miR-488-3p może służyć jako nowy nieinwazyjny marker diagnostyczny w RZS. miR-488-3p moduluje funkcje biologiczne synowiocytów za pośrednictwem ROCK1. Wykazano istotną ujemną korelację między jego poziomem a ciężkością choroby u pacjentów z RZS.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
miR-488-3p może służyć jako nowy nieinwazyjny marker diagnostyczny w RZS. miR-488-3p moduluje funkcje biologiczne synowiocytów za pośrednictwem ROCK1. Wykazano istotną ujemną korelację między jego poziomem a ciężkością choroby u pacjentów z RZS.
Diagnozowanie reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) pozostaje wyzwaniem ze względu na ograniczenia istniejących biomarkerów. Celem badania było zbadanie potencjału miR-488-3p w surowicy jako biomarkera RA oraz ujawnienie jego potencjalnego mechanizmu działania. W badaniu wzięło udział 135 pacjentów z RA, 130 pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA) oraz 125 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Poziomy ekspresji miR-488-3p sprawdzono za pomocą RT-qPCR. Mechanizm działania przeanalizowano za pomocą testów funkcjonalnych (CCK-8, cytometria przepływowa, ELISA) i eksperymentów walidacyjnych celów (reporterowy gen lucyferazy, RIP). Poziomy ekspresji miR-488-3p w surowicy były znacznie niższe u pacjentów z RA niż u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA) oraz w grupie kontrolnej (p < 0,001). Analiza krzywej ROC wykazała, że miR-488-3p wykazuje wysoką dokładność diagnostyczną w rozróżnianiu RA od zdrowych osób z grupy kontrolnej i pacjentów z OA. miR-488-3p korelował negatywnie z prędkością opadania erytrocytów (ESR), białkiem C-reaktywnym (CRP), czynnikiem reumatoidalnym (RF) oraz wynikami DAS28. Walidacja funkcjonalna wykazała, że nadekspresja miR-488-3p hamowała proliferację i odpowiedź zapalną synowiocytów, jednocześnie indukując apoptozę. Badania mechanistyczne wykazały, że miR-488-3p może bezpośrednio targetować kinazę ROCK1 (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1), która pośredniczy w jego ochronnych efektach. Serum miR-488-3p rokuje jako nowy nieinwazyjny marker diagnostyczny dla RA i chroni synowiocyty przed uszkodzeniem.
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) to powszechna choroba autoimmunologiczna charakteryzująca się zapaleniem błony maziowej, erozją oraz destrukcją stawów1,2. Globalna chorobowość RZS wynosi około 0,5%–1%3, co poważnie wpływa na jakość życia pacjentów i ich zdolność do pracy. Choroba rozwija się podstępnie, a wczesne objawy są często nietypowe i łatwo mogą zostać błędnie zdiagnozowane lub przeoczone4. W miarę postępu choroby może ona prowadzić do deformacji stawów, utraty funkcji, a nawet zwiększyć ryzyko wystąpienia powikłań, takich jak choroby układu sercowo-naczyniowego5, co stanowi znaczne obciążenie dla pacjentów, ich rodzin oraz systemów opieki zdrowotnej.
Obecnie do diagnozy RA wymagane jest połączenie objawów klinicznych, oznak, badań laboratoryjnych oraz oceny obrazowej6. Powszechnie stosowane wskaźniki laboratoryjne obejmują szybkość opadania erytrocytów (ESR) i białko C-reaktywne (CRP), które są nieswoistymi markerami systemowego stanu zapalnego, a także czynnik reumatoidalny (RF) i przeciwciała przeciwko cytrulinowanym peptydom cyklicznym (anti-CCP), które stanowią ważne serologiczne biomarkery RA7,8. Jednakże tradycyjne biomarkery te mają swoje ograniczenia: RF może być dodatni u niektórych zdrowych osób i pacjentów z innymi chorobami autoimmunologicznymi (odsetek wyników fałszywie dodatnich wynosi około 5%); anti-CCP, mimo wysokiej swoistości (>95%), wykazuje ograniczoną czułość we wczesnych stadiach choroby (około 60–70%)4,9, a niektórzy pacjenci z RA pozostają seronegatywni10. Dlatego ważne jest znalezienie bardziej czułych i swoistych biomarkerów do wczesnej diagnostyki, monitorowania choroby i oceny rokowania w RA11.
MikroRNA (miRNA) to grupa endogennych, niekodujących regulatorowych cząsteczek RNA o długości około 22–25 zasad12,13. Stwierdzono, że miRNA pełnią rolę kluczowych regulatorów w rozwoju wielu chorób, a ich aberrantna ekspresja jest ściśle powiązana z patogenezą schorzeń13,14,15, co czyni miRNA obiecującymi biomarkerami w diagnostyce chorób i monitorowaniu terapii. W ciągu ostatnich kilku lat rola miRNA w RZS zyskała coraz większą uwagę16. Badania wykazały, że wiele miRNA wykazuje zaburzoną ekspresję (np. miR-146a, miR-155 itp.) w surowicy, tkankach błony stawowej i monocytach krwi obwodowej (PBMCs) pacjentów z RZS17,18,19. Cząsteczki te przyczyniają się do patogenezy RZS poprzez regulację produkcji cytokin zapalnych, promowanie proliferacji i inwazji komórek błony stawowej oraz wpływ na różnicowanie osteoklastów20. Wśród nich miR-488 jest zlokalizowany w regionie 1q25.2 chromosomu 1 u ludzi21, a wcześniejsze badania potwierdziły jego działanie neuroprotekcyjne: odgrywa on rolę regulacyjną w progresji glejaków22 i neuroblastomów23, a co istotne, miR-488-3p promuje apoptozę chondrocytów w chorobie zwyrodnieniowej stawów (OA)24. Choć OA i RZS są różnymi chorobami stawów, wykazują wspólne mechanizmy w procesach patologicznych zapalenia błony stawowej i destrukcji chrząstki25. Postawiliśmy hipotezę, że miR-488-3p może odgrywać rolę w RZS poprzez regulację podobnych szlaków docelowych. Jednak specyficzna rola i potencjalne mechanizmy działania miR-488-3p w RZS nie zostały dotąd wyjaśnione.
Badanie analizowało zmiany poziomów ekspresji miR-488-3p w surowicy u pacjentów z RZS oraz jego związek z aktywnością choroby i wskaźnikami klinicznymi, mając na celu ocenę jego potencjalnej wartości jako nieinwazyjnego markera diagnostycznego RZS. Niniejsze badanie dostarcza nowej wiedzy na temat wczesnego przesiewu i przewidywania progresji choroby w RZS, co przyczynia się do poprawy rokowań u pacjentów z RZS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Hefei BOE (numer zatwierdzenia 2021–1), a od wszystkich uczestników przed włączeniem do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę.
Pacjenci i próbki
Do badania zakwalifikowano 135 pacjentów z RA (zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami klasyfikacji ACR/EULAR z 2010 r.) z Oddziału Reumatologii i Immunologii szpitala Hefei BOE, 130 pacjentów z OA z Oddziału Ortopedii (zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi OA Chińskiego Stowarzyszenia Medycznego z 2018 r.) oraz 125 zdrowych osób kontrolnych, dopasowanych pod względem wieku i płci, z centrum badań profilaktycznych tego samego szpitala. Uczestnicy byli w wieku 30–80 lat. W przypadku zdrowej grupy kontrolnej potwierdzono brak chorób autoimmunologicznych, schorzeń stawów oraz ostrych infekcji poprzez szczegółowy wywiad, badanie fizykalne i testy laboratoryjne. Z badania wykluczono uczestników z współistniejącymi chorobami autoimmunologicznymi, historią infekcji lub urazów w ciągu ostatnich 3 miesięcy, chorobami nowotworowymi, a także kobiety w ciąży lub karmiące piersią.
Pobieranie i przygotowanie próbek
Od wszystkich uczestników badania pobrano krew żylną na czczo. Po 30 min krzepnięcia w temperaturze pokojowej, próbki surowicy wyizolowano poprzez wirowanie z prędkością 1500 × g przez 15 min. Surowicę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz.
Wykrywanie markerów klinicznych i serologicznych
Aby kompleksowo ocenić stan choroby i aktywność zapalną, zmierzono kliniczne i serologiczne biomarkery przy użyciu standaryzowanych metod laboratoryjnych. OB zmierzono metodą Westergrena w celu oceny niespecyficznego zapalenia układowego. Poziom CRP oznaczono za pomocą testu immunoturbidymetrycznego (normalna wartość referencyjna: <10 mg/L), aby ocenić odpowiedź zapalną w fazie ostrej. RF zmierzono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), przyjmując normalną wartość referencyjną ≤20 IU/mL. Przeciwciała anty-CCP zmierzono za pomocą testu ELISA drugiej generacji, aby uzyskać serologiczne potwierdzenie diagnozy RZS.
Linie komórkowe i hodowla
Ludzkie synowiocyty fibroblastopodobne od pacjentów z RA (HFLS-RA) hodowano w podłożu Dulbecco's Modified Medium (DMEM) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Komórki utrzymywano w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂; do wszystkich eksperymentów wykorzystano komórki z przejść od trzeciego do szóstego.
Ekstrakcja RNA i ilościowa real-time RT-PCR
Całkowite RNA wyekstrahowano z próbek surowicy przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA. Transkrypcję odwrotną przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, stosując zestaw do syntezy pierwszej nici miRNA dla miRNA oraz zestaw do transkrypcji odwrotnej dla genów docelowych RNA posłańca (mRNA). Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) wykonano przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym z gotową mieszaniną PCR (master mix) opartą na SYBR Green. Program termocyklera ustawiono na wstępną denaturację w 95 °C przez 30 s, a następnie przeprowadzono 40 cykli amplifikacji (denaturacja w 95 °C przez 5 s oraz przyłączanie/elongacja w 60 °C przez 30 s). Każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach. Małe jądrowe RNA U6 (U6 snRNA) oraz dehydrogenaza gliceraldo-3-fosforanowa (GAPDH) służyły odpowiednio jako endogenne geny referencyjne do normalizacji miRNA i mRNA. Sekwencje starterów zestawiono w Supplementary Table 1. Względne poziomy ekspresji miR-488-3p i jego genów docelowych obliczono metodą 2−ΔΔCt. W celu weryfikacji zależności regulacyjnych przeanalizowano również zmiany poziomów mRNA genów docelowych po nadekspresji lub inhibicji miR-488-3p.
Transfekcja komórek
Komórki HFLS-RA wysiano do płytek 6-dołkowych w gęstości 5 × 105 komórek/dołek. Komórki przetransfekowano przy użyciu odczynnika do transfekcji opartego na liposomach zgodnie z instrukcją producenta. Grupy transfekcyjne obejmowały grupy z pojedynczą transfekcją oraz grupy z kotransfekcją. Grupy z pojedynczą transfekcją obejmowały: 1) kontrolę — komórki nietransfekowane; 2) negatywną kontrolę mimiku (NC) — komórki przetransfekowane negatywną kontrolą mimiku miR-488-3p; 3) mimik miR-488-3p — komórki przetransfekowane mimikiem miR-488-3p; 4) NC inhibitora — komórki przetransfekowane negatywną kontrolą inhibitora miR-488-3p; 5) inhibitor miR-488-3p — komórki przetransfekowane inhibitorem miR-488-3p. Grupy z kotransfekcją obejmowały: 1) mimik miR-488-3p + nadekspresja-NC (oe-NC) — komórki kotransfekowane mimikiem miR-488-3p oraz negatywną kontrolą wektorów nadekspresji ROCK1; 2) mimik miR-488-3p + oe-ROCK1 — komórki kotransfekowane mimikiem miR-488-3p oraz wektorami nadekspresji ROCK1. Wszystkie sekwencje transfekcji podsumowano w Tabeli uzupełniającej 1. Wektor nadekspresji ROCK1 przygotowano poprzez klonowanie regionu sekwencji kodującej (CDS) do plazmidu pcDNA 3.1. Przetransfekowane komórki wykorzystano w następnych eksperymentach po 48 h od transfekcji komórek.
Analiza funkcji komórkowych
Test proliferacji komórek (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): Przetransfekowane komórki HFLS-RA zasiano w płytkach 96-dołkowych w zagęszczeniu 5 × 103 komórek/dołek, stosując trzy powtórzenia na grupę. W odstępach 0, 24, 48 i 72 h po transfekcji do każdego dołka dodano 10 µL roztworu CCK-8, a następnie inkubowano w 37 °C przez 2 h. Absorbancję zmierzono przy 450 nm (długość fali detekcji) i 630 nm (długość fali referencyjnej) przy użyciu czytnika mikropłytek. Względną szybkość proliferacji obliczono, przyjmując czas 0 h jako linię bazową.
Wykrywanie apoptozy (cytometria przepływowa): Apoptozę oceniano za pomocą testu apoptozy z wykorzystaniem Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI). Komórki przetransfekowano odpowiednimi plazmidami, a następnie zebrano po trypsynizacji. Stopień apoptozy określono metodą cytometrii przepływowej.
Analiza czynników zapalnych (test enzymatycznego referencyjnego immunosorbenta [ELISA]): Komórki HFLS-RA wysiano do płytek 24-dołkowych i transfektowano wskazanym mimikiem miR-488-3p, inhibitorem miR-488-3p lub odpowiadającymi im kontrolami negatywnymi przez 48 h. Stężenia interleukiny-6 (IL-6), czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) oraz interleukiny-1β (IL-1β) w supernatantach hodowli komórkowych określono ilościowo przy użyciu zestawów ELISA.
Walidacja celu
Przewidywanie celu: Przewidziano, że ROCK1 jest bezpośrednim celem miR-488-3p przy użyciu bazy danych TargetScan26Przewidywane miejsca wiązania między miR-488-3p a ROCK1 3′-region nietranslacyjny (3' UTR)′region nietranslacyjny 3' (UTR) zidentyfikowano również.
Test raportora podwójnej lucyferazy: Dziki typ lub mutant 3′UTR genu ROCK1 został sklonowany do plazmidu pGL3. Przewidywane miejsca wiązania i miejsca zmutowane przedstawiono na Rysunku 4. Komórki HEK- 293T poddano kotransfekcji mimikiem lub inhibitorem miR-488-3p wraz z konstrukcjami wektorowymi27. Aktywność lucyferazy zmierzono 48 h po transfekcji mimikiem lub inhibitorem miR-488-3p.
Immunoprecypitacja RNA (RIP): Komórki HFLS-RA inkubowano z przeciwciałem przeciwko Argonaute 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, rozcieńczenie 1:200) lub kontrolnym przeciwciałem immunoglobuliną G (IgG) (RRID: AB_2819160, rozcieńczenie 1:5000), a następnie przeprowadzono ekstrakcję RNA i ilościową PCR (qPCR) w celu oceny wzbogacenia mRNA ROCK1 zgodnie z powyższym opisem.
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną badania przeprowadzono przy użyciu programów SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) oraz GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Dane pomiarowe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Wszystkie eksperymenty wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, a każde powtórzenie biologiczne analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. Surowe dane zostały dołączone w materiałach uzupełniających. Przed zastosowaniem parametrycznych testów statystycznych dane oceniono za pomocą wykresu prawdopodobieństwa normalnego (P-P). Do porównania ciągłych zmiennych bazowych (np. wieku, wskaźnika masy ciała [BMI] itp.) zastosowano test t dla prób niezależnych, natomiast dla zmiennych kategorycznych (np. płci itp.) wykorzystano test chi-kwadrat. Poziomy ekspresji genów porównano za pomocą testu t dla prób niezależnych. Zmiany w proliferacji komórek w różnych punktach czasowych analizowano za pomocą analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA), natomiast jednoczynnikową analizę ANOVA zastosowano do porównania wskaźników apoptozy określonych metodą cytometrii przepływowej. Analizę korelacji przeprowadzono z wykorzystaniem testu Spearmana (dla zmiennych nie spełniających rozkładu normalnego) oraz Pearsona (dla zmiennych spełniających rozkład normalny). Skuteczność diagnostyczną oceniono za pomocą analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Optymalna wartość odcięcia, czułość oraz swoistość zostały określone przy użyciu maksymalnego indeksu Youdena. Wszystkie testy statystyczne były dwustronne, a wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podstawowa charakterystyka uczestników badania
Badanie to objęło 125 zdrowych osób z grupy kontrolnej, 130 pacjentów z OA oraz 135 pacjentów z RA w celu przeprowadzenia systematycznej analizy (Tabela 1). Nie stwierdzono istotnych różnic w charakterystyce wyjściowej trzech grup pod względem wieku (p = 0,191), stosunku płci (p = 0,203) oraz BMI (p = 0,562), co zapewniło porównywalność populacji badawczej. W odniesieniu do charakterysty...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Jak podkreślili Smolen i wsp.1 w najnowszych wytycznych dotyczących diagnostyki i leczenia RA, opracowanie nowych biomarkerów ma istotną wartość kliniczną. W niniejszym badaniu potwierdziliśmy, że poziom serum miR-488-3p był znacząco obniżony u pacjentów z RA i wykazał obiecującą skuteczność diagnostyczną, z relatywnie zadowalającą czułością i swoistością. Wczesna diagnostyka RA od zawsze stanowiła trudność kliniczną, a istniejące biomarkery nie są wystarczająco czułe w diagnostyce RA, podczas gdy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Bioscience | 556547 | apoptoza komórek |
| przeciwciało anty-Ago2 | Proteintech | 66720-1-Ig | immunoprecypitacja RNA |
| roztwór CCK-8 | Dojindo | CK04 | proliferacja komórek |
| podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher | 121000146 | hodowla komórkowa |
| płodowa surowica bydlęca | Thermo Fisher | 10437028 | hodowla komórkowa |
| Cytometr przepływowy | BD Bioscience | FACSCalibur | apoptoza komórek |
| Zestaw ELISA do przeciwciał anty-CCP człowieka | Cusabio | CSB-E09077h | wykrywanie anty-CCP |
| Zestaw ELISA do RF-IgA człowieka | Feien Biotechnology | EH4270 | wykrywanie RF |
| ludzkie synowiocyty podobne do fibroblastów w reumatoidalnym zapaleniu stawów (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | walidacja in vitro funkcji miR-488-3p |
| przeciwciało kontrolne IgG | Abcam | ab205718 | immunoprecypitacja RNA |
| Zestaw ELISA do interleukiny-1β (IL-1β) | R&D Systems | DY201-05 | stężenie komórkowej IL-1β |
| Zestaw ELISA do interleukiny-6 (IL-6) | R&D Systems | D6050B | stężenie komórkowej IL-6 |
| Liposome Transfection Reagent 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | transfekcja komórek |
| Czytnik mikropłytek | BioTek | ELx808 | test ELISA |
| Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | transkrypcja odwrotna |
| podłoże Opti-MEM | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | transfekcja komórek |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | nadekspresja ROCK1 |
| Penicylina-streptomycyna | Thermo Fisher | 15140122 | hodowla komórkowa |
| System laboratoryjny Phadia 250 | Thermo Fisher | Phadia 250 | analiza krwi |
| PrimeScriptTM Reverse Transcription Kit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | transkrypcja odwrotna |
| jodek propidyny (PI)/ rybonukleaza (RNaza) | BD Bioscience | 550825 | apoptoza komórek |
| System QuantStudio 5 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | test PCR |
| odczynnik RNAiso Plus | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | izolacja RNA |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | amplifikacja PCR |
| Baza danych TargetScan | TargetScan | N/A | predykcja miejsc wiązania, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant C-Reactive Protein IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | wykrywanie CRP |
| Zestaw ELISA do czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) | R&D Systems | DY210-05 | stężenie komórkowego TNF-α |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.