miR-488-3p może służyć jako nowy nieinwazyjny marker diagnostyczny w RZS. miR-488-3p moduluje funkcje biologiczne synowiocytów za pośrednictwem ROCK1. Wykazano istotną ujemną korelację między jego poziomem a ciężkością choroby u pacjentów z RZS.
Artykuł badawczy
Ekspresja Mir-488-3p w surowicy jako nieinwazyjny biomarker diagnostyczny u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Diagnozowanie reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) pozostaje wyzwaniem ze względu na ograniczenia istniejących biomarkerów. Celem badania było zbadanie potencjału miR-488-3p w surowicy jako biomarkera RA oraz ujawnienie jego potencjalnego mechanizmu działania. W badaniu wzięło udział 135 pacjentów z RA, 130 pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA) oraz 125 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Poziomy ekspresji miR-488-3p sprawdzono za pomocą RT-qPCR. Mechanizm działania przeanalizowano za pomocą testów funkcjonalnych (CCK-8, cytometria przepływowa, ELISA) i eksperymentów walidacyjnych celów (reporterowy gen lucyferazy, RIP). Poziomy ekspresji miR-488-3p w surowicy były znacznie niższe u pacjentów z RA niż u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA) oraz w grupie kontrolnej (p < 0,001). Analiza krzywej ROC wykazała, że miR-488-3p wykazuje wysoką dokładność diagnostyczną w rozróżnianiu RA od zdrowych osób z grupy kontrolnej i pacjentów z OA. miR-488-3p korelował negatywnie z prędkością opadania erytrocytów (ESR), białkiem C-reaktywnym (CRP), czynnikiem reumatoidalnym (RF) oraz wynikami DAS28. Walidacja funkcjonalna wykazała, że nadekspresja miR-488-3p hamowała proliferację i odpowiedź zapalną synowiocytów, jednocześnie indukując apoptozę. Badania mechanistyczne wykazały, że miR-488-3p może bezpośrednio targetować kinazę ROCK1 (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1), która pośredniczy w jego ochronnych efektach. Serum miR-488-3p rokuje jako nowy nieinwazyjny marker diagnostyczny dla RA i chroni synowiocyty przed uszkodzeniem.
Wprowadzenie
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) to powszechna choroba autoimmunologiczna charakteryzująca się zapaleniem błony maziowej, erozją oraz destrukcją stawów1,2. Globalna chorobowość RZS wynosi około 0,5%–1%3, co poważnie wpływa na jakość życia pacjentów i ich zdolność do pracy. Choroba rozwija się podstępnie, a wczesne objawy są często nietypowe i łatwo mogą zostać błędnie zdiagnozowane lub przeoczone4. W miarę postępu choroby może ona prowadzić do deformacji stawów, utraty funkcji, a nawet zwiększyć ryzyko wystąpienia powikłań, takich jak choroby układu sercowo-naczyniowego5, co stanowi znaczne obciążenie dla pacjentów, ich rodzin oraz systemów opieki zdrowotnej.
Obecnie do diagnozy RA wymagane jest połączenie objawów klinicznych, oznak, badań laboratoryjnych oraz oceny obrazowej6. Powszechnie stosowane wskaźniki laboratoryjne obejmują szybkość opadania erytrocytów (ESR) i białko C-reaktywne (CRP), które są nieswoistymi markerami systemowego stanu zapalnego, a także czynnik reumatoidalny (RF) i przeciwciała przeciwko cytrulinowanym peptydom cyklicznym (anti-CCP), które stanowią ważne serologiczne biomarkery RA7,8. Jednakże tradycyjne biomarkery te mają swoje ograniczenia: RF może być dodatni u niektórych zdrowych osób i pacjentów z innymi chorobami autoimmunologicznymi (odsetek wyników fałszywie dodatnich wynosi około 5%); anti-CCP, mimo wysokiej swoistości (>95%), wykazuje ograniczoną czułość we wczesnych stadiach choroby (około 60–70%)4,9, a niektórzy pacjenci z RA pozostają seronegatywni10. Dlatego ważne jest znalezienie bardziej czułych i swoistych biomarkerów do wczesnej diagnostyki, monitorowania choroby i oceny rokowania w RA11.
MikroRNA (miRNA) to grupa endogennych, niekodujących regulatorowych cząsteczek RNA o długości około 22–25 zasad12,13. Stwierdzono, że miRNA pełnią rolę kluczowych regulatorów w rozwoju wielu chorób, a ich aberrantna ekspresja jest ściśle powiązana z patogenezą schorzeń13,14,15, co czyni miRNA obiecującymi biomarkerami w diagnostyce chorób i monitorowaniu terapii. W ciągu ostatnich kilku lat rola miRNA w RZS zyskała coraz większą uwagę16. Badania wykazały, że wiele miRNA wykazuje zaburzoną ekspresję (np. miR-146a, miR-155 itp.) w surowicy, tkankach błony stawowej i monocytach krwi obwodowej (PBMCs) pacjentów z RZS17,18,19. Cząsteczki te przyczyniają się do patogenezy RZS poprzez regulację produkcji cytokin zapalnych, promowanie proliferacji i inwazji komórek błony stawowej oraz wpływ na różnicowanie osteoklastów20. Wśród nich miR-488 jest zlokalizowany w regionie 1q25.2 chromosomu 1 u ludzi21, a wcześniejsze badania potwierdziły jego działanie neuroprotekcyjne: odgrywa on rolę regulacyjną w progresji glejaków22 i neuroblastomów23, a co istotne, miR-488-3p promuje apoptozę chondrocytów w chorobie zwyrodnieniowej stawów (OA)24. Choć OA i RZS są różnymi chorobami stawów, wykazują wspólne mechanizmy w procesach patologicznych zapalenia błony stawowej i destrukcji chrząstki25. Postawiliśmy hipotezę, że miR-488-3p może odgrywać rolę w RZS poprzez regulację podobnych szlaków docelowych. Jednak specyficzna rola i potencjalne mechanizmy działania miR-488-3p w RZS nie zostały dotąd wyjaśnione.
Badanie analizowało zmiany poziomów ekspresji miR-488-3p w surowicy u pacjentów z RZS oraz jego związek z aktywnością choroby i wskaźnikami klinicznymi, mając na celu ocenę jego potencjalnej wartości jako nieinwazyjnego markera diagnostycznego RZS. Niniejsze badanie dostarcza nowej wiedzy na temat wczesnego przesiewu i przewidywania progresji choroby w RZS, co przyczynia się do poprawy rokowań u pacjentów z RZS.
Protokół
Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Hefei BOE (numer zatwierdzenia 2021–1), a od wszystkich uczestników przed włączeniem do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę.
Pacjenci i próbki
Do badania zakwalifikowano 135 pacjentów z RA (zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami klasyfikacji ACR/EULAR z 2010 r.) z Oddziału Reumatologii i Immunologii szpitala Hefei BOE, 130 pacjentów z OA z Oddziału Ortopedii (zdiagnozowanych zgodnie z kryteriami diagnostycznymi OA Chińskiego Stowarzyszenia Medycznego z 2018 r.) oraz 125 zdrowych osób kontrolnych, dopasowanych pod względem wieku i płci, z centrum badań profilaktycznych tego samego szpitala. Uczestnicy byli w wieku 30–80 lat. W przypadku zdrowej grupy kontrolnej potwierdzono brak chorób autoimmunologicznych, schorzeń stawów oraz ostrych infekcji poprzez szczegółowy wywiad, badanie fizykalne i testy laboratoryjne. Z badania wykluczono uczestników z współistniejącymi chorobami autoimmunologicznymi, historią infekcji lub urazów w ciągu ostatnich 3 miesięcy, chorobami nowotworowymi, a także kobiety w ciąży lub karmiące piersią.
Pobieranie i przygotowanie próbek
Od wszystkich uczestników badania pobrano krew żylną na czczo. Po 30 min krzepnięcia w temperaturze pokojowej, próbki surowicy wyizolowano poprzez wirowanie z prędkością 1500 × g przez 15 min. Surowicę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz.
Wykrywanie markerów klinicznych i serologicznych
Aby kompleksowo ocenić stan choroby i aktywność zapalną, zmierzono kliniczne i serologiczne biomarkery przy użyciu standaryzowanych metod laboratoryjnych. OB zmierzono metodą Westergrena w celu oceny niespecyficznego zapalenia układowego. Poziom CRP oznaczono za pomocą testu immunoturbidymetrycznego (normalna wartość referencyjna: <10 mg/L), aby ocenić odpowiedź zapalną w fazie ostrej. RF zmierzono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), przyjmując normalną wartość referencyjną ≤20 IU/mL. Przeciwciała anty-CCP zmierzono za pomocą testu ELISA drugiej generacji, aby uzyskać serologiczne potwierdzenie diagnozy RZS.
Linie komórkowe i hodowla
Ludzkie synowiocyty fibroblastopodobne od pacjentów z RA (HFLS-RA) hodowano w podłożu Dulbecco's Modified Medium (DMEM) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Komórki utrzymywano w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂; do wszystkich eksperymentów wykorzystano komórki z przejść od trzeciego do szóstego.
Ekstrakcja RNA i ilościowa real-time RT-PCR
Całkowite RNA wyekstrahowano z próbek surowicy przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA. Transkrypcję odwrotną przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, stosując zestaw do syntezy pierwszej nici miRNA dla miRNA oraz zestaw do transkrypcji odwrotnej dla genów docelowych RNA posłańca (mRNA). Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) wykonano przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym z gotową mieszaniną PCR (master mix) opartą na SYBR Green. Program termocyklera ustawiono na wstępną denaturację w 95 °C przez 30 s, a następnie przeprowadzono 40 cykli amplifikacji (denaturacja w 95 °C przez 5 s oraz przyłączanie/elongacja w 60 °C przez 30 s). Każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach. Małe jądrowe RNA U6 (U6 snRNA) oraz dehydrogenaza gliceraldo-3-fosforanowa (GAPDH) służyły odpowiednio jako endogenne geny referencyjne do normalizacji miRNA i mRNA. Sekwencje starterów zestawiono w Supplementary Table 1. Względne poziomy ekspresji miR-488-3p i jego genów docelowych obliczono metodą 2−ΔΔCt. W celu weryfikacji zależności regulacyjnych przeanalizowano również zmiany poziomów mRNA genów docelowych po nadekspresji lub inhibicji miR-488-3p.
Transfekcja komórek
Komórki HFLS-RA wysiano do płytek 6-dołkowych w gęstości 5 × 105 komórek/dołek. Komórki przetransfekowano przy użyciu odczynnika do transfekcji opartego na liposomach zgodnie z instrukcją producenta. Grupy transfekcyjne obejmowały grupy z pojedynczą transfekcją oraz grupy z kotransfekcją. Grupy z pojedynczą transfekcją obejmowały: 1) kontrolę — komórki nietransfekowane; 2) negatywną kontrolę mimiku (NC) — komórki przetransfekowane negatywną kontrolą mimiku miR-488-3p; 3) mimik miR-488-3p — komórki przetransfekowane mimikiem miR-488-3p; 4) NC inhibitora — komórki przetransfekowane negatywną kontrolą inhibitora miR-488-3p; 5) inhibitor miR-488-3p — komórki przetransfekowane inhibitorem miR-488-3p. Grupy z kotransfekcją obejmowały: 1) mimik miR-488-3p + nadekspresja-NC (oe-NC) — komórki kotransfekowane mimikiem miR-488-3p oraz negatywną kontrolą wektorów nadekspresji ROCK1; 2) mimik miR-488-3p + oe-ROCK1 — komórki kotransfekowane mimikiem miR-488-3p oraz wektorami nadekspresji ROCK1. Wszystkie sekwencje transfekcji podsumowano w Tabeli uzupełniającej 1. Wektor nadekspresji ROCK1 przygotowano poprzez klonowanie regionu sekwencji kodującej (CDS) do plazmidu pcDNA 3.1. Przetransfekowane komórki wykorzystano w następnych eksperymentach po 48 h od transfekcji komórek.
Analiza funkcji komórkowych
Test proliferacji komórek (Cell Counting Kit-8 [CCK-8]): Przetransfekowane komórki HFLS-RA zasiano w płytkach 96-dołkowych w zagęszczeniu 5 × 103 komórek/dołek, stosując trzy powtórzenia na grupę. W odstępach 0, 24, 48 i 72 h po transfekcji do każdego dołka dodano 10 µL roztworu CCK-8, a następnie inkubowano w 37 °C przez 2 h. Absorbancję zmierzono przy 450 nm (długość fali detekcji) i 630 nm (długość fali referencyjnej) przy użyciu czytnika mikropłytek. Względną szybkość proliferacji obliczono, przyjmując czas 0 h jako linię bazową.
Wykrywanie apoptozy (cytometria przepływowa): Apoptozę oceniano za pomocą testu apoptozy z wykorzystaniem Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI). Komórki przetransfekowano odpowiednimi plazmidami, a następnie zebrano po trypsynizacji. Stopień apoptozy określono metodą cytometrii przepływowej.
Analiza czynników zapalnych (test enzymatycznego referencyjnego immunosorbenta [ELISA]): Komórki HFLS-RA wysiano do płytek 24-dołkowych i transfektowano wskazanym mimikiem miR-488-3p, inhibitorem miR-488-3p lub odpowiadającymi im kontrolami negatywnymi przez 48 h. Stężenia interleukiny-6 (IL-6), czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) oraz interleukiny-1β (IL-1β) w supernatantach hodowli komórkowych określono ilościowo przy użyciu zestawów ELISA.
Walidacja celu
Przewidywanie celu: Przewidziano, że ROCK1 jest bezpośrednim celem miR-488-3p przy użyciu bazy danych TargetScan26Przewidywane miejsca wiązania między miR-488-3p a ROCK1 3′-region nietranslacyjny (3' UTR)′region nietranslacyjny 3' (UTR) zidentyfikowano również.
Test raportora podwójnej lucyferazy: Dziki typ lub mutant 3′UTR genu ROCK1 został sklonowany do plazmidu pGL3. Przewidywane miejsca wiązania i miejsca zmutowane przedstawiono na Rysunku 4. Komórki HEK- 293T poddano kotransfekcji mimikiem lub inhibitorem miR-488-3p wraz z konstrukcjami wektorowymi27. Aktywność lucyferazy zmierzono 48 h po transfekcji mimikiem lub inhibitorem miR-488-3p.
Immunoprecypitacja RNA (RIP): Komórki HFLS-RA inkubowano z przeciwciałem przeciwko Argonaute 2 (Ago2) (RRID: AB_2882071, rozcieńczenie 1:200) lub kontrolnym przeciwciałem immunoglobuliną G (IgG) (RRID: AB_2819160, rozcieńczenie 1:5000), a następnie przeprowadzono ekstrakcję RNA i ilościową PCR (qPCR) w celu oceny wzbogacenia mRNA ROCK1 zgodnie z powyższym opisem.
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną badania przeprowadzono przy użyciu programów SPSS 23.0 (RRID: SCR_002865) oraz GraphPad Prism 9.0 (RRID: SCR_002798). Dane pomiarowe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Wszystkie eksperymenty wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, a każde powtórzenie biologiczne analizowano w trzech powtórzeniach technicznych. Surowe dane zostały dołączone w materiałach uzupełniających. Przed zastosowaniem parametrycznych testów statystycznych dane oceniono za pomocą wykresu prawdopodobieństwa normalnego (P-P). Do porównania ciągłych zmiennych bazowych (np. wieku, wskaźnika masy ciała [BMI] itp.) zastosowano test t dla prób niezależnych, natomiast dla zmiennych kategorycznych (np. płci itp.) wykorzystano test chi-kwadrat. Poziomy ekspresji genów porównano za pomocą testu t dla prób niezależnych. Zmiany w proliferacji komórek w różnych punktach czasowych analizowano za pomocą analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA), natomiast jednoczynnikową analizę ANOVA zastosowano do porównania wskaźników apoptozy określonych metodą cytometrii przepływowej. Analizę korelacji przeprowadzono z wykorzystaniem testu Spearmana (dla zmiennych nie spełniających rozkładu normalnego) oraz Pearsona (dla zmiennych spełniających rozkład normalny). Skuteczność diagnostyczną oceniono za pomocą analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). Optymalna wartość odcięcia, czułość oraz swoistość zostały określone przy użyciu maksymalnego indeksu Youdena. Wszystkie testy statystyczne były dwustronne, a wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Wyniki
Podstawowa charakterystyka uczestników badania
Badanie to objęło 125 zdrowych osób z grupy kontrolnej, 130 pacjentów z OA oraz 135 pacjentów z RA w celu przeprowadzenia systematycznej analizy (Tabela 1). Nie stwierdzono istotnych różnic w charakterystyce wyjściowej trzech grup pod względem wieku (p = 0,191), stosunku płci (p = 0,203) oraz BMI (p = 0,562), co zapewniło porównywalność populacji badawczej. W odniesieniu do charakterystyki choroby, poziomy OB (82,63 ± 40,32 vs. 18,39 ± 6,38 mm/h, p < 0,01) oraz CRP (56,3 ± 38,07 vs. 10,54 ± 4,98 mg/L, p < 0,01) w grupie RA były istotnie wyższe niż w grupie OA, co odzwierciedlało stopień stanu zapalnego w organizmie. Jednocześnie RF, marker serologiczny związany z RA, był dodatni u 70,37% (95/135) pacjentów, przy istotnie wyższym stężeniu w surowicy (14,13 ± 81,05 vs. 5,10 ± 1,37 IU/mL, p < 0,01); odsetek dodatnich wyników przeciwciał anty-CCP u pacjentów z RA wyniósł 56,30% (76/135), przy wyniku DAS28 wynoszącym 4,12 ± 1,36.
Charakterystyka ekspresji i wartość diagnostyczna miR-48-3p u pacjentów z RA
Poziomy ekspresji miR-488-3p w surowicy były znacząco obniżone u pacjentów z RA w porównaniu z pacjentami z OA i zdrowymi kontrolami (p < 0.01, Rycina 1A). Analiza krzywej ROC wykazała, że miR-48-3p charakteryzuje się wysoką dokładnością diagnostyczną w rozróżnianiu RA od OA i zdrowych kontroli: w rozróżnianiu RA od zdrowych kontroli wartość AUC wyniosła 0,931 (95% CI: 0,896–0,967), czułość wyniosła 96,15% (95% CI: 91,31%–98,35%), a swoistość 80,95% (95% CI: 73,2%–86,85%, p < 0,01, Rycina 1B); natomiast przy rozróżnianiu RA od pacjentów z OA wartość AUC wyniosła 0,80 (95% CI: 0,747–0,854), przy czułości 85,93% (95% CI: 79,06%–90,80%) i swoistości 66,15% (95% CI: 57,6%–73,72%, p < 0,01, Rycina 1C). Wieloczynnikowa analiza regresji logistycznej zidentyfikowała miR-488-3p jako niezależny czynnik związany z ryzykiem RA (OR = 0,16, 95% CI: 0,097–0,284; Tabela 2).
Analiza korelacji miR-488-3p z wskaźnikami klinicznymi RA
Poziomy ekspresji miR-488-3p w surowicy były istotnie ujemnie skorelowane z kluczowymi wskaźnikami klinicznymi RA, w tym z OB, CRP, RF i DAS28 (wszystkie p < 0,01; Tabela 3). Konkretnie, miR-48-3p wykazał ujemną korelację z OB (r = −0,718), CRP (r = −0,726), RF (r = −0,805) oraz wynikiem DAS28 (r = −0,836) (Tabela 3).
Nadekspresja miR-48-3p hamuje proliferację komórek i odpowiedzi zapalne oraz indukuje apoptozę w komórkach HFLS-RA
Aby zbadać wpływ miR-48-3p na funkcje HFLS-RA, zmodyfikowano jego ekspresję poprzez transfekcję mimetykami i inhibitorami. Analiza RT-qPCR potwierdziła, że poziom ekspresji miR-48-3p był znacznie wyższy w grupie z mimetykiem miR-48-3p w porównaniu z grupą kontrolną (p = 0,01), natomiast poziom ekspresji w grupie z inhibitorem miR-48-3p był znacznie niższy (p = 0,03, Rysunek 2A). Test CCK-8 wykazał, że nadekspresja miR-48-3p hamowała proliferację komórek, która była znacznie niższa niż w grupie kontrolnej po 24 h, 48 h i 72 h (p = 0,0208, p < 0,001, p = 0,036), a zahamowanie ekspresji miR-48-3p znacząco zwiększyło proliferację komórek (Rysunek 2B). Cytometria przepływowa wykazała, że nadekspresja miR-48-3p znacząco promowała apoptozę (p = 0,03, Rysunek 2C).
Następnie przeprowadziliśmy test ELISA, aby zbadać wpływ nadekspresji miR-48-3p na poziomy cytokin zapalnych. Wyniki wykazały, że w przypadku nadekspresji miR-48-3p poziomy cytokin zapalnych (IL-6, TNF-α i IL-1β) były znacząco obniżone (p < 0,01, Rycina 3A-C), natomiast hamowanie ekspresji miR-48-3p wywołało efekt przeciwny. Te istotne efekty regulacyjne zostały potwierdzone we wszystkich trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych, a kontrole negatywne nie wykazały istotnych zmian (p > 0,05).
MiR-488-3p reguluje ekspresję cząsteczek ROCK1
Aby wyjaśnić molekularne mechanizmy leżące u podstaw roli miR-48-3p w progresji reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), zbadaliśmy cele downstream miR-48-3p. Analizy bioinformatyczne wykazały, że miR-48-3p prawdopodobnie wiąże się z regionem 3'UTR genu ROCK1 (Rycyna 4A). Podwójny test reporterowy lucyferazy potwierdził, że aktywność lucyferazy była znacznie obniżona, gdy dziki typ 3'UTR ROCK1 został współtransfekowany z mimetykami miR-48-3p (p < 0,001), natomiast aktywność lucyferazy była znacznie zwiększona po zahamowaniu ekspresji miR-48-3p (p < 0,001); podczas gdy po zmutowaniu miejsca wiązania nie zaobserwowano istotnych zmian w tym efekcie regulacyjnym (Rycina 4B). Eksperymenty RIP dodatkowo zweryfikowały tę relację regulacyjną, wykazując, że poziom ekspresji mRNA ROCK1 był znacznie wyższy w kompleksach wzbogaconych przeciwciałem Ago2 w porównaniu z kontrolami IgG (p < 0,001, Rycina 4C).
Dodatkowo w próbkach klinicznych ROCK1 wykazał wzorzec ekspresji przeciwny do miR-48-3p, gdzie zaobserwowano istotny wzrost ekspresji ROCK1 zarówno w stosunku do pacjentów z OA, jak i zdrowych kontroli (Rysunek 4D). W komórkach HFLS-RA analiza RT-qPCR wykazała, że nadekspresja miR-48-3p doprowadziła do istotnego spadku ekspresji ROCK1 (p = 0,093), podczas gdy inhibicja miR-48-3p znacząco zwiększyła ekspresję ROCK1 (p = 0,003, Rysunek 4E).
ROCK1 pośredniczy w efektach regulacyjnych miR-48-3p w komórkach HFLS-RA
W komórkach HFLS-RA supresja ekspresji ROCK1 spowodowana nadekspresją miR-48-3p została odwrócona poprzez transfekcję wektorami nadekspresyjnymi ROCK1 (Ryc. 5A). Podobnie, hamujący wpływ nadekspresji miR-48-3p na proliferację komórek został osłabiony przez nadekspresję ROCK1 (Ryc. 5B). Co więcej, nadekspresja ROCK1 odwróciła również zwiększoną apoptozę indukowaną przez miR-48-3p (Ryc. 5C) i przywróciła poziomy cytokin zapalnych, które zostały stłumione przez nadekspresję miR-48-3p (Ryc. 5D).
Rysunek 1. Poziomy ekspresji i wartość diagnostyczna miR-488-3p u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RA), chorobą zwyrodnieniową stawów (OA) oraz w grupie kontrolnej osób zdrowych. (A) Porównanie względnych poziomów ekspresji miR-488-3p u pacjentów z RZS, pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów oraz w grupie kontrolnej osób zdrowych. (B) Analiza krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla miR-48-3p w celu odróżnienia RA od zdrowych kontroli. (C) Analiza krzywej ROC dla miR-488-3p w celu odróżnienia pacjentów z RZS od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. AUC, pole pod krzywą; CI, przedział ufności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2. Efekty funkcjonalne miR-48-3p w komórkach HFLS-RA. (A) Względnia ekspresja miR-48-3p w transfektowanych komórkach HFLS-RA określona za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). (B) Wpływ nadekspresji i inhibicji miR-48-3p na proliferację komórek. (C) Wpływ nadekspresji i inhibicji miR-48-3p na apoptozę. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Wszystkie pomiary wykonano z wykorzystaniem trzech powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało trzy powtórzenia techniczne. p < Wartość 0,05 wskazuje na statystycznie istotną różnicę między wskazanymi grupami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3. Wpływ miR-488-3p na wydzielanie cytokin zapalnych. (A) Interleukina 6 (IL-6). (B) czynnik martwicy nowotworów-α (TNF-α). (C) Interleukina-1β (IL-1β). Stężenia cytokin zmierzono za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Dane przedstawiono jako średnią ± SD. Wszystkie pomiary przeprowadzono z zastosowaniem trzech powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało trzy powtórzenia techniczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4Walidacja mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw regulacji ROCK1 ukierunkowanej na miR-48-3p. (A) Przewidywane miejsce wiązania miR-48-3p w obrębie 3′-niezakodowanego regionu (3′UTR) genu ROCK1. (B) Podwójny test reporterowy lucyferazy wykazujący oddziaływanie między miR-48-3p a 3′UTR ROCK1 typu dzikiego lub zmutowanym. (C) Analiza immunoprecypitacji RNA (RIP) wykazująca wzbogacenie matrycowego RNA (mRNA) białka ROCK1 w kompleksach wzbogaconych przeciwciałem przeciwko białku Argonaute 2 (Ago2). (D) Względne poziomy ekspresji ROCK1 u pacjentów z RZS, pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów oraz w grupie kontrolnej osób zdrowych. (E) Względna ekspresja ROCK1 w transfektowanych komórkach HFLS-RA określona za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Wszystkie pomiary wykonano z użyciem trzech powtórzeń biologicznych, z których każde obejmowało trzy powtórzenia techniczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5Udział ROCK1 w regulacji komórek HFLS-RA przez miR-48-3p. (A) Regulacja ekspresji ROCK1 w komórkach HFLS-RA po transfekcji komórek. (B) Wpływ nadekspresji ROCK1 na proliferację komórek w warunkach nadekspresji miR-48-3p. (C) Wpływ nadekspresji ROCK1 na apoptozę w warunkach nadekspresji miR-48-3p. (D) Wpływ nadekspresji ROCK1 na produkcję cytokin prozapalnych przy nadekspresji miR-48-3p. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Wszystkie pomiary wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, z trzema powtórzeniami technicznymi dla każdego z nich. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Zmienna | Kontrola (n = 125) | OA (n = 130) | RA (n = 135) | pwartość p |
| Wiek (lata) | 55.10 ± 9.30 | 57.21 ± 10.27 | 55.22 ± 11.61 | 0.191 |
| Płeć (męska/żeńska) | 74/51 | 63/67 | 69/66 | 0.203 |
| BMI (kg/m²2) | 22.79 ± 1.73 | 22.98 ± 1.98 | 23.04 ± 2.05 | 0.562 |
| Czas trwania choroby (lata) | - | 7.96 ± 4.00 | 8.03 ± 3.83 | 0.882 |
| Dodatni wynik przeciwciał anty-CCP (n/%) | - | - | 76 (56.30) | - |
| OB (mm/h) | 18.39 ± 6.38 | 82.63 ± 40.32 | <0.001 | |
| CRP (mg/L) | 10.54 ± 4.98 | 56.33 ± 38.07 | <0.001 | |
| RF-dodatni | - | - | 95 (70.37) | |
| RF (IU/ml) | - | 5.10 ± 1.37 | 144.13 ± 81.05 | <0.001 |
| DAS28 | - | - | 4.12 ± 1.36 | - |
Tabela 1: Charakterystyka wyjściowa uczestników badania. Trzy grupy badawcze były porównywalne pod względem cech demograficznych. U pacjentów z RA stwierdzono podwyższony poziom markerów zapalnych oraz RF.
| Zmienna | lub | 95% przedział ufności | pwartość p |
| Wiek (lata) | 1.411 | 0.822–2.422 | 0.211 |
| Płeć (mężczyzna/kobieta) | 1.209 | 0.707–2.067 | 0.489 |
| BMI (kg/m²)2) | 1.336 | 0.778–2.295 | 0.293 |
| Czas trwania choroby (lata) | 1.13 | 0.663–1.929 | 0.653 |
| MiR-483-3p | 0.166 | 0.097–0.284 | <0.001 |
Tabela 2: Niezależne czynniki powiązane z progresją choroby zwyrodnieniowej stawów do reumatoidalnego zapalenia stawów, wyznaczone na podstawie wieloczynnikowej regresji logistycznej. Stwierdzono, że MiR-48-3p wiąże się z ryzykiem rozwoju RZS u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.
| Elementy | MiR-48-3p (Reumatoidalne zapalenie stawów) | pwartość p |
| Korelacja(r) | ||
| OB (mm/h) | -0.718 | <0.001 |
| CRP (mg/L) | -0.726 | <0.001 |
| RF (IU/ml) | -0.805 | <0.001 |
| DAS28 | -0.836 | <0.001 |
Tabela 3: Korelacje między miR-48-3p a cechami kliniczno-patologicznymi u pacjentów z RA. miR-488-3p wykazywał istotną ujemną korelację z ESR, CRP, RF oraz wynikiem DAS28 u pacjentów z RA.
Tabela uzupełniająca 1. Informacje o sekwencjach użytych w transfekcji komórek i analizie PCR. Podsumowano sekwencje starterów oraz odczynniki do transfekcji wykorzystane w badaniu.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Jak podkreślili Smolen i wsp.1 w najnowszych wytycznych dotyczących diagnostyki i leczenia RA, opracowanie nowych biomarkerów ma istotną wartość kliniczną. W niniejszym badaniu potwierdziliśmy, że poziom serum miR-488-3p był znacząco obniżony u pacjentów z RA i wykazał obiecującą skuteczność diagnostyczną, z relatywnie zadowalającą czułością i swoistością. Wczesna diagnostyka RA od zawsze stanowiła trudność kliniczną, a istniejące biomarkery nie są wystarczająco czułe w diagnostyce RA, podczas gdy znaczący potencjał diagnostyczny miR-488-3p może wypełnić tę lukę, szczególnie w przypadku identyfikacji pacjentów z seronegatywnym RA. W porównaniu z osobami zdrowymi pacjenci z RA wykazywali bardziej nasilony stan zapalny układowy. Podczas gdy u pacjentów z OA dominuje miejscowe zwyrodnienie stawów, często obserwuje się niskostopniowy stan zapalny układowy. Zatem efektywność różnicująca miR-488-3p jest znacznie wyższa w porównaniu z osobami zdrowymi niż w porównaniu z pacjentami z OA. Skuteczność diagnostyczna miR-488-3p nie była bezpośrednio porównywana ze skutecznością uznanych biomarkerów klinicznych. Pacjenci włączeni do tego badania zostali zdiagnozowani zgodnie z aktualnym klinicznym złotym standardem dla RA, który obejmuje uznane biomarkery, takie jak przeciwciała anty-CCP, RF, ESR i CRP. Znaczące różnice w tych markerach zaobserwowano pomiędzy pacjentami z OA a RA (Tabela 1). Dlatego ta kohorta nie była odpowiednia do bezpośredniego porównania skuteczności diagnostycznej miR-488-3p z tymi uznanymi biomarkerami. Takie porównania wymagają niezależnej kohorty walidacyjnej.
Dodatkowo stwierdzono, że poziomy ekspresji miR-488-3p są istotnie ujemnie skorelowane z różnymi wskaźnikami klinicznymi RA, w tym z systemowymi markerami stanu zapalnego (ESR, CRP)28 oraz autoprzeciwciałami (RF)6. Szczególnie istotne klinicznie jest to, że miR-488-3p wykazał silną ujemną korelację z wskaźnikiem aktywności choroby (DAS28). DAS28 jest złożonym indeksem odzwierciedlającym aktywność choroby na podstawie obrzęku stawów, tkliwości, stanu zapalnego oraz stanu klinicznego pacjentów. W związku z tym wyniki te sugerują, że miR-488-3p może służyć jako potencjalny biomarker aktywności choroby w RA. Wspiera to również tezę o jego roli regulacyjnej w patogenezie RA i wskazuje, że może on wpływać na progresję choroby poprzez hamowanie szlaków sygnalizacji zapalnej lub odpowiedzi autoimmunologicznych29.
W eksperymentach funkcjonalnych stwierdzono, że miR-488-3p hamował proliferację i promował apoptozę komórek HFLS-RA pobranych od pacjentów z RA oraz znacząco redukował produkcję cytokin zapalnych (IL-6, TNF-α oraz IL-1β). Komórki HFLS-RA odgrywają kluczową rolę w procesie patologicznym RA30, a ich aberrantna proliferacja i wzrost inwazyjny mogą prowadzić do hiperplazji błony maziowej i destrukcji stawów, podczas gdy nadprodukcja czynników zapalnych dodatkowo nasila miejscowe i systemowe odpowiedzi zapalne31. Zatem regulacja funkcji HFLS-RA przez miR-488-3p może bezpośrednio hamować inwazję maziową i erozję kostną w RA, stanowiąc teoretyczną podstawę do opracowania nowych celowanych strategii terapeutycznych. Wcześniejsze badania wykazały, że inne miRNA, takie jak miR-155, mogą wpływać na progresję RA poprzez regulację funkcji synowiocytów19, co stanowi dalsze potwierdzenie naszych wyników.
Badania mechanistyczne wykazały, że miR-488-3p może bezpośrednio celować w ROCK1 i hamować jego ekspresję poprzez wiązanie się z jego 3'UTR. ROCK1 jest kluczową cząsteczką efektorową szlaku sygnalizacyjnego Rho/ROCK, który uczestniczy w reorganizacji cytoszkieletu, odpowiedzi zapalnej i włóknieniu32. Wcześniejsze badania wykazały, że ROCK1 jest wysoce eksprimowany w synowiocytach w RA i promuje ich migrację oraz inwazję33. Zgodnie z oczekiwaniami, nadekspresja ROCK1 znacząco odwróciła działanie miR-488-3p w komórkach HFLS-RA, co wskazuje na jego udział w roli regulacyjnej miR-488-3p w progresji RA.
Niemniej jednak, w przyszłych badaniach należy przeprowadzić jeszcze wiele prac. Ekspresję miR-488-3p w próbkach klinicznych oceniono za pomocą RT-qPCR, wykorzystując U6 jako referencję wewnętrzną. Wcześniejsze badania dostarczyły sprzecznych wyników dotyczących stabilności U6, zwłaszcza w próbkach krążących, takich jak surowica. Choć w niniejszym badaniu przeprowadzono wstępne eksperymenty w celu zapewnienia stabilności U6, jej potencjalna zmienność wciąż stanowi ograniczenie, co zwiększa ryzyko błędnej diagnozy. Wskazana jest dalsza walidacja z wykorzystaniem bardziej stabilnych genów referencyjnych. Z drugiej strony, ocena kliniczna miR-488-3p opierała się na kohorcie z jednego ośrodka, bez walidacji zewnętrznej. Wielkość próby była stosunkowo mała i ograniczona do skali szpitalnej. Ponadto zabrakło długoterminowej obserwacji pozwalającej ocenić wartość prognostyczną miR-488-3p. Ograniczenia te powinny zostać rozwiązane w przyszłych badaniach. Ponadto niektóre badania wykazują, że dostarczanie miRNA in vivo pozostaje głównym wyzwaniem dla translacji klinicznej34. Przyszłe badania mogłyby potwierdzić potencjał terapeutyczny miR-488-3p in vivo poprzez stworzenie myszy z warunkowym nokautem lub zastosowanie systemów celowanego dostarczania, takich jak nanonośniki35.
Podsumowując, niniejsze badanie wykazało potencjalną wartość miR-488-3p w diagnostyce oraz jako potencjalny cel terapeutyczny w RZS. miR-488-3p wykazał wysoką skuteczność diagnostyczną oraz hamował proliferację i odpowiedzi zapalne komórek HFLS-RA, jednocześnie promując apoptozę. Sugeruje to, że może on stanowić obiecujący cel dla opracowania nowych strategii terapeutycznych w RZS. Przyszłe badania powinny skupić się na: 1) walidacji stabilności diagnostycznej miR-488-3p w dużych kohortach wieloośrodkowych, 2) zbadaniu jego efektów synergistycznych z istniejącymi lekami terapeutycznymi, takimi jak inhibitory JAK lub leki biologiczne28, oraz 3) optymalizacji systemów dostarczania miRNA w celu poprawy ich wykonalności w translacji klinicznej36.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Surowe dane stanowiące podstawę wyników niniejszego badania są dostępne w materiałach uzupełniających przesłanych wraz z tym manuskryptem.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Bioscience | 556547 | apoptoza komórek |
| przeciwciało anty-Ago2 | Proteintech | 66720-1-Ig | immunoprecypitacja RNA |
| roztwór CCK-8 | Dojindo | CK04 | proliferacja komórek |
| podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher | 121000146 | hodowla komórkowa |
| płodowa surowica bydlęca | Thermo Fisher | 10437028 | hodowla komórkowa |
| Cytometr przepływowy | BD Bioscience | FACSCalibur | apoptoza komórek |
| Zestaw ELISA do przeciwciał anty-CCP człowieka | Cusabio | CSB-E09077h | wykrywanie anty-CCP |
| Zestaw ELISA do RF-IgA człowieka | Feien Biotechnology | EH4270 | wykrywanie RF |
| ludzkie synowiocyty podobne do fibroblastów w reumatoidalnym zapaleniu stawów (HFLS-RA) | Cell Applications | HFLS-RA-200 | walidacja in vitro funkcji miR-488-3p |
| przeciwciało kontrolne IgG | Abcam | ab205718 | immunoprecypitacja RNA |
| Zestaw ELISA do interleukiny-1β (IL-1β) | R&D Systems | DY201-05 | stężenie komórkowej IL-1β |
| Zestaw ELISA do interleukiny-6 (IL-6) | R&D Systems | D6050B | stężenie komórkowej IL-6 |
| Liposome Transfection Reagent 3000 | Ingenuity Life Technologies | L3000015 | transfekcja komórek |
| Czytnik mikropłytek | BioTek | ELx808 | test ELISA |
| Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 638313 | transkrypcja odwrotna |
| podłoże Opti-MEM | Ingenuity Life Technologies, Inc | 31985070 | transfekcja komórek |
| pcDNA 3.1 | Invitrogen | V790-20 | nadekspresja ROCK1 |
| Penicylina-streptomycyna | Thermo Fisher | 15140122 | hodowla komórkowa |
| System laboratoryjny Phadia 250 | Thermo Fisher | Phadia 250 | analiza krwi |
| PrimeScriptTM Reverse Transcription Kit | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | RR037A | transkrypcja odwrotna |
| jodek propidyny (PI)/ rybonukleaza (RNaza) | BD Bioscience | 550825 | apoptoza komórek |
| System QuantStudio 5 | Applied Biosystems, Inc. | A28138 | test PCR |
| odczynnik RNAiso Plus | Nihonbao Bioengineering Co., Ltd. | 9108 | izolacja RNA |
| SYBR Green Premix Ex Taq | Nippon Poh Bio-Engineering Co., Ltd. | RR420A | amplifikacja PCR |
| Baza danych TargetScan | TargetScan | N/A | predykcja miejsc wiązania, (https://www.targetscan.org/) |
| Tina-quant C-Reactive Protein IV | Roche Diagnostics | 7876033190 | wykrywanie CRP |
| Zestaw ELISA do czynnika martwicy nowotworów-α (TNF-α) | R&D Systems | DY210-05 | stężenie komórkowego TNF-α |
Bibliografia
- Smolen JS, et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 2018;4:18001.
- Kook HY, et al. Serum miR-214 as a novel biomarker for ankylosing spondylitis. Int J Rheum Dis. 2019;22(7):1196-201.
- Alamanos Y, Voulgari PV, Drosos AA. Incidence and prevalence of rheumatoid arthritis, based on the 1987 American College of Rheumatology criteria: a systematic review. Semin Arthritis Rheum. 2006;36(3):182-8.
- van der Linden MPM, et al. Long-term impact of delay in assessment of patients with early arthritis. Arthritis Rheum. 2010;62(12):3537-46.
- Anderson J, et al. Rheumatoid arthritis disease activity measures: American College of Rheumatology recommendations for use in clinical practice. Arthritis Care Res (Hoboken). 2012;64(5):640-7.
- Aletaha D, et al. 2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2569-81.
- Yang J, et al. MicroRNA-488: a miRNA with diverse roles and clinical applications in cancer and other human diseases. Biomed Pharmacother. 2023;165:115115.
- Molendijk M, Hazes JMW, Lubberts E. From patients with arthralgia, pre-RA and recently diagnosed RA: what is the current status of understanding RA pathogenesis? RMD Open. 2018;4(1):e000256.
- van Venrooij WJ, van Beers JJBC, Pruijn GJM. Anti-CCP antibodies: the past, the present and the future. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(7):391-8.
- Szodoray P, et al. Anti-citrullinated protein/peptide autoantibodies in association with genetic and environmental factors as indicators of disease outcome in rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev. 2010;9(3):140-3.
- Filer A, et al. Utility of ultrasound joint counts in the prediction of rheumatoid arthritis in patients with very early synovitis. Ann Rheum Dis. 2011;70(3):500-7.
- Zuo C, Fan P, Yang Y, Hu C. MiR-488-3p facilitates wound healing through CYP1B1-mediated Wnt/β-catenin signaling pathway by targeting MeCP2. J Diabetes Investig. 2024;15(2):145-58.
- Mendell JT, Olson EN. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 2012;148(6):1172-87.
- Cai Z, Poulos RC, Liu J, Zhong Q. Machine learning for multi-omics data integration in cancer. iScience. 2022;25(2):103798.
- Fabian MR, Sonenberg N. The mechanics of miRNA-mediated gene silencing: a look under the hood of miRISC. Nat Struct Mol Biol. 2012;19(6):586-93.
- Duroux-Richard I, et al. Circulating miRNA-125b is a potential biomarker predicting response to rituximab in rheumatoid arthritis. Mediators Inflamm. 2014;2014:342524.
- Zakeri Z, et al. MicroRNA and exosome: key players in rheumatoid arthritis. J Cell Biochem. 2019;120(7):10930-44.
- Pauley KM, et al. Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients. Arthritis Res Ther. 2008;10(4):R101.
- Kurowska-Stolarska M, et al. MicroRNA-155 as a proinflammatory regulator in clinical and experimental arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(27):11193-8.
- Pers YM, et al. miR-155 contributes to the immunoregulatory function of human mesenchymal stem cells. Front Immunol. 2021;12:624024.
- Fu Q, et al. miR-488-3p alleviates neuropathic pain by regulating target gene ROCK1. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2023;83(3):271-9.
- Xue W, et al. PVT1 regulates the malignant behaviors of human glioma cells by targeting miR-190a-5p and miR-488-3p. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2018;1864(5 Pt A):1783-94.
- Muiños-Gimeno M, et al. Human microRNAs miR-22, miR-138-2, miR-148a, and miR-488 are associated with panic disorder and regulate several anxiety candidate genes and related pathways. Biol Psychiatry. 2011;69(6):526-33.
- Le TD, Zhang J, Liu L, Li J. Computational methods for identifying miRNA sponge interactions. Brief Bioinform. 2017;18(4):577-90.
- Scanzello CR, Goldring SR. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 2012;51(2):249-57.
- McGeary SE, et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 2019;366(6472):eaav1741.
- Liu X, et al. Impaired AGO2/miR-185-3p/NRP1 axis promotes colorectal cancer metastasis. Cell Death Dis. 2021;12(4):390.
- Smolen JS, Aletaha D, McInnes IB. Rheumatoid arthritis. Lancet. 2016;388(10055):2023-38.
- O'Connell RM, Rao DS, Baltimore D. microRNA regulation of inflammatory responses. Annu Rev Immunol. 2012;30:295-312.
- Bottini N, Firestein GS. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 2013;9(1):24-33.
- Firestein GS, McInnes IB. Immunopathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 2017;46(2):183-96.
- Amano M, Nakayama M, Kaibuchi K. Rho-kinase/ROCK: a key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton (Hoboken). 2010;67(9):545-54.
- Peng H, et al. ROCK1 induces endothelial-to-mesenchymal transition in glomeruli to aggravate albuminuria in diabetic nephropathy. Sci Rep. 2016;6:20304.
- van der Meel R, et al. Smart cancer nanomedicine. Nat Nanotechnol. 2019;14(11):1007-17.
- Yin H, et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat Rev Genet. 2014;15(8):541-55.
- Setten RL, Rossi JJ, Han SP. The current state and future directions of RNAi-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(6):421-46.