Artykuł metodologiczny

Przygotowanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek szpiku kostnego do transcriptomiki przestrzennej z wykorzystaniem dekalcyfikacji opartej na EDTA

26 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72474

⸱

28 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hematology and Oncology Program, Center for Applied Medical Research (CIMA), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), 3Hematology and Cell Therapy Department, Cancer Center Clínica Universidad de Navarra (CCUN), Instituto de Investigaciones Sanitarias de Navarra (IdiSNA), 4Bioscience Program, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

W tym artykule

Podsumowanie

Ustandaryzowany schemat przygotowania próbek kostnych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie do transkryptomiki przestrzennej obejmuje 10-dniowy etap dekalcyfikacji w EDTA w celu zachowania integralności RNA. Kluczowe punkty kontroli jakości pomagają określić, czy próbki spełniają wymagania dla dalszej analizy przestrzennej ekspresji genów.

Streszczenie

Szpik kostny (BM) to złożona i dynamiczna struktura, w której relacje przestrzenne wpływają na zachowanie, sygnalizację i funkcję komórek. Z tego powodu zrozumienie pełnej dynamiki oddziaływań komórkowych wymaga zastosowania komplementarnych technik przestrzennych, które zachowują i mapują architekturę populacji komórek in situ. Pomimo znaczących postępów w technologiach jednokomórkowych, które przyczyniły się do zrozumienia heterogeniczności transkrypcyjnej zdrowej i chorobowo zmienionej tkanki szpiku kostnego, organizacja przestrzenna różnych typów komórek, specyficzne dla niszy programy regulacyjne oraz ich interakcje wciąż wymagają dalszych badań. Niedawny rozwój transkryptomiki przestrzennej umożliwił bezstronną analizę ekspresji genów z kontekstem przestrzennym w różnych tkankach, co czyni te technologie komplementarnymi wobec metod jednokomórkowych, którym brakuje rozdzielczości przestrzennej. Choć transkryptomika przestrzenna jest szeroko stosowana w tkankach miękkich, jej wykorzystanie w tkankach zmineralizowanych, takich jak szpik kostny, pozostaje ograniczone ze względu na trudności związane z przetwarzaniem tkanki kostnej. Protokół przedstawiony w niniejszym opracowaniu był stosowany do przygotowania próbek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) z tkanek zdrowych i chorych myszy oraz ludzi. Uwzględniono 10-dniowy etap dekalcyfikacji oparty na kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), aby zachować integralność RNA i umożliwić zastosowanie transkryptomiki przestrzennej w próbkach kości długich. Protokół ten opisuje przygotowanie próbek szpiku kostnego do analizy transkryptomicznej przestrzennej, w tym przetwarzanie tkanki, jej utrwalanie i krojenie, a także niezbędne etapy oceny jakości, takie jak ocena integralności skrawków, morfologii tkanki oraz jakości RNA. Schemat postępowania wspiera również identyfikację typów komórek i integrację z danymi transkryptomicznymi z poziomu pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania składu komórkowego, zdefiniowania interakcji międzykomórkowych oraz wizualizacji rozkładu przestrzennego komórek heterogennych transkrypcyjnie w stanach zdrowych i chorobowych. Ogólnie rzecz biorąc, ten schemat postępowania przygotowuje w pełni zmineralizowane tkanki zdrowe i nowotworowe do analizy transkryptomicznej przestrzennej przy jednoczesnym zachowaniu architektury szpiku kostnego.

Wprowadzenie

Szpik kostny (BM) jest wysoce złożonym i przedzielonym organem, który stanowi główne miejsce hematopoezy oraz dojrzewania komórek odpornościowych1,2. Ta heterogeniczna tkanka składa się z różnorodnych linii komórek hematopoetycznych, mezenchymalnych, endotelialnych i odpornościowych, które współistnieją w wysoce wyspecjalizowanej i zorganizowanej niszy trójwymiarowej3,4. W obrębie tej niszy każda populacja komórek zajmuje odrębne obszary anatomiczne, a kontekst przestrzenny odgrywa fundamentalną rolę w regulowaniu zachowania, sygnalizacji i funkcji komórek4,5. Bliskość fizyczna konkretnych struktur, takich jak kość beleczkowata czy sieci naczyniowe, steruje kluczowymi procesami fizjologicznymi, w tym utrzymaniem stanu spoczynku komórek macierzystych krwi (HSC) oraz przebudową kości6,7. W konsekwencji to dynamiczne mikrośrodowisko oraz ściśle regulowane interakcje między jego komponentami komórkowymi i zrębowymi kształtują sieci regulacyjne, które utrzymują homeostazę i wpływają na progresję nowotworów hematologicznych8,9,10,11,12,13.

Postępy w sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) zrewolucjonizowały nasze rozumienie różnorodności komórkowej szpiku kostnego (BM), umożliwiając odkrycie wcześniej nierozpoznanych podtypów komórek oraz przewidywanych oddziaływań między nimi w obrębie niszy3,10,11,12,14,15,16. Jednakże transkryptomika pojedynczych komórek, choć dostarcza informacji o wysokiej rozdzielczości na temat poszczególnych komponentów niszy krwiotwórczej, jest z natury ograniczona procesem trawienia tkanki, który oddziela komórki od ich naturalnego środowiska i potencjalnie zmienia ich stan natywny17, a także brakiem kontekstu przestrzennego definiującego organizację tkanki kostnej4,18. Utrata kontekstu pozycyjnego uniemożliwia jednoznaczne określenie miejsca bytowania konkretnych, transkrypcyjnie odrębnych populacji lub sposobu, w jaki oddziałują one z sąsiednimi komórkami19. Ponadto gęsta tkanka kostna jest często dysocjowana tylko częściowo, co prowadzi do niedoreprezentowania kluczowych populacji komórek, takich jak osteocyty i adipocyty, w zbiorach danych scRNA-seq oraz do stronniczego przedstawienia heterogeniczności tkanki20,21. Transkryptomika przestrzenna pozwala na badanie ekspresji genów in situ, w przestrzennych przekrojach tkanki, co umożliwia odzyskanie informacji kontekstowych i rozwiązanie ograniczeń technologii pojedynczych komórek8,19,22,23,24,25,26. Technologia ta stanowi istotny postęp w tej dziedzinie, ponieważ umożliwia precyzyjne pozycjonowanie przestrzenne i analizę organizacji strukturalnej różnych populacji komórek tworzących BM, co jest niezbędne do zrozumienia ich oddziaływań i funkcji w natywnym mikrośrodowisku8,26. Co więcej, w kontekście chorób transkryptomika przestrzenna pozwala badaczom i klinicystom wypełnić lukę między tradycyjną patologią a genomiką wysokoprzepustową, umożliwiając nałożenie danych molekularnych na obrazy morfologiczne1,8. Technologie transkryptomiki przestrzennej można podzielić na dwie główne grupy: metody oparte na sekwencjonowaniu oraz metody oparte na obrazowaniu17,24. Platformy oparte na sekwencjonowaniu, takie jak Visium, Curio Seeker, GeoMx Digital Spatial Profiler (GeoMx DSP), Stereo-seq, Deterministic Barcoding in Tissue sequencing (DBiT-seq) oraz otwarta platforma Open-ST, wychwytują mRNA na matrycach lub koralikach z kodowaniem przestrzennym przed sekwencjonowaniem nowej generacji. Metody oparte na obrazowaniu, w tym Multiplexed Error-Robust Fluorescence in Situ Hybridization (MERFISH), Molecular Cartography, RNAscope, CosMX i Xenium, bezpośrednio wizualizują transkrypty in situ poprzez multipleksową hybrydyzację lub chemię sond typu padlock27,28. Alternatywnie platformy te można sklasyfikować jako ukierunkowane lub nieukierunkowane, w zależności od tego, czy wymagają one detekcji opartej na sondach17,24.

Metody transkryptomiki przestrzennej są powszechnie stosowane w przypadku tkanek miękkich, takich jak mózg, serce i wątroba, gdzie przygotowanie nienaruszonych przekrojów histologicznych jest proste29,30,31. Z kolei wdrożenie transkryptomiki przestrzennej w badaniach kości jest znacznie trudniejsze ze względu na ich zmineralizowaną naturę, która wymaga procesu dekalcyfikacji32,33 – kontrolowanego usuwania fosforanu wapnia, aby tkanka stała się wystarczająco miękka do cięcia i późniejszych analiz histologicznych lub molekularnych8,20,23,34. Tradycyjne metody dekalcyfikacji rutynowo stosowane w praktyce klinicznej opierają się zazwyczaj na silnych roztworach kwasowych, takich jak kwas solny, azotowy, mrówkowy lub fosforowy, które poważnie degradują integralność RNA i zaburzają morfologię komórkową35,36. Taka degradacja molekularna obniża stosunek sygnału do szumu w testach przestrzennych, co często prowadzi do nieakceptowalnie niskich wskaźników wykrywania genów w porównaniu z tkankami miękkimi8,10. Ograniczenie to podkreśla potrzebę opracowania zestandaryzowanych procedur dekalcyfikacji, które niezawodnie zachowują integralność mRNA w próbkach zmineralizowanych na potrzeby analiz przestrzennych opartych na sekwencjonowaniu8,20.

Niniejszy protokół przedstawia zestandaryzowany schemat przygotowania utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) próbek szpiku kostnego (BM) do transkryptomiki przestrzennej, zastosowany wcześniej przez Muiños-Lopez et al.8. Schemat obejmuje 10-dniowy etap dekalcyfikacji z wykorzystaniem kwasu etylenodiaminooctowego (EDTA) przy kontrolowanym pH. W przeciwieństwie do agresywnych kwasów, EDTA działa jako łagodny chelator, który zachowuje strukturę mikroskopową i utrzymuje jakość kwasów nukleinowych, co wspiera jego zastosowanie w aplikacjach molekularnych8,20,33,36,37. Jako dowód koncepcji, protokół został wdrożony na próbkach tkanki kostnej z modeli mysich zdrowych oraz z szpiczakiem mnogim (MM), a także na ludzkich próbkach BM od osób zdrowych i chorych, a następnie próbki te zostały zsekwencjonowane na platformie Visium Spatial Gene Expression38. Schemat obejmuje zestandaryzowane procedury pobierania tkanek z ludzkich i mysich próbek kości, utrwalanie, dekalcyfikację, odwodnienie, zatopienie w parafinie i krojenie, a następnie kompleksowy potok kontroli jakości obejmujący ocenę integralności skrawków, barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E), ocenę jakości RNA (DV200) oraz opcjonalną immunofluorescencję (IF) w celu weryfikacji typów komórek. Kroki przygotowawcze te gwarantują, że do dalszych etapów transkryptomiki przestrzennej, w tym do wstępnego przetwarzania skrawków tkanki, konstrukcji bibliotek, sekwencjonowania oraz późniejszej kontroli jakości i analizy danych, trafią jedynie wysokiej jakości skrawki.

Niniejsza zestandaryzowana procedura wspiera przygotowanie i ocenę jakości próbek szpiku kostnego (BM) pochodzenia ludzkiego i mysiego do analizy transkryptomicznej przestrzennie rozdzielczej. Ma ona na celu ułatwienie badań nad specyficznymi dla nisz programami regulacyjnymi w zaburzeniach hematologicznych i szkieletowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą europejską 2010/63/EU dotyczącą ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu w Nawarrze (Comité de Ética para la Experimentación Animal; protokoły CEEA082-20 i CEEA039-20). Opieka nad zwierzętami, ich obchodzenie oraz eutanazja były wykonywane zgodnie z hiszpańskim ustawodawstwem w celu zminimalizowania bólu i cierpienia.

Badanie z udziałem ludzi zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Navarrze (Comisión de Ética de Investigación, CEI; projekty 2022.100mod1 i 2023.172) oraz Komisję Etyki Badań Służby Zdrowia Navarry (CEIm–Departamento de Salud de Navarra; PI_2022/92 MS-1). Wszystkie procedury z udziałem uczestników byli ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi Deklaracji Helsińskiej. Dane osobowe były przetwarzane poufnie, zgodnie z hiszpańską ustawą organiczną 3/2018 o ochronie danych osobowych i gwarancjach praw cyfrowych oraz hiszpańską ustawą 14/2007 o badaniach biomedycznych.

UWAGA: Szczegółowa lista odczynników i sprzętu użytych w niniejszym badaniu znajduje się w Tabela materiałówKompleksowy schemat procedury eksperymentalnej służącej do wdrażania transkryptomiki przestrzennej w tkankach kostnych przedstawiono na Rysunek 1 i zorganizowane w trzy fazy operacyjne: pozyskiwanie próbek, kontrolę jakości (QC) oraz przestrzenne profilowanie transkrypcyjne. Pozyskiwanie próbek obejmuje pobieranie fragmentów kości ludzkich lub mysich, a następnie ich utrwalenie, dekalcyfikację w EDTA, odwodnienie, zatopienie w parafinie oraz krojenie i przygotowanie preparatów na szkiełkach. Faza QC służy ocenie integralności histologicznej i stopnia zachowania RNA. Zwalidowane skrawki kostne poddawane są następnie permeabilizacji tkanki bezpośrednio na szkiełku, przygotowaniu bibliotek, sekwencjonowaniu oraz analizie danych.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat pobierania próbek i przygotowania tkanek kostnych mysich i ludzkich z użyciem EDTA. Kości udowe myszy oraz ludzkie próbki kostne są pobierane, utrwalane, dekalcyfikowane w EDTA, odwadniane, zatapiane w parafinie i cięte. Jakość próbek jest oceniana za pomocą barwienia H&E oraz oceny integralności RNA (DV200), po czym następuje wstępne przetwarzanie tkanek do transkryptomiki przestrzennej, przygotowanie bibliotek, sekwencjonowanie i kontrola jakości danych. Skróty: BM = szpik kostny; DV200 = procent fragmentów RNA dłuższych niż 200 nukleotydów; EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; H&E = hematoksylina i eozyna; QC = kontrola jakości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Pozyskiwanie i przetwarzanie próbek tkanki kostnej

  1. Pobieranie kości myszy
    1. Zanurzyć zwierzęta w 5% izofluranie i potwierdzić utratę odruchów.
    2. Po pełnym znieczuleniu przeprowadzić eutanazję poprzez zwichnięcie stawów szyjnych zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i regulacyjnymi.
      ​UWAGA: Eutanazję musi przeprowadzić przeszkolony personel, a śmierć musi zostać potwierdzona przed przystąpieniem do pobierania tkanek.
    3. Zdezynfekować skórę, rozpylając 70% etanol na powierzchni grzbietowej myszy, a następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać niewielkie nacięcie, aby ostrożnie usunąć skórę i odsłonić kończyny tylne.
    4. Wypreparować kończyny tylne, przecinając je powyżej stawu biodrowego, i przenieść do probówki 50 mL zawierającej 10 mL zimnego roztworu soli PBS wg Dulbecco (DPBS). Umieścić probówkę w lodzie.
    5. Usunąć przytwierdzone mięśnie i tkankę łączną za pomocą sterylnej pęsety i skalpela.
    6. Przenieść kości do sterylnego pojemnika 50 mL wypełnionego czystym, zimnym DPBS, a następnie umieścić pojemnik w lodzie.
    7. Bezzwłocznie przystąpić do utrwalania tkanek próbki, aby zachować ich integralność.
  2. Postępowanie z próbkami kości ludzkich
    1. Otrzymać biopsje rdzeniowe kości lub chirurgiczne fragmenty kości w sterylnych pojemnikach 100 mL.
    2. Przenieść fragmenty kości do czystego, sterylnego pojemnika 100 mL wypełnionego zimnym DPBS, a następnie umieścić go w lodzie.
    3. Bezzwłocznie przystąpić do utrwalania próbek, aby zachować integralność tkanek.
      OSTROŻNIE: Próbki ludzkie muszą być przetwarzane w warunkach BSL 2.
  3. Utrwalanie tkanki kostnej
    1. Wziąć pojemnik 50 mL lub 100 mL z próbką kości i wylać DPBS.
    2. Oznaczyć kasety plastikowe i umieścić próbki kości w poszczególnych kasetach. Szczelnie zamknąć pokrywy, aby zapobiec utracie tkanki podczas dalszego przetwarzania.
      ​UWAGA: W przypadku próbek mysich umieścić jedną kość na kasetę. W przypadku próbek kości ludzkich, jeśli jest to konieczne, użyć sterylnego skalpela, aby pociąć tkankę na fragmenty wystarczająco małe, by zmieściły się w standardowych kasetach, i umieścić jeden fragment na kasetę. Jeśli próbki kości ludzkich są zbyt twarde, by pociąć je na tym etapie, można pozostawić je w całości i przenieść do roztworu dekalcyfikującego; po dekalcyfikacji zmiękczoną tkankę można pociąć na fragmenty o odpowiedniej wielkości i umieścić w oznaczonych kasetach.
    3. Dodać 4% buforowany roztwór formaldehydu w stosunku próbki do utrwalacza 1:20 i inkubować próbkę przez 24 h w 4 °C.
      OSTROŻNIE: Utrwalacz należy stosować w dygestorium chemicznym ze względu na jego toksyczność i lotne opary.
      UWAGA: Należy unikać nadmiernego utrwalania (>48 h), co obniża integralność RNA w procesach FFPE39.
  4. Dekalcyfikacja zmineralizowanej tkanki kostnej
    1. Wylać formalinę i wypłukać próbkę kości wodą ultrapurystyczną. Przepłukać wodą, krótko wymieszać i wylać, aby usunąć wszelkie pozostałości formaliny.
    2. Przygotować 0,25 M roztwór EDTA w wodzie ultrapurystycznej i dostosować pH do 6,95.
      UWAGA: Choć w tradycyjnych protokołach dekalcyfikacji pH EDTA jest często dostosowywane do 8,0, w tym procesie stosuje się EDTA o pH około 6,95, aby wspomóc wydajną chelację przy jednoczesnym zachowaniu morfologii tkanki i jakości RNA8.
    3. Dodać roztwór EDTA do pojemnika z próbką kości i inkubować przez 10 dni w 4 °C przy łagodnym mieszaniu.
      ​UWAGA: Dla próbek mysich zazwyczaj wystarczające jest około 50 mL roztworu EDTA. Dla próbek kości ludzkich zazwyczaj stosuje się około 100 mL. Objętość tę można jednak dostosować do wielkości kości, aby zapewnić całkowite zanurzenie i skuteczną dekalcyfikację.
    4. Po 5 dniach dekalcyfikacji wylać roztwór EDTA i zastąpić go taką samą objętością świeżego EDTA, ponieważ zdolność chelatująca z czasem ulega nasyceniu. Kontynuować inkubację w tych samych warunkach.
    5. Po 10 dniach inkubacji wylać roztwór EDTA i ocenić, czy dekalcyfikacja została zakończona.
      1. Wyonać niewielkie nacięcie sterylnym skalpelem lub wprowadzić cienką sterylną igłę w narożnik lub obszar peryferyjny tkanki, wybierając zawsze obszar o niskiej istotności analitycznej, aby uniknąć uszkodzenia regionów zainteresowania. Umieścić kość na sterylnej płytce Petriego, aby ustabilizować próbkę podczas cięcia lub wprowadzania igły. Jeśli tkankę można łatwo przeciąć lub igła przechodzi z minimalnym oporem, próbka jest odpowiednio zdekalcyfikowana.
      2. W przypadku kości udowych myszy, delikatnie wygiąć kość pęsetą, aby ocenić jej elastyczność, co jest wiarygodnym wskaźnikiem całkowitego usunięcia minerałów.
        UWAGA: Czas trwania etapu dekalcyfikacji zależy od wielkości i grubości próbki kości, a także od użytej objętości EDTA. Jeśli kość pozostaje twarda po początkowym okresie inkubacji, kontynuować dekalcyfikację do czasu, aż tkanka będzie wystarczająco miękka, by łatwo ją było przeciąć. Nadmierne wydłużenie tego etapu może pogorszyć jakość tkanki i integralność RNA, dlatego przedłużenie powinno być ograniczone do minimalnego czasu wymaganego do uzyskania odpowiedniego zmiękczenia20.
  5. Odwadnianie
    1. Wypłukać, dodając wodę ultrapurystyczną do pojemnika z próbką kości, a następnie inkubować przez 5 min w 4 °C przy mieszaniu.
    2. Wylać wodę i zastąpić ją 70% roztworem etanolu. Inkubować przez 1 h w 4 °C.
      UWAGA: Ten etap może służyć jako punkt zatrzymania. Próbki można przechowywać w 70% etanolu w 4 °C przed przejściem do kolejnych kroków. Maksymalny czas przechowywania nie został zweryfikowany eksperymentalnie w tym protokole, dlatego użytkownicy powinni postępować zgodnie ze standardowymi praktykami swojego laboratorium.
    3. Odwadniać próbkę sekwencyjnie w rosnących stężeniach etanolu (70%, 80%, 96%; po 1 h każdy w 4 °C), a następnie w 100% etanolu przez noc w 4 °C.
    4. Wylać 100% etanol i zastąpić go ksylenem. Inkubować przez 4 h w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Wylać ksylen i umieścić kasetę z próbką w naczyniu zawierającym roztopioną, czystą parafinę. Inkubować w roztopionej parafinie przez noc w 60 °C.
      UWAGA: Można stosować krótsze czasy infiltracji w przypadku dostępności systemów przetwarzania wspomaganych próżniowo, ponieważ urządzenia te ułatwiają bardziej wydajną penetrację parafiny40,41,42.
      OSTROŻNIE: Wszystkie etapy obejmujące ksylen i roztwory etanolu o różnych stężeniach muszą być wykonywane w dygestorium chemicznym, aby zapewnić odpowiednią wentylację i zminimalizować ekspozycję na toksyczne i łatwopalne opary.
  6. Zalewanie parafiną
    ​UWAGA: Przetrzeć powierzchnie stacji do zalewania roztworem do dekontaminacji RNaz, aby zapobiec degradacji RNA.
    1. Włączyć stację do zalewania i podgrzać zbiornik parafiny, kąpiel parafinową dla kaset, kąpiel parafinową dla form oraz płytę grzewczą do form do 60 °C. Aktywować płytę chłodzącą, aby wystygła przed zalewaniem.
    2. Odczekać do pełnego roztopienia parafiny, a dopiero wtedy umieścić kasety z próbkami infiltrowanymi parafiną w kąpieli parafinowej dla kaset. Inkubować przez 2 h, aby zapewnić całkowite usunięcie ksylenu przed zalewaniem.
    3. Umieścić wszystkie niezbędne formy w kąpieli parafinowej dla form.
      UWAGA: Dla próbek ludzkich należy stosować standardowe metalowe formy do zalewania. Dla próbek mysich należy stosować plastikowe formy do zalewania kompatybilne z platformą Visium, które posiadają kwadratową wnękę o wymiarach odpowiednich do prawidłowego rozmieszczenia przekrojów na slajdach Visium. Ponieważ całe kości myszy nie mieszczą się całkowicie w kwadratowej wnęce tych form, należy pociąć kości bezpośrednio przed zalewaniem za pomocą sterylnego skalpela, aby uzyskać fragmenty o odpowiedniej wielkości. W zależności od wymiarów, w jednej formie można zalać jeden lub dwa fragmenty kości.
    4. Dodać cienką warstwę bazową świeżej parafiny, dozując roztopioną parafinę z centralnego wylotu stacji do zalewania.
    5. Otworzyć kasetę i delikatnie przenieść tkankę z kasety do formy za pomocą ciepłej pęsety.
    6. Umieścić wypełnioną parafiną formę na płycie grzewczej i, dopóki parafina pozostaje w stanie ciekłym, zorientować tkankę w pożądanej płaszczyźnie cięcia za pomocą ciepłej pęsety.
    7. Umieścić formę na zimnej powierzchni stacji do zalewania, aby krótko utrwalić pozycję fragmentu kości.
    8. Wypełnić formę całkowicie roztopioną parafiną z dozownika, upewniając się, że tkanka jest w pełni przykryta i nie pozostały duże pęcherzyki powietrza.
    9. Umieścić oznaczoną kasetę na górze formy, tak aby stanowiła ona podstawę bloku parafinowego.
    10. Przenieść formę z przymocowaną kasetą na płytę chłodzącą stacji do zalewania. Pozostawić parafinę do całkowitego zastygnięcia na 10 min, aż blok stanie się nieprzezroczysty i twardy.
    11. Po zastygnięciu wyjąć blok parafinowy z formy i przechowywać w 4 °C do czasu krojenia.
      UWAGA: Ten etap może służyć jako punkt zatrzymania. Blok parafinowy można przechowywać w 4 °C; jednak, jeśli to możliwe, krojenie tkanek i dalsze analizy transkryptomiczne przestrzenne powinny być wykonywane tak szybko, jak to praktycznie możliwe po zalewaniu, aby zminimalizować degradację RNA podczas przechowywania43,44.
  7. Krojenie i przygotowanie slajdów
    UWAGA: Oczyścić mikrotom i kąpiel wodną roztworem do dekontaminacji RNaz, aby zapobiec degradacji RNA.
    1. Napełnić kąpiel wodną wodą destylowaną i podgrzać ją do 42 °C. Włączyć mikrotom i zainstalować nowe ostrze. Oznaczyć slajdy mikroskopowe ołówkiem.
    2. Zamocować blok parafinowy w uchwycie na próbki, upewniając się, że kaseta jest zorientowana zgodnie z pożądaną podłużną płaszczyzną cięcia.
      ​UWAGA: Przygotować plastikowy worek wypełniony lodem; gdy krojenie stanie się trudne z powodu miękkiej parafiny, umieścić worek z lodem bezpośrednio na bloku, podczas gdy pozostaje on zamocowany w mikrotomie, mocując go gumką recepturką na kilka minut, aby utwardzić parafinę i poprawić jakość przekrojów.
    3. Ustawić grubość cięcia mikrotomu na 20 µm i wykonać cięcia wyrównujące.
    4. Zmienić ustawienie mikrotomu na 5 µm. Zebrać cztery przekroje o grubości 5 µm do oznaczonej, wolnej od RNaz probówki mikrocentryfugowej 1,5 mL. Trzymać probówkę na suchym lodzie i przechowywać w -80 °C.
    5. Kontynuować krojenie przy 5 µm i rozłożyć wstęgi przekrojów w kąpieli wodnej. Gdy przekrój będzie w pełni rozprostowany i bez zmarszczek, podnieść go za pomocą oznaczonego slajdu.
      1. Po każdej określonej liczbie przekrojów (np. co 5-10 wstęg, w zależności od wielkości tkanki), zebrać dodatkowe 4 przekroje o grubości 5 µm do nowej oznaczonej probówki 1,5 mL. Powtarzać ten proces do momentu uzyskania łącznie trzech probówek 1,5 mL zawierających przekroje 5 µm.
        UWAGA: Jeśli tkanka pęka, łamie się lub nie można uzyskać ciągłego przekroju, oznacza to, że próbka nie została w pełni zdekalcyfikowana i wymaga dodatkowego czasu dekalcyfikacji. Odzyskać próbkę, cofając kroki procesu aż do fazy dekalcyfikacji. Aby to zrobić, roztopić blok parafinowy w 60 °C przez około 2 h i przenieść preparat do ksylenu (2 h). Rehydratować próbkę poprzez roztwory etanolu o malejącym stężeniu (100%, 96%, 80%, 70%), a następnie w wodzie destylowanej. Przenieść rehydratowaną próbkę do świeżego 0,25 M EDTA (pH 6,95) i przedłużyć okres dekalcyfikacji w razie potrzeby przed ponownym odwadnianiem, zalewaniem i krojeniem. Tę procedurę odzyskiwania należy stosować wyłącznie jako ostateczność, ponieważ odwrócenie procesu FFPE może naruszyć integralność RNA.
    6. Umieścić slajdy w piecu w 37 °C na noc, aby odparować resztki wody, a następnie przechowywać je w 4 °C.
    7. Aby poprawić przyleganie tkanki, opcjonalnie wypiekać slajdy przez 3 h w 42 °C przed inkubowaniem ich przez noc w 37 °C.
      UWAGA: Ten krok jest zazwyczaj zbędny przy użyciu slajdów szklanych wymienionych w Tabeli materiałów, ponieważ zapewniają one silne przyleganie, a tkanka zazwyczaj pozostaje mocno przytwierdzona przez cały proces. Ten krok może służyć jako punkt zatrzymania. Slajdy można przechowywać w 4 °C; jednak, jeśli to możliwe, dalsze analizy transkryptomiczne przestrzenne powinny być wykonywane tak szybko, jak to praktycznie możliwe po zalewaniu, aby zminimalizować degradację RNA podczas przechowywania43,44.

2. Ocena jakości próbki

  1. Ocena jakości przekroju
    1. Wszystkie skrawki należy zbadać pojedynczo pod standardowym mikroskopem świetlnym w polu jasnym (4×–10×). Obejrzeć każdy preparat, aby upewnić się, że skrawki nie są pofragmentowane, i odnotować jakość każdego z nich.
      ​UWAGA: Należy sprawdzić, czy nie występują fałdy, zmarszczki, sprasowania lub prążki (tzw. chatter marks), które mogą wskazywać na problemy z twardością parafiny, ostrością noża lub niepełną dekalcyfikacją. Należy zweryfikować, czy nie brakuje fragmentów tkanki w wyniku ich oddzielenia się podczas krojenia lub przenoszenia do kąpieli wodnej.
    2. Wybierz najlepiej zachowane sekcje do transkryptomiki przestrzennej (najbardziej kompletne, o najlepszej morfologii).
    3. Zidentyfikuj sekcje następujące bezpośrednio po wybranych i zarezerwuj je dla H&barwienie E oraz IF, aby upewnić się, że obraz po barwieniu odpowiada jak najdokładniej tkance, która zostanie poddana sekwencjonowaniu.
  2. H&Barwienie E w celu oceny integralności tkanki
    1. Umieść preparaty na szkiełkach w szklanym statywie do barwienia i inkubuj przez 15 min w temperaturze 60 °C.
    2. Przenieś kasetkę do szklanych słoików do barwienia zawierających ksylen na 15 min.
    3. Rehydratyzuj skrawki, przenosząc kasetę przez słoiki do barwienia zawierające etanol 100%, 96%, 80% i 70%, inkubując przez 5 min w każdym roztworze.
      ​UWAGA: Wszystkie etapy obejmujące użycie ksylenu oraz roztworów etanolu o różnych stężeniach muszą być wykonywane w dygestorium w celu zapewnienia odpowiedniej wentylacji i zminimalizowania narażenia na toksyczne i łatwopalne opary.
    4. Płukanie szkiełek przez 5 min w naczyniu do barwienia wypełnionym wodą.
    5. Zanurzyć kasetę w hematoksylinie na 10 min, a następnie płukać pod bieżącą wodą z kranu, aż woda płucząca stanie się przejrzysta.
    6. Zanurz statyw w wodzie zawierającej pięć kropli stężonego kwasu solnego, delikatnie mieszając do momentu pojawienia się czerwonego zabarwienia.
    7. Przenieś statyw do wody nasyconej węglanem litu i pozostaw do czasu uzyskania trwałego niebieskiego zabarwienia, a następnie krótko opłucz w wodzie.
    8. Barwić przekroje w 1% (w/v) roztworze eozyny przez 5 min, a następnie ponownie wypłukać w wodzie.
    9. Odwodnij preparaty na szkiełkach, przenosząc kasetę przez naczynia do barwienia zawierające wodę oraz etanol o stężeniach 70%, 80%, 96% i 100%, inkubując przez 5 min w każdym z roztworów.
    10. Przejaśnij preparaty na szkiełkach w ksylenie przez 15 minut min.
    11. Ostrożnie osusz tył każdego szkiełka, nałóż medium montażowe na szkiełko nakrywkowe, a następnie zamontuj skrawki. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperatura pokojowa przez 24 godziny h przed obrazowaniem.
    12. Przeprowadź obrazowanie tkanek przy użyciu mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z powiększeniem 20x.
      UWAGA: Wykonaj H& barwienie H&E na sąsiednich skrawkach w pierwszej kolejności jako etap kontroli jakości w celu oceny przydatności próbki do transkryptomiki przestrzennej. Po dokonaniu wyboru należy przeprowadzić drugie barwienie H& Barwienie E bezpośrednio na skrawku przeznaczonym do transkryptomiki przestrzennej, zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi przygotowania tkanek dla platformy analizy przestrzennej ekspresji genów wymienionej w Tabela materiałów.
  3. Ocena integralności RNA (DV200)
    ​UWAGA: W przypadku protokołu przestrzennej ekspresji genów tradycyjny wskaźnik RIN (RNA Integrity Number) jest nieskuteczny, ponieważ w utrwalonych tkankach zazwyczaj brakuje pików rybosomalnego RNA 18S i 28S. W związku z tym jako bardziej informacyjny parametr jakości niż RIN powszechnie stosuje się wskaźnik DV200, zdefiniowany jako procent fragmentów RNA o długości przekraczającej 200 nukleotydów. dla zdegradowanych próbek klinicznych. W przypadku Visium v2 firma 10x Genomics zaleca stosowanie bloków FFPE o wartości DV200 ≥ 30%, aby zapewnić wydajną hybrydyzację sond oraz optymalną sprawność analizy. Wybór bloków tkankowych o najwyższych dostępnych wartościach DV200 pomaga zapobiegać ubytkom w sekwencjonowaniu (dropouts) i maksymalizuje czułość spotów.
    1. Wyjmij probówki o pojemności 1,5 ml zawierające 5 µm przekroje pobrane podczas etapu sekcjonowania tkanek i umieścić je w lodzie w celu ekstrakcji RNA.
    2. Wyizoluj całkowite RNA. Ta standaryzowana procedura obejmuje deparafinizację próbek, trawienie proteinazą K w celu odwrócenia wiązań sieciujących powstałych w wyniku utrwalania formaliną, usunięcie DNA genomowego poprzez traktowanie DNazą I oraz końcową elucję oczyszczonego RNA w wodzie wolnej od RNaz.
    3. Oceń integralność RNA za pomocą systemu opartego na elektroforezie kapilarnej z wykorzystaniem wysoko czułego testu RNA. Podsumowanie schematu postępowania przedstawiono w Plik uzupełniający 142,45,46,47,48.
  4. Opcjonalna immunofluorescencja w celu weryfikacji typu komórek
    1. Umieść preparat FFPE w szklanym statywie do barwienia i inkubuj przez 15 min w temperaturze 60 °C.
    2. Przenieść kasetkę do szklanych słoików do barwienia zawierających ksylen na 15 min.
    3. Rehydratyzuj przekrój, przenosząc kasetkę przez kolejne roztwory etanolu o stężeniach 100%, 96%, 80% i 70% przez 2 min każdorazowo, a następnie przez 5 min w wodzie i 5 min w roztworze PBS-Tween (1x PBS z dodatkiem 0,1% Tween-20).
      UWAGA: Wszystkie etapy obejmujące użycie ksylenu i etanolu muszą być wykonywane w dygestorium chemicznym.
    4. Przeprowadź odmaskowanie antygenów zgodnie z zaleceniami producenta przeciwciała pierwszorzędowego, upewniając się, że bufor do odmaskowania, pH oraz warunki grzania są zgodne z kartą charakterystyki przeciwciała. UWAGA: W niniejszym protokole odmaskowanie antygenów wykonuje się przy użyciu 10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH 9,0, w systemie grzewczym z wykorzystaniem garnka elektrycznego przez 30 min w temperaturze 95 °Cnastępnie chłodzono przez 20 min w temperaturze pokojowej.
    5. Przemyj preparat na szkiełku dwukrotnie po 10 minut za każdym razem w roztworze PBS-Tween.
    6. Narysuj barierę hydrofobową wokół tkanki za pomocą pisaka do tworzenia barier hydrofobowych i zablokuj nieswoiste wiązanie, nakładając 5% BSA w 1x DPBS na skrawki tkanki na co najmniej 40 min w temperaturze pokojowej w komorze uwilżonej.
      UWAGA: Komorę wilgotną przygotowuje się poprzez umieszczenie arkusza papieru filtrowanego w plastikowym pudełku do barwienia szkiełek i dokładne zwilżenie go wodą destylowaną w celu utrzymania stabilnego, wilgotnego środowiska podczas inkubacji przeciwciał.
    7. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego w 1x DPBS, stosując zalecane rozcieńczenie dla każdego przeciwciała.
      UWAGA: W niniejszym schemacie postępowania, zgodnie z protokołem producenta, do identyfikacji mysich komórek śródbłonka (EC) i mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wykorzystano odpowiednio przeciwciała pierwotne przeciwko Emcn (V.7C7) oraz Cd271 (ME20.4), natomiast do identyfikacji ich ludzkich odpowiedników zastosowano przeciwciała przeciwko CD31 (JC70A) lub PRRX1 (poliklonalne).
    8. Usunąć roztwór blokujący, delikatnie stukając krawędzią szkiełka o papier chłonny w celu usunięcia pozostałych kropli, następnie nanieść mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować szkiełko przez noc w temperaturze 4 °C w komorze z nawilżeniem.
    9. Przemyj preparat na szkiełku dwukrotnie przez 5 min w roztworze PBS-Tween i przygotuj roztwór przeciwciał wtórnych w rozcieńczeniu zalecanym przez producenta, upewniając się, że fluorofory są kompatybilne spektralnie i nie nakładają się na siebie.
      UWAGA: W niniejszym schemacie postępowania zastosowano przeciwciało wtórne sprzężone z Alexa Fluor w rozcieńczeniu 1:200.
    10. Nanieś mieszaninę przeciwciał wtórnych i inkubuj przez 30 minut min w temperaturze pokojowej, w ciemności, w komorze uwilżonej.
    11. Przemyć preparat dwa razy po 5 min w roztworze PBS-Tween.
    12. Nanieść 10-krotne rozcieńczenie medium montażowego zawierającego DAPI (patrz Tabela materiałów), przygotowane w roztworze PBS–glicerol 1:1, i inkubować próbkę przez 5 min.
    13. Zamknąć preparat szkiełkiem nakrywkowym i zabezpieczyć krawędzie lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu.
    14. Wizualizuj zabarwioną tkankę przy użyciu platformy do obrazowania multispektralnego.

Plik uzupełniający 1: Podsumowanie etapów protokołu oceny integralności RNA oraz schematu pracy Visium Spatial Transcriptomics. Ten plik uzupełniający zawiera szczegółowe podsumowanie kroków proceduralnych wykonanych zgodnie z instrukcjami producenta. Obejmuje on: (i) analizę High Sensitivity RNA ScreenTape Assay stosowaną do oceny integralności RNA (DV200), opisaną w kroku 2.3.3 głównego protokołu, oraz (ii) przegląd schematu pracy Visium CytAssist Spatial Gene Expression, obejmujący wstępne przetwarzanie tkanek, przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie (kroki 3.1–3.3 głównego protokołu).Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

3. Transkryptomika przestrzenna

UWAGA: Przeprowadź procedurę transkryptomiki przestrzennej, korzystając z platformy i odczynników wymienionych w Tabeli materiałów, zgodnie z odpowiednimi instrukcjami obsługi42,45,46. Plik uzupełniający 1 podsumowuje główne etapy wstępnego przetwarzania tkanek, przygotowania bibliotek oraz sekwencjonowania.

  1. Kontrola jakości danych transkryptomiki przestrzennej
    1. Przeprowadź demultipleksację danych transkryptomiki przestrzennej, korzystając ze standardowego potoku przetwarzania dla zestawów danych Visium (patrz Tabela materiałów).
    2. Zmapuj odczyty do odpowiedniego genomu referencyjnego Ensembl 105.
      UWAGA: W przypadku próbek ludzkich zastosowano GRCh38, a w przypadku próbek mysich mm10.
    3. Wygeneruj przefiltrowane macierze cech-kodów kreskowych (feature-barcode matrices) przy użyciu tego samego potoku i zaimportuj je do środowiska analizy pojedynczych komórek/analizy przestrzennej (patrz Tabela materiałów).
    4. Przejrzyj obrazy H&E w interfejsie wizualizacji dostarczonym przez potok transkryptomiki przestrzennej (patrz Tabela materiałów) i ręcznie usuń plamki (spots), które nakładają się na obszar kości korowej lub tkankę kostną, w zależności od zestawu danych.
    5. Znormalizuj zestawy danych, stosując metodę transformacji stabilizującej wariancję, powszechnie stosowaną w procedurach analizy pojedynczych komórek (patrz Tabela materiałów).

Wyniki

Aby ocenić możliwość zastosowania tego schematu opartego na EDTA w różnych gatunkach i kontekstach chorobowych, protokół zastosowano do czterech próbek szpiku kostnego (BM): dwóch kości udowych myszy oraz dwóch ludzkich próbek kości reprezentujących stan zdrowy oraz wielomałpłazczak szpiku (MM) (Tabela 1 i Rysunek 1).

Identyfikacja próbekGatunkiPłećWiekChoroba
YFPcγ1MyszKobieta210 dniZdrowy
mMMMyszSamiec314 dniMM
hHBMCzłowiekSamiec76 latZdrowy
hMMCzłowiekKobieta50 latMM

Tabela 1: Próbki kości mysich i ludzkich uwzględnione w badaniu. Dla każdej próbki podano gatunek, płeć, wiek oraz stan zdrowia. Skróty: hHBM = zdrowy ludzki szpik kostny; hMM = ludzka mieloma mnoga; mMM = mysia mieloma mnoga; MM = mieloma mnoga; YFPcγ1 = zdrowa mysz kontrolna.

Próbki wykorzystane w niniejszym badaniu zostały wcześniej scharakteryzowane i opisane w poprzednich publikacjach grupy badawczej, a konkretnie w pracach Muiños-Lopez et al. oraz Cenzano et al., z wyjątkiem próbki mysiej MM. W przypadku wcześniej opisanych okazów dane i wyniki transkryptomiki przestrzennej są przedstawione w tych badaniach8,10. W związku z tym materiał zawarty w niniejszym opracowaniu służy do oceny technicznej przydatności protokołu do transkryptomiki przestrzennej, a nie do prezentacji nowych odkryć biologicznych.

Próbki kości udowych myszy pobrano z genetycznie zmodyfikowanego modelu mysiego MM BIC (BIcγ1), który odzwierciedla cechy kliniczne i immunologiczne pacjentów z MM, oraz od odpowiadających im zdrowych myszy kontrolnych (YFPcγ1)8,49. Od każdego zwierzęcia pobrano jedną kość udową, którą następnie oczyszczono i przetworzono zgodnie ze zstandaryzowanym protokołem (Rysunek 2A). Do analiz wykorzystano konkretnie kości udowe, ponieważ oferują one dużą ilość dostępnego szpiku, wysoką jakość niszy oraz łatwość powtarzalnego przetwarzania, co czyni je odpowiednimi dla platformy transkryptomiki przestrzennej opartej na sekwencjonowaniu8,10. Poprawność dekalcyfikacji kości udowej myszy kontrolnej potwierdzono makroskopowo poprzez wyraźny wzrost elastyczności tkanki podczas manipulacji pęsetą (Rysunek 2B). Następnie fragment kości wydajnie zatopiono w parafinie, wykorzystując specjalistyczną formę kompatybilną z transkryptomiką przestrzenną, aby zachować integralność RNA oraz architekturę tkanki do dalszych analiz molekularnych (Rysunek 2C).

Przeanalizowano również dwie ludzkie próbki BM o przeciwstawnych historiach opracowania8,10. Świeżą próbkę BM od zdrowego hematologicznie człowieka pobrano z odpadów chirurgicznych podczas ortopedycznej wymiany stawu biodrowego w Hospital Universitario de Navarra (Rycyna 2D–F). Aby wykazać translacyjną użyteczność protokołu, próbkę tę opracowano w taki sam sposób jak próbki mysie. Zgodnie z wynikami zaobserwowanymi w tkance mysiej, pomyślną dekalcyfikację ludzkiej kości przy użyciu EDTA potwierdzono makroskopowo poprzez całkowite zmiękczenie tkanki, co objawiało się bezwysiłkową penetracją igłą (Rycyna 2E). Zdekalcyfikowany fragment ludzkiej kości został pomyślnie zatopiony w parafinie przy użyciu standardowej metalowej formy w celu dalszego opracowania (Rycyna 2F). Druga ludzka próbka składała się z archiwalnych biopsji BM utrwalonych w FFPE, pobranych z grzebienia biodrowego pacjenta z MM w Zakładzie Patomorfologii Clínica Universidad de Navarra (CUN). Co istotne, ta archiwalna próbka MM została wcześniej dekalcyfikowana zgodnie ze standardowym protokołem klinicznym z użyciem silnych kwasów36. Próbka ta stanowi jakościowy kontrast dla preparatów opracowanych za pomocą EDTA; jednak różnice w źródle tkanki, historii utrwalania, przechowywaniu i dekalcyfikacji oznaczają, że zaobserwowane różnice nie mogą być przypisane wyłącznie czynnikowi dekalcyfikującemu.

figure-results-1
Rycina 2: Próbki kości mysich i ludzkich podczas przygotowania z użyciem EDTA. (A) Nienaruszone kontrolne kości udowe myszy przed dekalcyfikacją. (B) Dekalcyfikowana kontrolna kość udowa myszy wykazująca zwiększoną elastyczność. (C) Kontrolne fragmenty kości mysiej zatopione w parafinie. (D) Zdrowe fragmenty ludzkiej kości z operacji biodra przed dekalcyfikacją. (E) Ten sam fragment po dekalcyfikacji EDTA, wykazujący penetrację igły. (F) Zdrowa ludzka kość dekalcyfikowana EDTA zatopiona w parafinie. Paski skali: (A, B) 5 mm; (C–F) 1 cm. Skrót: EDTA = kwas etylendiaminotetraoctowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W celu analizy ogólnej architektury tkanki wykonano barwienie H&E (Rysunek 3). Lepsza zachowana morfologia zaobserwowana w przekrojach mysich może odzwierciedlać różnice w obchodzeniu się z próbkami i ich przetwarzaniu, a nie immanentne cechy gatunkowe. Kości udowe myszy zostały pobrane specjalnie do zastosowania w transkryptomice przestrzennej i przetworzone natychmiast jako całe kości, co pozwoliło na zachowanie ich architektury (Rysunek 3A, B). W przeciwieństwie do nich, próbki ludzkie pochodzą albo z materiału pozostałego po operacji wymiany stawu biodrowego (Rysunek 3C) , albo z diagnostycznych biopsji kości w MM (Rysunek 3D)); w obu przypadkach jakość tkanki przed analizą może być zróżnicowana. W rezultacie różnice morfologiczne między ludzką próbką dekalcyfikowaną EDTA a biopsją MM dekalcyfikowaną kwasem są subtelne, ponieważ oba ludzkie preparaty wykazują już podstawowe ograniczenia strukturalne wprowadzone nie tylko przez dekalcyfikację, ale także przez ogólne przetwarzanie tkanek (Rysunek 3C, D). W związku z tym kompleksowa ocena jakości próbek do transkryptomiki przestrzennej wymaga ewaluacji wielu odrębnych parametrów. Po pierwsze, należy uważnie monitorować integralność tkanki, ponieważ stopień zachowania struktury może znacznie różnić się w zależności od konkretnego rodzaju próbki, a nie tylko od zastosowanego kwasu dekalcyfikującego. Po drugie, należy ocenić jakość RNA, ponieważ warunki dekalcyfikacji mogą na nią wpływać20,35,36.

figure-results-2
Rysunek 3: Przekroje barwione H&E użyte do oceny jakości tkanki. Kolejne przekroje FFPE odpowiadają (A) zdrowej myszy kontrolnej10, (B) myszy z MM, (C) zdrowej ludzkiej kości8,10 oraz (D) ludzkiej biopsji MM8. Paski skali = 500 µm. Skróty: FFPE = utrwalone formaliną i zatopione w parafinie; H&E = hematoksylina i eozyna; MM = szpiczak mnogi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W celu uzupełnienia analizy histologicznej oceniono jakość RNA. Podczas gdy barwienie H&E wykazało niejednoznaczne różnice, integralność RNA wyraźnie zróżnicowała efekty dwóch metod dekalcyfikacji (Tabela 2). Wartości DV200 zarówno dla próbek mysich, jak i dla zdrowego preparatu ludzkiej kości przekroczyły próg zalecany dla testów Visium FFPE, co wskazuje na wystarczający rozkład długości fragmentów RNA dla hybrydyzacji sond i konstrukcji bibliotek. Próbka zdrowej myszy YFP wykazuje DV200 na poziomie 82,55%, a próbka zdrowej ludzkiej kości (hHBM) osiąga 58%, co w obu przypadkach znacznie przekracza próg akceptowalności 30% zdefiniowany przez 10x Genomics. Próbka myszy z MM (mMM) wykazuje DV200 na poziomie 31,3%, co jest bliskie dolnej granicy akceptowalności; może to odzwierciedlać wydłużony czas przechowywania bloku parafinowego w temperaturze 4 °C przed krojeniem, obok innych czynników specyficznych dla próbki. W przeciwieństwie do niej, biopsja ludzkiego MM dekalcyfikowana kwasem (hMM) wykazuje DV200 wynoszące zaledwie 8%, co wiązało się z wyraźnie niższą integralnością RNA, nawet przy mniej nasilonym pogorszeniu morfologicznym. Podsumowując, przeprowadzenie zarówno oceny strukturalnej, jak i molekularnej jest istotne dla określenia przydatności próbek do dalszych analiz przestrzennych.

Identyfikacja próbkiDV200 (%)1
YFPcγ182.55
mMM31.3
hHBM58
hMM28
1DV200: Procent całkowitej liczby fragmentów RNA > 200 nukleotydów.
2Próbka ta została odwapniona zgodnie ze standardowym protokołem klinicznym z użyciem silnych kwasów.

Tabela 2: Jakość RNA w próbkach badawczych. DV200 to procent fragmentów RNA dłuższych niż 200 nukleotydów; wartości wynoszące co najmniej 30% uznano za odpowiednie do dalszych analiz z zakresu transkryptomiki przestrzennej. Skróty: hHBM = zdrowy ludzki szpik kostny; hMM = ludzka mieloma mnoga; mMM = mysia mieloma mnoga.

Można przeprowadzić również dodatkowe oceny jakości. Aby dalej zweryfikować integralność tkanki i potwierdzić zachowanie specyficznych przedziałów komórkowych po dekalcyfikacji w EDTA, wykonano opcjonalne barwienie IF na sąsiednich skrawkach FFPE z tkanek mysich i ludzkich. Do wizualizacji odpowiednio komórek śródbłonka (EC) i mezenchymalnych (MSC) w próbce mysiej z MM użyto przeciwciał przeciwko endomucynie (Emcn) i Cd271 (Rycina 4A). Barwienie to wykazało, że tkanki przetworzone w EDTA wykazują dobrze zdefiniowane struktury naczyniowe z ciągłym barwieniem Emcn oraz zachowane sieci zrębowe, co dowodzi, że badane markery pozostały wykrywalne po procesowaniu. Ponadto obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu obrazowania multispektralnego dostarczyło dodatkowych dowodów na to, że badane antygeny pozostały wykrywalne w celu weryfikacji typu komórek, co zapewniło dodatkowy poziom kontroli jakości przed analizą transkryptomiczną przestrzenną. Ponadto wyniki te zaobserwowano również w zdrowych próbkach od starszych ludzi, w których ekspresję EC wykryto za pomocą CD31, a MSC za pomocą przeciwciał PRRX1 (Paired Related Homeobox 1), co pokazuje, że badane markery niszy pozostały identyfikowalne po dekalcyfikacji w EDTA (Rycina 4B). W przeciwieństwie do tego, wyników tych nie udało się powtórzyć w ludzkich biopsjach MM poddanych różnym protokołom dekalcyfikacji opartym na kwasach. Jak wspomniano wcześniej, integralność RNA w tych próbkach była niska, co ograniczyło dalsze analizy transkryptomiczne. Ze względu na zdegradowany charakter tych ludzkich próbek, ich późniejsza użyteczność ograniczyła się do podstawkowego profilowania transkryptomicznego8 oraz oceny immunohistochemicznej (IHC) złośliwych komórek plazmatycznych (PC) (Rycina 4C).

figure-results-3
Rycina 4: Opcjonalna immunofluorescencja i immunohistochemia w celu weryfikacji typów komórek. (A) Tkanka MM myszy wykazująca jądra znakowane DAPI (niebieski), MSC dodatnie pod kątem CD271 (zielony) oraz EC dodatnie pod kątem EMCN (czerwony). (B) Zdrowa kość ludzka wykazująca jądra znakowane DAPI (niebieski), MSC dodatnie pod kątem PRRX1 (zielony) oraz EC dodatnie pod kątem CD31 (czerwony)10. (C) Biopsja MM człowieka wykazująca złośliwe PC dodatnie pod kątem CD1388. Paski skali: (A) 250 µm (przegląd), 20 µm (powiększenie z nałożeniem kanałów) i 50 µm (obrazy z pojedynczych kanałów); (B) 500 µm (przegląd) oraz 20 µm (powiększenia z nałożeniem kanałów i z pojedynczych kanałów); (C) 500 µm. Skróty: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; EC = komórka śródbłonka; MM = szpiczak mnogi; MSC = mezenchymalna komórka macierzysta; PC = komórka plazmatyczna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Łącznie morfologia tkanki oraz wyniki DV200 potwierdzają przydatność próbek utrwalonych w EDTA do późniejszej analizy transkryptomicznej przestrzennej. Zastosowania transkryptomiki przestrzennej w ramach tego schematu przygotowania próbek zostały opisane wcześniej8,10.

Dyskusja

Poprzez zintegrowanie kontrolowanej dekalcyfikacji opartej na EDTA, standaryzowanego przetwarzania FFPE oraz rygorystycznych punktów kontroli jakości, niniejszy protokół eliminuje wiele ograniczeń tradycyjnie związanych z przygotowaniem tkanki kostnej do transkryptomiki przestrzennej, w szczególności tych dotyczących degradacji RNA i uszkodzeń morfologicznych wywoływanych przez silne metody dekalcyfikacji kwasowej8,10,20,33,36. Najbardziej krytycznym etapem przetwarzania zmineralizowanych próbek do transkryptomiki przestrzennej jest dekalcyfikacja. Niewystarczająca dekalcyfikacja powoduje, że kość pozostaje zbyt sztywna do skrawania, co uniemożliwia fizyczne uzyskanie wysokiej jakości skrawków do transkryptomiki przestrzennej8,20,23,37,50. Gdy tkanka kostna pozostaje zbyt twarda, ulega ona rozdrobnieniu lub drganiom przy kontakcie z nożem mikrotomu, co prowadzi do powstawania poszarpanych skrawków lub dziur, które nie oddają wiernie naturalnej architektury szpiku kostnego. Co istotne, powodzenie dekalcyfikacji nie może zostać w pełni potwierdzone aż do etapu mikrotomii: nawet próbki, które sprawiają wrażenie powierzchownie zmiękczonych, mogą nadal zawierać resztki minerałów, co staje się widoczne dopiero podczas próby wycinania cienkich skrawków FFPE. Z tego powodu niezbędne jest uważne monitorowanie postępu dekalcyfikacji, aby zapewnić powtarzalne wyniki.

W tym schemacie postępowania stosuje się 0,25 M EDTA o pH 6,95 przez 10 dni przy stałym mieszaniu i wymianie roztworu w piątym dniu8,10. Podczas opracowywania protokołu oceniano samo EDTA, EDTA uzupełnione o poliwinylopirolidon oraz 10% kwas mrówkowy, a także różne czasy dekalcyfikacji i harmonogramy wymiany roztworów; dane porównawcze nie zostały tutaj przedstawione. Czas trwania krótszy niż 10 dni często prowadził do pękania tkanek podczas krojenia próbek mysich, natomiast w przypadku próbek ludzkich zaobserwowano zmienność zależną od konkretnej próbki. Z tego powodu dla kości udowych myszy stosuje się 10-dniowy okres dekalcyfikacji, podczas gdy próbki ludzkie mogą wymagać dłuższego procesu w zależności od gęstości i zawartości beleczek kostnych. Przed zatopieniem w parafinie należy zastosować fizyczne punkty kontroli jakości. Jeśli podczas mikrotomii okaże się, że dekalcyfikacja była niewystarczająca, należy zastosować procedurę ponownego przetwarzania wyłącznie jako ostateczną próbę ratowania próbki, ponieważ dodatkowa ekspozycja na ciepło, rozpuszczalniki i ponowna rehydratacja mogą obniżyć jakość RNA.

Głównym ograniczeniem tej metody jest wydłużony czas przetwarzania, co stanowi wyraźny kontrast w stosunku do szybkich protokołów opartych na kwasach, powszechnie stosowanych w patologii klinicznej20,36. Chociaż dłuższe czasy przetwarzania są zazwyczaj akceptowalne w warunkach badawczych, niedawne prace, takie jak protokół opisany przez Miao i wsp., w którym zastosowano roztwór Morse'a (22,5% kwasu mrówkowego i 10% cytrynianu sodu) do dekalcyfikacji w ciągu 24 h, wskazują na rosnące zainteresowanie przyspieszeniem przygotowania kości do analiz przestrzennych20. Jednakże metody oparte na kwasach wiążą się historycznie z znacznie wyższym ryzykiem degradacji RNA, co obniża wartości DV200 i ostatecznie ogranicza ich kompatybilność z transkryptomiką przestrzenną1,8,35,36. Niniejsze podejście oparte na EDTA priorytetyzuje zachowanie RNA nad szybkością, zapewniając kompatybilność z platformami przestrzennymi opartymi na sekwencjonowaniu, takimi jak Visium.

Potencjalnym ograniczeniem przestrzennej transkryptomiki szpiku kostnego (BM) jest wysoka liczebność transkryptów immunoglobulin pochodzących z komórek plazmatycznych (PC), co może utrudniać wykrywanie genów o niskiej ekspresji. Podobnie jak w strategiach kontroli jakości i filtrowania zastosowanych w poprzednim badaniu grupy badawczej, obejmujących usuwanie punktów niskiej jakości (<200 UMIs i <150 wykrytych genów), filtrowanie typów komórek o niskim udziale (<20% na punkt) podczas analiz dekonwolucji oraz wybór genów markerowych wykrytych w zbiorach danych przestrzennej transkryptomiki, transkrypty immunoglobulin mogą być również filtrowane obliczeniowo podczas analizy końcowej, aby zminimalizować ich wpływ, jeśli jest to odpowiednie8. Celowane podejścia do przestrzennej transkryptomiki mogą dodatkowo poprawić wykrywalność transkryptów o niskiej liczebności w konkretnych zastosowaniach.

Potencjalne zastosowania tej metody są szerokie. Niedawna integracja danych przestrzennych i jedno-komórkowych ujawniła wyspecjalizowane ludzkie nisze osteogenne oraz złożone gradienty sygnalizacyjne promieniujące z kości beleczkowej3,26. Co więcej, transkryptomika przestrzenna wykazała, że starzenie przekształca mikrośrodowisko szpiku kostnego (BM) poprzez zmianę organizacji przestrzennej i komunikacji komórek śródbłonka (EC), co prowadzi do upośledzenia wsparcia osteogennego i pojawienia się zapalnych sieci sygnalizacyjnych w starzejącej się niszy10. Profilowanie multiomiczne zidentyfikowało również odrębne sąsiedztwa mikrośrodowiskowe, takie jak regiony arterio-endostealne wspierające wczesną mielopoezę oraz strefy peri-adipocytarne wzbogacone w hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe3. W kontekście szpiczaka mnogiego (MM), niniejszy protokół umożliwia integrację przestrzennych i jedno-komórkowych ram transkryptomicznych w celu scharakteryzowania składu chorobowo zmienionego szpiku kostnego u myszy oraz oddziaływań międzykomórkowych. Poprzednie prace ujawniły przestrzennie odrębne rozkłady złośliwych komórek plazmatycznych (PC) i zidentyfikowały programy immunologiczne i zapalne, takie jak NEToza i sygnalizacja IL-17, które były odwrotnie skorelowane z regionami wzbogaconymi w nowotwór. Dodatkowo, wzrost gęstości złośliwych PC korelował z przejściem z efektorowych w wyczerpane stany limfocytów T. Wyniki te zostały również zwalidowane w ludzkich próbkach szpiku kostnego utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE), co wykazało ich znaczenie translacyjne przy różnym obciążeniu chorobowym8. W ostateczności, ten schemat przygotowania stanowi fundament techniczny do badania złożonych oddziaływań komórkowych w obrębie zmineralizowanej architektury szpiku kostnego.

Platformy wysokiej rozdzielczości do badania przestrzennej ekspresji genów umożliwiają profilowanie całego transkryptomu z rozdzielczością bliską pojedynczej komórce38,51,52. Podejścia te mogą rozszerzyć zastosowanie schematu przygotowania próbek na analizy o wyższej rozdzielczości w odniesieniu do zorganizowanego przestrzennie szpiku kostnego oraz nowotworów hematologicznych. Przedstawiony schemat stanowi zatem podstawę techniczną dla przyszłych badań nad fizjologiczną i nowotworową hematopoezą.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów. Patent dotyczący know-how i wykorzystania eksperymentalnego modeli mysich MM MIcγ1 został licencjonowany firmie MIMO Biosciences (wniosek nr PCT/EP2023/071025).

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Instituto de Salud Carlos III i współfinansowana przez ERDF A way of making Europe (PI22/00983); CIBERONC (CB16/12/00489), RICORS TERAV (RD21/0017/0009) oraz RICORS TERAV Plus (RD24/0014/0010); AGATA 0011-1411-2020-000010/0011-1411-2020-000011; Departamento de Salud Gobierno de Navarra (GN2024/04); Cancer Research UK [C355/A26819]; FC AECC i AIRC w ramach programu Accelerator Award; The International Myeloma Foundation (Brian van Novis) oraz The Paula and Rodger Riney Foundation dla FP. IAC otrzymał wsparcie z grantu Marie Curie (H2020-MSCA-IF-837491) z Komisji Europejskiej, grantu AECC Talent (INVES258003CALV) oraz Departamento de Salud, Gobierno de Navarra (GN2023/03). MC otrzymał wsparcie z stypendium FPU (FPU22/03283) z Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Chcielibyśmy podziękować pracownikom Advanced Genomics Laboratory oraz Animal Facility w CIMA Universidad de Navarra za nieocenioną pomoc techniczną i merytoryczną. Dziękujemy również oddziałom patologii Clínica Universidad de Navarra (CUN) oraz Hospital Universitario de Navarra za udostępnienie próbek BM oraz za wybitną współpracę. Szczególne podziękowania kierujemy do José Ángela Martíneza-Climenta i Marty Larrayoz za modele mysie MM. Dziękujemy Patxi San Martín-Urizowi, Tanii López i Eduardo Larequiemu za doskonałe wsparcie w optymalizacji technologii, opracowaniu protokołów i rozwiązywaniu problemów podczas przetwarzania próbek BM od myszy i ludzi do transkryptomiki przestrzennej. Dziękujemy również Beñatowi Aricecie i Asierowi Ullate za całą pracę obliczeniową związaną z transkryptomiką przestrzenną. Na koniec jesteśmy głęboko wdzięczni pacjentom i zdrowym dawcom, którzy hojnie wzięli udział w tym badaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
probówki 1,5 mlEppendorf15625367
sterylny pojemnik o pojemności 100 mL deltalab723-510
4200 TapeStationAgilentG2991AElektroforeza kapilarna–system oparty na [metodzie] do oceny integralności RNA
sterylny pojemnik o pojemności 50 ml IberoMedREOR001
probówka 50 ml FALCON352070
Zaawansowany pisak PAPTed Pella 22309Z377821-1EAPisak do tworzenia barier hydrofobowych 
Przeciwciało anty-PRRX1 wytworzone w królikuSigma-AldrichHPA051084
BSA (albumina surowicy bydlęcej)Sigma-AldrichA9418-50G
Kasety KartellLABWARE2921
Przeciwciało monoklonalne CD271 (receptor NGF) (ME20.4)Invitrogen14-9400-82
CD31, komórki śródbłonka (koncentrat) klon JC70AAgilent DakoM0823
Szkiełka nakrywkoweFisher Scientific12-544-EP50 mm x 24 mm
DAPI (medium montażowe VECTASHIELD Antifade z DAPI)Vector LaboratoriesH-1200-10
roztwór do deparafinizacjiQiagen19093
DPBSThermo Scientific AAJ67802APThermo Scientific Chemicals fosforanowy bufor solny (DPBS, 1×), pożywka Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu
Medium montażowe DPX do histologiiSigma-Aldrich06522-500ML
EDTAThermo Scientific 15748687Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), roztwór 0,5 M, stopień czystości do biologii molekularnej, ultrapure
Stacja do zatapiania Leica Biosystems14 0388 81101Leica EG1150H
Przeciwciało Emcn (V.7C7)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
Referencyjny genom Ensembl (GRCh38 / mm10, wersja 105)EMBL-EBIBrak danychGenom referencyjny użyty do dopasowania odczytów.
EozynaMillipore SigmaHT110116
EtanolMillipore SigmaE7023-500MLNożyczki chirurgiczne
Kąpiel wodna do histologii Falc Instruments B-IFalc610.1030.00
Formalina 4% PanReac AppliChem2524311315Formaldehyd 3,7%–4,0% m/v buforowane do pH = 7 i stabilizowane metanolem (CE-IVD) do diagnostyki klinicznej
Statyw do barwienia szkiełek przedmiotowych WHEATONZ710970-3EA
Szklane naczynia do barwienia MARKABR472200-10EATermocykler  X50
GlicerolSigma-AldrichC3H8O3
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H+L), adsorbowane krzyżowo, koniugowane z Alexa Fluo 568InvitrogenA11004
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG (H+L), silnie adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluo Plus 488InvitrogenA32723
Kozie przeciwciało wtórne przeciwko króliczemu IgG (H+L), silnie adsorbowane, sprzężone z Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Hematoksylina Millipore SigmaMHS16
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Ocena integralności RNA
Drabina RNA High Sensitivity ScreenTapeAgilent5067-5581Ocena integralności RNA
Bufor do próbek High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5580Ocena integralności RNA
Mikroskop o wysokiej rozdzielczości Leica BiosystemsN/ASkaner Aperio CS2
Kwas solny (0,1 N HCl)Fisher ChemicalSA54-1
platforma Illumina NextSeq 2000Illumina20038897
Przeciwciało wtórne Invitroge przeciwko IgG szczura (H+L) z kozy, adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluo 568InvitrogenA11077
Nożyczki irydologiczne - ToughCutF.S.T 14058-11
IsovetBRAUNBR3009Izofluran
Węglan litu Merck554-13-2
Loupe Browser (v6.0.0) 10x GenomicsNie dotyczyOprogramowanie służące do wizualizacji obrazów HE oraz kurateli punktów Visium; otwiera pliki .cloupe generowane przez potok analityczny.
Metalowe formy do zatapianiaBio-Optica07-BM24256
Lamelki do mikroskopuAvantor631-0108Lamelki do mikroskopu Superfrost Plus
Noże do mikrotomuPIÓROFEAT207500006_U
Mikrotom HM 340EEprediaBrak danychmodel HM 340E
IgłaBD301156BD Microlanc 3 Igła 21 G 1 IN (25 MM)
Nikon Optiphot-2Nikon71052Jasnopowy mikroskop świetlny
Parafina PanReac AppliChem256993Parafina t.t. 55–58°C plastyfikowane granulaty DMSO (CE-IVD) do diagnostyki klinicznej
szalka Petriego CorningCLS430167-100EA
Formy do zatapiania w plastiku Bio-Optica07-MP7070
Kleszczyki Pottsa-SmithaF.S.T 11012-18Pinceta
Fluorometr Qubit 3.0Invitrogen Q33216
Probówki do analizy QubitInvitrogen Q32856
Zestaw Qubit RNA HS Assay KitInvitrogen Q32855
probówka do mikrocentryfugi 1,5 ml wolna od RNazThermo Scientific AM12400
woda wolna od RNaz MerkW4502
RNaseZap RNazaInvitrogen AM9780Roztwór do dekontaminacji
Zestaw RNeasy FFPE (50)Qiagen73504Ekstrakcja całkowitego RNA
SCTransform (v0.3.5)Laboratorium SatijiNie dotyczyMetoda normalizacji stabilizującej wariancję zaimplementowana w pakiecie Seurat.
Seurat (v4.3.0.1) Laboratorium SatijiNie dotyczyPakiet R wykorzystywany do analizy transkryptomiki jednokomórkowej i przestrzennej.
Space Ranger (v2.0.1)10x GenomicsNie dotyczyOprogramowanie wykorzystywane do demultipleksacji, dopasowania sekwencji oraz generowania macierzy cecha-kod kreskowy dla zbiorów danych Visium.
skalpel Stlime Schreiber GmbH 51-11-030
STutility (v1.1.1)Laboratorium BergenN/DPakiet R wykorzystywany do wizualizacji i integracji transkryptomiki przestrzennej.
Ostrze skalpela chirurgicznego nr 23Swann-Morton210Ostrza skalpeli chirurgicznych
Termocykler Eppendorf6313000018
Tween-200Sigma-AldrichP2287-500ML
Vectra Polaris PerkinElmerCLS143455Platforma obrazowania wielospektralnego do wizualizacji IF
Zestaw akcesoriów Visium 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000194
Visium CytAssist10x GenomicsPN-1000441
Zestaw sond do analizy transkryptomu ludzkiego Visium Human Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000363
Zestaw sond transkryptomicznych dla myszy Visium Mouse Transcriptome Probe Kit Small 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000365
Zestaw slajdów do przestrzennej analizy ekspresji genów Visium, 4 reakcje, 10X Genomics 10x GenomicsPN-1000188
KsylenPanreac214736Ksylen, mieszanina izomerów do analizy, ACS, ISO

Bibliografia

  1. Cooper RA, et al. Spatial transcriptomic approaches for characterising the bone marrow landscape: pitfalls and potential. Leukemia. 2025;39(2):291-295.
  2. Mercier FE, Ragu C, Scadden DT. The bone marrow at the crossroads of blood and immunity. Nat Rev Immunol. 2012;12(1):49-60.
  3. Bandyopadhyay S, et al. Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging. Cell. 2024;187(12):3120-3140.e29.
  4. Tikhonova AN, et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 2019;569(7755):222-228.
  5. Baccin C, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48.
  6. Kunisaki Y, et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 2013;502(7473):637-643.
  7. Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.
  8. Muiños-Lopez E, et al. Characterization of the bone marrow architecture of multiple myeloma using spatial transcriptomics. Commun Biol. 2025;8(1):1620.
  9. Gui G, et al. Single-cell spatial transcriptomics reveals immunotherapy-driven bone marrow niche remodeling in AML. Sci Adv. 2025;11(28):eadw4871.
  10. Cenzano I, et al. Single-cell profiling reveals RAB13+ endothelial cells and profibrotic mesenchymal cells in aged human bone marrow. Aging Cell. 2026;25(4):e70475.
  11. de Jong MME, et al. The multiple myeloma microenvironment is defined by an inflammatory stromal cell landscape. Nat Immunol. 2021;22(6):769-780.
  12. de Jong MME, et al. An IL-1β-driven neutrophil–stromal cell axis fosters a BAFF-rich protumor microenvironment in individuals with multiple myeloma. Nat Immunol. 2024;25(5):820-833.
  13. Cenzano I, et al. Stromal and endothelial transcriptional changes during progression from MGUS to myeloma and after treatment response. Nat Commun. 2026;17:74389.
  14. Ye J, et al. Deconvolution of the hematopoietic stem cell microenvironment reveals a high degree of specialization and conservation. iScience. 2022;25(5):104225.
  15. Chen L, et al. An inflammatory T-cell-stromal axis contributes to hematopoietic stem/progenitor cell failure and clonal evolution in human myelodysplastic syndrome. Nat Commun. 2025;16(1):10041.
  16. Prummel KD, et al. Inflammatory stromal and T cells mediate human bone marrow niche remodeling in clonal hematopoiesis and myelodysplasia. Nat Commun. 2025;16(1):10042.
  17. De Jonghe J, et al. scTrends: A living review of commercial single-cell and spatial 'omic technologies. Cell Genom. 2024;4(12):100723.
  18. van den Brink SC, et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017;14(10):935-936.
  19. Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes—next generation tools for tissue exploration. Bioessays. 2020;42(10):1900221.
  20. Miao J, et al. A practical protocol of processing mineralized tissue for Visium spatial transcriptomics. Mechanobiol Med. 2025;3(4):100163.
  21. Baldwin M, et al. A roadmap for delivering a human musculoskeletal cell atlas. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(11):738-752.
  22. Duan H, Cheng T, Cheng H. Spatially resolved transcriptomics: advances and applications. Blood Sci. 2023;5(1):1-12.
  23. Xiao X, et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 2023;11(1):59.
  24. Jain S, Eadon MT. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol. 2024;20(10):659-671.
  25. Tilburg J, et al. Spatial transcriptomics of murine bone marrow megakaryocytes at single-cell resolution. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(4):100158.
  26. Lin W, et al. Mapping the spatial atlas of the human bone tissue integrating spatial and single-cell transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2025;53(2):gkae1298.
  27. Marx V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 2021;18(1):9-14.
  28. Yue L, et al. A guidebook of spatial transcriptomic technologies, data resources and analysis approaches. Comput Struct Biotechnol J. 2023;21:940-955.
  29. Joglekar A, et al. A spatially resolved brain region- and cell type-specific isoform atlas of the postnatal mouse brain. Nat Commun. 2021;12(1):463.
  30. Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023;55(1):66-77.
  31. Wang F, et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023;9(24):eadf5464.
  32. Robinson MH, et al. Regulation of antigen-specific T cell infiltration and spatial architecture in multiple myeloma and premalignancy. J Clin Invest. 2023;133(15):e167303.
  33. Wehrle E, et al. Protocol for preparing formalin-fixed paraffin-embedded musculoskeletal tissue samples from mice for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 2024;5(2):103089.
  34. Sangeetha R, Uma K, Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J Oral Maxillofac Pathol. 2013;17(3):386-391.
  35. Yip RKH, et al. Profiling the spatial architecture of multiple myeloma in human bone marrow trephine biopsy specimens with spatial transcriptomics. Blood. 2025;146(15):1837-1849.
  36. Miquelestorena-Standley E, et al. Effect of decalcification protocols on immunohistochemistry and molecular analyses of bone samples. Mod Pathol. 2020;33(8):1505-1517.
  37. Ambrosi TH, et al. Human skeletal development and regeneration are shaped by functional diversity of stem cells across skeletal sites. Cell Stem Cell. 2025;32(5):811-823.e11.
  38. 10x Genomics. Visium Spatial Platform. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/platforms/visium#assays
  39. Amemiya K, et al. Influence of formalin fixation duration on RNA quality and quantity from formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissues. Pathol Int. 2023;73(12):593-600.
  40. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002;161(6):1961-1971.
  41. Nam SK, et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 2014;48(1):36-42.
  42. 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000407, Revision E. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-ffpe/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe-user-guide
  43. Eccher A, et al. Pathology laboratory archives: conservation quality of nucleic acids and proteins for NSCLC molecular testing. J Pers Med. 2024;14(4):333.
  44. Bai Z, et al. Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Cell. 2024;187(23):6760-6779.e24.
  45. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE—Tissue Preparation Guide. Document CG000518, Revision D. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026: Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/tissue-prep/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-for-ffpe-tissue-preparation-guide
  46. 10x Genomics. Visium CytAssist Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE User Guide. Document CG000495, Revision G. Pleasanton (CA): 10x Genomics. 2026. Available from: https://www.10xgenomics.com/support/cytassist-spatial-gene-expression/documentation/steps/library-construction/visium-cyt-assist-spatial-gene-expression-reagent-kits-for-ffpe
  47. Agilent Technologies. High Sensitivity RNA ScreenTape assay for TapeStation systems quick guide. Version A.01.05. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/HS-RNA_QuickGuide.pdf
  48. Agilent Technologies. Agilent 4200 TapeStation system—System manual. Publication G2991-90000, Version A.02.02. Santa Clara (CA): Agilent Technologies. 2024: Available from: https://download.chem.agilent.com/software/4200_tapestation_user_info_package_v2/tapestation%20user%20information/tapestation%20manuals/agilent%204200%20tapestation%20system%20manual_g2991-90000.pdf
  49. Larrayoz M, et al. Preclinical models for prediction of immunotherapy outcomes and immune evasion mechanisms in genetically heterogeneous multiple myeloma. Nat Med. 2023;29(3):632-645.
  50. Wang S. Resolving the bone – optimizing decalcification in spatial transcriptomics and molecular pathology. J Histotechnol. 2025;48(1):68-77.
  51. Oliveira MF, et al. High-definition spatial transcriptomic profiling of immune cell populations in colorectal cancer. Nat Genet. 2025;57(6):1512-1523.
  52. Bourgain-Chang E, Kuang X, Cang Z, Nie Q. Reconstructing single-cell resolution from spatial transcriptomics with CellRefiner. Nat Commun. 2026;17(1):3304.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pr bki FFPEdekalcyfikacja EDTAkrojenie tkanekintegralno RNAidentyfikacja typ w kom rekmorfologia tkankianaliza ekspresji gen wintegracja danych z pojedynczych kom rek
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły