Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Opis przypadku

Opis przypadku rodziny z dystalną dziedziczną neuropatią ruchową wywołaną homozygotycznym wariantem c.1124G>A w genie VRK1 (Vaccinia-Related Kinase 1)

55 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72503

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2The First Clinical Medical College, Yunnan University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie opisuje chińską rodzinę w stopniu krewniaczym z dziedziczną dystalną neuropatią ruchową (dHMN) o późnym początku, wywołaną homozygotycznym wariantem c.1124G>A w genie kinazy 1 związanej z wirusem ospy krowiej (VRK1). Wyniki te poszerzają kliniczne spektrum fenotypowe i genetyczne dHMN związanej z VRK1 w populacji chińskiej.

Streszczenie

Celem niniejszego badania była analiza fenotypów klinicznych, charakterystyki neurofizjologicznej oraz patogenności wariantów genowych w rodzinie z dystalną dziedziczną neuropatią ruchową (dHMN) spowodowaną wariantami VRK1, a także dostarczenie dowodów wspierających diagnozę kliniczną i poradnictwo genetyczne w tej chorobie. Opisujemy chińską rodzinę spokrewnioną z dHMN spowodowaną homozygotycznym wariantem c.1124G>A w genie VRK1. Zebrano dane kliniczne i elektrofizjologiczne probanda. W celu zidentyfikowania miejsca wariantu przeprowadzono sekwencjonowanie całego eksomu (WES) i walidację metodą sekwencjonowania Sangera, a interpretację patogenności wykonano zgodnie z wytycznymi American College of Medical Genetics and Genomics/Association for Molecular Pathology (ACMG/AMP). Probandem był 24-letni mężczyzna, u którego wystąpiło postępujące od 2 lat osłabienie i zanik dystalnych części kończyn dolnych, któremu towarzyszyły szczupłe kończyny górne oraz brak zaburzeń czucia. Badanie elektrofizjologiczne wykazało zmniejszoną amplitudę złożonego potencjału czynnościowego mięśnia (CMAP) w nerwach ruchowych obu kończyn górnych i dolnych, co wskazuje na obwodowe uszkodzenie neurogenne, podczas gdy przewodnictwo w nerwach czuciowych było prawidłowe. Testy genetyczne wykryły homozygotyczny wariant c.1124G>A (p.Trp375Ter) w genie VRK1. Jego rodzice oraz starsze siostry byli heterozygotycznymi nosicielami, a drzewo genealogiczne było zgodne z autosomalnym recesywnym modelem dziedziczenia. Zgodnie z wytycznymi ACMG wariant ten został sklasyfikowany jako patogenny (dowody: PVS1, PM2, PP1). Homozygotyczny wariant VRK1 c.1124G>A powoduje dHMN o późnym początku, a nie hipoplazję mostowo-móżdżkową typu 1A (PCH1A), jak adnotowano w niektórych bazach danych genetycznych. Ta rodzina wykazuje charakterystyczne fenotypy, w tym szczupłe kończyny górne i rozlumnie zmniejszone amplitudy CMAP w obu kończynach górnych i dolnych, co rozszerza spektrum kliniczne i genetyczne dHMN związanej z VRK1 w populacji chińskiej.

Wprowadzenie

Dystalna dziedziczna neuropatia ruchowa (dHMN) stanowi genetycznie heterogenną grupę uwarunkowanych genetycznie zaburzeń obwodowego układu nerwowego, definiowanych patologicznie jako zależna od długości degeneracja dolnych neuronów ruchowych i ich aksonów. Klinicznie pacjenci wykazują postępujące osłabienie i zanik mięśni dystalnych kończyn, podczas gdy w większości przypadków funkcje czuciowe pozostają w dużej mierze zachowane1. Pierwsze objawy zazwyczaj dotyczą dystalnych części kończyn dolnych, obejmując osłabienie zgięcia palców stopy oraz zanik mięśnia brzuchatego łydki i mięśni wewnętrznych stopy, z stopniowym postępem obejmującym mięśnie międzykostne dłoni oraz mięśnie kłębu mównego i kłębu małego w miarę rozwoju choroby2. Wzorce dziedziczenia różnią się w zależności od podtypu, opisano zarówno formy autosomalne dominujące, jak i autosomalne recesywne. Do tej pory z dHMN powiązano ponad 50 genów patogennych, jednak u ponad połowy dotkniętych osób podstawowa przyczyna genetyczna pozostaje nieznana3.

Z uwagi na wyraźną heterogenność genetyczną i rozległe nakładanie się fenotypów z innymi schorzeniami nerwowo-mięśniowymi, diagnoza dHMN oparta wyłącznie na ocenie klinicznej jest często niewiarygodna4. Konwencjonalne, etapowe podejścia diagnostyczne, polegające na przejściu od fenotypowania klinicznego do sekwencjonowania genów kandydatów, są nieefektywne i charakteryzują się niską skutecznością diagnostyczną, szczególnie w przypadkach sporadycznych lub fenotypowo nietypowych1,2. Celowane panele genowe stanowią bardziej kosztowo efektywną alternatywę, lecz są ograniczone przez zdefiniowane wcześniej listy genów i mogą pomijać rzadkie lub nowe warianty patogenne. Sekwencjonowanie całego genomu oferuje najpełniejszy zakres genomowy, ale jest ograniczone przez wysoki koszt, wydłużony czas analizy oraz dużą liczbę wariantów o niepewnym znaczeniu w rutynowej praktyce klinicznej5. W niniejszym badaniu zastosowano zintegrowany model diagnostyczny łączący systematyczną ocenę kliniczną, badanie neurofizjologiczne, sekwencjonowanie całego eksomu (WES) oraz analizę segregacji rodzinnej. Badania neurofizjologiczne pomagają potwierdzić izolowane zajęcie obwodowych nerwów ruchowych i określić rozkład uszkodzeń nerwów, co pozwala zawęzić diagnostykę różnicową. WES umożliwia jednoczesną analizę wszystkich znanych genów związanych z dHMN, wykrycie potencjalnych nowych wariantów patogennych oraz późniejszą analizę segregacji rodzinnej, co pozwala na dalsze odfiltrowanie łagodnych wariantów przypadkowych i wzmocnienie dowodów na patogenność wariantów kandydatów, zapewniając tym samym pragmatyczną równowagę między skutecznością diagnostyczną, kosztem a interpretowalnością wyników.

Gen kinazy 1 związanej z vaccinia (VRK1) koduje kinazę serynowo-treoninową, która uczestniczy w jądrowej transdukcji sygnałów oraz szlakach naprawy uszkodzeń DNA, a jej funkcja fizjologiczna jest niezbędna dla zachowania homeostazy i żywotności neuronów6. Warianty patogenne w VRK1 prowadzą do szerokiego spektrum klinicznego: hipoplazji mostowo-móżdżkowej typu 1A o początku niemowlęcym (PCH1A), charakteryzującej się mikrocefalią, ciężką hipotonią i głębokim opóźnieniem rozwoju motorycznego; dHMN o początku u dorosłych z przewagą zajęcia dystalnych części kończyn; oraz rzadszymi postaciami, w tym dziedziczną spastyczną paraplegią (HSP) i fenotypami przypominającymi stwardnienie zanikowe boczne (ALS)7,8,9. W szczególności, homozygotyczny wariant nonsensowny c.1124G>A (p.Trp375Ter) w VRK1 został udokumentowany w wielu niezależnych rodowodach dHMN z konsekwentnym dziedziczeniem autosomalnym recesywnym, co potwierdza jego ustalony związek przyczynowy z dHMN10. Wariant ten wprowadza przedwczesny kodon stop w C-końcowym regionie kodującym VRK1 i według przewidywań powoduje utratę funkcji białka, albo poprzez produkcję skróconego białka, albo poprzez aktywację rozkładu mRNA zapośredniczonego przez mechanizm nonsense-mediated decay. Choć dokładny mechanizm patologiczny nie został funkcjonalnie zwalidowany dla tego konkretnego wariantu, wysuwa się hipotezę, że upośledzona aktywność kinazy VRK1 może zakłócać naprawę DNA w neuronach oraz wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne, przyczyniając się tym samym do degeneracji neuronów ruchowych i rozwoju dHMN.

W praktyce klinicznej testy genetyczne w kierunku VRK1 powinny być priorytetowe w następujących scenariuszach: u pacjentów z klinicznie podejrzewaną dHMN, u których występuje zależny od długości dystalny niedowład ruchowy i zaniki przy zachowanym czuciu, szczególnie u osób z autosomalnym recesywnym wywiadem rodzinnym lub u których choroba wystąpiła w wieku dorosłym; u osób z rodzin konsangwinicznych z niewyjaśnioną dystalną neuropatią ruchową; u pacjentów z nakładającymi się objawami ze strony ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, których nie można przypisać innym znanym zaburzeniom genetycznym; oraz w przypadkach dHMN lub choroby Charcota-Marie-Tootha typu 2 (CMT2), w których nie stwierdzono powszechnych patogennych wariantów genów11,12. Należy uznać kilka istotnych ograniczeń tego podejścia diagnostycznego. Po pierwsze, dHMN związana z VRK1 wykazuje znaczne nakładanie się fenotypowe z innymi zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, w tym z rdzeniowym zanikiem mięśni (SMA), CMT2, HSP oraz wczesnym stadium ALS, co może prowadzić do błędnej klasyfikacji diagnostycznej. Po drugie, interpretacja rzadkich wariantów VRK1 pozostaje trudna, ponieważ większość z nich nie posiada walidacji funkcjonalnej i w dużym stopniu opiera się na narzędziach predykcji in silico, co skutkuje niepewną klasyfikacją patogenności dla części wariantów. Po trzecie, ze względu na to, że jest to badanie pojedynczego rodowodu, możliwość generalizacji naszych wyników jest ograniczona, a korelacje genotypowo-fenotypowe wymagają dalszego potwierdzenia w większych kohortach pacjentów.

Obecnie doniesienia o dHMN związanej z VRK1 w populacjach chińskich pozostają rzadkie, a pełna heterogenność fenotypowa i cechy kliniczne tego schorzenia nie zostały jeszcze w pełni określone. W niniejszym badaniu opisujemy chińską rodzinę konsanguinijną z dHMN spowodowaną homozygotycznym wariantem c.1124G>A w genie VRK1. Poprzez integrację wyników klinicznych, elektrofizjologicznych i genetycznych, charakteryzujemy cechy fenotypowe i genotypowe tej rodziny, dostarczając danych referencyjnych wspierających dokładną diagnozę kliniczną i poradnictwo genetyczne w przypadku dHMN związanej z VRK1.

OPIS PRZYPADKU:

Proband (III₁) był 24-letnim mężczyzną z Bijie w prowincji Guizhou, urodzonym z rodziców będących kuzynami pierwszego stopnia. Drzewo genealogiczne rodziny obejmujące trzy pokolenia przedstawiono na Rysunku 1; jest ono zgodne z autosomalnym recesywnym wzorcem dziedziczenia. II₁ i II₂ (rodzice probanda) byli heterozygotycznymi nosicielami wariantu VRK1 c.1124G>A i nie wykazywali objawów. Proband (III₁) był homozygotą pod względem tego wariantu i prezentował objawy kliniczne. III₂ i III₄ (starsze siostry probanda) były heterozygotycznymi nosicielami bez fenotypu klinicznego. III₃ (trzecia starsza siostra probanda) została adoptowana w dzieciństwie; zgłaszała podobne osłabienie kończyn dolnych i zanik mięśni, jednak nie uzyskano potwierdzenia genetycznego.

Objawy kliniczne

Główna dolegliwość: Postępujące osłabienie i zanik mięśni obu kończyn dolnych trwający od 2 lat.

Historia aktualnej choroby: Dwa lata wcześniej u pacjenta rozwinął się bezbolesny niedowład dystalnych części kończyn dolnych, bez wyraźnych czynników wyzwalających. Pacjent zgłaszał częste upadki podczas chodzenia po płaskim terenie, lecz był w stanie kucnąć i wstać bez pomocy. Pacjent oraz jego rodzina zauważyli stopniowe zanikanie mięśni nóg poniżej kolan. Pacjent zgłaszał słabą tolerancję wysiłku od dzieciństwa, objawiającą się trudnościami w bieganiu i skakaniu. Nie występowały drętwienia, bóle ani zaburzenia czucia temperatury w kończynach; nie stwierdzono wyraźnego niedowładu kończyn górnych ani objawów opuszkowych. Inteligencja pacjenta była w normie, a on sam pracował niezależnie jako fryzjer.

Badanie neurologiczne

Siła mięśniowa (skala MRC): zgięcie w stawie biodrowym 5/5, wyprost w stawie kolanowym 4+/5, zgięcie grzbietowe stopy 4/5, zgięcie podeszwowe stopy 3+/5 obustronnie; mięśnie proksymalne kończyn górnych 5/5, wyprost w nadgarstku 4+/5, zgięcie palców 4/5, wewnętrzne mięśnie dłoni 4/5 obustronnie.

Napięcie mięśniowe: Prawidłowe we wszystkich czterech kończynach; brak zwiększonego lub zmniejszonego napięcia.

Masa mięśniowa: Zaobserwowano wyraźny zanik mięśni dystalnych kończyn dolnych (mięśnia brzuchatego łydki, mięśnia piszczelowego przedniego oraz mięśni wewnętrznych stopy) (Rycina 2A). Kończyny górne wydawały się szczupłe, z łagodnym zanikiem mięśni wewnętrznych dłoni (Rycina 2B).

Fascykulacje: Nie zaobserwowano widocznych fascykulacji w mięśniach kończyn ani tułowia.

Odruchy ścięgniste: odruchy kończyn górnych były zniesione; odruchy ścięgniste kończyn dolnych (odruch kolanowy i skokowy) były obustronnie zniesione.

Objawy patologiczne: Obustronny objaw Babinskiego oraz objaw Chaddocka były ujemne.

Badanie czucia: Czucie powierzchowne (ból, dotyk, temperatura) oraz czucie głębokie (wibracja, pozycja) były zachowane we wszystkich kończynach.

Koordynacja: Próba palec-nos oraz próba pięta-kolano-piszczel były prawidłowe obustronnie.

Nerwy czaszkowe: Źrenice równe i reagujące na światło; ruchy gałek ocznych pełne; symetria twarzy; prawidłowe uniesienie podniebienia miękkiego; prawidłowe ruchy języka bez zaników ani fascykulacji; brak dysfagii lub dyzartrii.

Chód: Obustronny chód kroczący.

Pomocnicze badania laboratoryjne: Poziom kinazy kreatynowej (CK) w surowicy, poziom witaminy B₁₂ oraz badania funkcji tarczycy (TSH, FT3, FT4) znajdowały się w granicach normy.

Neuroobrazowanie: U tego pacjenta nie wykonano obrazowania magnetycznego rezonansu (MRI) czaszki i kręgosłupa.

Diagnostyka różnicowa

PCH1A: Wykluczono. Pacjent przechodził chorobę o początku w wieku dorosłym, nie stwierdzono mikrocefali, hipotonii, dysplazji móżdżku ani opóźnienia rozwoju, co było niezgodne z klasycznym niemowlęcym fenotypem PCH1A.

SMA: Wykluczono. U pacjenta wystąpił początek w wieku dorosłym z zajęciem wyłącznie dystalnym i prawidłową siłą mięśni proksymalnych kończyn, bez typowego dla SMA wzorca osłabienia z przewagą proksymalną.

CMT2: Wykluczono na podstawie neurofizjologii. U pacjenta wystąpiło wyłącznie zajęcie nerwów ruchowych, przy całkowicie prawidłowych potencjałach czynnościowych nerwów czuciowych, w związku z czym nie spełniono kryteriów diagnostycznych dla CMT2.

ALS: Wykluczono. Nie stwierdzono zajęcia górnego motoneuronu, objawów opuszkowych ani fascykulacji w mięśniach szyjnych lub unerwionych przez jądra opuszkowe; przewlekły postępujący przebieg z zajęciem wyłącznie dystalnym był nietypowy dla ALS.

HSP: Wykluczono. U pacjenta nie stwierdzono spastyczności, hiperrefleksji ani objawów patologicznych, a zajęcie dotyczyło wyłącznie dolnego motoneuronu.

Choroba Kennedy'ego (rdzeniowo-opłatomowy zanik mięśni, SBMA): Wykluczono. Nie stwierdzono zajęcia opuszek, nie wystąpiły fascykulacje okołoustne ani objawy endokrynologiczne; wzorzec dziedziczenia nie był zgodny z transmisją sprzężoną z chromosomem X.

Diagnoza, ocena i plan

Rozpoznanie

1. dHMN, potwierdzona homozygotycznym wariantem patogennym c.1124G>A (p.Trp375Ter) w genie VRK1 (dziedziczenie autosomalne recesywne).

2. Czysta aksonalna neuropatia ruchowa obwodowa, obejmująca głównie dystalne części kończyn dolnych.

Ocena

Pacjent zgłosił się z powoli postępującym niedowładem ruchowym dystalnym i zanikiem mięśni przy zachowanym czuciu, co jest zgodne z klasycznym fenotypem dHMN związanym z VRK1 występującym w wieku dorosłym.

Wyniki neurofizjologiczne wskazały na rozproszone uszkodzenie aksonalne ruchowe przy prawidłowym przewodnictwie czuciowym, co potwierdza czystą neuropatię ruchową.

W chwili obecnej nasilenie choroby było lekkie do umiarkowanego: pacjent pozostał sprawny ruchowo i zdolny do samodzielnego wykonywania codziennych czynności zawodowych, bez zajęcia opuszkowego lub oddechowego.

Rodowód wykazał autosomalny recesywny sposób dziedziczenia, przy czym heterozygotyczni nosiciele pozostawali bezobjawowi.

Plan leczenia i obserwacji

1. Leczenie objawowe: Zaleć orteze stawu skokowego i stopy w celu poprawy stabilności chodu i zapobiegania urazom podczas upadków; skieruj pacjenta do medycyny rehabilitacyjnej w celu opracowania indywidualnych programów treningu siłowego i rozciągania, aby utrzymać zakres ruchu w stawach i zapobiegać przykurczom.

2. Regularna obserwacja: Zaplanuj coroczne oceny neurologiczne, w tym powtarzane badania przewodnictwa nerwowego, aby monitorować postęp choroby.

3. Poradnictwo genetyczne: Zapewnienie probandowi oraz członkom jego rodziny szczegółowego poradnictwa genetycznego w zakresie ryzyka nawrotu, opcji planowania reprodukcyjnego oraz badań genetycznych przedobjawowych dla krewnych z grupy ryzyka.

4. Edukacja pacjenta: Zaleca się unikanie leków neurotoksycznych oraz nadmiernego zmęczenia; należy zapewnić wsparcie psychologiczne w celu opanowania lęku związanego z chorobą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Prowincjonalnego Szpitala Medycyny Tradycyjnej Chińskiej w Yunnan (numer zatwierdzenia: YYLW-2026-006). Przed włączeniem do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę od probanda oraz wszystkich uczestniczących członków rodziny.

1. Przygotowanie uczestników i ocena kliniczna

  1. Proband oraz dostępni członkowie rodziny zostali włączeni do badania po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody.
  2. Szczegółowe informacje demograficzne, historia choroby, wywiad rodzinny oraz informacje o pokrewieństwie zostały zebrane za pomocą standaryzowanego kwestionariusza.
  3. Przeprowadzono systematyczne badanie neurologiczne, obejmujące ocenę siły mięśniowej, napięcia mięśniowego, odruchów ścięgnistych, funkcji czuciowych, koordynacji, chodu oraz funkcji nerwów czaszkowych.
  4. Siłę wszystkich głównych grup mięśniowych udokumentowano z użyciem skali Medical Research Council (MRC).
  5. Po otrzymaniu pisemnej zgody uczestnika wykonano dokumentację fotograficzną kończyn.
    UWAGA: Wszystkie oceny kliniczne zostały przeprowadzone przez certyfikowanego neurologa specjalizującego się w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych w celu zapewnienia spójności diagnostycznej.

2. Badanie neurofizjologiczne

  1. Przygotowanie pacjenta
    1. Uczestnik został poinstruowany, aby unikać kofeiny i intensywnego wysiłku fizycznego przez co najmniej 2 h przed badaniem.
    2. Temperaturę w gabinecie badawczym utrzymywano na poziomie 24–26ºC, a temperaturę skóry kończyny utrzymywano powyżej 32ºC, w razie potrzeby stosując lampę grzewczą.
    3. Uczestnika ułożono w pozycji na plecach w cichym, słabo oświetlonym gabinecie badawczym.
  2. Badanie prędkości przewodzenia w nerwach
    1. Skórę w miejscach przykładania elektrod oczyszczono gazikami nasączonymi alkoholem w celu zmniejszenia impedancji.
    2. Powierzchniowe elektrody rejestrujące umieszczono nad punktem motorycznym docelowego mięśnia, a elektrodę referencyjną ustawiono dystalnie nad odpowiadającym mu ścięgnem.
    3. Elektrody stymulujące umieszczono wzdłuż przebiegu nerwu w standardowych punktach anatomicznych.
    4. Badania przewodzenia w nerwach ruchowych przeprowadzono obustronnie w nerwach pośrodkowych, łokciowych, piszczelowych i strzałkowych wspólnych. Zarejestrowano latencję dystalną, amplitudę złożonego potencjału czynnościowego mięśnia (CMAP) oraz prędkość przewodzenia ruchowego.
    5. Badania przewodzenia w nerwach czuciowych przeprowadzono obustronnie w nerwach pośrodkowych, łokciowych, strzałkowych powierzchownych i łydkowych, stosując odpowiednio techniki ortodromiczne lub antydromiczne. Zarejestrowano amplitudę potencjału czynnościowego nerwu czuciowego (SNAP) oraz prędkość przewodzenia czuciowego.
    6. Pasmo filtracji ustawiono na 20 Hz–10 kHz dla badań ruchowych i 20 Hz–2 kHz dla badań czuciowych. Prędkości przesuwu ustawiono odpowiednio na 2 ms/division dla badań ruchowych i 1 ms/division dla badań czuciowych.
  3. Elektromiografia igłowa
    1. Koncentryczną elektrodę igłową wprowadzono do każdego z docelowych mięśni w warunkach sterylnych.
    2. Oceniono aktywność spontaniczną w spoczynku, w tym dodatnie fale ostre, potencjały fibrylacyjne i potencjały fascykulacyjne.
    3. Morfologię potencjału jednostki motorycznej (MUP) oceniono podczas lekkiego skurczu dobrowolnego. Zmierzono czas trwania, amplitudę i polifazię.
    4. Wzorzec rekrutacji oceniono podczas maksymalnego skurczu dobrowolnego.
    5. Obustronnie zbadano mięśnie piszczelowe przednie, brzuszaste przyśrodkowe, odwodziciele palucha, pierwsze międzykostne grzbietowe, naramienne i czworogłowe (głowę prostą). Zbadano również mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe oraz przykręgosłupowe na poziomie T10.
      UWAGA: Wszystkie badania neurofizjologiczne zostały przeprowadzone przez doświadczonego elektromiografistę. Impedancję skóry utrzymywano poniżej 5 kΩ w celu zapewnienia jakości zapisu. Powtarzalność wszystkich przebiegów potwierdzono w co najmniej dwóch kolejnych stymulacjach.

3. Pobieranie próbek krwi obwodowej i ekstrakcja genomicznego DNA

  1. Krew żylna obwodowa (3–5 mL) została pobrana od każdego uczestnika do probówki z antykoagulantem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
  2. Próbki krwi przechowywano w temperaturze 4ºC bezpośrednio po pobraniu i przetworzono w ciągu 24 h.
  3. Kwas DNA genomiczny wyekstrahowano z leukocytów krwi obwodowej przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA genomicznego.
  4. Stężenie i czystość DNA zmierzono za pomocą spektrofotometru.
  5. Integralność DNA oceniono za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym.
    UWAGA: Zaakceptowano próbki DNA o stosunku A260/A280 wynoszącym 1,8–2,0 i stężeniu ≥50 ng/µL. Próbki, które nie spełniły kryteriów kontroli jakości, poddano ponownej ekstrakcji.

4. Sekwencjonowanie całego eksomu

  1. Przygotowanie biblioteki
    1. DNA genomiczne (1 μg) zostało pofragmentowane do fragmentów o długości 150–200 bp za pomocą sonikacji.
    2. Naprawę końców, dodanie ogonów A oraz ligację adapterów przeprowadzono zgodnie z protokołem zestawu do przygotowania bibliotek.
    3. Regiony eksonowe wzbogacono przy użyciu zestawu do wychwytywania całego eksomu ludzkiego zgodnie z protokołem producenta.
    4. Wychwyconą bibliotekę namnożono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a otrzymane produkty oczyszczono.
  2. Sekwencjonowanie
    1. Sekwencjonowanie par końców (paired-end) przeprowadzono na platformie do sekwencjonowania wysokoprzepustowego przy długości odczytu 150 bp.
    2. Dążono do uzyskania średniej głębokości sekwencjonowania ≥100 Χ w obrębie docelowego eksomu, przy czym ≥98% docelowych zasad miało pokrycie o głębokości ≥10Χ, a ≥95% pokrycie o głębokości ≥20Χ.
    3. UWAGA: Przed sekwencjonowaniem potwierdzono stężenie biblioteki ≥2 nM oraz rozkład wielkości insertów w zakresie 250–350 bp. Po sekwencjonowaniu oceniono wartości Q30, zawartość GC oraz głębokość pokrycia, aby potwierdzić jakość danych.

5. Analiza bioinformatyczna i filtrowanie wariantów

  1. Przeprowadzono podstawową analizę danych, obejmującą base calling, ocenę jakości oraz przycinanie adapterów.
  2. Oczyszczone odczyty dopasowano do ludzkiego genomu referencyjnego GRCh37 (hg19) przy użyciu oprogramowania do dopasowania sekwencji.
  3. Wykonano variant calling w celu identyfikacji wariantów jednonukleotydowych (SNVs) oraz małych insercji i delecji (indels).
  4. Warianty zostały adnotowane z wykorzystaniem publicznych baz danych, w tym Genome Aggregation Database (gnomAD), 1000 Genomes Project, ClinVar oraz Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM).
  5. Warianty przefiltrowano i spriorytetyzowano według następujących kryteriów:
    1. Zachowano warianty zlokalizowane w regionach eksonowych lub kanonicznych miejscach splicingowych.
    2. Wykluczono warianty częste o częstości mniejszego allelu (MAF) >0,01 w bazach populacyjnych.
    3. Priorytetowo potraktowano warianty nonsensowne, przesuwające ramkę odczytu, miejsca splicingowe oraz warianty missense, które zostały przewidziane jako szkodliwe.
    4. Geny kandydujące porównano z listami genów znanych zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Dalszy priorytet nadano genom zgodnym z autosomalnym recesywnym wzorcem dziedziczenia.
    5. Transkrypt VRK1 NM_003384.3 posłużył jako sekwencja referencyjna dla nomenklatury wariantów.

6. Walidacja sekwencjonowaniem metodą Sangera i analiza segregacji rodzinnej

  1. Zaprojektowano startery PCR flankujące miejsce kandydującego wariantu przy użyciu oprogramowania do projektowania starterów.
  2. Docelowy region genomiczny z DNA każdego członka rodziny powielono metodą PCR.
  3. Produkty PCR oczyszczono i przeprowadzono dwukierunkowe sekwencjonowanie metodą Sangera.
  4. Chromatogramy sekwencjonowania dopasowano do sekwencji referencyjnej przy użyciu oprogramowania do dopasowywania sekwencji.
  5. Zweryfikowano genotyp każdego członka rodziny i oceniono kosegregację wariantu z fenotypem choroby w drzewie rodowodowym.
    UWAGA: Potwierdzono uzyskanie czystych chromatogramów z pojedynczymi pikiem, bez szumu tła. Amplifikację PCR i sekwencjonowanie powtórzono dla próbek, które dały niejednoznaczne wyniki.

7. Klasyfikacja patogenności wariantu i potwierdzenie diagnostyczne

  1. Zweryfikowany wariant sklasyfikowano zgodnie ze standardami i wytycznymi American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) z 2015 roku.
  2. W celu ustalenia ostatecznej diagnozy molekularnej zintegrowano fenotypy kliniczne, wyniki badań neurofizjologicznych, wyniki testów genetycznych oraz dane dotyczące segregacji rodzinnej.
  3. Rodzinie zapewniono poradnictwo genetyczne w zakresie ryzyka nawrotu, opcji reprodukcyjnych oraz długoterminowych rokowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki badań genetycznych

WES wykonano u probanda, przy średniej głębokości pokrycia regionu docelowego wynoszącej 12 ×; 98,7% zasad docelowych miało pokrycie ≥10 ×, a 96,2% pokrycie ≥20 ×. Po filtrowaniu i priorytetyzacji wariantów, jako potencjalny wariant patogenny zidentyfikowano homozygotyczny wariant nonsensowny c.124G>A (p.Trp375Ter) w genie VRK1 (transkrypty NM_0384.3, wersja genomu GRCh37/hg19).

Sekwencjonowanie metodą Sangera p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu zastosowano zintegrowany schemat diagnostyczny łączący fenotypowanie kliniczne, badanie neurofizjologiczne, WES oraz analizę segregacji rodzinnej w celu zidentyfikowania homocygotycznego wariantu patogennego VRK1 c.1124G>A w chińskiej rodzinie z konsangwinicznością, u której wystąpiła dHMN o późnym początku. Niniejszy rodowód poszerza spektrum fenotypowe zaburzeń związanych z VRK1 i dostarcza danych referencyjnych do diagnostyki dHMN w populacji chińskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta została sfinansowana w ramach Krajowego Projektu Budowy Specjalności Przewagi TCM 2026 (Encefalopatia) (Yuncaishe [2025] nr 219) oraz Programu Badań Podstawowych Departamentu Nauki i Technologii Prowincji Yunnan (grant nr 202401AZ070001-057).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki &Materiały eksploatacyjne
Próżniowa probówka do pobierania krwi z antykoagulantem EDTA (5 ml)BD Biosciences (Becton, Dickinson and Company)367861
Zestaw do izolacji genomowego DNA (w formacie kolumienek wiążących) z krwi obwodowejQIAGEN; QIAamp DNA Blood Mini Kit51106
Zestaw do multipleksowej amplifikacji sond zależnej od ligacji (MLPA)MRC HollandDostosowany zestaw sond dla genu docelowego
Zestaw do amplifikacji PCR (zawiera polimerazę Taq, dNTP oraz bufor reakcyjny)Takara Bio; LA Taq PCR KitRR002A
Agaroza w proszku (klasy elektroforetycznej)Biowest111860
Zestaw do reakcji sekwencjonowania metodą Sangera (BigDye Terminator v3.1)Thermo Fisher Scientific; Applied Biosystems4337455
Zestaw do oczyszczania produktów sekwencjonowaniaThermo Fisher Scientific; zestaw do oczyszczania BigDye XTerminator Purification Kit4376484
bufor do elektroforezy TAEKlasa handlowa / przygotowane laboratoryjnie—
probówki PCR w paskach 8-dołkowych, probówki do wirowania i inne rutynowe materiały eksploatacyjneAxygen—
Instrumenty &Sprzęt
Analizator genetyczny do elektroforezy kapilarnej (platforma do sekwencjonowania Sangera)Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific3500 Dx
Termocykler gradientowy (urządzenie do PCR)Bio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
Ultramikrospektrofotometr (do oznaczania ilości kwasów nukleinowych)NanoDrop One, Thermo Fisher ScientificND-ONE-W
System poziomej elektroforezy w żelu agarozowymBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYY-6C
System dokumentacji i analizy żeliBio-Rad LaboratoriesGelDoc Go
Stołowa wysokoprędkościowa wirówka chłodzącaEppendorf5424 R
System do pomiaru prędkości przewodzenia nerwowego i elektromiografii (NCV/EMG)Natus MedicalKluczowy punkt 9033A07
Metalowa łaźnia termostatyczna / łaźnia wodnaDLAB Scientific—
Oprogramowanie do analizy
Oprogramowanie do analizy danych MLPA (Coffalyser.Net)MRC Hollandv140
Analiza pików sekwencjonowania metodą Sangera i oprogramowanie do dopasowania sekwencjiApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificAnaliza sekwencjonowania v6.0
Oprogramowanie do projektowania starterówPremier BiosoftPrimer Premier 6
Narzędzia do dopasowania sekwencji i interpretacji wariantówNCBI BLAST (online), baza danych ClinVar—

Bibliografia

  1. Tazir M, Nouioua S. Distal hereditary motor neuropathies. Rev Neurol (Paris). 2024;180(10):1031–6.
  2. Frasquet M, Sevilla T. Hereditary motor neuropathies. Curr Opin Neurol. 2022;35(5):562–70.
  3. Rossor AM. Broadening the genetic spectrum of distal hereditary motor neuropathy. Eur J Neurol. 2021;28(4):1104–5.
  4. Devic P, Petiot P. Les amyotrophies spinales distales [distal hereditary motor neuropathy]. Rev Neurol (Paris). 2011;167(11):781–90.
  5. Dick KJ, et al. Refinement of the locus for distal hereditary motor neuronopathy VII (dHMN-VII) and exclusion of candidate genes. Genome. 2008;51(11):959–62.
  6. Lazo PA. Nuclear functions regulated by the VRK1 kinase. Nucleus. 2024;15(1):2353249. doi:10.1080/19491034.2024.2353249.
  7. El-Bazzal L, et al. Loss of Cajal bodies in motor neurons from patients with novel mutations in VRK1. Hum Mol Genet. 2019;28(14):2378–94.
  8. Feng SY, Li LY, Feng SM, Zou ZY. A novel VRK1 mutation associated with recessive distal hereditary motor neuropathy. Ann Clin Transl Neurol. 2019;6(2):401–5.
  9. Marcos AT, et al. VRK1 (Y213H) homozygous mutant impairs Cajal bodies in a hereditary case of distal motor neuropathy. Ann Clin Transl Neurol. 2020;7(5):808–18.
  10. Lazo PA, Morejón-García P. VRK1 variants at the cross road of Cajal body neuropathogenic mechanisms in distal neuropathies and motor neuron diseases. Neurobiol Dis. 2023;183:106172. doi:10.1016/j.nbd.2023.106172.
  11. Capponi S, et al. HSPB1 and HSPB8 in inherited neuropathies: study of an Italian cohort of dHMN and CMT2 patients. J Peripher Nerv Syst. 2011;16(4):287–94.
  12. Luigetti M, et al. A novel HSPB1 mutation in an Italian patient with CMT2/dHMN phenotype. J Neurol Sci. 2010;298(1–2):114–17.
  13. Curthoys IS. A critical review of the neurophysiological evidence underlying clinical vestibular testing using sound, vibration and galvanic stimuli. Clin Neurophysiol. 2010;121(2):132–44.
  14. Simon AJ, et al. Whole exome sequencing (WES) approach for diagnosing primary immunodeficiencies (PIDs) in a highly consanguineous community. Clin Immunol. 2020;214:108376. doi:10.1016/j.clim.2020.108376.
  15. Miller DT, et al. ACMG SF v3.2 list for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing: a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Genet Med. 2023;25(8):100866. doi:10.1016/j.gim.2023.100866.
  16. Tan L, et al. A 9-month-old Chinese patient with Gabriele-de Vries syndrome due to novel germline mutation in the YY1 gene. Mol Genet Genomic Med. 2021;9(2):e1582. doi:10.1002/mgg3.1582.
  17. Xu K, et al. Novel VRK1 variants and a founder effect in axonal polyneuropathy. Neurol Genet. 2026;12(3):e200381. doi:10.1212/NXG.0000000000200381.
  18. Campos-Díaz A, et al. Pathogenic effects of Leu200Pro and Arg387His VRK1 protein variants on phosphorylation targets and H4K16 acetylation in distal hereditary motor neuropathy. J Mol Med (Berl). 2024;102(6):801–17.
  19. Greenbaum L, et al. Identification of a homozygous VRK1 mutation in two patients with adult-onset distal hereditary motor neuropathy. Muscle Nerve. 2020;61(3):395–400.
  20. Bos R, et al. Altered action potential waveform and shorter axonal initial segment in hiPSC-derived motor neurons with mutations in VRK1. Neurobiol Dis. 2022;164:105609. doi:10.1016/j.nbd.2021.105609.
  21. Martín-Doncel E, Rojas AM, Cantarero L, Lazo PA. VRK1 functional insufficiency due to alterations in protein stability or kinase activity of human VRK1 pathogenic variants implicated in neuromotor syndromes. Sci Rep. 2019;9(1):13381. doi:10.1038/s41598-019-49821-7.
  22. Vinograd-Byk H, Renbaum P, Levy-Lahad E. Vrk1 partial knockdown in mice results in reduced brain weight and mild motor dysfunction, and indicates neuronal VRK1 target pathways. Sci Rep. 2018;8(1):11265. doi:10.1038/s41598-018-29215-x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Gen VRK1wariant homozygotycznyneuropatia obwodowasekwencjonowanie całego egzomusekwencjonowanie metodą Sangeradziedziczenie autosomalne recesywnebadanie elektrofizjologicznezłożony potencjał czynnościowy mięśniawariant patogenny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.