Niniejszy protokół przedstawia ocenę działania zmodyfikowanego preparatu Xiaoyao San w mysim modelu depresji wywołanej chronicznym nieprzewidywalnym łagodnym stresem, obejmującą oceny behawioralne, histologiczne oraz molekularne nekroptozy neuronalnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Zmodyfikowany Xiaoyao San łagodzi zachowania depresyjne i nekroptozę neuronów w mysim modelu przewlekłego nieprzewidywalnego łagodnego stresu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Utrata i uszkodzenie neuronów są istotnymi cechami patologicznymi depresji, a nekroptoza została zaproponowana jako potencjalny mechanizm śmierci komórek neuronalnych. Analiza zbiorów danych Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE54565, GSE54566 oraz GSE54568) wykazała powiązanie między depresją a nekroptozą, co sugeruje, że hamowanie tej ścieżki może stanowić potencjalną strategię terapeutyczną. Modyfikowany Xiaoyao San (MXYS), zmodyfikowana receptura tradycyjnego chińskiego leku Xiaoyao San, został opracowany poprzez włączenie ziół oczyszczających z gorączki, chłodzących krew, poprawiających funkcje poznawcze i wspomagających reanimację w celu zwiększenia skuteczności terapeutycznej. Jednak jego wpływ na nekroptozę neuronów oraz składniki aktywne docierające do tkanki mózgowej pozostają niejasne. Do wstępnej identyfikacji składników MXYS wykrytych w tkance mózgowej wykorzystano ultra-wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (UHPLC-HRMS). Skuteczność terapeutyczną oceniono w mysim modelu depresji wywołanej przewlekłym nieprzewidywalnym łagodnym stresem (CUMS), stosując oceny behawioralne, badanie histologiczne, immunofluorescencję, western blotting oraz analizy bioinformatyczne. Podawanie MXYS wiązało się z poprawą zachowań depresyjnych, złagodzeniem patologicznych uszkodzeń mózgu oraz zmniejszeniem fosforylacji kinazy RIPK3 (receptor-interacting protein kinase 3) i białka MLKL (mixed lineage kinase domain-like protein). Wyniki te sugerują, że MXYS wykazuje działanie przeciwdepresyjne związane z redukcją markerów nekroptozy neuronalnej, co stanowi wsparcie eksperymentalne dla dalszych badań nad MXYS jako potencjalną strategią terapeutyczną w leczeniu depresji.
Wprowadzenie
Depresja, ciężkie zaburzenie psychiczne z grupy zaburzeń nastroju, charakteryzuje się przede wszystkim uporczywym obniżeniem nastroju i jest pod wpływem wielu czynników1. Klinicznie pacjenci z depresją często wykazują takie objawy jak obniżony nastrój, spowolnienie poznawcze, ograniczona komunikacja werbalna i aktywność fizyczna, a w ciężkich przypadkach zachowania autoagresywne i myśli samobójcze2. Ze względu na wysoką rozpowszechnioność, nawrotowość, stopień niepełnosprawności oraz wskaźniki samobójstw, depresja jest główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie i nakłada znaczne obciążenia społeczne oraz ekonomiczne3. Według Światowej Organizacji Zdrowia przewiduje się, że do 2030 roku depresja stanie się głównym czynnikiem przyczyniającym się do globalnego obciążenia chorobowego, wyprzedzając nowotwory oraz choroby sercowo-naczyniowe i naczyniowo-mózgowe3. Ponadto pandemia choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) wiązała się z 27,6% wzrostem globalnej rozpowszechnioności ciężkich zaburzeń depresyjnych4. W Chinach roczna rozpowszechnioność depresji wynosi 3,6%, a rozpowszechnienie w ciągu całego życia 6,8%5. Patogeneza depresji pozostaje nie w pełni zrozumiała ze względu na złożoną etiologię i liczne czynniki sprawcze. W konsekwencji opcje terapeutyczne pozostają ograniczone, a u około 30%–40% pacjentów rozwija się depresja lekooporna z powodu nieadekwatnej odpowiedzi na obecnie dostępne leki przeciwdepresyjne6. Co więcej, opóźnione działanie, objawy resztkowe, neurotoksyczność oraz działania niepożądane związane z istniejącymi lekami przeciwdepresyjnymi nadal stanowią istotne wyzwania terapeutyczne7.
Programowana śmierć komórek od dawna stanowi główny obszar badań biomedycznych. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że depresja jest powiązana z nekroptozą8,9,10,11. Nekroptoza, podobnie jak apoptoza, jest formą programowanej śmierci komórki; jednak w przeciwieństwie do apoptozy wywołuje ona wyraźne odpowiedzi immunologiczne i zapalne12. W przypadku braku aktywności kaspazy-8, czynnik martwicy nowotworów-α (TNF-α) wiąże się z receptorem czynnika martwicy nowotworów 1 (TNFR1), co prowadzi do aktywacji kinazy 1 białka oddziałującego z receptorem (RIPK1)13. Aktywowana RIPK1 oddziałuje z kinazą 3 białka oddziałującego z receptorem (RIPK3), tworząc kompleks nekrosomu, który następnie aktywuje białko podobne do kinazy o mieszanej linii (MLKL)14. Po oligomeryzacji MLKL przemieszcza się z cytoplazmy do błony komórkowej, powodując obrzęk organelli15,16, zaburzenie integralności błony komórkowej oraz uwalnianie zawartości wewnątrzkomórkowej, w tym wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMPs) i mediatorów stanu zapalnego, takich jak TNF-α, interleukina (IL)-1 oraz IL-6, co potęguje odpowiedzi zapalne17. Nekroptozę powiązano z licznymi chorobami zapalnymi i neurodegeneracyjnymi, w tym ze stwardnieniem rozsianym, depresją, stwardnieniem bocznym zanikowym, chorobą Parkinsona oraz chorobą Alzheimera18,19,20. Analizy proteomiczne wykazały, że depresja wywołana przewlekłym nieprzewidywalnym łagodnym stresem (CUMS) wiąże się ze zwiększoną ekspresją RIPK3 i MLKL oraz aktywacją szlaku nekroptozy2. W innym mysim modelu depresji indukowanej przez CUMS fluoksetyna wykazala działanie przeciwdepresyjne, które było powiązane z hamowaniem nekroptozy zależnej od RIPK110. Ponadto wykazano, że Nec-1s, inhibitor nekroptozy, łagodzi zachowania podobne do depresyjnych wywołane lipopolisacharydem (LPS)21. Ponieważ uszkodzenie neuronów jest istotną cechą patologiczną depresji, celowanie w nekroptozę może stanowić obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu depresji.
Tradycyjna medycyna chińska (TCM) ma długą historię leczenia depresji. Zgodnie z teorią TCM wątroba zarządza swobodnym przepływem qi; zatem depresję przypisuje się przede wszystkim stresowi emocjonalnemu prowadzącemu do stagnacji qi wątroby. W związku z tym główną strategią terapeutyczną jest kojenie wątroby i łagodzenie depresji. Xiaoyao San (XYS) to klasyczna receptura ziołowa szeroko stosowana w tym celu, a liczne dowody potwierdzają jej zastosowanie w leczeniu depresji22. Ponadto zgłoszono, że XYS posiada właściwości antynekroptotyczne23,24. Opierając się na koncepcjach TCM dotyczących „depresji wątroby przekształcającej się w ogień” oraz „wznoszenia się czystego yang do mózgu”, XYS zmodyfikowano poprzez dodanie Moutan Cortex (Mudan Pi) i Gardeniae Fructus (Zhizi) w celu oczyszczenia ciepła i schłodzenia krwi, wraz z Acori Tatarinowii Rhizoma (Shi Changpu) i Polygalae Radix (Yuan Zhi) dla promowania funkcji poznawczych i rekonwalescencji. Powstały preparat nazwano zmodyfikowanym Xiaoyao San (MXYS) i opracowano go w celu zapewnienia wzmocnionych efektów terapeutycznych w oparciu o zasady TCM. Jednak w niniejszym badaniu nie przeprowadzono bezpośredniego porównania z oryginalną formulacją XYS25. Badania kliniczne wykazały skuteczność przeciwdepresyjną MXYS26,27,28, a jego efekty terapeutyczne mogą być związane z regulacją osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA) oraz hamowaniem neurostanu zapalnego29,30,31. Niemniej jednak pozostaje niejasne, czy MXYS wiąże się z redukcją nekroptozy neuronalnej.
W niniejszym badaniu do wstępnej identyfikacji związków pochodnych MXYS wykrytych w tkance mózgowej wykorzystano ultra-wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (UHPLC-HRMS). Publicznie dostępne zestawy danych z Gene Expression Omnibus (GEO) oraz analizy bioinformatyczne, w tym analiza ważonej sieci koekspresji genów (WGCNA), analiza różnicowej ekspresji oraz analiza wzbogacenia, zostały użyte do zbadania powiązań między MXYS, depresją a nekroptozą. Na podstawie tych wyników postawiono hipotezę, że MXYS może wywierać działanie przeciwdepresyjne związane z redukcją markerów nekroptozy neuronalnej, przy czym szlak ATF4 (aktywujący czynnik transkrypcyjny 4)/CREB (białko wiążące element odpowiedzi cAMP)/BDNF (mózgowy czynnik neurotroficzny) stanowi potencjalny mechanizm korelacyjny. Aby zweryfikować tę hipotezę, zidentyfikowano wstępnie związki wykryte w tkance mózgowej za pomocą UHPLC-HRMS, przeprowadzono analizy bioinformatyczne w celu zidentyfikowania potencjalnych celów terapeutycznych oraz wykonano eksperymenty in vivo, aby zbadać, czy stosowanie MXYS wiąże się ze zmianami w markerach nekroptozy i szlaku ATF4/CREB/BDNF. Wyniki te dostarczają wstępnych dowodów wspierających potencjalne zastosowanie terapeutyczne MXYS w depresji, przy jednoczesnym uznaniu, że konieczne pozostają badania porównawcze z oryginalną formulacją XYS oraz walidacja zależności dawka-odpowiedź.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Henan (numer zatwierdzenia DWLLGZR202200023). Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Samce szczurów Sprague–Dawley (SD) pozyskano z licencjonowanego dostawcy zwierząt laboratoryjnych. Zwierzęta utrzymywano w kontrolowanej temperaturze i wilgotności, w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, zapewniając im standardową karmę i wodę ad libitum.
Identyfikacja składników MXYS zawartych w tkance mózgowej
Przygotowanie liofilizowanego proszku MXYS:
11 ziół wchodzących w skład MXYS namaczano w 10 objętościach wody destylowanej przez 2 h, a następnie gotowano przez 40 min. Miętę dodano w ciągu ostatnich 5 min odwaru. Drugi odwar przygotowano w ten sam sposób, używając 8 objętości wody destylowanej. Oba odwary połączono, przefiltrowano przez gazę, zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem do stężenia 1 g/mL (ekwiwalent surowca roślinnego) i liofilizowano w próżni przez 48 h w celu uzyskania liofilizowanego proszku MXYS. Wydajność ekstrakcji wyniosła 21,7% (w/w)25,29,31.
Zwierzęta i podawanie MXYS:
Dwanaście samców szczurów SD randomly przydzielono do dwóch grup, którym dwukrotnie w ciągu doby podawano drogą doustną (zgłębnikowo) MXYS lub wodę oczyszczoną. Podawanie preparatu odbywało się o godzinie 8:00 rano i 8:00 wieczorem (odstęp 12 h). Proszek MXYS rozpuszczono w wodzie oczyszczonej i podawano w dawce 24,4 g/kg (około dwukrotność dawki klinicznej dla szczurów)25. Grupa kontrolna otrzymywała wodę oczyszczoną w równoważnej objętości (10 mL/kg).
Przygotowanie tkanki mózgowej zawierającej MXYS:
Po 14 dniach wszystkie szczury zanieczulono pentobarbitalem sodowym (40 mg/kg, doglebowo) 2 h po ostatniej podaży MXYS. Tkanki mózgowe pobrano po perfuzji przezsercowej solą fizjologiczną. Całe mózgi wycięto natychmiast i umieszczono w lodzie, aby uzyskać próbki kontrolnej tkanki mózgowej oraz tkanki mózgowej traktowanej MXYS.
Warunki chromatografii/spektrometrii mas i baza danych:
Liofilizowany proszek MXYS, blanki tkanki mózgowej wzbogaconej proszkiem MXYS, blanki tkanki mózgowej oraz ekstrakty z tkanki mózgowej zawierające MXYS analizowano przy użyciu systemu ultrawydajnej chromatografii cieczowej wyposażonego w kolumnę HSS-T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) utrzymywaną w temperaturze 35°C. Fazy ruchome składały się z wody zawierającej 0,1% kwasu mrówkowego (faza ruchoma A) oraz acetonitrylu zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego (faza ruchoma B). Próbki rozdzielano przy szybkości przepływu 0,3 mL/min, stosując gradient: 5% B przez 1 min, wzrost do 98% B w ciągu 16 min, powrót do 5% B w 0,5 min i utrzymanie 5% B przez 2,5 min.
Widma masowe pozyskano w trybach dodatniej i ujemnej jonizacji przez rozpylanie elektrosprayowe, stosując akwizycję zależną od danych w zakresie m/z od 90 do 1 300. Widma MS/MS wygenerowano z 10 najintensywniejszych jonów prekursorowych, wykorzystując stopniowane energie kolizyjne dysocjacji wysokoenergetycznej o wartościach 20, 40 i 60 eV. Temperaturę kapilary utrzymano na poziomie 320°C, a temperaturę grzałki sondy ustawiono na 350°C.
Adnotacja związków została przeprowadzona poprzez dopasowanie dokładnej masy, rozkładu izotopowego i widm MS/MS do wewnętrznej bazy danych tradycyjnej medycyny chińskiej oraz publicznych baz danych GNPS32, ReSpect33 i MassBank34. Zachowano związki z wiarygodnym dopasowaniem MS/MS i spójnym kształtem piku chromatograficznego. Pełna lista związków zidentyfikowanych wstępnie znajduje się w Tabeli uzupełniającej 1.
Bioinformatyka
Wybór i przetwarzanie wstępne zestawów danych z bazy GEO:
Potencjalny udział nekroptozy w patologii depresji zbadano poprzez przeszukanie bazy GEO z użyciem słowa kluczowego „depression”. Na podstawie kryteriów wyboru do dalszej analizy wyłoniono trzy zestawy danych (GSE54566, GSE54565 i GSE54568). Zestawy danych pochodziły z różnych obszarów mózgu: GSE54565 (przednia część kory zakrętu obręczy), GSE54566 (ciało migdałowate) oraz GSE54568 (grzbietowo-boczna kora przedczołowa, BA9). Wszystkie zestawy danych zostały wygenerowane przy użyciu platformy Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array (GPL570) i składały się z próbek tkanki mózgowej pobranych po śmierci od pacjentów z dużym zaburzeniem depresyjnym (MDD) oraz kontroli niepsychiatrycznej. Szczegółowa charakterystyka próbek dla każdego zestawu danych została podsumowana w Tabeli uzupełniającej 2. Zestawy te zawierały dane transkrypcyjne z trzech obszarów mózgu zaangażowanych w depresję. Dla każdego zestawu danych przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji genów pomiędzy grupą MDD a grupą kontrolną, a spójnie zwiększone i zmniejszone poziomy ekspresji genów zintegrowano za pomocą pakietu R Robust Rank Aggregation (RRA).
Wszystkie zestawy danych zostały poddane wstępnej obróbce z wykorzystaniem algorytmu robust multi-array average (RMA) w celu korekcji tła i normalizacji. Po normalizacji RMA zastosowano algorytm ComBat zaimplementowany w pakiecie sva w języku R, aby skorygować efekty serii pomiędzy zestawami danych, przyjmując pochodzenie zestawu danych jako kowariant serii. Procedura ta zredukowała zmienność techniczną między zestawami danych i poprawiła ich porównywalność w dalszych analizach.
Analizy bioinformatyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania R (wersja 4.2.1). Główne pakiety R obejmowały ClusterProfiler (wersja 4.8.2) do analiz wzbogacenia Gene Ontology (GO) oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), WGCNA (wersja 1.72) do analizy ważonej sieci koekspresji genów, RRA do integracji genów różnicowo wyrażonych oraz sva (wersja 3.48.0) do korekcji efektu serii metodą ComBat. Workflow analityczny obejmował pozyskiwanie danych, normalizację RMA, korekcję efektu serii ComBat, analizę różnicowej ekspresji z integracją RRA, konstrukcję modułów WGCNA, analizy wzbogacenia GO i KEGG z wykorzystaniem współczynnika fałszywych odkryć (FDR) < 0.05 oraz predykcję celów wraz z analizą sieci oddziaływań białko-białko (PPI).
Wykorzystanie WGCNA do konstruowania sieci koekspresji genów i identyfikacji modułów istotnie powiązanych z depresją i nekroptozą:
WGCNA konstruuje ważone sieci koekspresji genów poprzez zastosowanie miękkiego progu potęgowania (wartość β) w celu przybliżenia topologii wolnej od skali. Wartość β wybrano w momencie, gdy współczynnik korelacji między log(k) a log(p(k)) osiągnął poziom co najmniej 0,9. Po wybraniu wartości β zidentyfikowano moduły genowe za pomocą metody dynamicznego cięcia drzewa (dynamic tree cut). Dodatkowe parametry ustawiono następująco: minModuleSize = 30, cutHeight = 0,25 oraz deepSplit = 2. Wartość β wybrano, gdy współczynnik korelacji między log(k) a log(p(k)) osiągnął co najmniej 0,9. Do konstrukcji sieci zastosowano miękki próg potęgowania β = 7. Dla każdego modułu obliczono eigengen modułu (ME), aby podsumować wzorce ekspresji genów i ocenić powiązania z cechami biologicznymi. Następnie obliczono istotność genów (GS) oraz przynależność do modułu (MM), a zależności między modułami a cechami oceniono za pomocą współczynnika korelacji (cor) i odpowiadającej mu wartości p. Wyższe współczynniki korelacji i niższe wartości p wskazywały na silniejsze powiązania między modułami genowymi a cechami biologicznymi.
Analiza wzbogacenia funkcjonalnego i konstrukcja sieci PPI:
Do przeprowadzenia analizy wzbogacenia szlaków KEGG wykorzystano narzędzie ClusterProfiler. W celu korekty wielokrotnych testów zastosowano metodę FDR Benjamini–Hochberg, a skorygowaną wartość p (FDR) < 0,05 uznano za statystycznie istotną. Po zidentyfikowaniu modułu docelowego, kluczowe geny w obrębie tego modułu zestawiono z genami związanymi z MXYS oraz nekroptozą. Następnie, przy użyciu bazy danych STRING, skonstruowano sieć PPI.
Przewidywanie celów dla związków wykrytych w tkance mózgowej:
Do przewidywania celów wykorzystano 143 związki wstępnie zidentyfikowane w tkance mózgowej szczura po podaniu MXYS. Dla każdego związku potencjalne cele pobrano z bazy danych GeneCards, korzystając z funkcji Related Targets z wynikiem istotności (relevance score) > 5. Powielone cele scalono i zachowano jedynie ludzkie geny posiadające oficjalne symbole genowe, co pozwoliło wyłonić 3 164 unikalne cele. Cele te poddano analizom wzbogacenia GO i KEGG przy użyciu pakietu R ClusterProfiler, przyjmując wartość FDR < 0,05 jako statystycznie istotną. Tło genetyczne stanowiły wszystkie ludzkie geny kodujące białka zannotowane w bazie danych KEGG.
Weryfikacja eksperymentalna
Hodowla komórkowa:
Komórki HT-22 pozyskano z Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (CL-0697, RRID: CVCL_0321) i hodowano w medium wzrostowym uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 100 U/mL penicyliny/streptomycyny. Komórki utrzymywano w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO₂.
Działanie MXYS przeciwko nekroptozie:
Liofilizowany proszek MXYS rozpuszczono w medium wzrostowego do stężenia 1,0 g/mL, wysterylizowano przez filtr membranowy 0,22 μm i przechowywano w temperaturze −20°C do momentu użycia. Komórki HT-22 wysiano w płytkach 96-dołkowych z gęstością 8 000 komórek na dołek, w trzech powtórzeniach na grupę. MXYS rozcieńczono w medium wzrostowym do stężeń końcowych 2, 4 i 6 mg/mL. Po 12 h inkubacji komórki poddano działaniu hydrochlorčku SM-164 (10 nM) oraz inhibitora kaspaz z-VAD-fmk (20 μM) przez 30 min, a następnie stymulowano ludzkim czynnikiem martwicy nowotworów-α (h-TNF-α; 20 ng/mL) przez kolejne 12 h. Żywotność komórek oceniono za pomocą luminescencyjnego testu żywotności komórek zgodnie z instrukcją producenta. Luminescencję zmierzono przy użyciu czytnika mikropłytek. Morfologię komórek zbadano pod mikroskopem odwróconym i wykonano reprezentatywne zdjęcia do analizy.
Zwierzęta:
Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Henan (numer zatwierdzenia DWLLGZR202200023). Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Do utworzenia modelu CUMS wykorzystano wyłącznie samce myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni. Zwierzęta przetrzymywano w kontrolowanej temperaturze i wilgotności, w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, z dostępem do standardowej karmy i wody ad libitum.
Model depresji indukowanej CUMS:
Myszy randomly przydzielono do grupy kontrolnej lub grupy CUMS. Po tygodniu aklimatyzacji myszy w grupie CUMS poddawano przerywanym i nieprzewidywalnym łagodnym stresorom, podczas gdy myszy kontrolne pozostawały niezakłócone. Paradygmat stresu składał się z 13 różnych stresorów, w tym przechylania klatki, potrząsania klatką, zamiany klatek, mokiej ściółki, deprywacji wody, oświetlenia stroboskopowego, ekspozycji na hałas, ciągłego światła, ciągłej ciemności, przerywanego oświetlenia, pływania w zimnej wodzie (4°C), pływania w ciepłej wodzie (40°C), stresu z unieruchomieniem oraz innych łagodnych stresorów. Każdy stresor stosowano przez 2–6 h na sesję w losowej kolejności, aby zachować nieprzewidywalność. Myszy poddawano działaniu jednego lub dwóch różnych stresorów każdego dnia zgodnie z randomizowanym harmonogramem.
Grupy i leczenie farmakologiczne:
Po sześciu tygodniach ekspozycji na CUMS myszy zostały losowo przydzielone do grup: CUMS, MXYS, paroksetyny lub Nec-1. Grupa MXYS otrzymywała liofilizowany proszek MXYS drogą gavage doustnie w dawce 35,2 g/kg/day. Grupa paroksetyny otrzymywała paroksetynę (20 mg/kg) drogą gavage doustnie, natomiast grupa Nec-1 otrzymywała Nec-1 (10 mg/kg) poprzez wstrzyknięcia doszpikowe przez cztery kolejne tygodnie. W tym samym okresie grupa kontrolna oraz grupa CUMS otrzymywały równoważną objętość soli fizjologicznej drogą gavage doustnie.
Eksperymenty behawioralne:
Myszy zostały losowo przydzielone do grup eksperymentalnych przy użyciu wygenerowanej komputerowo sekwencji liczb losowych przed rozpoczęciem podawania leku. Sekwencja randomizacji została wygenerowana przez niezależnego badacza, który nie brał udziału w późniejszych eksperymentach ani analizie danych.
Testy behawioralne zostały przeprowadzone przez badacza nieznającego przynależności zwierząt do grup badawczych. Ten sam badacz przeprowadził punktację behawioralną na podstawie nagrań wideo (czas unieruchomienia, przebyta odległość oraz czas spędzony w centrum), wykorzystując zautomatyzowane oprogramowanie do śledzenia w celu zminimalizowania subiektywizmu. Badacz nie miał dostępu do kodów przydziału do grup aż do momentu zebrania i zapisania wszystkich danych behawioralnych.
Analizy immunofluorescencyjne zostały przeprowadzone przez innego badacza, który również nie znał przydziału do grup eksperymentalnych. Próbki zostały oznaczone za pomocą kodów identyfikacyjnych, a przynależność do grup ujawniono dopiero po zakończeniu pomiarów densytometrycznych lub pomiarów intensywności fluorescencji. Analizy statystyczne zostały przeprowadzone przez trzeciego badacza, który nie znał ani przydziału do grup, ani odpowiadających im wyników eksperymentalnych aż do momentu zestawienia wszystkich danych ilościowych.
Test preferencji sacharozy (SPT): Badania behawioralne przeprowadzono po ostatnim podaniu leku. Przed testami myszy poddano aklimatyzacji do 1% roztworu sacharozy, udostępniając im przez 12 h dwie butelki zawierające 1% roztwór sacharozy, a następnie przez kolejne 12 h jedną butelkę z 1% roztworem sacharozy i jedną butelkę z wodą pitną. Następnie myszy poddano 12-godzinnemu głodzeniu i pragnieniu przed właściwym testem. Podczas testu każdej myszy udostępniono jedną butelkę z 1% roztworem sacharozy i jedną butelkę z wodą pitną. Po 12 h zmierzono objętość spożytego płynu z każdej butelki. Preferencję sacharozy obliczono według wzoru:
Test zawieszenia ogona (TST): Ogon każdej myszy przymocowano do górnej części aparatury testowej za pomocą taśmy klejącej. Zachowanie myszy rejestrowano przez 6 min przy użyciu oprogramowania do wideorejestracji i analizy behawioralnej. Ilościowo określono czas trwania unieruchomienia podczas ostatnich 4 min testu.
Test otwartego pola (OFT): Każdą mysz umieszczano indywidualnie w centrum aparatury do testu otwartego pola. Aktywność behawioralną rejestrowano i analizowano przez 5 min za pomocą oprogramowania do śledzenia zachowań, uwzględniając dystans lokomocyjny oraz aktywność ruchową. Po każdym teście aparatury oczyszczano 75% etanolem.
Pobieranie próbek:
Myszy, które padły w trakcie procedury CUMS lub wykazywały objawy ciężkiej choroby (np. spadek masy ciała >20%, widoczna infekcja lub niezdolność do poruszania się), zostały wykluczone z badania. Eutanazję przeprowadzono przez certyfikowany personel poprzez podanie przedawki pentobarbitalu sodu (150 mg/kg, doglebowo). Po utracie przytomności zastosowano zwichnięcie kręgów szyjnych jako metodę pomocniczą w celu potwierdzenia śmierci. Do analiz barwienia Nissla i immunofluorescencji w sposób losowy wybrano trzy myszy z każdej grupy. Tkanki hipokampa do analizy western blot zostały natychmiast wycięte na lodzie i zamrożone szokowo w ciekłym azocie.
Barwienie metodą Nissla:
Do barwienia metodą Nissla oraz analiz immunofluorescencyjnych myszy poddano głębokiej narkozie przy użyciu pentobarbitalu sodowego (150 mg/kg, d.o.) i poddano dekapitacji bez perfuzji transkardialnej. Mózgowia szybko usunięto i utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 24–48 h przed zatopieniem w parafinie. Przekroje parafinowe wykonano o grubości 3 μm. Sekcje parafinowe odparafinizowano poprzez sekwencyjną inkubację w roztworze do usuwania parafiny, etanolu absolutnego i 75% etanolu, a następnie przemyto bieżącą wodą. Przekroje mrożone, w stosownych przypadkach, doprowadzono do temperatury pokojowej, utrwalono utrwalaczem do tkanek przez 15 min i przemyto bieżącą wodą. Przekroje tkanek barwiono roztworem do barwienia metodą Nissla przez 2–5 min, przemyto wodą, różnicowano za pomocą 0,1% lodowatego kwasu octowego, a następnie przemyto w celu przerwania reakcji. Kontrolowano różnicowanie pod mikroskopem, po czym próbki wysuszono, przejaśniono w ksylenie przez 10 min i zamontowano w neutralnym medium montażowym.
Immunofluorescencja:
Procedury immunofluorescencyjne przeprowadzono zgodnie ze standardowymi metodami. Tkanka mózgu została utrwalona w 4% paraformaldehydzie i zatopiona w parafinie w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego. Przekroje tkanek inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko NeuN (1:200), MLKL (1:300), ATF4 (1:5000) i CREB (1:1000). Po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi przekroje przemyto czterokrotnie PBS i inkubowano przez 1 h w ciemności z odpowiednimi fluorescencyjnymi przeciwciałami wtórnymi: sprzężonym z CY3 kozim przeciwciałem anty-mysie IgG (1:300, Servicebio, GB21301) dla mysiego anty-ATF4; sprzężonym z Alexa Fluor 488 kozim przeciwciałem anty-mysie IgG (1:400, Servicebio, GB25301) dla mysiego anty-MLKL; sprzężonym z CY3 kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG (1:300, Servicebio, GB21303) dla króliczego anty-NeuN; oraz sprzężonym z Alexa Fluor 488 kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG (1:400, Servicebio, GB25303) dla króliczego anty-CREB. Następnie przekroje barwiono DAPI przez 10 min w temperaturze pokojowej, przemyto PBS i zamontowano w medium anty-fade, a obrazy fluorescencyjne pozyskano przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
Western Blot:
Tkanki mózgu homogenizowano w buforze do lizy RIPA (radioimmunoprecipitation assay). Oznaczono stężenia białek i 20 μg całkowitego białka w każdej ścieżce rozdzielono za pomocą 10% elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) przed przeniesieniem na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF). Po blokowaniu membrany inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałami pierwszorzędowymi (1:1000), a następnie inkubowano z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) przez 1 h. Prążki białkowe wizualizowano za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego, a intensywność prążków określono ilościowo przy użyciu oprogramowania ImageJ. W analizie western blot tkanek hipokampa badano po dwie myszy z grupy; przedstawiono reprezentatywne immunobloty. W przypadku eksperymentów na komórkach HT-22 analizę western blot przeprowadzono jednokrotnie jako eksperyment reprezentatywny. Dane te przedstawiono jako jakościowe obserwacje trendów, a nie jako ilościowo określone statystycznie wyniki.
Analiza statystyczna:
Różnice między grupami analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Dostępność danych:
Zbiory danych wygenerowane i przeanalizowane w ramach niniejszego badania zostały zawarte w opublikowanym artykule oraz w jego materiałach uzupełniających. Wyniki identyfikacji związków metodą UHPLC-HRMS przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 1, a charakterystyka zbiorów danych GEO wykorzystanych w analizach bioinformatycznych została podsumowana w Tabeli uzupełniającej 2. Dodatkowe dane wspierające, w tym immunofluorescencja GFAP (Rycina uzupełniająca 1), barwienie immunofluorescencyjne p-RIPK3 i p-MLKL (Rycina uzupełniająca 2), schemat projektu doświadczalnego i harmonogram przydziału zwierząt (Rycina uzupełniająca 3) oraz oryginalne, nieprzycięte obrazy z analizy western blot (Rycina uzupełniająca 4), są dostępne w materiałach uzupełniających.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Analiza WGCNA identyfikuje moduł genów związanych z depresją, wzbogacony w szlak nekroptozy
Pakiet RRA został wykorzystany do integracji genów o spójnie zwiększonej i zmniejszonej ekspresji różnicowej w zbiorach danych GSE54566, GSE54565 oraz GSE54568, co pozwoliło na zidentyfikowanie 2 513 genów. Mapa ciepła tych genów przedstawiona jest na Rysunku 1A. Trzy zbiory danych pochodziły z różnych obszarów mózgu — przedniej części kory zakrętu obręczy, ciała migdałowatego ora...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nieprawidłowa śmierć neuronów odgrywa kluczową rolę w patogenezie depresji8. Nekroptoza, będąca formą programowanej śmierci komórki, była przedmiotem intensywnych badań, co doprowadziło do znaczących postępów w opracowywaniu inhibitorów celujących w tę ścieżkę39. Od momentu zidentyfikowania inhibitora nekroptozy Nec-1 w 2005 roku40, poczyniono znaczne postępy w opracowywaniu związków celujących w kluczowe komponenty szlaku sygnałowego nekroptozy. Nec...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Konflikt interesów:
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Kluczowy Projekt Badań Naukowych Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Henan w Chinach (nr 26A360008), Projekt Badań Naukowych nad Tradycyjną Medycyną Chińską w prowincji Henan (nr 2025ZY3152), Narodową Fundację Nauk Naturalnych Chin (nr 82274496), Projekt Badań nad Nauką i Technologią prowincji Henan (nr 232301420018) oraz Projekt Dziedzictwa i Innowacji Zhang Zhongjing Departamentu Nauki i Technologii Narodowej Administracji Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (nr GZY-KJS-2022-044-1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Acori Tatarinowii Rhizoma (Acorus tatarinowii Schott; Shi Changpu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | 231001 | Składnik ziołowy (12 g) |
| Taśma klejąca | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Test zawieszenia ogonem |
| Angelicae Sinensis Radix (Angelica sinensis (Oliv.) Diels; Dang Gui) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | G01230507-16 | Składnik ziołowy (10 g) |
| Przeciwciało anty-ATF4 (immunofluorescencja) | Servicebio | GB111137 | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało anty-ATF4 (western blot) | MedChemExpress | HY-P80486 | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało anty-BDNF | MedChemExpress | HY-P80567 | Przeciwciało pierwotne do western blot |
| Przeciwciało anty-CREB | Beyotime | AF1018 | Przeciwciało pierwotne do western blot i immunofluorescencji |
| Przeciwciało anty-GAPDH | Abcam | ab181602 | Kontrola ładowania |
| Przeciwciało anty-MLKL | Proteintech | 66675-1-Ig | Przeciwciało pierwotne do western blot i immunofluorescencji |
| Przeciwciało anty-NeuN | Servicebio | GB11138 | Przeciwciało pierwotne do immunofluorescencji |
| Przeciwciało anty-fosfo-CREB | Beyotime | AF5785 | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało anty-fosfo-MLKL | Bioss | bsm-54104R | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało anty-fosfo-RIPK1 | Biolynx | BX60008 | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało anty-fosfo-RIPK3 | Abcam | ab195117 | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało anty-RIPK1 | Cell Signaling Technology | 3493S | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało anty-RIPK3 | Proteintech | 17563-1-AP | Przeciwciało pierwotne |
| Atractylodes macrocephala (Atractylodes macrocephala Koidz.; Bai Zhu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | 230801 | Składnik ziołowy (10 g) |
| Zautomatyzowane oprogramowanie do śledzenia zachowań | Panlab (Harvard Apparatus) | N/A | Oprogramowanie do śledzenia wideo SMART 3.0 dla testów otwartego pola i zawieszenia ogonem |
| Zestaw do analizy białek BCA | CWBIO | CW0014S | Kwantyfikacja białek |
| System rejestracji zachowań | Panlab (Harvard Apparatus) | SMART V3.0 | Testy otwartego pola i zawieszenia ogonem |
| System obrazowania chemiluminescencyjnego Bio-Rad | Bio-Rad | 12003154 | System obrazowania ChemiDoc MP do detekcji western blot metodą chemiluminescencji |
| Zestaw do luminescencyjnego pomiaru żywotności komórek CellTiter-Lumi II | Beyotime | C0056XL | Analiza żywotności komórek |
| Mikroskop konfokalny | Nikon Eclipse C1 | N/A | Obrazowanie immunofluorescencyjne |
| DAPI | Servicebio | G1012 | Barwnik jądrowy |
| Ekologiczny roztwór do usuwania parafiny | Servicebio | G1128 | Deparafinizacja |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | BI | C04001-500 | Suplement do hodowli komórkowej |
| Gardeniae Fructus (Gardenia jasminoides J. Ellis; Zhi Zi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | 22102109 | Składnik ziołowy (12 g) |
| Glycyrrhizae Radix (Glycyrrhiza uralensis Fisch.; Gan Cao) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | 230301 | Składnik ziołowy (3 g) |
| Kozie przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z CY3 | Servicebio | GB21301 | Fluorescencyjne przeciwciało wtórne dla mysiego anty-ATF4 (IF, CY3, 1:300) |
| Kozie przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z Alexa Fluor 488 | Servicebio | GB25301 | Fluorescencyjne przeciwciało wtórne dla mysiego anty-MLKL (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| Kozie przeciwciało anty-krolicze IgG sprzężone z CY3 | Servicebio | GB21303 | Fluorescencyjne przeciwciało wtórne dla króliczego anty-NeuN (IF, CY3, 1:300) |
| Kozie przeciwciało anty-krolicze IgG sprzężone z Alexa Fluor 488 | Servicebio | GB25303 | Fluorescencyjne przeciwciało wtórne dla króliczego anty-CREB (IF, Alexa Fluor 488, 1:400) |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG z HRP | Absin | abs20040 | Przeciwciało wtórne do western blot |
| Mysie przeciwciało anty-królicze IgG przeciwko lekkiemu łańcuchowi sprzężone z HRP | ABclonal | AS061 | Przeciwciało wtórne do western blot |
| Ludzki TNF-α | Novoprotein | C008 | Induktor nekroptozy |
| Komórki HT-22 | Procell | CL-0697 | RRID: CVCL_0321 |
| Pożywka wzrostowa HyClone | Cytiva (HyClone) | SH30022.01 | Pożywka do hodowli komórkowej |
| ImageJ | NIH | Darmowe oprogramowanie | Kwantyfikacja prążków |
| Mikroskop odwrócony | Nikon | Eclipse Ti-SR | Morfologia komórek |
| Azot ciekły | Henan Jilai New Energy Technology Co., Ltd. | N/A | Konserwacja tkanek |
| Czytnik mikropłytek Molecular Devices | Molecular Devices | SpectraMax M5 | Pomiar luminescencji |
| Moutan Cortex (Paeonia suffruticosa Andr.; Mu Danpi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | 22121714 | Składnik ziołowy (12 g) |
| Nekrostatyna-1 (Nec-1) | Selleck | S8037 | Inhibitor RIPK1 |
| Paraformaldehyd | Servicebio | G1101-500ML | Fiksacja tkanek |
| Paroksetyny chlorowodorek hemihydrat | Aladdin | P129711 | Kontrola pozytywna |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | Bufor do płukania |
| Mięta (Mentha haplocalyx Briq.; Bo He) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | 230101 | Składnik ziołowy (6 g) |
| Penicylina–streptomycyna | Gibco | 15140-122 | Antybiotyk do hodowli komórkowej |
| Polygalae Radix (Polygala tenuifolia Willd.; Yuan Zhi) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | 20221101 | Składnik ziołowy (12 g) |
| Membrana z polifluorku winylidenu (PVDF) | Merck Millipore | ISEQ00010 | Western blot |
| Poria (Wolfiporia cocos; Fu Ling) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | D23070601 | Składnik ziołowy (15 g) |
| Bufor lizujący do analizy radioimmunoprecypitacyjnej (RIPA) | CWBIO (Jiangsu Cowin Biotech Co., Ltd.) | CW2333S | Ekstrakcja białek |
| Radix Bupleuri (Bupleurum chinense DC.; Chai Hu) | Beijing Tongrentang Co., Ltd., Zhengzhou, Chiny | 230801 | Składnik ziołowy (12 g) |
| Odczynniki do SDS-PAGE | Solarbio; Servicebio; Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. | Nie dotyczy | Akrylamid, bis-akrylamid, Tris, SDS, APS i TEMED przygotowane wewnętrznie |
| Pentobarbital sodu | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 69020181 | Środek znieczulający |
| System ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej | Thermo Fisher Scientific | Vanquish UHPLC System | Analiza LC-MS |
| Kolumna UHPLC HSS-T3 (100 × 2.1 mm, 1.8 μm) | Waters | 186003539 | Rozdział chromatograficzny |
| z-VAD-fmk | TargetMol | T6013 | Inhibitor pan-kaspazy |
Bibliografia
- Zhang Y, et al. Natural volatile oils derived from herbal medicines: A promising therapy way for treating depressive disorder. Pharmacol Res. 2021;164:105376.
- O’Connor EA, et al. Depression and suicide risk screening: Updated evidence report and systematic review for the US Preventive Services Task Force. JAMA. 2023;329(23):2068-85.
- World Health Organization. The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization; Geneva; 2008.
- Pedrosa-Naudín MA, et al. Non-adherence to antidepressant treatment and related factors in a region of Spain: A population-based registry study. Pharmaceutics. 2022;14(12):2696.
- Huang Y, et al. Prevalence of mental disorders in China: A cross-sectional epidemiological study. Lancet Psychiatry. 2019;6(3):211-24.
- Thase ME. New medications for treatment-resistant depression: A brief review of recent developments. CNS Spectr. 2017;22(S1):39-48.
- Monteggia LM, Malenka RC, Deisseroth K. Depression: The best way forward. Nature. 2014;515(7526):200-1.
- Cao H, et al. Hippocampal proteomic analysis reveals activation of necroptosis and ferroptosis in a mouse model of chronic unpredictable mild stress-induced depression. Behav Brain Res. 2021;403:113261.
- Sun Y, et al. Dysmyelination by oligodendrocyte-specific ablation of Ninj2 contributes to depressive-like behaviors. Adv Sci (Weinh). 2022;9(3):e2103065.
- Zeb S, et al. Necroptotic kinases are involved in the reduction of depression-induced astrocytes and fluoxetine’s inhibitory effects on necroptotic kinases. Front Pharmacol. 2022;13:1060954.
- Duan YW, Chen SX, Li QY, Zang Y. Neuroimmune mechanisms underlying neuropathic pain: The potential role of the TNF-α-necroptosis pathway. Int J Mol Sci. 2022;23(13):7191.
- Frank D, Vince JE. Pyroptosis versus necroptosis: Similarities, differences, and crosstalk. Cell Death Differ. 2019;26(1):99-114.
- Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G. Molecular mechanisms of necroptosis: An ordered cellular explosion. Nat Rev Mol Cell Biol. 2010;11(10):700-14.
- Linkermann A, Green DR. Necroptosis. N Engl J Med. 2014;370(5):455-65.
- Sun L, et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 2012;148(1-2):213-27.
- Cai Z, et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 2014;16(1):55-65.
- Kaczmarek A, Vandenabeele P, Krysko DV. Necroptosis: The release of damage-associated molecular patterns and its physiological relevance. Immunity. 2013;38(2):209-23.
- Wallach D, Kang TB, Kovalenko A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: A historical perspective. Nat Rev Immunol. 2014;14(1):51-9.
- Yuan J, Amin P, Ofengeim D. Necroptosis and RIPK1-mediated neuroinflammation in CNS diseases. Nat Rev Neurosci. 2019;20(1):19-33.
- Mitroshina EV, Saviuk M, Vedunova MV. Necroptosis in CNS diseases: Focus on astrocytes. Front Aging Neurosci. 2022;14:1016053.
- Gong Q, et al. RIPK1 inhibition mitigates neuroinflammation and rescues depressive-like behaviors in a mouse model of LPS-induced depression. Cell Commun Signal. 2024;22(1):427.
- Kwon TG, et al. A review of antidepressant and anxiolytic effects of Soyo-san (Xiaoyao-san) and modified Soyo-san in animal models. Phytomedicine. 2024;135:155387.
- Jiao H, et al. Xiaoyaosan ameliorates CUMS-induced depressive-like and anorexia behaviors in mice via necroptosis-related cellular senescence in the hypothalamus. J Ethnopharmacol. 2024;318(Pt A):116938.
- Yan ZY, et al. Antidepressant mechanism of traditional Chinese medicine formula Xiaoyaosan in a CUMS-induced depressed mouse model via RIPK1-RIPK3-MLKL-mediated necroptosis based on network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 2021;12:773562.
- Wu M, et al. Integration of network pharmacology and experimental verification to reveal the active components and molecular mechanism of modified Danzhi Xiaoyao San in the treatment of depression. J Ethnopharmacol. 2025;337:118739.
- Chen X, et al. Therapeutic effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder combined with intravenous human umbilical cord mesenchymal stem cells on post-stroke depression. Chin J Pathophysiol. 2019;35(12):2274-79.
- Zhang J. Clinical observation of Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets in the treatment of 30 cases of depression. New J Tradit Chin Med. 2008;40(11):48-49.
- Zhang J, Zhang B. Thirty-five patients with post-stroke depression were treated with Shugan Jiannao Tiaoyu Tablets. New J Tradit Chin Med. 2006;38(3):75-76.
- Su P, et al. Modified Xiaoyao San reverses lipopolysaccharide-induced depression-like behavior through suppressing microglial M1 polarization by enhancing autophagy via the PI3K/AKT/mTOR pathway in mice. J Ethnopharmacol. 2023;308:116659.
- Guo X, et al. Effect of Jiawei Danzhi Xiaoyao Powder on mineralocorticoid receptor and glucocorticoid receptor in the hippocampus of depression model rats. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 2014;20(11):119-22.
- Wang B, et al. Modified Danzhi Xiaoyaosan inhibits neuroinflammation by regulating the TRIM31/NLRP3 inflammasome in chronic unpredictable mild stress-induced depression. Exp Gerontol. 2024;187:112451.
- Wang M, et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nat Biotechnol. 2016;34(8):828-37.
- Sawada Y, et al. RIKEN tandem mass spectral database (ReSpect) for phytochemicals: A plant-specific MS/MS-based data resource and database. Phytochemistry. 2012;82:38-45.
- Horai H, et al. MassBank: A public repository for sharing mass spectral data for life sciences. J Mass Spectrom. 2010;45(7):703-14.
- Wang M, et al. Targeting programmed cell death in inflammatory bowel disease through natural products: New insights from molecular mechanisms to targeted therapies. Phytother Res. 2024;38:4587-611.
- Huang X, et al. Shikonin overcomes drug resistance and induces necroptosis by regulating the miR-92a-1-5p/MLKL axis in chronic myeloid leukemia. Aging (Albany NY). 2020;12(17):17662-80.
- Yuan J, Najafov A, Py BF. Roles of caspases in necrotic cell death. Cell. 2016;167(7):1693-704.
- Mu R, et al. Activation of TGR5 ameliorates streptozotocin-induced cognitive impairment by modulating apoptosis, neurogenesis, and neuronal firing. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:3716609.
- Gardner CR, et al. From (tool)bench to bedside: The potential of necroptosis inhibitors. J Med Chem. 2023;66(4):2361-85.
- Degterev A ,et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat Chem Biol. 2005;1(2):112-19.
- Cao L, Mu W. Necrostatin-1 and necroptosis inhibition: Pathophysiology and therapeutic implications. Pharmacol Res. 2021;163:105297.
- Vissers M, et al. Safety, pharmacokinetics and target engagement of the novel RIPK1 inhibitor SAR443060 (DNL747) for neurodegenerative disorders: Randomized, placebo-controlled, double-blind phase I/Ib studies in healthy subjects and patients. Clin Transl Sci. 2022;15(8):2010-23.
- Mo K, et al. Targeting HNRNPC suppresses thyroid follicular epithelial cell apoptosis and necroptosis through m6A-modified ATF4 in autoimmune thyroid disease. Pharmacol Res. 2023;195:106933.
- Liu J, et al. Brain-derived neurotrophic factor elevates activating transcription factor 4 (ATF4) in neurons and promotes ATF4-dependent induction of SESN2. Front Mol Neurosci. 2018;11:62.
- Tang H, Kang R, Liu J, Tang D. ATF4 in cellular stress, ferroptosis, and cancer. Arch Toxicol. 2024;98(4):1025-41.
- Pang BPS, et al. Deficiency of muscle-generated brain-derived neurotrophic factor causes inflammatory myopathy through reactive oxygen species-mediated necroptosis and pyroptosis. Redox Biol. 2024;74:103418.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.