Badanie to wykazało, że poziom LUS oraz serum miR-486-3p był podwyższony u noworodków z zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Ich łączna ocena poprawiła przewidywanie ciężkości przebiegu choroby oraz rokowań, a miR-486-3p regulował funkcję komórek w modelu ARDS poprzez celowanie w Delta-Like Canonical Notch Ligand 4.
Artykuł badawczy
Wartość prognostyczna punktacji ultrasonografii płuc oraz stężenia miR-486-3p w surowicy w noworodkowym zespole ostrej niewydolności oddechowej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem niniejszego badania była ocena wartości prognostycznej wyniku ultrasonografii płuc (LUS) oraz surowiczego miR-486-3p w przebiegu noworodkowego zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) oraz zbadanie leżącego u podstaw mechanizmu. Do badania zakwalifikowano łącznie 112 noworodków z ARDS oraz 100 zdrowych niemowląt urodzonych w tym samym okresie, które utworzyły odpowiednio grupę badawczą i grupę kontrolną. Każdy noworodek został poddany ultrasonografii płuc w ciągu 6 h od przyjęcia na oddział intensywnej terapii w celu oceny LUS. Do ilościowego oznaczenia ekspresji genów wykorzystano qRT-PCR, natomiast w celu oceny skuteczności prognostycznej i korelacji przeprowadzono analizę krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) oraz analizę korelacji Pearsona. Ponadto, w celu zbadania mechanizmu działania miR-486-3p, z wykorzystaniem HPMECs stworzono model ARDS in vitro. Przeprowadzono test reporterowy z podwójną lucyferazą, aby zweryfikować relację docelową między miR-486-3p a Delta-Like Canonical Notch Ligand 4 (DLL4). Wyniki wykazały, że LUS oraz poziom surowiczego miR-486-3p były znacząco podwyższone u noworodków z ARDS. Analiza krzywej ROC wykazała, że zarówno miR-486-3p, jak i LUS mogą przewidywać rokowanie noworodków z ARDS (odpowiednio AUC = 0,883 i 0,873, czułość: 96,4% i 89,3%, swoistość: 77,4% i 73,8%), a połączenie miR-486-3p z LUS dawało lepszy efekt prognostyczny (AUC = 0,929, czułość: 92,9%, swoistość: 84,5%). Pod względem mechanistycznym miR-486-3p oddziaływał na DLL4, regulując funkcje biologiczne komórek w modelu ARDS. Podsumowując, łączna ocena LUS i surowiczego miR-486-3p może stanowić obiecującą metodę oceny ciężkości choroby i przewidywania rokowań u noworodków z ARDS. W celu potwierdzenia powszechnej przydatności tej metody konieczna jest dalsza walidacja wieloośrodkowa.
Wprowadzenie
Noworodkowy zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) jest zagrażającym życiu krytycznym zaburzeniem oddechowym, charakteryzującym się przede wszystkim upośledzeniem funkcji surfaktantu pęcherzykowego, co stwarza ogromne ryzyko dla przeżywalności noworodków1,2. Mimo opracowania różnych metod leczenia, ogólne rokowanie dla dotkniętych noworodków pozostaje niezadowalające3. Wczesna identyfikacja ciężkości choroby i dokładna ocena rokowań są zatem niezbędne dla optymalizacji interwencji klinicznych i poprawy wyników pacjentów. Po rozwinięciu się ARDS funkcja płuc noworodka zostaje poważnie upośledzona, co towarzyszy zaburzeniom wentylacji i wymiany gazowej4. USG płuc może być uznane za podstawową metodę obrazowania do monitorowania wentylacji w ARDS5. Stało się ono preferowanym przyłóżkowym narzędziem obrazującym do monitorowania zmian w płucach w ARDS, a skala USG płuc (LUS) jest szeroko stosowana do diagnozowania ostrych chorób oddechowych noworodków oraz oceny ciężkości choroby i rokowań w warunkach intensywnej opieki6. Jednak pojedyncze badanie obrazowe lub laboratoryjne posiada wrodzone wady i nie może w pełni zaspokoić potrzeb oceny klinicznej7. Dlatego też poszukiwanie nowych biomarkerów w celu stworzenia zintegrowanego systemu oceny ma ogromne znaczenie kliniczne.
MikroRNA (miRNA) stanowią nową klasę czynników regulacyjnych genów, które odgrywają kluczową rolę w patogenezie ARDS8. Na przykład obniżona ekspresja miR-141-3p jest ściśle powiązana z ciężkością przebiegu włóknienia płuc oraz uszkodzenia płuc9. miR-124-3p jest czynnikiem ochronnym w ARDS poprzez celowanie w p6510. Wcześniejsze badania z wykorzystaniem sekwencjonowania wysokoprzepustowego potwierdziły, że miR-486-3p jest istotnie nadekspresowany u pacjentów z ARD11. Niedawne badania wskazały oś hsa_circ_0006892/miR-486-3p jako potencjalny mechanizm molekularny zaangażowany w rozwój ARDS12. Wyniki te sugerują, że miR-486-3p jest ściśle powiązany z ARDS. Niemniej jednak wartość prognostyczna i predykcyjna miR-486-3p w odniesieniu do ciężkości i wyników ARDS u noworodków wciąż wymaga pełnego wyjaśnienia.
Obecnie głównymi metodami oceny ARDS u noworodków są radiografia klatki piersiowej, analiza gazów krwi oraz detekcja pojedynczego biomarkera. Obrazowanie klatki piersiowej wiąże się z ekspozycją na promieniowanie i nie umożliwia monitorowania w czasie rzeczywistym w sposób powtarzalny. Analiza gazów krwi odzwierciedla jedynie ostrą funkcję oddechową i nie posiada wartości prognostycznej dla długoterminowych wyników. Detekcja pojedynczego mikroRNA dostarcza obiektywnych wyników ilościowych, ale nie odzwierciedla zmian morfologicznych tkanki płucnej w czasie rzeczywistym. W porównaniu z tymi konwencjonalnymi podejściami, połączenie LUS i surowiczego miR-486-3p integruje zalety obrazowania przy łóżku pacjenta i detekcji molekularnej.
Niniejsze badanie skoncentrowano na noworodkach spełniających kryteria ARDS, a nie na klasycznym RDS wynikającym z niedoboru surfaktantu. W związku z tym badanie ma na celu ocenę, czy wyjściowe badanie LUS oraz poziom miR-486-3p w surowicy pozwalają przewidzieć krótkoterminową śmiertelność w przebiegu ARDS u noworodków. Celem tych badań jest dostarczenie cennych danych, które usprawnią kliniczną ocenę stanu choroby oraz krótkoterminową ocenę prognostyczną w przypadku ARDS u noworodków.
Protokół
Badanie to otrzymało zgodę etyczną od Komisji Etyki Medycznej Pierwszego Szpitala Ludowego w Yongkang, w ścisłej zgodności z Deklaracją Helsińską.
Obiekty badań
To jednorodne, obserwacyjne badanie kohortowe z komponentem eksperymentalnym in vitro zostało przeprowadzone między styczniem 2022 r. a grudniem 2023 r. Do badania w First People's Hospital of Yongkang włączono łącznie 112 kolejnych noworodków z diagnozą ARDS. W celach porównawczych jako grupę kontrolną zrekrutowano zdrowe niemowlęta urodzone w tym samym okresie, bez historii asfiksji lub stresu wewnątrzmacicznego.
Kryteria włączenia:
Wszyscy uczestnicy spełniali kryteria diagnostyczne noworodkowego zespołu niewydolności oddechowej, zgodnie z wytycznymi z Montreux (edycja z 2017 r.). Diagnozę potwierdzono za pomocą obrazowania i oceny klinicznej: badania rentgenowskie wykazały rozlane zacienienia w obu płucach zgodne z obrzękiem płuc, a echokardiografia nie wykazała oznak nadciśnienia w lewym przedsionku, co pozwoliło wykluczyć kardiogenny obrzęk płuc. Dodatkowe kryteria obejmowały nagły początek objawów oraz konieczność wentylacji mechanicznej przez ponad 3 dni, przy braku ciężkich infekcji pozapłucnych. Od rodzin noworodków uzyskano stosowną świadomą zgodę.
Kryteria wykluczenia:
Z badania wykluczono noworodki z pierwotnym niedoborem surfaktantu pęcherzykowego, wrodzoną wadą serca, zaburzeniami metabolicznymi lub innymi istotnymi schorzeniami podstawowymi. Ponadto wykluczono niemowlęta z malformacjami płuc lub klatki piersiowej oraz innymi poważnymi wadami wrodzonymi. Wykluczono również noworodkowy zespół niewydolności oddechowej (RDS).
Dane kliniczne
Dla wszystkich uczestników udokumentowano wiek gestacyjny, płeć, masę urodzeniową przy przyjęciu oraz charakterystykę matki. Każdy noworodek został poddany ultrasonografii płuc w ciągu 6 h od przyjęcia na oddział intensywnej terapii i oceniony pod kątem LUS. Wynik LUS oceniano w skali do maksymalnie 36 punktów, gdzie wyższa punktacja wskazywała na większe nasilenie objawów płucnych. Próbki krwi pobierano natychmiast po przyjęciu w ramach wstępnej oceny klinicznej i przed jakąkolwiek główną interwencją terapeutyczną (np. ponownym podaniem surfaktantu, zmianą trybu wentylacji na bardziej agresywny lub włączeniem leków wazopresyjnych). Próbki krwi od zdrowych noworodków pobrano w momencie ich włączenia do badania. W celu izolacji surowicy krew pełną umieszczano w probówkach z separatorem surowicy i pozostawiano w spoczynku w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby umożliwić całkowite krzepnięcie. Następnie próbki wirowano przy 1500 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Górny, przejrzysty nadsącz surowicy został ostrożnie odessany, podzielony na aalikwoty do sterylnych fiolek kriogenicznych i natychmiast przechowywany w zamrażarce ultra-niskotemperaturowej w -80 °C do późniejszych eksperymentów. Do dalszych doświadczeń wykorzystywano wyłącznie przejrzyste, niehemolizowane próbki surowicy. Zużyte probówki do pobierania krwi oraz pozostałości krwi utylizowano jako odpady medyczne i biologiczne zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi.
Grupowanie
Wszystkich noworodków podzielono na dwie odrębne grupy: grupę lekką (stopnie I–II) oraz grupę ciężką (stopnie III–IV), w oparciu o wstępne wyniki RTG klatki piersiowej oraz stopień ciężkości stanu oceniany 24 h po przyjęciu. Interpretacja zdjęć RTG klatki piersiowej wykazała stopień I, charakteryzujący się obustronnym zmniejszeniem przejrzystości płuc, z drobnymi ogniskami i cieniami siateczkowatymi w obrębie miąższu płuc. Stopień II wskazywał na rozprzestrzenienie się zmian na środkowe i zewnętrzne strefy płuc, z widocznym obrazem bronchogramu powietrznego. W stopniu III stwierdzono istotne zmniejszenie przejrzystości obu płuc, co prowadziło do zatarcia konturów serca i przepony. Stopień IV charakteryzował się wyraźnymi objawami bronchogramu powietrznego, prowadzącymi do niemal całkowitego zacienienia, przypominającego obraz „białego płuca”.
Noworodki z rozpoznaną ARDS poddano kompleksowemu schematowi leczenia po przyjęciu na oddział intensywnej terapii noworodków. Schemat ten obejmował wentylację mechaniczną, sedację, podanie surfaktantu płucnego, terapie przeciwzapalne, wsparcie żywieniowe, pomoc w odkrztuśaniu oraz działania w celu wyrównania płynów. Rozpoznanie ARDS u noworodka stanowiło punkt początkowy badania. Punkty końcowe zdefiniowano jako albo pomyślną rekonwalescencję i wypisanie pacjenta, albo zgon pacjenta w wyniku nieskutecznego leczenia. Na podstawie wyników klinicznych uczestników podzielono na dwie grupy: grupę przeżywających oraz grupę zgonów.
Hodowla i traktowanie komórek
Ludzkie komórki śródbłonka mikrokrążenia płucnego (HPMECs) hodowano w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny. Komórki utrzymywano w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO₂. W celu stworzenia modelu komórkowego ARDS komórki poddano działaniu lipopolisarydu (LPS) w stężeniu 1 mg/L13,14. Prawidłowe ustanowienie modelu potwierdzono, obserwując pod mikroskopem odwróconym niewielki skurcz komórek po traktowaniu LPS. Po zakończeniu eksperymentów zużytą pożywkę hodowlaną, martwe komórki oraz jednorazowe materiały hodowlane zutylizowano jako odpady biologicznie niebezpieczne.
Transfekcja komórek i grupowanie
Komórki HPMEC wysiano na płytki hodowlane i inkubowano aż do osiągnięcia 70% konfluencji przed transfekcją. Kompleksy do transfekcji przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki podzielono na grupy: kontrolę pustą, mimic miR-486-3p, negatywną kontrolę mimic, inhibitor miR-486-3p, negatywną kontrolę inhibitora, mimic miR-486-3p + plazmid nadekspresyjny DLL4 (OE-DLL4) oraz mimic miR-486-3p + pusty plazmid nadekspresyjny (OE-NC). Kompleksy do transfekcji dodano do odpowiednich studzienek i inkubowano przez 4–6 h. Pożywkę zastąpiono świeżą pożywką kompletną i kontynuowano hodowlę przez 24–48 h przed kolejnymi eksperymentami. O pomyślnej transfekcji świadczyła stabilna konfluencja komórek bez nadmiernej śmierci komórkowej.
Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym
Całkowite RNA wyekstrahowano z próbek surowicy oraz hodowlanych komórek przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA. Stężenie i czystość RNA zmierzono spektrofotometrem, a próbki z wartością stosunku A260/A280 w zakresie 1,8–2,1 uznano za odpowiednie do dalszych analiz. Komplementarne DNA (cDNA) zsyntetyzowano przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji. Następnie przeprowadzono ilościową PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z następującymi warunkami cykli: wstępna denaturacja w 95 °C przez 3 min, a następnie 40 cykli: 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s. W celu wykrycia mikroRNA obliczono względną ekspresję miR-486-3p metodą 2-ΔΔCt, przyjmując snRNA U6 jako wewnętrzną referencję. Dla ilościowego oznaczenia mRNA ekspresję DLL4 znormalizowano do mRNA GAPDH przy użyciu tego samego algorytmu 2-ΔΔCt. Sekwencje starterów były następujące: miR-486-3p forward: 5'-GTATGACGGGGCAGCTCAGTA-3' i miR-486-3p reverse: 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3', U6 forward: 5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3' i U6 reverse: 5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'. DLL4 forward: 5'-AGGTGCCACTTCGGTTACAC-3' i DLL4 reverse: 5'-GGGAGAGCAAATGGCTGATA-3', GAPDH forward: 5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3' i GAPDH reverse: 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'.
Test proliferacji komórek CCK-8
Ztransfekowane komórki wysiano do płytek 96-dołkowych w gęstości 1 × 103 komórek na dołek i inkubowano przez 24, 48 oraz 72 h. Następnie odessano pożywkę hodowlaną, a komórki przemyto dwukrotnie 1× PBS. Po tym dodano do każdego dołka 100 µL świeżego 1× PBS oraz 10 µL roztworu CCK-8, a płytki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 2 h. Absorbancję zmierzono przy 450 nm za pomocą czytnika mikroplatek, a proliferację komórek oceniono na podstawie wartości absorbancji. Prawidłowy przebieg testu potwierdzono poprzez zależne od czasu zmiany absorbancji w grupach doświadczalnych.
Analiza apoptozy metodą cytometrii przepływowej
Komórki trawiono 0,25% trypsyną, a otrzymaną zawiesinę komórkową zebrano i odwirowano przy 1500 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Nastawnik usunięto, a osady komórkowe przemyto trzykrotnie schłodzonym 1× PBS. Następnie komórki resuspendowano w 500 µL 1x Binding Buffer, po czym dodano 5 µL Annexin V-FITC oraz 5 µL jodku propidyny (PI). Po delikatnym wymieszaniu próbki inkubowano przez 40 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Apoptozę komórek zmierzono metodą cytometrii przepływowej, a dane przeanalizowano przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej. O poprawnym wykonaniu testu świadczył niski poziom apoptozy w grupie kontrolnej oraz wyraźny wzrost apoptozy w grupie modelu ARDS.
Analiza z użyciem lucyferazy jako reportera
Potencjalne geny docelowe miR-486-3p zidentyfikowano przy użyciu bazy danych TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_72/). Po zidentyfikowaniu przewidywanych miejsc wiązania skonstruowano plazmidy reporterowe lucyferazy typu dzikiego (DLL4-WT) oraz mutanty (DLL4-MUT) zawierające odpowiadające im sekwencje wiążące. Wektory DLL4-WT i DLL4-MUT kotransfekowano do HPMEC wraz z odpowiednio mimetykami lub inhibitorami miR-486-3p. Następnie zmierzono względną aktywność lucyferazy, wykorzystując zestaw do testu reporterowego podwójnej lucyferazy. Sygnały bioluminescencyjne wykryto za pomocą luminometru zgodnie z instrukcją producenta. Pomyślną walidację celu potwierdzono poprzez znaczną redukcję aktywności lucyferazy w grupie DLL4-WT po nadekspresji miR-486-3p.
Szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników, materiałów eksploatacyjnych i sprzętu laboratoryjnego użytych w tym badaniu znajdują się w załączonej Tabeli Materiałów.
Metody statystyczne
Analizy statystyczne i wizualizacje danych wykonano przy użyciu oprogramowania SPSS w wersji 26.0 oraz GraphPad Prism w wersji 9.0. Dane pomiarowe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, a porównania średnich dwóch niezależnych próbek przeprowadzono za pomocą niezależnego testu t. Do porównań trzech lub więcej grup zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) oraz ANOVA z powtarzanymi pomiarami, a następnie test post-hoc Tukeya w celu zidentyfikowania różnic między grupami. Dane kategoryczne przedstawiono jako liczebność (procenty), a porównania między grupami analizowano przy użyciu testu chi-kwadrat. W przypadku danych nieparametrycznych zastosowano test Wilcoxona-Manna-Whitneya. Dodatkowo wykreślono krzywą ROC, aby ocenić wartość prognostyczną poziomu ekspresji miR-486-3p w surowicy oraz LUS w określaniu śmiertelności u pacjentów pediatrycznych z ARDS. Do badania korelacji wykorzystano analizę korelacji Pearsona. Wszystkie grupy eksperymentalne obejmowały trzy niezależne powtórzenia biologiczne i techniczne. Jednostkę statystyczną zdefiniowano jako niezależny eksperyment, przy czym każde powtórzenie biologiczne reprezentowało oddzielną partię hodowli komórkowych pochodzącą z różnych pasażów, natomiast powtórzenia techniczne służyły do redukcji zmienności wewnątrzeksperymentalnej. Najpierw wyciągnięto średnią z powtórzeń technicznych, a następnie przeprowadzono analizę statystyczną w oparciu o wartości średnie z powtórzeń biologicznych. Istotność statystyczną określono jako p < 0,05.
Wyniki
Porównywalne dane wyjściowe między grupami
Ogólna charakterystyka niemowląt włączonych do badania została przedstawiona w Tabeli 1. Nie stwierdzono istotnych różnic w wyjściowej charakterystyce demograficznej między dwiema grupami: wiek gestacyjny (36,07 ± 2,71 vs. 35,72 ± 2,64 tygodni, p = 0,347), odsetek płci męskiej (59,0% vs. 6,1%, p = 0,290), masa urodzeniowa (3,39 ± 0,57 vs. 3,3 ± 0,5 kg, p = 0,437), wiek matki (29,18 ± 4,0 vs. 29,6 ± 4,05 lat, p = 0,387) oraz sposób urodzenia (pochwowy: 54,0% vs. 58,0%; cesarskie cięcie: 46,0% vs. 42,0%, p = 0,54), co wskazuje na porównywalność tych grup. Na podstawie oceny rentgenowskiej klatki piersiowej, w grupie ARDS 72 przypadki (64,3%) sklasyfikowano jako łagodne (stopień I-II), natomiast 40 przypadków (35,7%) sklasyfikowano jako ciężkie (stopień III-IV).
Stopień nasilenia ARDS koreluje z rokowaniami pacjenta
Analiza porównawcza wyników przeżywalności pomiędzy grupą dzieci z ARDS, które przeżyły, a tymi, które zmarły, została przedstawiona w Tabeli 2. Spośród 112 noworodków z diagnozą ARDS, 84 przypadki (75%) zakończyły się przeżyciem, natomiast 28 przypadków (25%) zakończyło się zgonem. Co istotne, nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w wieku niemowląt, płci, masie urodzeniowej, wieku matki, sposobie porodu, charakterystyce płynu owodniowego, etiologii ani innych zmiennych pomiędzy obiema grupami (p > 0.05). Odnotowano jednak istotną różnicę w ciężkości ARDS (p < 0.01), co wskazuje na krytyczny czynnik prognostyczny.
miR-486-3p i LUS są podwyższone w ARDS. Analiza RT-qPCR wykazała, że poziomy miR-486-3p w surowicy były znacząco podwyższone u noworodków z ARDS w porównaniu z grupą kontrolną zdrowych noworodków. Ponadto, w obrębie kohorty z ARDS, grupa z ciężkim przebiegiem wykazywała wyraźnie wyższe poziomy niż grupa z przebiegiem łagodnym (P < 0.01) (Rysunek 1A). Co więcej, LUS był wyższy w grupie z ciężkim ARDS niż w grupie z łagodnym ARDS (p < 0.01) (Rysunek 1B). Przy podziale pacjentów z ARDS według wyników klinicznych, grupa zgonów wykazywała wyraźnie wyższe poziomy LUS i miR-486-3p niż grupa przeżyjących (Rysunek 1C,D). Silna dodatnia korelacja została stwierdzona pomiędzy LUS a poziomem miR-486-3p w surowicy u pacjentów, którzy nie przeżyli (r = 0.832, p <0.01) (Rysunek 1E).
Wykrywanie łączone poprawia prognozowanie rokowań
W oparciu o protokół analizy ROC oceniliśmy wydajność prognostyczną pojedynczych i połączonych wskaźników. Wartości AUC dla LUS i miR-486-3p w przewidywaniu krótkoterminowej śmiertelności wyniosły odpowiednio 0,873 (95% CI: 0,809-0,936) oraz 0,883 (95% CI: 0,82-0,94). Wartości czułości wyniosły 89,3% i 96,4%, natomiast wartości swoistości odpowiednio 73,8% i 7,4%. Optymalne wartości odcięcia dla LUS i miR-486-3p wyniosły odpowiednio 15,500 oraz 1,465. Ponadto wartość AUC dla połączonego modelu predykcyjnego wyniosła 0,929 (95% CI: 0,83-0,975), wykazując czułość 92,9% i swoistość 84,5% przy optymalnej wartości odcięcia 1,659 (Rysunek 1F).
Nadekspresja miR-486-3p upośledza funkcje komórek
Zgodnie z protokołem hodowli komórkowej i interwencji LPS, skonstruowaliśmy in vitro model komórkowy ARDS z wykorzystaniem HPMECs. Wyniki qPCR wykazały, że ekspresja miR-486-3p stopniowo wzrastała w czasie po stymulacji LPS (Rysunek 2A). W celu zbadania wpływu miR-486-3p na komórki modelu ARDS zastosowano nadekspresję lub wyciszenie tego mikroRNA (Rysunek 2B). Zgodnie z protokołami testu CCK-8 i cytometrii przepływowej, określono proliferację i apoptozę komórek. Nadekspresja miR-486-3p znacząco hamowała proliferację komórek i promowała ich apoptozę. Z kolei wyciszenie miR-486-3p łagodziło uszkodzenia komórek wywołane przez LPS (Rysunek 2C,D).
miR-486-3p obniża ekspresję DLL4
Zgodnie z protokołem konstrukcji plazmidów i testu reporterowego z podwójną lucyferazą, zweryfikowano interakcję między miR-486-3p a DLL4. Analiza bioinformatyczna potwierdziła obecność konserwatywnej sekwencji wiązania między miR-486-3p a 3’UTR genu DLL4 (Rycina 3A). Aktywność lucyferazy w grupie z typem dzikim DLL4 uległa znacznemu zmniejszeniu po nadekspresji miR-486-3p, podczas gdy w grupie z mutantem nie zaobserwowano wyraźnych zmian (Rycina 3B), co dowodzi, że DLL4 jest bezpośrednim genem docelowym miR-486-3p. W modelach komórkowych ekspresja DLL4 spadała w sposób zależny od czasu po traktowaniu LPS (Rycina 3C). Manipulacja ekspresją miR-486-3p również negatywnie regulowała poziomy DLL4 (Rycina 3D).
W próbkach klinicznych ekspresja DLL4 była niższa u noworodków z ARDS niż w grupie kontrolnej osób zdrowych i uległa dalszemu obniżeniu w grupie zgonów (Rysunek 3E–F). W grupie pacjentów, którzy nie przeżyli, zaobserwowano ujemną korelację między miR-486-3p a DLL4 (r = -0,795, P < 0,01) (Rysunek 3G). Wszystkie testy qPCR dla DLL4 przeprowadzono w trzech powtórzeniach technicznych, a wyniki były stabilne.
DLL4 odwraca uszkodzenie komórek indukowane przez miR-486-3p
Po przeprowadzeniu protokołu kotransfekcji z użyciem mimiku miR-486-3p oraz plazmidu nadekspresyjnego DLL4, wykonaliśmy eksperymenty z odzyskiwania funkcji (rescue). Analiza qPCR potwierdziła, że ekspresja DLL4 została skutecznie przywrócona po transfekcji OE-DLL4 (Rycyna 4A). Testy funkcjonalne wykazały, że nadekspresja DLL4 częściowo odwróciła hamujący wpływ miR-486-3p na proliferację komórek oraz jego efekt proapoptotyczny (Rycyna 4B,C). Wyniki te wskazują, że miR-486-3p częściowo moduluje aktywność komórkową poprzez celowanie w DLL4.
Dostępność danych:
Wszystkie dane wygenerowane lub przeanalizowane w ramach niniejszego badania zostały udostępnione jako Plik uzupełniający 1.
Rycina 1Porównanie poziomu LUS oraz serum miR-486-3p pomiędzy grupami. (A) Poziomy miR-486-3p w surowicy zdrowych noworodków oraz noworodków z ARDS. (B) Wartości LUS u zdrowych noworodków oraz noworodków z ARDS. (C) Poziomy miR-486-3p w surowicy w grupie przeżycia i grupie zgonów. (D) wartości LUS w grupie przeżycia i grupie zgonów. (E) Analiza korelacji między poziomem miR-486-3p w surowicy a LUS u noworodków z ARDS, które nie przeżyły. (F) Krzywe ROC dla pojedynczego badania LUS, pojedynczego miR-486-3p oraz detekcji łączonej w celu prognozowania rokowania w ARDS u noworodków. Wszystkie dane ilościowe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. *** = p <0,01, w porównaniu z grupą zdrową; ### = p <0,01, w porównaniu z grupą z łagodną postacią ARDS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 2Wpływ miR-486-3p na komórki w modelu ARDS. (A) Zależne od czasu zmiany ekspresji miR-486-3p w HPMEC po traktowaniu LPS. (B) Względnia ekspresja miR-486-3p po interwencji w postaci nadekspresji i wyciszenia. (C) Aktywność proliferacji komórek wykryta za pomocą testu CCK-8 po zmianie ekspresji miR-486-3p. (D) Odsetek apoptozy komórek wyznaczony metodą cytometrii przepływowej po zmianie ekspresji miR-486-3p. Wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Oznaczenia statystyczne: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3Weryfikacja relacji celowania między miR-486-3p a DLL4. (A) Schematyczna reprezentacja przewidywanego miejsca wiązania między miR-486-3p a 3’UTR DLL4. (B) Test reporterowy z podwójną lucyferazą potwierdził relację celowania między miR-486-3p a DLL4. (C) Dynamiczne zmiany ekspresji DLL4 w HPMEC po traktowaniu LPS. (D) Ekspresja DLL4 po nadekspresji lub wyciszeniu miR-486-3p. (E) Poziomy DLL4 w surowicy zdrowych noworodków oraz noworodków z ARDS. (F) Poziomy DLL4 w grupie przeżycia i grupie zgonów noworodków z ARDS. (G) Analiza korelacji między poziomem miR-486-3p w surowicy a poziomem DLL4 u noworodków z ARDS, które nie przeżyły. Wszystkie dane ilościowe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Oznaczenia statystyczne: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0,01 w stosunku do grupy zdrowej, ### = p <0,01 w porównaniu z grupą z łagodną postacią ARDS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4Wpływ miR-486-3p celującego w DLL4 na komórki w modelu ARDS. (A) Wykrycie ekspresji DLL4 po kotransfekcji mimiku miR-486-3p i plazmidu nadekspresyjnego DLL4. (B) Zmiany w aktywności proliferacji komórek po przywróceniu ekspresji DLL4. (C) Zmiany w tempie apoptozy komórek po przywróceniu ekspresji DLL4. Wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Oznaczenia statystyczne: * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.
| Zmienna | Zdrowi (n=10) | RDS noworodkowy (n=12) | pwartość p |
| Wiek gestacyjny (tygodnie) | 36.07 ± 2.71 | 35.72 ± 2.64 | 0.347 |
| Płeć (mężczyźni, %) | 59 (59.0 %) | 74 (66.1 %) | 0.29 |
| Masa urodzeniowa (kg) | 3.39 ± 0.57 | 3.33 ± 0.55 | 0.437 |
| Wiek matki (lata) | 29.18 ± 4.00 | 29.66 ± 4.05 | 0.387 |
| Metoda dostarczenia | 0.439 | ||
| pochwowy | 54 (54.0 %) | 65 (58.0 %) | |
| Cesarskie cięcie | 46 (46.0 %) | 47 (42.0 %) | |
| stopnie zaawansowania ARDS | --- | ||
| I-II | --- | 72 (64.3 %) | |
| III-IV | --- | 40 (35.7 %) |
Tabela 1: Charakterystyka wyjściowa włączonych niemowląt. Tabela ta podsumowuje wyjściowe dane demograficzne zdrowych noworodków oraz noworodków z ARDS. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe dla zmiennych ciągłych oraz liczbę (procent) dla zmiennych kategorycznych. Wartości P wskazują na statystyczne różnice między grupami. Skróty: ARDS = zespół ostrej niewydolności oddechowej.
| Zmienna | Przeżywalność (n=84) | Zgon (n=28) | pwartość p |
| Wiek ciążowy (tygodnie) | 35.95 ± 2.58 | 35.04 ± 2.76 | 0.112 |
| Płeć (mężczyźni, %) | 53 (63.1 %) | 21 (75.0%) | 0.253 |
| Masa urodzeniowa (kg) | 3.37 ± 0.58 | 3.23 ± 0.42 | 0.248 |
| Wiek matki (lata) | 29.49 ± 3.82 | 30.18 ± 4.74 | 0.438 |
| Metoda dostarczania | 0.444 | ||
| pochwowy | 47 (56.0 %) | 18 (64.3 %) | |
| Cesarskie cięcie | 37 (44.0 %) | 10 (35.7 %) | |
| Nieprawidłowy płyn owodniowy | 6 (9.5 %) | 4 (14.3 %) | 0.485 |
| stopnie ciężkości ARDS | 0.001** | ||
| I-II | 61 (72.6 %) | 11 (39.3 %) | |
| III-IV | 23 (27.4 %) | 17 (60.7%) | |
| Etiologia | 0.827 | ||
| Zadławienie | 33 (39.3 %) | 12 (42.9 %) | |
| Zapalenie płuc | 17 (20.2 %) | 6 (21.4 %) | |
| Sepsis | 12 (14.3 %) | 2 (7.1 %) | |
| Zespół aspiracji mekonium | 22 (26.2 %) | 8 (28.6 %) |
Tabela 2: Porównanie danych klinicznych pomiędzy grupą przeżywającą a grupą zgonów u noworodków z ARDS. Tabela ta porównuje wskaźniki kliniczne pomiędzy noworodkami z ARDS, które przeżyły, a tymi, które nie przeżyły. Dane ciągłe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, a dane kategoryczne jako liczba (procent). Wartości p wskazują na istotność statystyczną pomiędzy dwiema grupami. ** = p<0,01. Skróty: ARDS = zespół ostrej niewydolności oddechowej.
Plik uzupełniający 1: Surowe zbiory danych klinicznych i eksperymentalnych wspierające wyniki niniejszego badania, w tym pomiary na poziomie indywidualnym dla wyniku ultrasonografii płuc (LUS), ekspresji miR-486-3p w surowicy, ekspresji DLL4 oraz wyniki testów komórkowych.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Noworodkowy zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) jest główną przyczyną niewydolności oddechowej i wczesnej śmiertelności wśród krytycznie chorych noworodków15. Wczesna i dokładna ocena ciężkości choroby oraz rokowań jest warunkiem niezbędnym do zastosowania zindywidualizowanej interwencji i zmniejszenia śmiertelności. Rosnąca liczba dowodów potwierdza, że mikroRNA uczestniczą w patologicznym przebiegu ARDS i stanowią obiecujące biomarkery krążące16. Badania wskazują, że poziom miR-155 jest znacznie podwyższony u pacjentów z sepsą cierpiących na ostre uszkodzenie płuc/ARDS17. Dodatkowo badania wykazały wzrost poziomu miR-629-5p w surowicy u dzieci zdiagnozowanych z ARDS18. Poziom miR-34a w surowicy jest ściśle powiązany z ciężkością i rokowaniami w noworodkowym zespole niewydolności oddechowej (RDS)19. Nowe badania wykazują, że miR-375 jest biomarkeriem diagnostycznym i prognostycznym w noworodkowym ARDS20. Podobnie jak w przypadku raportowanych cząsteczek, miR-486-3p w surowicy można stabilnie wykryć we krwi obwodowej za pomocą ilościowego PCR, co czyni go odpowiednim do szybkiego przesiewu w noworodkowych oddziałach intensywnej terapii (NICU). W porównaniu z miR-375 i miR-34a, które odzwierciedlają głównie wczesny początek choroby, ekspresja miR-486-3p ściślej koreluje z ciężkością zmian płucnych i zmienia się dynamicznie wraz z postępem uszkodzenia płuc. W połączeniu z LUS osiąga wyższą dokładność prognostyczną w ocenie krótkoterminowej śmiertelności. Niemniej jednak miR-486-3p wykazuje stosunkowo niską specyficzność choroby, a odpowiednie dowody z badań klinicznych pozostają ograniczone w porównaniu z dobrze uznanymi biomarkerami miRNA. Podsumowując, miR-486-3p ma potencjał, aby służyć jako marker pomocniczej diagnostyki lub przewidywania rokowań w noworodkowym ARDS.
LUS jest dojrzałym wskaźnikiem obrazowania przy łóżku pacjenta, który ocenia napowietrzenie płuc na podstawie charakterystyk ultradźwiękowych tkanki płucnej21. Co istotne, LUS służy jako skuteczna miara ilościowa do oceny stopnia wentylacji pęcherzykowej22. Badania potwierdziły jego przydatność w ocenie zarówno nasilenia, jak i rokowań w przypadku ARDS u noworodków23. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, nasze badanie kliniczne wykazało, że pomiary LUS u noworodków z ARDS były znacznie wyższe w porównaniu z noworodkami zdrowymi. Ponadto, wśród dotkniętych noworodków, podgrupa z ciężkim przebiegiem wykazała wyraźnie wyższe wartości LUS niż podgrupa z przebiegiem łagodnym, co podkreśla bezpośrednią zależność między podwyższonymi odczytami LUS a stopniem niedodmy, obrzęku płuc i konsolidacji płuc24. Nasze wyniki wskazały ponadto, że pacjenci, którzy ostatecznie zmarli, wykazywali również znacznie wyższy LUS niż osoby, które przeżyły. U noworodków, które nie przeżyły, zaobserwowano silną dodatnią korelację między LUS a poziomem miR-486-3p w surowicy, co dodatkowo potwierdza synergistyczną wartość obu wskaźników. Każda z metod posiada specyficzne cechy: LUS nie emituje promieniowania, jest przenośny i odpowiedni do monitorowania przy łóżku pacjenta w czasie rzeczywistym, jednak jego interpretacja w dużym stopniu zależy od doświadczenia operatora i jest podatna na błędy subiektywne. Wykrywanie miR-486-3p w surowicy dostarcza obiektywnych, powtarzalnych wyników ilościowych, ale nie może odzwierciedlać zmian morfologicznych w tkance płucnej w czasie rzeczywistym. W praktyce klinicznej zaleca się stosowanie tego połączonego podejścia w rutynowej pracy oddziałów intensywnej terapii noworodka. Jest ono odpowiednie do wczesnej stratyfikacji ryzyka u noworodków z podejrzeniem lub potwierdzonym ARDS, regularnej dynamicznej oceny postępu choroby oraz pomocniczego określania krótkoterminowych rokowań klinicznych. Metoda ta nie jest jednak przeznaczona do zastąpienia obrazowania definitywnego lub badań etiologicznych; wykazuje ograniczoną swoistość w przypadku noworodków z współistniejącymi innymi zapalnymi chorobami płuc. Ponadto, ponieważ nasze badanie zostało przeprowadzone w jednym ośrodku, jego przydatność dla populacji z różnych regionów wymaga jeszcze weryfikacji.
Klinicznie zaobserwowaliśmy, że podwyższone wartości LUS w połączeniu z wysokim poziomem miR-486-3p w surowicy wiązały się ze złym rokowaniem w przebiegu ARDS u noworodków, co sugeruje, że miR-486-3p może być ściśle powiązany z ciężkim uszkodzeniem naczyń płucnych i upośledzoną zdolnością do naprawy naczyń w niedojrzałym płucu. Nasze eksperymenty in vitro na komórkach uzupełniły tę obserwację kliniczną, wykazując, że miR-486-3p bezpośrednio moduluje proliferację i apoptozę komórek śródbłonka, które są kluczowymi procesami sterującymi integralnością i naprawą naczyń w płucach noworodka. Ponadto badania wykazały, że miRNA odgrywają kluczową rolę w różnych procesach komórkowych25,26. Powszechnie wiadomo, że miRNA wywierają swój wpływ głównie poprzez potranskrypcyjną regulację genów docelowych, obejmującą przede wszystkim splicing miRNA i represję translacji białek27. Gen DLL4 odgrywa istotną rolę w rozwoju naczyń i angiogenezie28. Badania wskazały, że rodzina mikroRNA-30 celuje w DLL4, aby modulować zachowanie komórek śródbłonka podczas angiogenezy29. Wyniki te sugerują, że modulacja DLL4 w śródbłonku może być powiązana z uszkodzeniem naczyń płucnych w ARDS u noworodków. W naszym badaniu zidentyfikowano i potwierdzono relację celowania między miR-486-3p a DLL4. Dalsze analizy wykazały, że podwyższona ekspresja miR-486-3p znacząco hamowała proliferację HPMECs indukowaną przez LPS, jednocześnie promując apoptozę. Co istotne, ekspresja DLL4 mogła częściowo odwrócić efekty pośredniczone przez miR-486-3p. Sugeruje to, że miR-486-3p celuje w DLL4, aby wpływać na funkcję HPMECs i regulować progresję ARDS u noworodków. Pozostaje jednak do dalszej weryfikacji, czy bezpośrednio wpływa on na dysfunkcję naczyń płucnych i przyczynia się do rozwoju ARDS. Warto zauważyć, że DLL4 jedynie częściowo odwrócił zmiany komórkowe wywołane przez miR-486-3p. Jako typowe miRNA, miR-486-3p moduluje wiele genów docelowych w dole strumienia. Przyszłe badania skupią się na identyfikacji kolejnych genów docelowych, aby wyjaśnić pełny mechanizm działania miR-486-3p w ARDS u noworodków.
Na koniec warto zauważyć, że rygorystyczna standaryzacja kluczowych etapów protokołu zapewnia wiarygodne i powtarzalne dane. Ujednolicono procedury pobierania próbek, przyjęto zestandaryzowane protokoły hodowli komórkowych i transfekcji oraz włączono niezależne powtórzenia w celu zminimalizowania błędu eksperymentalnego. Typowe problemy operacyjne i ich rozwiązania podsumowano w następujący sposób: w przypadku oceny LUS należy zestandaryzować protokół skanowania 12 obszarów oraz ujednolicić zasady punktacji, a także dostosować pozycję noworodka w celu uzyskania wyraźnych obrazów. W przypadku wykrywania miRNA w surowicy należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, weryfikować czystość RNA (A260/A280 = 1.8–2.1) i uwzględniać powtórzenia techniczne. W przypadku modeli komórkowych indukowanych LPS należy stosować świeżo przygotowany LPS w stężeniu 1 mg/L oraz stabilne warunki hodowli. Podczas transfekcji należy zoptymalizować konfluencję komórek i stosunek odczynników oraz wymienić medium, aby zmniejszyć cytotoksyczność. W przypadku testów dual-luciferase należy zapewnić całkowną lizę komórek oraz standaryzację procedur operacyjnych.
Podsumowując, w porównaniu z metodami konwencjonalnymi, takimi jak obrazowanie klatki piersiowej, analiza gazometryczna krwi oraz testowanie pojedynczych biomarkerów, strategia łącząca LUS/miR-486-3p jest wolna od promieniowania, tania i łatwa w wykonaniu, a przy tym wykazuje lepszą wartość prognostyczną. Stanowi ona wiarygodne, uzupełniające narzędzie prognostyczne w przypadku ARDS u noworodków. Klinicznie metoda ta może być stosowana do wczesnej stratyfikacji ryzyka i dynamicznego monitorowania stanu pacjentów na oddziałach intensywnej terapii noworodków. Może ona również służyć jako ujednolicony wskaźnik oceny w badaniach wieloośrodkowych. Pod względem mechanistycznym, zwalidowana oś miR-486-3p/DLL4 wyznacza nowe kierunki w badaniu mechanizmów patologicznych i terapii celowanej. Jednakże to zintegrowane podejście posiada również immanentne ograniczenia techniczne. Wyniki LUS różnią się w zależności od operatora, a miR-486-3p nie wykazuje swoistości dla konkretnej jednostki chorobowej w przypadku zapalnych chorób płuc. Metoda ta umożliwia detekcję tylko w jednym punkcie czasowym i nie może zastąpić rozstrzygającego obrazowania ani badań etiologicznych.
Pomimo obiecujących wyników, uwagę należy zwrócić na kilka ograniczeń. Po pierwsze, projekt obejmujący jedną instytucję ogranicza możliwość uogólnienia naszych wniosków. Po pierwsze, zabrakło nam zewnętrznej kohorty walidacyjnej, aby zweryfikować solidność zdolności prognostycznej panelu LUS/miR-486-3p. Po trzecie, poziom miR-486-3p w surowicy mierzono tylko w jednym punkcie czasowym, co uniemożliwiło uchwycenie jego dynamicznego związku z progresją choroby. Po czwarte, brak uzupełniających analiz białek oraz walidacji in vitro/in vivo ogranicza wiarygodność naszych wniosków mechanistycznych. Wreszcie, specyficzna rola miR-486-3p w patofizjologii ARDS u noworodków pozostaje nie do końca wyjaśniona i wymaga dalszych badań. Podsumowując, zwiększony wynik LUS oraz podwyższony poziom miR-486-3p w surowicy u noworodków z diagnozą ARDS stanowią istotne punkty odniesienia w praktyce klinicznej. Synergistyczna ocena tych dwóch biomarkerów może ułatwić dokładne przewidywanie zarówno ciężkości, jak i rokowań w przypadku ARDS u noworodków, wykazując tym samym określoną wartość zastosowania klinicznego.
Oświadczenia
Do optymalizacji angielskich sformułowań, sprawdzania gramatyki i standaryzacji formatu wykorzystano program Grammarly. Wszystkie koncepcje badawcze, eksperymenty, dane i wnioski stanowią oryginalną pracę autorów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| probówki do PCR o pojemności 0,2 ml | Axygen | PCR-02-C | |
| 0,25% roztwór trypsyny z EDTA | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | |
| Probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Inkubator do hodowli komórkowych z nawilżaniem i 5% CO2 | Thermo Fisher | 3111 | |
| Płytki do hodowli komórkowej z 6 dołkami | Corning | 3516 | |
| 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowej | Corning | 3599 | |
| Etanol absolutny | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC | BD Biosciences | 556547 | |
| Wirówka laboratoryjna nakładkowa | Eppendorf | 5810R | |
| Prąca dygestoria biologiczna | Thermo Fisher | Seria 1300 A2 | |
| Zestaw do liczenia komórek CCK-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| Jednorazowe sterylne probówki do pobierania krwi | BD Vacutainer | 367815 | |
| Plazmid do nadekspresji DLL4 (OE-DLL4) | GenePharma | EX-M02151 | |
| Plazmid reporterowy lucyferazy DLL4-MUT | GenePharma | PGL3-DLL4-MUT | |
| Plazmid reporterowy lucyferazy DLL4-WT | GenePharma | PGL3-DLL4-WT | |
| Pożywka DMEM z wysoką zawartością glukozy | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | |
| Zestaw do podwójnego testu reporterowego lucyferazy | Biolab | BL101A | |
| Czytnik do enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA) | Thermo Fisher | Multiskan FC | |
| płytki surowica cielęca (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 10099141C | |
| Końcówki do pipet z filtrem (10 μL, 200 μL, 1000 μL) | Axygen | TF-10-R-S, TF-200-R-S, TF-1000-R-S | |
| Cytometr przepływowy | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Probówki do cytometrii przepływowej | BD Biosciences | 352054 | |
| Wysokoobrotowa wirówka chłodząca | Eppendorf | 5424R | |
| Lipopolisacharyd (LPS) z E. coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| System ultrasonografii płuc | Mindray | M9 | |
| Spektrofotometr mikrob objętościowy | Thermo Fisher | NanoDrop 2000 | |
| Inhibitor miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486-AS | |
| Mimik miR-486-3p | RiboBio | HmiR0000486 | |
| Zestaw starterów qPCR dla miR-486-3p | RiboBio | HmiRQP0486 | |
| Inhibitor kontrolny negatywny (NC) | RiboBio | HmiR0001-AS | |
| Negatywny kontrolny mimik (NC) | RiboBio | HmiR0001 | |
| Plazmid kontrolny negatywny do nadekspresji (OE-NC) | GenePharma | EX-NEG | |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny (100×) | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | |
| Bufor fosforanowy (PBS) 1× | Gibco (Thermo Fisher) | 10010023 | |
| Zestaw pipet (10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL) | Eppendorf | Research Plus | |
| Roztwór barwiący jodkiem propidium (PI) | BD Biosciences | 556463 | |
| System do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym | Applied Biosystems (Thermo Fisher) | 7500 Fast | |
| Woda wolna od RNaz | Invitrogen (Thermo Fisher) | 10977015 | |
| Szybka mieszanina RT-PCR (RT-PCR Quick Master Mix) | Toyobo | FSQ-101 | |
| Sterylne pipety jednorazowe | Corning | 4487, 4488, 4489 | |
| Mieszanina Master Mix do Real-time PCR z SYBR Green | Toyobo | QPK-201 | |
| Odczynnik Trizol | Invitrogen (Thermo Fisher) | 15596026 | |
| Zestaw starterów do qPCR dla snRNA U6 | RiboBio | HmiRQP0001 | |
| Mieszadło vortexowe | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Bibliografia
- Chi M, Mei YB, Feng ZC. A review on neonatal acute respiratory distress syndrome. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2018;20(9):724-728.
- Garcia MJ, Amarelle L, Malacrida L, Briva A. Novel opportunities from bioimaging to understand the trafficking and maturation of intracellular pulmonary surfactant and its role in lung diseases. Front Immunol. 2023;14:1250350.
- Wu H, et al. The value of oxygen index and base excess in predicting the outcome of neonatal acute respiratory distress syndrome. J Pediatr (Rio J). 2021;97(4):409-413.
- Coppola S, et al. Respiratory mechanics, lung recruitability, and gas exchange in pulmonary and extrapulmonary acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 2019;47(6):792-799.
- Bello G, Blanco P. Lung ultrasonography for assessing lung aeration in acute respiratory distress syndrome: a narrative review. J Ultrasound Med. 2019;38(1):27-37.
- Wu HL, et al. Lung ultrasound score for monitoring the withdrawal of extracorporeal membrane oxygenation on neonatal acute respiratory distress syndrome. Heart Lung. 2024;63:9-12.
- King A, Blank D, Bhatia R, Marzbanrad F, Malhotra A. Tools to assess lung aeration in neonates with respiratory distress syndrome. Acta Paediatr. 2020;109(4):667-678.
- Zhu Z, et al. Whole blood microRNA markers are associated with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Med Exp. 2017;5(1):38.
- Long G, Zhang Q, Yang X, Sun H, Ji C. Diagnostic and predictive significance of serum miR-141-3p in acute respiratory distress syndrome patients with pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 2024;262(3):157-162.
- Liang Y, et al. MiR-124-3p helps to protect against acute respiratory distress syndrome by targeting p65. Biosci Rep. 2020;40(5).
- Najafipour R, et al. Screening for differentially expressed microRNAs in BALF and blood samples of infected COVID-19 ARDS patients by small RNA deep sequencing. J Clin Lab Anal. 2022;36(11):e24672.
- Zhang S, et al. Clinical significance and potential mechanism of hsa_circ_0006892 in acute respiratory distress syndrome complicated with pulmonary fibrosis. Mol Biol Rep. 2024;51(1):1120.
- Yao MY, et al. Long non-coding RNA MALAT1 exacerbates acute respiratory distress syndrome by upregulating ICAM-1 expression via microRNA-150-5p downregulation. Aging (Albany NY). 2020;12(8):6570-6585.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-338-3p is a biomarker in neonatal acute respiratory distress syndrome and has roles in the inflammatory response of ARDS cell models. Acta Med Okayama. 2022;76(6):635-643.
- Shi S, et al. Evaluation of the neonatal sequential organ failure assessment and mortality risk in neonates with respiratory distress syndrome: a retrospective cohort study. Front Pediatr. 2022;10:911444.
- Martucci G, et al. Identification of a circulating miRNA signature to stratify acute respiratory distress syndrome patients. J Pers Med. 2020;11(1).
- Wang ZF, Yang YM, Fan H. Diagnostic value of miR-155 for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome in patients with sepsis. J Int Med Res. 2020;48(7):300060520943070.
- Zhang C, Ji Y, Wang Q, Ruan L. MiR-629-5p may serve as a biomarker for pediatric acute respiratory distress syndrome and can regulate the inflammatory response. Pediatr Neonatol. 2024. doi:10.1016/j.pedneo.2024.05.003.
- Li Q, Chen Y, Lin L. Value of serum miR-34a and Ang-1 in severity evaluation and prognosis of neonatal respiratory distress syndrome. Emerg Med Int. 2022;2022:5480026.
- Deng Y, Zhang R, Jiang X. Association of umbilical cord blood miR-375 with neonatal respiratory distress syndrome and adverse neonatal outcomes in premature infants. Acta Biochim Pol. 2022;69(3):605-611.
- Ostras O, Shponka I, Pinton G. Ultrasound imaging of lung disease and its relationship to histopathology: an experimentally validated simulation approach. J Acoust Soc Am. 2023;154(4):2410-2425.
- Soliman RM, et al. Prediction of extubation readiness using lung ultrasound in preterm infants. Pediatr Pulmonol. 2021;56(7):2073-2080.
- Huang L, Ye D, Wang J. Analysis of diagnosing neonatal respiratory distress syndrome with lung ultrasound score. Pak J Med Sci. 2022;38(5):1101-1106.
- Chardoli M, et al. Lung ultrasound in predicting COVID-19 clinical outcomes: a prospective observational study. J Am Coll Emerg Physicians Open. 2021;2(6):e12575.
- Jafari N, Abediankenari S. Role of microRNAs in immunoregulatory functions of epithelial cells. BMC Immunol. 2024;25(1):84.
- Sun LL, Li WD, Lei FR, Li XQ. The regulatory role of microRNAs in angiogenesis-related diseases. J Cell Mol Med. 2018;22(10):4568-4587.
- Hynes C, Kakumani PK. Regulatory role of RNA-binding proteins in microRNA biogenesis. Front Mol Biosci. 2024;11:1374843.
- Chowdhury TA, Li K, Ramchandran R. Lessons learned from a lncRNA odyssey for two genes with vascular functions, DLL4 and TIE1. Vascul Pharmacol. 2019;114:103-109.
- Bridge G, et al. The microRNA-30 family targets DLL4 to modulate endothelial cell behavior during angiogenesis. Blood. 2012;120(25):5063-5072.