Artykuł metodologiczny

Zorientowana na dobrostan technika manualnej unieruchomienia myszy w celu podania substancji i pobrania krwi

21 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72535

⸱

25 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Oncology, and Tumor Immunology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 2Taskforce Refinement C3R, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité – Universitätsmedizin Berlin, 4Julius Wolff Institute for Biomechanics and Musculoskeletal Regeneration, Berlin Institute of Health at Charité – Universitätsmedizin Berlin, 5Research Facilities of Experimental Medicine, Charité – Universitätsmedizin Berlin

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje nową metodę manualnego unieruchomienia myszy podczas wstrzykiwania preparatów lub pobierania krwi, co pozwala na redukcję stresu i poprawę dobrostanu zwierząt podczas przeprowadzanych procedur.

Streszczenie

Testy na zwierzętach pozostają niezbędne w badaniach biomedycznych, znacząco przyczyniając się do zrozumienia mechanizmów chorób oraz oceny skuteczności i bezpieczeństwa leków i substancji chemicznych, przy czym gryzonie należą do najczęściej stosowanych zwierząt laboratoryjnych. Do najczęstszych interwencji w praktyce laboratoryjnej należą manipulacje i unieruchamianie podczas procedur takich jak iniekcje i pobieranie krwi, które są rutynowo wykonywane u świadomych myszy bez sedacji lub znieczulenia. Prawidłowe unieruchomienie jest niezbędne dla zapewnienia bezpieczeństwa zarówno zwierzęcia, jak i operatora. Jednakże tradycyjne metody unieruchamiania, takie jak fiksacja ręczna lub tuby ograniczające ruchy, znane są z wywoływania ostrych reakcji stresowych u myszy, co negatywnie wpływa na dobrostan zwierząt i potencjalnie rzutuje na wyniki eksperymentalne. W celu promowania udoskonalenia (refinement) w ramach zasady 3R oraz poprawy dobrostanu zwierząt, niniejszy protokół opisuje zastosowanie nowo opracowanego tunelu aplikacyjnego do iniekcji i pobierania krwi u myszy. Tunel zapewnia mniej drastyczną, a wciąż bezpieczną metodę unieruchamiania w porównaniu z technikami konwencjonalnymi. Ta zorientowana na dobrostan metoda unieruchamiania może być łatwo wdrożona w standardowych procedurach, takich jak iniekcje dosiewnicze i dożylne oraz pobieranie krwi, minimalizując stres i poprawiając warunki obsługi myszy laboratoryjnych.

Wprowadzenie

Testy na zwierzętach nadal odgrywają centralną rolę w badaniach biomedycznych, znacząco przyczyniając się do zrozumienia mechanizmów chorób oraz oceny skuteczności i bezpieczeństwa leków i substancji chemicznych. Gryzonie stanowią najczęściej wykorzystywane gatunki zwierząt laboratoryjnych; w Unii Europejskiej w 2023 roku do celów naukowych wykorzystano około 3,5 miliona myszy i 0,5 miliona szczurów1. Rosnąca świadomość społeczna dotycząca cierpienia spowodowanego procedurami eksperymentalnymi doprowadziła do wprowadzenia wymogów prawnych mających na celu poprawę dobrostanu zwierząt w badaniach naukowych, zgodnie z zasadą 3R2,3. Ponieważ całkowite zastąpienie testów na zwierzętach metodami alternatywnymi nie jest jeszcze możliwe, szczególnie istotna jest optymalizacja istniejących procedur eksperymentalnych w celu złagodzenia cierpienia zwierząt. Prace z zwierzętami, w tym stosowanie ograniczników unieruchamiających podczas takich procedur jak iniekcje, stanowią jedną z najczęstszych interwencji, którym poddawane są zwierzęta laboratoryjne zarówno podczas rutynowej opieki, jak i w trakcie eksperymentów.

Tradycyjne unieruchomienie do iniekcji doszpikowych polega na mocnym chwyceniu karku za skórę i futro kciukiem i palcem wskazującym, zabezpieczeniu ogona oraz odwróceniu zwierząt w celu odsłonięcia brzucha do wykonania zastrzyków. Pozycja ta jest nienaturalna i może prowadzić do trudności w oddychaniu, co wywołuje u zwierząt lęk4. Opisano już różne udoskonalone techniki unieruchamiania, w tym na przykład tzw. metodę trzech palców, w której nacisk na obszar szyi jest mniejszy w porównaniu do klasycznych technik chwytania za kark4. Inna metoda w dużej mierze pozwala uniknąć całkowitego unieruchomienia: w tym przypadku zwierzęta mogą trzymać się drucianej siatki, podczas gdy ogon i kończyny tylne są unieruchomione, co umożliwia dostęp do dolnej części brzucha w celu wykonania iniekcji5. Niemniej jednak obie procedury mają swoje ograniczenia. W metodzie trzech palców zwierzęta nadal muszą być podnoszone i ustawiane w nienaturalnej pozycji, co potencjalnie może wywołać reakcje stresowe. Alternatywna technika nie zapewnia z kolei wystarczającej ochrony przed ugryzieniami przez zestresowane lub broniące się zwierzęta i może ograniczać czas dostępny na wykonanie iniekcji. Oprócz potencjalnych obrażeń po ugryzieniu istnieje również zwiększone ryzyko niewłaściwego unieruchomienia lub przypadkowego zakłucia igłą. Unieruchomienie do iniekcji dożylnych lub pobierania krwi z żyły ogonowej wymaga zastosowania ograniczników, które unieruchamiają zwierzęta bez konieczności trzymania ich w dłoniach, dzięki czemu ręce pozostają wolne do wykonywania procedur. Ograniczniki to zazwyczaj rurki wykonane z przezroczystego akrylu, posiadające zamknięty koniec z otworami dostępu dla ogona oraz otwarty koniec do wkładania myszy, który można zabezpieczyć regulowanymi zatyczkami. Wymaga to podniesienia zwierząt za ogon i wciągnięcia ich do ogranicznika tyłem, aby ogon mógł zostać przełożony przez otwory dostępu. Jest to stresująca procedura, którą potęguje dość mała średnica ograniczników, niezbędna do zapobiegania obracaniu się myszy podczas zabiegów, co mogłoby doprowadzić do obrażeń6,7.

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie nowo opracowanego tunelu aplikacyjnego do iniekcji i pobierania krwi u myszy, który umożliwia mniej drastyczną, a wciąż bezpieczną unieruchomienie. Tunel składa się ze sztywnej zewnętrznej ramy oraz wyjmowanej pluszowej wyściółki wewnętrznej, która tworzy miękką, ciemną przestrzeń przypominającą norę. W porównaniu z konwencjonalnymi ogranicznikami, tunel został celowo zaprojektowany o większych wymiarach, aby pomieścić dociętą na wymiar wkładkę Vetbed Isobed, zapewniając miękką i wygodną wyściółkę wewnętrzną, która zwiększa poczucie bezpieczeństwa zwierząt przy zachowaniu wystarczającego unieruchomienia (Rysunek 1A–B). Oba końce tunelu są otwarte, dzięki czemu myszy mogą do niego wejść, po prostu wchodząc przodem i wychodząc tyłem. Po wejściu do tunelu zwierzęta nie mogą się obrócić, podczas gdy ogon pozostaje dostępny do iniekcji dożylnych lub pobierania krwi (Rysunek 1C). W przypadku iniekcji doszpikowych można uzyskać dostęp do tylnego obszaru brzucha, ustawiając tunel pod kątem (Rysunek 1D) i trzymając ogon zwierzęcia u nasady, jednocześnie wywierając lekki nacisk na obszar krzyżowy, co powoduje wygięcie tylnej części ciała myszy do góry (Rysunek 1C). Metoda ta jest mniej stresująca zarówno dla myszy, jak i dla eksperymentatorów, ponieważ nie wymaga unieruchomienia ręcznego.

Poprzednie badanie wykazało, że stosowanie tunelu do iniekcji doszpikowych trwale obniża poziom stresu i poprawia dobrostan myszy, nawet w modelach eksperymentalnych z częstymi iniekcjami doszpikowymi8. W niniejszym badaniu tunel aplikacyjny został również z powodzeniem przetestowany pod kątem iniekcji dożylnych oraz pobierania krwi z żyły ogonowej u samców i samic myszy.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w niniejszym protokole zostały przejrzane i zatwierdzone przez właściwy lokalny organ nadzorczy (State Office for Health and Social Affairs of Berlin (LAGeSo); numer zatwierdzenia 2022-077-G) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE 2.0. Wszystkie materiały użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Podanie dożylne

UWAGA: Niniejsza metoda opisuje zorientowane na dobrostan zwierząt podejście do manualnego unieruchomienia w celu podania dożylnego u myszy. Iniekcje dożylne powinny być wykonywane wyłącznie przez przeszkolony personel, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz ustalonymi procedurami bezpieczeństwa i higieny.

  1. Przygotowanie zwierząt
    UWAGA: Podczas pracy ze zwierzętami należy zawsze stosować niezbędne środki ochrony indywidualnej (ŚOI) zgodnie z instytucjonalnymi wymaganiami dotyczącymi biosafety i higieny (np. fartuchy, rękawiczki, czepki, maski).
    1. Umieść klatkę macierzystą pod czerwoną lampą na 10–15 min, aby wspomóc rozszerzenie naczyń krwionośnych i poprawić widoczność żył ogonowych.
  2. Przygotowanie obszaru roboczego
    1. Oczyść tunel aplikacyjny 70% etanolem. Pozostaw etanol do całkowitego odparowania przez około 5 min.
    2. Wewnątrz tunelu umieść zwinięty kawałek wypranego i autoklawowanego podłoża (dotnij Vetbed Isobed do wymaganego rozmiaru) (Rysunek 1B).
    3. Palcami delikatnie ściśnij podłoże przy wejściu do tunelu, aż pozostały otwór będzie miał szerokość około dwóch sąsiednich palców. Nie ściskaj podłoża bardziej.
    4. Ustaw tunel aplikacyjny na powierzchni roboczej i umieść dodatkowy kawałek płaskiego podłoża przed wejściem do tunelu.
    5. Przygotuj strzykawkę z igłą 27G zawierającą odpowiedni roztwór do wstrzyknięcia i postaw ją obok tunelu. Upewnij się, że w zasięgu ręki znajdują się gaziki i spray dezynfekcyjny.
  3. Humanitarna unieruchomienie w tunelu
    1. Przenieś mysz z klatki macierzystej za pomocą rurki do chwytania.
    2. Pozwól myszy dobrowolnie wejść do tunelu aplikacyjnego, ustawiając rurkę do chwytania bezpośrednio przed otworem tunelu (Rysunek 1C).
      UWAGA: Niektóre myszy wolą najpierw wejść na podłoże umieszczone przed tunelem aplikacyjnym, a dopiero potem dobrowolnie wejść do środka. Można zapobiec zbyt głębokiemu wejściu myszy do tunelu, delikatnie trzymając nasadę ogona.
    3. Po wejściu do środka mysz zazwyczaj pozostaje w pozycji wewnątrz zwiniętego podłoża, nie odwracając się.
      UWAGA: Jeśli myszy nie wchodzą do tunelu, otwór może być zbyt mały; należy lekko ściisnąć podłoże przy wejściu do tunelu. Jeśli myszy są zbyt małe i mają tendencję do odwracania się, należy mocniej ściisnąć zwinięte podłoże lub dodać dodatkową warstwę (Rysunek 1B).
  4. Wstrzyknięcie dożylne
    UWAGA: Wstrzyknięcie dożylne wykonuje się zgodnie z uznanymi, konwencjonalnymi procedurami wstrzykiwania do żyły ogonowej.
    1. Delikatnie wyprostuj ogon, trzymając go za końcówkę, i zdezynfekuj zamierzone miejsce wstrzyknięcia. Obróć ogon o około 90°, aby boczna żyła ogonowa znajdowała się grzbietowo.
    2. Rozpocznij wstrzykiwanie od dystalnego końca ogona, aby w razie potrzeby umożliwić kolejne próby w miejscach bardziej proksymalnych.
      KROK KRYTYCZNY: Wprowadź igłę pod kątem około 15–20° względem ogona, utrzymując igłę niemal równolegle do ogona. Wsuń igłę tylko nieznacznie poza skos, ponieważ żyły ogonowe są powierzchowne. Prawidłowe umieszczenie igły objawia się minimalnym oporem podczas wstrzykiwania i widocznym przepływem wstrzykiwanego roztworu przez żyłę. Wstrzyknij żądaną objętość powolnym, stałym tempem (≤5 mL/kg w ciągu 13 s). Po wyjęciu igły przyłóż delikatny nacisk do miejsca wstrzyknięcia za pomocą sterylnego gazika, aby zapobiec krwawieniu.
      UWAGA: Zużyte igły/strzykawki należy niezwłocznie wyrzucić do odpornych na przebicie i nieszczelności pojemników na odpady ostre. Nie należy próbować zakładać nasadek na strzykawki, aby uniknąć zranień igłami.
  5. Uwolnienie i pozytywne wzmocnienie
    1. Włóż tunel z myszą z powrotem do klatki macierzystej i pozwól zwierzęciu dobrowolnie wyjść z przeciwległego końca tunelu (Rysunek 1C).
    2. Podaj smakołyki w klatce macierzystej, aby wspierać pozytywne wzmocnienie i habituację do procedury.
  6. Czyszczenie i konserwacja
    1. Wyjmij wewnętrzne podłoże z tunelu aplikacyjnego. Oczyść tunel aplikacyjny 70% etanolem.
    2. Jeśli podłoże pozostaje czyste, można je ponownie wykorzystać w kolejnych eksperymentach. Jeśli jest zanieczyszczone lub widocznie brudne, należy je uprać i autoklawować przed ponownym użyciem.
      UWAGA: Używaj jednego podłoża na grupę eksperymentalną. Wymieniaj podłoże pomiędzy różnymi eksperymentami, pomiędzy zwierzętami płci męskiej i żeńskiej oraz zawsze wtedy, gdy wymagają tego instytucjonalne wytyczne higieniczne.

2. Podanie domięśniowe

UWAGA: Niniejsza metoda opisuje zorientowane na dobrostan podejście do ręcznego unieruchomienia podczas podawania substancji drogą doszpaniową u myszy. Iniekcje doszpaniowe powinny być wykonywane wyłącznie przez przeszkolony personel, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz ustalonymi procedurami bezpieczeństwa i higieny. Aby ułatwić dostęp do miejsca wstrzyknięcia, tunel aplikacyjny stosuje się w połączeniu z platformą nachyloną (klinem), która unosi tylną część ciała myszy do góry.

  1. Przygotowanie obszaru roboczego
    1. Oczyścić tunel aplikacyjny i klin 70% etanolem. Pozostawić etanol do całkowitego odparowania przez około 5 min.
    2. Umieścić zwinięty kawałek umytej i autoklawowanej wyściółki (przyciąć Wetbed Isobed do wymaganego rozmiaru) wewnątrz tunelu (Rycina 1B).
    3. Palcami delikatnie ścisnąć wyściółkę przy wejściu do tunelu, aż pozostały otwór będzie miał szerokość około dwóch sąsiadujących palców. Nie ściskać wyściółki mocniej
    4. Ustawić tunel aplikacyjny na górze klinu (Rycina 1D) na powierzchni roboczej i umieścić dodatkową płaską wyściółkę przed wejściem do tunelu.
    5. Przygotować strzykawkę do iniekcji z igłą 27G zawierającą odpowiedni roztwór do wstrzyknięcia i umieścić ją obok tunelu.
  2. Restrykcja zorientowana na dobrostan w tunelu
    OSTRZEŻENIE: Podczas pracy z zwierzętami zawsze należy stosować niezbędne środki ochrony osobistej (ŚOO) zgodnie z instytucjonalnymi wymogami biobezpieczeństwa i higieny (np. fartuchy, rękawice, czepki, maski).
    1. Przenieść mysz z klatki macierzystej za pomocą tuby transportowej. Pozwolić myszy dobrowolnie wejść do tunelu aplikacyjnego, ustawiając tubę transportową bezpośrednio przed otworem tunelu (Rycina 1C).
      UWAGA: Niektóre myszy wolą najpierw wejść na wyściółkę umieszczoną przed tunelem aplikacyjnym, zanim dobrowolnie wejdą do tunelu. W takim przypadku należy pozwolić myszy najpierw wejść do tunelu, a dopiero potem ustawić tunel na klinie.
    2. Gdy mysz znajdzie się wewnątrz, delikatnie przytrzymać nasadę ogona między palcem wskazującym a kciukiem, aby zapobiec przesunięciu się myszy zbyt daleko w głąb tunelu. Mysz zazwyczaj pozostaje w pozycji wewnątrz zwiniętej wyściółki bez odwracania się.
      UWAGA: Jeśli myszy nie wchodzą do tunelu, otwór może być zbyt mały; należy lekko ścisnąć wyściółkę przy wejściu do tunelu. Jeśli myszy są zbyt małe i mają tendencję do odwracania się, należy mocniej ściągnąć zwiniętą wyściółkę lub dodać dodatkową warstwę (Rycina 1B).
  3. Iniekcja doprzewnowiskowa
    1. Przytrzymać nasadę ogona kciukiem i palcem wskazującym jednej ręki (Rycina 1C). Delikatnie nacisnąć obszar sakralny palcem środkowym tej samej ręki i lekko odchylić ogon ku górze. Stabilizuje to zwierzę i zapewnia swobodny dostęp do tylnego regionu brzucha.
    2. KROK KRYTYCZNY: Wykonać iniekcję, trzymając strzykawkę równolegle do powierzchni roboczej i wprowadzając ją w wyraźnie widoczny tylny region brzucha.
    3. Po iniekcji delikatnie zmniejszyć nacisk i puścić ogon.
      OSTRZEŻENIE: Zużyte igły/strzykawki należy natychmiast wyrzucać do odpornych na przebicie i nieszczelności pojemników na odpady ostre. Nie próbować nakładać kołpaków na strzykawki, aby zapobiec przypadkowym zakłuciom igłą.
  4. Uwolnienie i pozytywne wzmocnienie
    1. Zwrócić tunel zawierający mysz do klatki macierzystej i pozwolić zwierzęciu dobrowolnie wyjść z przeciwległego końca tunelu (Rycina 1C).
    2. Podawać smakołyki w klatce macierzystej, aby wesprzeć pozytywne wzmocnienie i habituację do procedury.
  5. Czyszczenie i konserwacja
    1. Wyjąć wewnętrzną wyściółkę z tunelu aplikacyjnego. Oczyścić tunel aplikacyjny i klin 70% etanolem.
    2. Jeśli wyściółka pozostaje czysta, może być ponownie użyta w kolejnych eksperymentach. Jeśli jest zanieczyszczona lub widocznie brudna, należy ją umyć i autoklawować przed ponownym użyciem.
      UWAGA: Stosować jedną wyściółkę na grupę eksperymentalną. Wymieniać wyściółkę pomiędzy różnymi eksperymentami, pomiędzy zwierzętami płci męskiej i żeńskiej oraz zawsze wtedy, gdy wymagają tego instytucjonalne wytyczne higieniczne.

3. Pobieranie krwi z żyły ogonowej

UWAGA: Niniejsza metoda opisuje zorientowane na dobrostan zwierząt podejście do manualnego unieruchomienia w celu pobrania krwi z żyły ogonowej u myszy. Wszystkie procedury muszą być wykonywane przez przeszkolony personel, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz ustalonymi protokołami bezpieczeństwa i higieny.

  1. Przygotowanie obszaru roboczego
    1. Oczyścić tunel aplikacyjny 70% etanolem. Pozostawić etanol do całkowitego odparowania przez około 5 min.
    2. Umieścić zwinięty kawałek umytej i autoklawowanej wyściółki (dociąć Vetbed Isobed do wymaganego rozmiaru) wewnątrz tunelu (Rysunek 1B).
    3. Palcami delikatnie ścisnąć wyściółkę przy wejściu do tunelu, aż pozostały otwór będzie miał szerokość około dwóch sąsiadujących palców. Nie ściskać wyściółki mocniej.
    4. Ustawić tunel aplikacyjny na powierzchni roboczej i położyć dodatkową płaską wyściółkę przed wejściem do tunelu.
    5. Upewnić się, że lancety, mikroprobówki do pobierania krwi, wymazy i spray dezynfekujący są pod ręką.
  2. Unieruchomienie w tunelu zorientowane na dobrostan zwierząt
    UWAGA: Podczas pracy ze zwierzętami należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI) zgodnie z instytucjonalnymi wymaganiami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i higieny (np. fartuchy, rękawiczki, czepki, maski).
    1. Przenieść mysz z klatki domowej za pomocą rury transportowej. Pozwolić myszy dobrowolnie wejść do tunelu aplikacyjnego, ustawiając rurę transportową bezpośrednio przed otworem tunelu (Rysunek 1C).
      UWAGA: Niektóre myszy wolą najpierw wejść na wyściółkę umieszczoną przed tunelem aplikacyjnym, zanim dobrowolnie wejdą do tunelu. Można zapobiec zbyt głębokiemu wejściu myszy do tunelu, delikatnie trzymając mysz u nasady ogona.
    2. Po wejściu mysz zazwyczaj pozostaje w pozycji wewnątrz zwiniętej wyściółki, nie odwracając się.
      UWAGA: Jeśli myszy nie wchodzą do tunelu, otwór może być zbyt mały; należy lekko ścisnąć wyściółkę przy wejściu do tunelu. Jeśli myszy są zbyt małe i mają tendencję do odwracania się, należy mocniej ściśnąć zwiniętą wyściółkę lub dodać dodatkową warstwę (Rysunek 1B).
  3. Pobieranie krwi
    1. Delikatnie wyprostować ogon, trzymając go za końcówkę, i zdezynfekować zamierzone miejsce poboru. Obrócić ogon o około 90°, aby ustawić boczne żyły ogonowe grzbietowo.
    2. KROK KRYTYCZNY: Przebić żyłę boczną za pomocą lancety. Zebrać krople krwi do mikroprobówki lub kapilary.
      UWAGA: Zużyte lancety należy niezwłocznie wyrzucić do odpornych na przebicie i nieszczelności pojemników na odpady ostre. Nie należy próbować zakładać zatyczek na lancety, aby zapobiec zranieniom igłą.
    3. Po pobraniu krwi wywrzeć delikatny ucisk na miejsce nakłucia za pomocą sterylnego wymazu, aby zatamować krwawienie.
  4. Uwolnienie i pozytywne wzmocnienie
    1. Włożyć tunel z myszą z powrotem do klatki domowej i pozwolić zwierzęciu dobrowolnie wyjść z przeciwległego końca tunelu (Rysunek 1C).
    2. Podawać smakołyki w klatce domowej, aby wspierać pozytywne wzmocnienie i habituację do procedury.
  5. Czyszczenie i konserwacja
    1. Wyjąć wewnętrzną wyściółkę z tunelu aplikacyjnego. Oczyścić tunel aplikacyjny 70% etanolem.
    2. Jeśli wyściółka pozostaje czysta, można jej użyć ponownie w kolejnych eksperymentach. Jeśli jest zanieczyszczona lub widocznie brudna, należy ją umyć i autoklawować przed ponownym użyciem.
      UWAGA: Stosować jedną wyściółkę na grupę eksperymentalną. Wymieniać wyściółkę pomiędzy różnymi eksperymentami, pomiędzy zwierzętami płci męskiej i żeńskiej oraz zawsze wtedy, gdy wymagają tego instytucjonalne wytyczne higieniczne.

Wyniki

Aby ocenić wpływ nowej techniki unieruchamiania na dobrostan myszy, przeprowadzono pobieranie krwi z żyły ogonowej oraz wstrzyknięcia dożylne zgodnie z opisanym protokołem. Samce i samice myszy typu dzikiego C57BL/6 poddano tym procedurom albo w tunelu aplikacyjnym, albo w konwencjonalnym unieruchamiaczu, a następnie oceniono pod kątem objawów bólu i stresu. Do określenia poziomu stresu myszy po pobraniu krwi z żyły ogonowej wykorzystano skalę grymasów mysich (MGS). MGS to powszechnie stosowany system punktowy, który analizuje ekspresję mięśni twarzy jako reakcję na ból lub stresujące procedury9,10. W celu wyznaczenia punktacji wykonano zdjęcia natychmiast po zwolnieniu myszy z unieruchamiacza lub tunelu (reprezentatywne obrazy przedstawiono na Rysunku 2). Dwóch obserwatorów doświadczonych w ocenie zachowania myszy oceniło trzy parametry ekspresji twarzy (widoczne na schematach na Rysunku 2C): zwężenie oczodołów (zamknięcie powieki i zwężenie obszaru oczodołu; wokół oka może być widoczna zmarszczka), wybrzuszenie nosa (może pojawić się wybrzuszenie na grzbiecie nosa i pionowe zmarszczki po bokach nosa) oraz położenie uszu (uszy obracają się na zewnątrz i/lub do tyłu, oddalając się od twarzy, i mogą składać się, tworząc „ostry” kształt; zwiększa się odstęp między uszami). Położenia wibrysów oraz wybrzuszenia policzków nie oceniano, ponieważ ciemny kolor futra myszy utrudniał wiarygodną ocenę. Każdy parametr punktowano w skali trzystopniowej od 0 do 2 (0 = brak, 1 = umiarkowany, 2 = wyraźny), a następnie wyciągnięto średnią z trzech parametrów twarzy, aby uzyskać jeden średni wynik MGS dla każdego zwierzęcia. Aby zapewnić rzetelność, każde zwierzę było oceniane przez obu obserwatorów niezależnie i w sposób zaślepiony, a dwa wyniki MGS uśredniono w celu uzyskania końcowego wyniku MGS dla każdego zwierzęcia. Zarówno u samic, jak i u samców myszy odnotowano istotną redukcję wyniku MGS, gdy pobieranie krwi przeprowadzano w tunelu aplikacyjnym w porównaniu z konwencjonalnym unieruchamiaczem (Rysunek 2A–B).

Oddzielna grupa myszy została poddana dożylnemu wstrzyknięciu 100 µL 0,9% chlorku sodu (NaCl), a następnie odnotowano wystąpienie słyszalnych wokalizacji oraz próby obrócenia się w urządzeniu ograniczającym ruchy. Myszy wydają słyszalne piski jako sygnał silnego stresu, szczególnie w przypadku odczuwania bólu lub strachu oraz podczas zachowań obronnych11,12,13. Ponadto myszy naturalnie reagują na unieruchomienie fizyczne paniką, co skutkuje reakcją ucieczki w celu opuszczenia ograniczonej przestrzeni. Dlatego próby obrócenia się o 180 stopni w urządzeniu ograniczającym ruchy uznano za oznaki strachu. Zarówno u samic, jak i u samców myszy, zaobserwowano częstsze występowanie słyszalnych wokalizacji i prób obrócenia się podczas wykonywania wstrzyknięć dożylnych w ograniczniku w porównaniu do tunelu aplikacyjnego (Rysunek 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Nowoczesny tunel aplikacyjny. (A) Reprezentatywne obrazy ilustrujące różnicę w rozmiarze między konwencjonalnym ograniczaczem a nowoczesnym tunelem aplikacyjnym. (B) Wewnętrzna wyściółka tunelu składa się z dociętego na wymiar kawałka zwiniętego materiału Vetbed, zapewniającego miękkie, wspierające i ciemne środowisko. Jeśli myszy są zbyt małe i mają tendencję do obracania się, zwiniętą wyściółkę można zacisnąć, aby zmniejszyć dostępną przestrzeń. (C) Różne etapy manipulacji wewnątrz tunelu aplikacyjnego, w tym wejście i wyjście, bezpieczne i komfortowe unieruchomienie oraz dostęp do brzucha i ogona. (D) Dodatkowy klin do wykonywania iniekcji domięśniowych wewnątrz tunelu. Klin zwiększa kąt nachylenia tunelu względem osoby wykonującej zabieg, co ułatwia dostęp do obszaru brzusznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Skala grymasu myszy po pobraniu krwi z żyły ogonowej. Samce i samice myszy poddano pobraniu krwi albo w tunelu aplikacyjnym, albo w konwencjonalnym ograniczniku. Zdjęcia do oceny skali grymasu myszy wykonano natychmiast po wyjściu zwierząt z ogranicznika lub tunelu; następnie zostały one niezależnie ocenione przez dwóch doświadczonych eksperymentatorów, którzy nie znali przydziału myszy do grup, oceniając stopień zmrużenia oczu, wybrzuszenie nosa oraz pozycję uszu. Dla każdego zwierzęcia obliczono średnią na podstawie dwóch ocen. (A) Samice myszy (tunel n = 5; ogranicznik n = 8). (B) Samce myszy (tunel n = 11; ogranicznik n = 11). Wykres ten został zaadaptowany z pracy Schlutt et al., 2026, PLOS ONE. Oryginalne dane, opublikowane w formie wykresu słupkowego na licencji CC BY 4.0, zostały zmodyfikowane i przedstawione tutaj w formie wykresu pudełkowego. (C) Schematyczny rysunek jednostek działania twarzy stworzony z opracowanego przez autorów promptu tekstowego przy użyciu ChatGPT Image 2 (OpenAI; dostępny pod adresem https://chatgpt.com/); końcowy obraz został sprawdzony i zatwierdzony przez autorów pod kątem poprawności naukowej. Dane przedstawiono jako wykresy pudełkowe (min do max); linia wskazuje średnią. Test Mann-Whitney, wartości p < 0,05 uznano za istotne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3Słyszalne wokalizacje i próby odwrócenia się po wstrzyknięciu dożylnym. Myszy, samce lub samice, poddano dożylnemu wstrzyknięciu 100 µL 0,9% NaCl w tunelu aplikacyjnym lub konwencjonalnym ograniczniku. Podczas procedury rejestrowano przypadki słyszalnej wokalizacji oraz prób odwrócenia się wewnątrz urządzenia ograniczającego (tak/nie). Wszystkie grupy n = 10. Dane przedstawiono na skumulowanych wykresach słupkowych zależności. Dokładny test Fishera, p-wartości < Wartość 0,05 uznano za istotną. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Rycina uzupełniająca 1: Iniekcja doszpczewna u szczurów z wykorzystaniem większej wersji tunelu aplikacyjnego.Do iniekcji doszpczewnej u szczurów zastosowano tunel aplikacyjny o średnicy 15 cm. Procedurę przeprowadzono zgodnie z tym samym protokołem, który opisano dla myszy. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ta technika unieruchamiania została opracowana w celu podawania substancji i pobierania krwi, aby wesprzeć podejście zgodne z najlepszymi praktykami w zakresie dobrostanu zwierząt. Niektóre środowiska naukowe wciąż wykazują niechęć do wdrażania udoskonalonych metod obchodzenia się i unieruchamiania zwierząt, które różnią się od długo ugruntowanych procedur standardowych, szczególnie gdy wymagają one dodatkowego czasu i wysiłku. Jednakże redukcja stresu u zwierząt laboratoryjnych jest nie tylko pożądana z perspektywy dobrostanu zwierząt, ale przyczynia się również znacząco do sukcesu eksperymentalnego poprzez zmniejszenie zmienności danych, minimalizację zmian fizjologicznych indukowanych stresem oraz ograniczenie liczby nieudanych prób i strat w grupie zwierząt. Niniejszy protokół przedstawia łatwą w implementacji metodę, która znacząco poprawia dobrostan zwierząt, zapewniając jednocześnie bezpieczne unieruchomienie i swobodny dostęp do zwierzęcia, co umożliwia bezpieczne przeprowadzanie procedur aplikacji i pobierania próbek.

Kluczowym krokiem w protokole jest zapewnienie pomyślnego wejścia i stabilnego ustawienia zwierzęcia w tunelu aplikacyjnym. W przypadku dobrowolnego wejścia zaleca się dwa możliwe podejścia: bezpośrednie wejście z rurki transferowej do tunelu lub najpierw umieszczenie myszy z rurki transferowej na uprzednio przygotowanej miękkiej wyściółce, z której mogą wejść do tunelu. Optymalne podejście zależy od zachowania zwierząt i obie metody powinny zostać ocenione. Wariantem preferowanym jest ten, w którym myszy wchodzą najszybciej i z najmniejszą niechęcią. Jeśli myszy wahają się przed wejściem do tunelu, należy rozważyć kilka czynników: (1) otwór wejściowy może być zbyt wąski, w takim przypadku wyściółkę można lekko ścisnąć, aby powiększyć otwór; (2) sygnały zapachowe z wewnętrznej wyściółki mogą wpływać na akceptację, dlatego wyściółki powinny najlepiej zachowywać znany zapach klatki, przy jednoczesnym zapewnieniu separacji między grupami eksperymentalnymi, klatkami i płciami oraz wymianie zabrudzonego materiału, aby uniknąć mylących zapachów; (3) wykazano, że myszy czują się bezpieczniej na powierzchniach o kolorach zbliżonych do koloru ich futra14, dlatego dopasowanie koloru wyściółki do futra zwierząt może być korzystne; oraz (4) skierowanie otworu tunelu w stronę ścianki klatki może zachęcić do wejścia, ponieważ myszy nadal widzą klatkę domową i współlokatorów. Potencjalnym ograniczeniem tunelu aplikacyjnego jest to, że opiera się on na dobrowolnym wejściu zwierzęcia, co może być postrzegane jako wprowadzenie krótkiego opóźnienia przed leczeniem lub pobraniem próbek. Jednak w niniejszym badaniu myszy wchodziły do tunelu szybko i konsekwentnie, zazwyczaj w czasie 2–10 s, co pozwoliło na przeprowadzenie procedur w wąskim i powtarzalnym oknie czasowym. Chociaż podejście to może wymagać nieco więcej czasu niż konwencjonalne unieruchomienie za pomocą chwytu za kark, niewielny wzrost czasu manipulacji należy rozważyć w zestawieniu ze znaczną poprawą dobrostanu zwierząt osiągniętą poprzez redukcję stresu związanego z obsługą. Co więcej, umieszczenie w konwencjonalnych unieruchamiaczach również wiąże się z czasem manipulacji, ponieważ myszy często stawiają opór przy umieszczaniu, co sprawia, że nie ma istotnej różnicy. W mniej niż 5% przypadków myszy nie weszły dobrowolnie do tunelu. Choć opisane powyżej środki były zazwyczaj wystarczające, aby zachęcić do wejścia, w razie potrzeby można było również delikatnie pomóc zwierzętom w wejściu do tunelu. Nawet w tych przypadkach miękka wewnętrzna wyściółka zapewnia przewagę w zakresie dobrostanu nad konwencjonalnymi unieruchamiaczami.

Po wprowadzeniu do tunelu myszy mogą pewnie chwycić jego wewnętrzną wyściółkę. Jest to bardzo korzystne z punktu widzenia dobrostanu zwierząt, ponieważ wykazano, że unieruchomione myszy przejawiają niższy poziom stresu, gdy podczas manipulacji mogą trzymać się powierzchni4. Jednocześnie operator może pewnie trzymać nasadę ogona, bez ryzyka, że mysz będzie próbowała się odwrócić. Niezbędne jest, aby wewnętrzna wyściółka ściśle opaszała zwierzę. Jeśli myszy są zbyt małe i mają tendencję do obracania się wewnątrz tunelu, można szybko wprowadzić korekty poprzez mocniejsze zaciśnięcie zwiniętej wyściółki lub dodanie dodatkowej warstwy. W przypadku eksperymentów z udziałem zwierząt o różnych rozmiarach (np. ze względu na różnice w wieku, płci lub diecie), można również zastosować tunele o różnych średnicach (patrz szablony do druku8).

Iniekcje i pobieranie krwi powinny być zawsze wykonywane przez przeszkolony personel. Niemniej jednak, zastosowanie tunelu okazało się skuteczne zarówno dla wysoko wykwalifikowanego personelu, jak i dla użytkowników z mniejszym doświadczeniem. W szczególności personel bez doświadczenia zgłaszał mniej nieudanych prób, co ograniczyło liczbę powtórzeń czynności i skróciło czas trwania procedur. Użytkownicy raportowali również większy komfort i poczucie bezpieczeństwa podczas unieruchamiania myszy w tunelu w porównaniu do nauki konwencjonalnych technik unieruchamiania manualnego. Stanowi to znaczną zaletę dla laboratoriów z częstą rotacją personelu, ponieważ metoda jest łatwa do wdrożenia i przynosi korzyści zarówno zwierzętom, jak i eksperymentatorowi. Obserwacje te są zgodne z wcześniej raportowanymi poprawami w zakresie komfortu manipulacji i pewności techników związanych z udoskonalonymi technikami obsługi, takimi jak wykorzystanie tunelu i kubka15.

Co istotne, opisana tutaj metoda jest skuteczna nawet u myszy niewytrenowanych, a wszystkie przedstawione wyniki uzyskano przy użyciu zwierząt bez wcześniejszej habituacji. Wcześniejsze badania wykazały, że habituacja i trening medyczny zwierząt mogą zmniejszyć reakcje stresowe u myszy poprzez oswojenie ich z planowanymi procedurami16,17. Protokół treningowy uwzględniający tunel aplikacyjny może zatem dodatkowo obniżyć poziom stresu, zwłaszcza gdy konieczne są częste interwencje, które w przeciwnym razie mogłyby wywołać negatywne skojarzenia z tunelem. Taki program treningowy został z sukcesem zastosowany w poprzednim badaniu, co pozwoliło nam na wielokrotne wykorzystanie tunelu do iniekcji dosytrawniczych przez wiele tygodni8. Szczególnie w badaniach wymagających powtarzalnych iniekcji, tunel ten może stanowić istotne udoskonalenie metodologiczne. Wykazano, że udoskonalone techniki manipulacji z wykorzystaniem rurek transportowych i ograniczeniem unieruchomienia utrzymują pozytywne efekty nawet po wielokrotnym unieruchomieniu za kark lub iniekcjach dosytrawniczych, w tym zwiększoną chęć do interakcji z opiekunami oraz zmniejszone zachowania lękowe w standardowych testach behawioralnych18,19. Podobnie, powtarzane iniekcje wykonywane w tunelu nie zwiększyły parametrów związanych ze stresem u myszy8.

Wykazano, że nagrody pokarmowe ułatwiają habituację poprzez pozytywne wzmocnienie, co jest powszechnie uznaną zasadą w treningu zwierząt. Dlatego zaleca się podawanie niewielkiego smakołyku na koniec każdej sesji manipulacji w ramach nagrody. Podczas testowania tunelu wystarczające były bardzo małe ilości, np. jedno ziarno owsa, co prawdopodobnie nie zakłóca normalnej diety zwierząt. Jeśli spożycie pokarmu budzi obawy, na przykład w badaniach metabolicznych, dostępne są smakołyki smakowe kompatybilne ze specjalistycznymi dietami (np. dietami ketogenicznymi). Co istotne, smakołyki należy traktować jako dodatkowy środek udoskonalający (refinement), który usprawnia habituację, a nie jako warunek niezbędny do pomyślnego korzystania z tunelu aplikacyjnego. Po zapoznaniu się z systemem myszy dobrowolnie i wielokrotnie wchodziły do tunelu aplikacyjnego również bez otrzymywania nagrody pokarmowej.

Opisana tutaj metoda posiada pewne ograniczenia w odniesieniu do dostępu do konkretnych obszarów ciała. O ile do ogona można łatwo i bezpiecznie uzyskać dostęp w celu wykonania wstrzykiwań dożylnych i pobrania krwi, a tylny obszar brzucha nadaje się do wstrzykiwań doszczelnych, o tyle dostęp do bocznych obszarów ciała w celu aplikacji podskórnych jest ograniczony. Należy również dokładnie rozważyć podawanie doustne. Konwencjonalne zgłębnikowanie nie jest możliwe w tym systemie, ponieważ nie można uzyskać wymaganego wyprostu szyi. Jednakże bardziej precyzyjne metody podawania doustnego, w których myszy dobrowolnie spożywają substancje z końcówki pipety (np. zmieszane z zagęszczonym mlekiem)20, mogą być wykonalne przez otwartą stronę tunelu. W takich przypadkach należy upewnić się, że głowa pozostaje wyraźnie widoczna i że mysz nie znajduje się zbyt głęboko w wyściółce lub tunelu, aby potwierdzić całkowite spożycie substancji.

W porównaniu z istniejącymi tunelami unieruchamiającymi, opisany tutaj tunel aplikacyjny oferuje wyraźne zalety w zakresie dobrostanu zwierząt. Chociaż unieruchomienie jest często konieczne dla bezpiecznego przeprowadzenia procedur aplikacji i pobierania próbek, jest ono również uznawane za jeden z największych stresorów, których doświadczają gryzonie podczas procedur eksperymentalnych7,21,22. Poprzednie badania wykazały już, że zastąpienie tradycyjnego chwytania za ogon i unieruchamiania metodami udoskonalonymi, takimi jak chwytanie za pomocą tunelu lub kubka, znacznie poprawia dobrostan zwierząt. Myszy traktowane tymi udoskonalnionymi metodami wykazują niższy poziom lęku i większą chęć do interakcji z opiekunami niż myszy podnoszone za ogon23,24. Stosowanie tunelu aplikacyjnego, do którego myszy wchodzą dobrowolnie, jest konsekwentnym rozwinięciem metody chwytania za pomocą tunelu. Skala grymasów u myszy opuszczających tunel aplikacyjny wskazuje, że zwierzęta nie czują się unieruchomione ani uwięzione. Choć metoda iniekcji doszpikowej przy myszach trzymających się kraty klatki przypomina opisane podnoszenie za obszar miednicy5, ta pierwsza opiera się na próbie ucieczki zwierząt. Na kracie myszy trzymają się łapami i ciągną do przodu, z dala od uścisku opiekuna, co prowadzi do unieruchomienia i w konsekwencji do stresu. Dodatkowo tego typu unieruchomienie zwiększa napięcie mięśni brzucha, co wtórnie nasila ból podczas nakłucia igłą. W przeciwieństwie do tego, tunel aplikacyjny stanowi udoskonaloną metodę unieruchomienia, a wyniki wskazują na obniżenie parametrów związanych ze stresem, w tym niższe wyniki w skali grymasów, rzadsze słyszalne wokalizacje oraz utrzymanie chęci do interakcji z opiekunami811,12,13. Chociaż wokalizacje ultradźwiękowe (USVs) są coraz częściej uznawane za etologicznie istotne sygnały komunikacyjne, ich wykorzystanie jako markerów stresu u dorosłych myszy pozostaje przedmiotem badań, ponieważ USVs są wysoce zależne od kontekstu i występują również podczas normalnych zachowań fizjologicznych25.

Niemniej jednak, ostatnie dowody sugerują, że rejestracja USV może stanowić obiecującą, nieinwazyjną i powtarzalną metodę oceny reakcji behawioralnych na unieruchomienie26. Włączenie rejestracji USV do przyszłych badań może zatem dostarczyć dodatkowego obiektywnego pomiaru, pozwalającego na dalszą charakterystykę stresu i reakcji emocjonalnych. Wszystkie te wyniki wskazują, że tunel aplikacyjny umożliwia bezpieczniejszą i mniej stresującą procedurę unieruchomienia podczas rutynowych aplikacji i pobierania próbek w porównaniu z konwencjonalnymi unieruchamiaczami. Co istotne, w przeciwieństwie do przezroczystych akrylowych unieruchamiaczy, miękka wyściółka wewnętrzna pozwala myszom na pewny chwyt powierzchni, co jest uważane za ważną poprawę dobrostanu zgodnie z zaleceniami NC3Rs27. Wewnątrz tunelu zaobserwowano znacznie mniej prób odwrócenia się, co poprawiło zarówno dobrostan, jak i bezpieczeństwo obsługi. W konwencjonalnych plastikowych unieruchamiaczach próby odwrócenia się są często powiązane z oddawaniem moczu, a powstałe mokre futro dodatkowo pogarsza komfort. Problem ten został w dużej mierze wyeliminowany dzięki zastosowaniu tunelu aplikacyjnego.

Potencjalne zastosowania tej metody są szerokie. Warto zauważyć, że ulepszona metoda unieruchamiania nie ogranicza się do myszy, lecz może być stosowana również u szczurów przy użyciu tunelu o większej średnicy (Rycina uzupełniająca 1). Gryzonie są najszerzej stosowanymi gatunkami zwierząt laboratoryjnych we wszystkich dyscyplinach naukowych, a unieruchamianie w celu podania substancji i pobierania próbek jest rutynową procedurą w wielu laboratoriach. Wykazano jednak, że stres związany z unieruchomieniem nie tylko pogarsza dobrostan zwierząt, ale także znacząco wpływa na wyniki naukowe, w tym na reakcje behawioralne.28,29 or mechanizmach fizjologicznych, takich jak funkcja odpornościowa30W związku z tym minimalizacja zmienności związanej ze stresem jest kluczowa zarówno dla rzetelności naukowej, jak i kwestii etycznych w eksperymentach na zwierzętach. Poprzez redukcję stresu związanego z unieruchomieniem, przy jednoczesnym zachowaniu bezpiecznego i praktycznego sposobu manipulowania zwierzętami, zastosowanie tunelu może znacząco poprawić jakość i powtarzalność eksperymentów, zwiększając jednocześnie dobrostan zwierząt.

Oświadczenia

A.S., J.K.U. i L.H. są właścicielami wzoru użytkowego tunelu wtryskowego w Niemczech (numer rejestracyjny 20 2024 100 448). Pozostali autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy pracownikom zwierzęcego laboratorium Charité oraz inspektorom ds. dobrostanu zwierząt, w szczególności dr. André Dülsnera, za wsparcie; jednostce Charité 3R za wsparcie finansowe przy upowszechnianiu tunelu aplikacyjnego; oraz wszystkim członkom grupy roboczej Charité 3R Refinement Taskforce za pomocne dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lancety do testów alergii, sterylneHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH, Hamburg, Germany1110106
Tunel aplikacyjny z opcjonalnym klinemTunel wydrukowany w 3D wewnątrz placówkiszablony do druku dostępne pod adresem https://osf.io/vsjnb.
Probówki do pobierania krwi: Microvette 100 EDTA K3E, 100 µL SARSTEDT AG & Co. KG, Nümbrecht, Germany20.1278.100
Przezroczysta probówka transportowaDatesand Group, Stockport, UKGZCHTUBE-100rozmiar: 50 x 3 x 100 mm
Etanol, ≥70%Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyT913.1
Strzykawka do precyzyjnego dozowania jednorazowego Inject-F 1 mL B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany9166017V
OwsiankaSchapfen Mühle GmbH Co.KG, Ulm, GermanyW100197autoklawowana
Lampa podczerwona Sanitas SIL 06Beurer Europe GmbH, Ulm, Germany61424
Miękka wyściółka wewnętrzna: Original Vetbed Isobed SLVetbed Deutschland, Mudersbach, Germany1999981docięta do wymaganych rozmiarów
Spray dezynfekcyjny Softasept ISO 70%B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany19905
Sterylne jednorazowe igły podskórne Sterican 27 G x ¾B.Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany4657705Brozmiar: 0.40 mm x 20 mm
Wymazy: medyczne aplikatory FIWA appFink & Walter GmbH, Merchweiler, Germany329012

Bibliografia

  1. Joint Research Center (JRC-ISPRA). Summary report on statistical information on the use of animals for scientific purposes in the Member States of the European Union and Norway in 2023. Luxembourg: Publications Office of the European Union; 2026.
  2. European Parliament and Council of the European Union. Directive 2010/63/EU of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Off J Eur Union. 2010;L276:33–79.
  3. Russell WMS, Burch RL. The principles of humane experimental technique. London: Methuen & Co. Ltd.; 1959.
  4. Labitt RN, Oxford EM, Davis AK, Butler SD, Daugherity EK. A validated smartphone-based electrocardiogram reveals severe bradyarrhythmias during immobilizing restraint in mice of both sexes and four strains. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2021;60(2):201–12.
  5. Baek JM, Kwak SC, Kim JY, Ahn SJ, Jun HY, Yoon KH, et al. Evaluation of a novel technique for intraperitoneal injections in mice. Lab Anim (NY). 2015;44(11):440–4.
  6. Turner PV, Pekow C, Vasbinder MA, Brabb T. Administration of substances to laboratory animals: equipment considerations, vehicle selection, and solute preparation. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2011;50(5):614–27.
  7. Meijer MK, Spruijt BM, van Zutphen LF, Baumans V. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 2006;40(4):382–91.
  8. Schlutt A, Riesner K, Kochan M, Mess AK, Jahn D, Lurje I, et al. A novel application tunnel in combination with medical training reduces stress induced by frequent intraperitoneal injections and blood draws in mice. PLoS One. 2026;21(5):e0341404.
  9. Onuma K, Watanabe M, Sasaki N. The grimace scale: a useful tool for assessing pain in laboratory animals. Exp Anim. 2024;73(3):234–45.
  10. Whittaker AL, Liu Y, Barker TH. Methods used and application of the mouse grimace scale in biomedical research 10 years on: a scoping review. Animals (Basel). 2021;11(3).
  11. Ruat J, Genewsky AJ, Heinz DE, Kaltwasser SF, Canteras NS, Czisch M, et al. Why do mice squeak. Toward a better understanding of defensive vocalization. iScience. 2022;25(7):104657.
  12. Ehret G. Schallsignale der Hausmaus (Mus musculus). Behaviour. 1974;52(1-2):38–56.
  13. Blanchard RJ, Hebert MA, Ferrari PF, Palanza P, Figueira R, Blanchard DC, et al. Defensive behaviors in wild and laboratory (Swiss) mice: the Mouse Defense Test Battery. Physiol Behav. 1998;65(2):201–9.
  14. Kawakami K, Xiao B, Ohno R, Ferdaus MZ, Tongu M, Yamada K, et al. Color preferences of laboratory mice for bedding materials: evaluation using radiotelemetry. Exp Anim. 2012;61(2):109–17.
  15. Davies JR, Purawijaya DA, Bartlett JM, Robinson ESJ. Impact of refinements to handling and restraint methods in mice. Animals (Basel). 2022;12(17).
  16. Leussis MP, Bolivar VJ. Habituation in rodents: a review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci Biobehav Rev. 2006;30(7):1045–64.
  17. Ahlström T. Handling and training mice and rats: low stress procedures. London: National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs); 2023.
  18. Henderson LJ, Dani B, Serrano EMN, Smulders TV, Roughan JV. Benefits of tunnel handling persist after repeated restraint, injection, and anesthesia. Sci Rep. 2020;10(1):14562.
  19. Gouveia K, Hurst JL. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Sci Rep. 2019;9(1):20305.
  20. Krzyzaniak O, Steiner S, Nilsson FAM, Dietrich M, Kampfen L, Johansen P, et al. Applicability of the micropipette-guided drug administration (MDA) method for assessing reward-related behaviors in mice. Physiol Behav. 2025;299:114967.
  21. Cinelli P, Rettich A, Seifert B, Burki K, Arras M. Comparative analysis and physiological impact of different tissue biopsy methodologies used for the genotyping of laboratory mice. Lab Anim. 2007;41(2):174–84.
  22. Pare WP, Glavin GB. Restraint stress in biomedical research: a review. Neurosci Biobehav Rev. 1986;10(3):339–70.
  23. Hurst JL, West RS. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 2010;7(10):825–6.
  24. Gouveia K, Hurst JL. Reducing mouse anxiety during handling: effect of experience with handling tunnels. PLoS One. 2013;8(6):e66401.
  25. Faure A, Pittaras E, Nosjean A, Chabout J, Cressant A, Granon S. Social behaviors and acoustic vocalizations in different strains of mice. Behav Brain Res. 2017;320:383–90.
  26. Yamauchi T, Yoshioka T, Yamada D, Hamano T, Ohashi M, Matsumoto M, et al. Cold-restraint stress-induced ultrasonic vocalization as a novel tool to measure anxiety in mice. Biol Pharm Bull. 2022;45(3):268–75.
  27. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs). Handling and restraint: General principles. London: NC3Rs; https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/handling-and-restraint
  28. Lee EH, Park JY, Kwon HJ, Han PL. Repeated exposure to short-term behavioral stress resolves pre-existing stress-induced depressive-like behavior in mice. Nat Commun. 2021;12(1):6682.
  29. Mink D, Horvath D, Basler M. Protocol to study social transmission of stress in group-housed mice using restraint stress. STAR Protoc. 2025;6(4):104224.
  30. Ding JX, Rudak PT, Inoue W, Haeryfar SMM. Physical restraint of mouse models to assess immune responses under stress with or without habituation. STAR Protoc. 2021;2(4):100838.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dobrostan zwierz tmyszy laboratoryjneunieruchomienie w tuneluiniekcja doszpikowainiekcja do ylnaredukcja stresuzasada 3R
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły