Nie dotyczy	Przygotowanie roztworów
Mikrotom obrotowy	Leica Instruments (Shanghai)	RM2016	Krojenie preparatów woskowych
Adapter uchwytu na próbkę	Technologia innowacyjnego oświetlenia	Dostarczony z LiToneXL	Montowanie przejaśnionych próbek do obrazowania arkuszem światła
Przylepiec skórny	Qingdao Schultz Biotechnology Co., Ltd.	-	Unieruchomienie kończyn i ogona
Szkiełka nakrywkowe	Jiangsu Shitai	80340-1630	Nakrywanie szkiełkiem
Suszarka do szkiełek przedmiotowych	Shaoxing Luyue	101-3B	Suszenie szkiełek
Roztwór zatrzymujący	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Dołączone do zestawów ELISA	Zakończenie reakcji ELISA
Roztwory substratów A i B	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Dołączone do zestawów ELISA	wywoływanie barwy w metodzie ELISA
Kąpiel do wypławiania tkanek	Wuhan Junjie Electronics	JK-5/6	Flotacja przekrojów
Procesor tkankowy	Wuhan Junjie Electronics	JT-12S	Zautomatyzowane opracowanie tkanek
Zestaw do utrwalania i przejrzystości tkanek, Odczynniki A–F	Jarvisbio	JA11012	Przezroczystość tkanek oparta na rozpuszczalnikach
Platforma do intubacji tchawicy	RWD Life Science	Re20-M	Pozycjonowanie do intubacji drogą ustną
Oprogramowanie do analizy ultradźwiękowej	Fujifilm VisualSonics	VevoLAB 3.2.6	Analiza danych echokardiograficznych
Żel do badań ultrasonograficznych	Tianjin Jinya Electronics Co., Ltd.	TM-100	Sprzężenie echokardiograficzne
System obrazowania ultradźwiękowego	Fujifilm VisualSonics	Vevo 3100	Echokardiografia
Retraktor powiek w kształcie litery V	Suqian Shengshi Medical Equipment Co., Ltd.	SS5009G	Wciągnięcia międzyżebrowe i żeber
Bufor płuczący	Quanzhou Ruixin Biological Technology Co.	Dołączone do zestawów ELISA	Mycie płytki ELISA
System oczyszczania wody	Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd.	UPT-II-20T	Produkcja wody w procesie odwróconej osmozy
Ksylen	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.	05.001.0586A	Przejaśnianie i deparafinizacja tkanek; łatwopalne i neurotoksyczne