Beznacznikowa metoda pomiaru impedancji w czasie rzeczywistym do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwwirusowych

Podsumowanie

Metoda analizy komórkowej w czasie rzeczywistym (RTCA) oparta na impedancji umożliwia bezznakową kwantyfikację efektów cytopatycznych wywołanych przez wirusy w czasie rzeczywistym, zapewniając szybką metodę oceny związków przeciwwirusowych i przeciwciał monoklonalnych poprzez zintegrowany, sterowany programowo schemat analizy.

Streszczenie

Technologie oparte na impedancji stanowią solidny i obiektywny sposób ilościowego określania efektów cytopatycznych (CPE) w monowarstwach kultur komórkowych, pokonując ograniczenia tradycyjnych analiz punktowych lub subiektywnych ocen wizualnych. Wirusy cytolityczne zazwyczaj wywołują wyraźne zmiany morfologiczne i śmierć komórek w zainfekowanych kulturach, co sprawia, że pomiary impedancji, odzwierciedlające zmiany w adhezji, morfologii i żywotności komórek, są czułym i dynamicznym wskaźnikiem infekcji i progresji wirusa. W rezultacie odczyty oparte na impedancji oferują potężne i wydajne podejście do oceny ochronnych efektów interwencji przeciwwirusowych. Niniejsze badanie przedstawia bezetykietową platformę przesiewową w czasie rzeczywistym, która wykorzystuje zaawansowane systemy pomiaru impedancji do ciągłego monitorowania indukowanych przez wirusy CPE. Podejście to umożliwia szybką, ilościową ocenę skuteczności przeciwwirusowej zarówno w przypadku leków małocząsteczkowych, jak i przeciwciał monoklonalnych, bez konieczności stosowania dodatkowych etapów znakowania lub barwienia. Protokół szczegółowo opisuje cały przebieg analizy, od wysiewu komórek i infekcji wirusowej po akwizycję i analizę danych. Ponadto zintegrowane z systemem oprogramowanie, stworzone specjalnie dla zastosowań w wirusologii, usprawnia przetwarzanie i interpretację danych, ułatwiając określenie potencjału neutralizacji przeciwciał monoklonalnych oraz aktywności związków przeciwwirusowych.

Wprowadzenie

W obliczu zagrożenia epidemią wirusową szczepionki i terapeutyki przeciwwirusowe stanowią główne strategie ograniczania transmisji wirusów oraz leczenia zakażonych pacjentów¹. Szczepionki zapobiegają infekcjom poprzez przygotowanie układu odpornościowego do rozpoznawania patogenów, zapewniając proaktywną i długoterminową ochronę. Terapeutyki przeciwwirusowe mają różne zastosowania, zależnie od modalności i konstrukcji leku. Podobnie jak szczepionki, przeciwciała monoklonalne mogą zapewnić proaktywną, trwałą ochronę (od tygodni do wielu miesięcy), a także mogą być wykorzystywane jako narzędzie do kontroli poekspozycyjnej. Zarówno przeciwciała monoklonalne, jak i małocząsteczkowe terapeutyki przeciwwirusowe są stosowane w leczeniu rozwiniętych infekcji poprzez bezpośrednie celowanie w komponenty wirusowe lub ich hamowanie, co redukuje ciężkość przebiegu choroby i służy jako reaktywna, krótkoterminowa interwencja.

Konwencjonalnym podejściem do funkcjonalnej oceny aktywności przeciwwirusowej w systemach biologicznych jest test neutralizacji z redukcją wirusa (VRNT), który ilościowo określa redukcję tworzenia plamiek w testach neutralizacji z redukcją plamek (PRNT), ognisk via immunobarwienia w teście neutralizacji z redukcją ognisk (FRNT) lub efektów cytopatycznych (CPE) przy użyciu testów opartych na żywotności komórek. PRNT jest uważany za złoty standard fenotypowej metody określania aktywności hamującej środków przeciwwirusowych przeciwko szerokiemu zakresowi infekcji wirusowych². Jednakże PRNT jest czasochłonny i pracochłonny, a interpretacja wyników może być subiektywna, szczególnie gdy podczas przedłużanej inkubacji dochodzi do przerostu lub fuzji plamek. Obiektywizm odczytów testu można poprawić, stosując FRNT, który opiera się na detekcji antygenów specyficznych dla wirusa lub ekspresji genu reporterowego. Podejście to może być jednak ograniczone dostępnością i wydajnością wysokiej jakości przeciwciał lub enzymów detekcyjnych. Kilka odczynników i protokołów testowych jest dobrze ugruntowanych i powszechnie stosowanych do oceny żywotności komórek, mierząc określone aspekty CPE. Enzymatyczna redukcja kolorymetrycznego odczynnika MTT (bromek 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenylo-2H-tetrazoliu), soli monotetrazoliowej, przez dehydrogenazy mitochondrialne w żywych komórkach generuje mierzalny sygnał kolorymetryczny spowodowany powstaniem barwnego produktu – formazanu. Odczynnik do testu żywotności (który lizuje komórki i uwalnia wewnątrzkomórkowe ATP napędzające reakcję katalizowaną przez lucyferazę, przekształcającą substrat lucyferynę w oksylucyferynę) jest jednorodnym testem luminescencyjnym. Takie testy żywotności komórek mogą być wykorzystywane do ilościowego określania zmniejszenia CPE podczas przesiewu środków przeciwwirusowych³. Jednak metody te wymagają również wielokrotnych etapów przemywania i barwienia i, podobnie jak testy PRNT i FRNT, są testami końcowymi. W rezultacie częściowo skuteczne środki przeciwwirusowe, które wywierają opóźniony wpływ na infekcję wirusową, mogą zostać pominięte, jeśli test przeciwwirusowy zostanie zakończony w suboptymalnym punkcie czasowym. Dlatego istnieje silna potrzeba opracowania zautomatyzowanego testu o średniej lub wysokiej przepustowości, który umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórkowych na infekcje wirusowe.

Systemy analizy komórkowej w czasie rzeczywistym (RTCA) umożliwiają ciągłe monitorowanie rozwoju efektu cytopatycznego (CPE) oraz odpowiedzi przeciwwirusowych w dopuszczalnych modelach komórkowych poprzez bezznacznikowy, nieinwazyjny odczyt oparty na impedancji. Indukowany przez wirusy efekt CPE obejmuje nie tylko śmierć komórek, ale także zmiany w morfologii i adhezji komórkowej, z których wszystkie mogą być czule wykrywane poprzez zmiany impedancji elektrycznej^4,5. Pomiary impedancji te są uzyskiwane przy użyciu złotych mikroelektrod wbudowanych w specjalistyczną 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, co pozwala na ilościową ocenę dynamicznych odpowiedzi komórkowych bez konieczności stosowania znaczników lub ekspresji genów reporterowych. Technologia RTCA była szeroko raportowana w wykrywaniu CPE w różnych modelach komórkowych zainfekowanych wirusami z wielu rodzin oraz w ocenie aktywności neutralizującej przeciwciał^6–10.

W niniejszej pracy przedstawiono kluczowe etapy tej bezetykietowej metody pomiaru impedancji w czasie rzeczywistym in vitro zdefiniowano testy przeciwwirusowe. Podejście to oparto na wcześniejszych badaniach obejmujących przesiewowe poszukiwanie związków przeciwwirusowych w komórkach HEK293A zainfekowanych adenowirusem 5 oraz ocenę przeciwciał neutralizujących z wykorzystaniem zdolnego do replikacji rekombinowanego wirusa zapalenia pęcherzykowego jamy ustnej wykazującego ekspresję glikoproteiny wirusa Lassa (rVSV-LASV(Lin IV)) w komórkach Vero CCL-81¹¹Wszystkie te eksperymenty przeprowadzono w systemie RTCA MP, który umożliwia jednoczesne uruchomienie do 6× płytek 96-dołkowych jednocześnie. Celem niniejszej pracy było stworzenie podstaw dla przesiewowych badań przeciwwirusniczych opartych na impedancji. Metodę tę można łatwo rozszerzyć na szeroki zakres modeli wirus-komórka po zdefiniowaniu optymalnych warunków analizy zgodnie z opisanym tutaj protokołem.

Protokół

Odczynniki i sprzęt wykorzystane w procedurze wymieniono w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla i pasażowanie komórek dopuszczających

UWAGA: W niniejszym protokole komórki Vero CCL-81 są wykorzystywane do neutralizacji przeciwciał, natomiast komórki HEK293A służą do przesiewania związków przeciwwirusowych. Aby zmniejszyć zmienność między eksperymentami, wysoce zaleca się stworzenie banku komórek permissywnych o tym samym numerze pasażu do przeprowadzenia analizy.

1. Przed użyciem podgrzać pożywkę do hodowli komórek — DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny — w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
2. Rozmrozić fiolkę z krio konserwowanymi komórkami permissywnymi w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aż do momentu, gdy pozostanie jedynie mały kryształ lodu; nie zanurzać zakrętki w kąpieli wodnej. 
3. Po przetarciu zewnętrznej strony fiolki 70% etanolem, umieścić ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza (BSC).
4. Ostrożnie przenieść komórki do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL i dodawać kroplowo 9 mL ogrzanej pożywki wzrostowej do komórek. Delikatnie wymieszać.
5. Odwirować zawiesinę komórkową przy 200 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
6. Przenieść resuspenderowane komórki w 5 mL uprzednio ogrzanej pożywki wzrostowej do nowej kolby T-25.
7. Hodować komórki do osiągnięcia 80%–90% konfluencji w inkubatorze przy 37°C i 5% CO₂ przed kolejnym pasażowaniem komórek. 
8. Przeprowadzić pasaż komórek.
   1. Odssać pożywkę i delikatnie dwukrotnie przemyć monowarstwę komórkową 3 mL 1× roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) bez jonów wapnia i magnezu, aby usunąć pozostałości pożywki wzrostowej.
   2. Do kolby dodać 2 mL 0,25% trypsyny-EDTA tak, aby pokryła komórki.
   3. Po 2–5 min inkubacji w 37°C zneutralizować trypsynę, dodając pięciokrotność objętości ogrzanej pożywki wzrostowej.
   4. Resuspenderować komórki, delikatnie pipetując zawiesinę komórkową w górę i w dół przy ściance kolby.
   5. Zasiać komórki z pożywką w pożądanej gęstości siewu lub stosunku podziału. 
      UWAGA: Pożądana gęstość siewu komórek jest określana empirycznie na podstawie tempa wzrostu komórek, częstotliwości pasażowania oraz docelowej konfluencji w momencie pasażowania. Na przykład siew komórek Vero CCL-81 w gęstości minimum 0,4 × 10⁴ komórek/cm² pozwala na pasażowanie komórek co 3 dni, zanim osiągną one 90% konfluencji.

2. Przesiewowe badanie czynników przeciwwirusowych

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schemat badania przesiewowego przeciwirusowego opartego na pomiarze impedancji. W skrócie, komórki podatne są wysiewane do 96-dołkowych mikropłytek zintegrowanych z mikroelektroniką, a ich kondycja jest monitorowana przez około 24 h przed rozpoczęciem testu. W przypadku testów neutralizacji przeciwciał, wirusy o stałej wielokrotności zakażenia (MOI) są mieszane z przeciwciałami i inkubowane wstępnie przez 1 h przed dodaniem do komórek. W przeciwieństwie do tego, podczas przesiewania związków przeciwirusowych, wirusy o stałej MOI oraz związki są dodawane do komórek jednocześnie. Wywołany przez wirusa efekt cytopatyczny (CPE) jest stale monitorowany za pomocą odczytów opartych na impedancji, a analiza danych może być przeprowadzana w trakcie trwania testu lub po jego zakończeniu.

1. Dzień 0: Pomiar tła płytki i wysiew komórek permisywnych
   1. Aby rozpocząć eksperyment, otwórz oprogramowanie urządzenia (RTCA Pro) i wybrać odpowiedni uchwyt do analizy. Następnie wybrać Wirusologia moduł przed rozpoczęciem eksperymentu.
   2. Wprowadź wszelkie istotne uwagi w Uwagi do eksperymentu karta (np. Nazwa eksperymentu, Nr seryjny urządzenia, Typ urządzenialub inne istotne szczegóły). Pola te są opcjonalne i mogą pozostać puste, jeśli nie mają zastosowania.
   3. Przejdź do Układ zakładkę i zdefiniuj dołki użyte w doświadczeniu. Jeśli niektóre dołki nie będą używane, należy zaznaczyć nieużywane dołki, kliknąć prawym przyciskiem myszy w interfejsie układu płytki, a następnie wybrać Wyłącz studzienkę(i) z menu rozwijanego, aby wykluczyć je z analizy.
   4. Pomiar tła mikropłytki 96-dołkowej zintegrowanej z mikroelektrodami
      1. Odmierzyć 50 µL pożywki do analizy do każdej studzienki płytki za pomocą pipety wielokanałowej w trybie pipetowania odwróconego, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza.
         UWAGA: Dobór pożywki do testu powinien zostać zoptymalizowany przed rozpoczęciem screeningu, aby zminimalizować zakłócenia czułości testu i zapewnić dokładną ocenę skuteczności leczenia. Na przykład testy neutralizacji przeciwciał przeprowadzono w pożywce DMEM zawierającej 2% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny, natomiast testy screeningowe związków przeciwwirusowych przeprowadzono w pożywce do wzrostu komórek, DMEM zawierającej 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny.
      2. Umieść płytkę w uchwycie urządzenia znajdującym się wewnątrz 37 °C inkubator z 5% CO2₂Upewnij się, że płyta jest ustawiona prawidłowo, a dołek A1 znajduje się w wskazanym miejscu. Następnie sprawdź kartę Komunikatów (Message tab) pod kątem ewentualnych powiadomień o błędach.
         UWAGA: Przy każdym umieszczaniu płytki w uchwycie należy upewnić się, że wyświetla się komunikat „Plate scanned. Connections okay”. W przypadku wystąpienia błędu należy wyjąć płytkę i ponownie umieścić ją w uchwycie.
      3. Przejdź do Harmonogram karta; Domyślnie wyświetla się krok 1, ponieważ jest on wymagany do pomiaru tła płytki. Kliknij w Start przycisk rozpoczynający pomiar z dołków. Krok ten kończy się automatycznie po zarejestrowaniu pojedynczego pomiaru impedancji tła.
         UWAGA: Ten krok wyznaczania tła musi zostać wykonany przed każdym eksperymentem. Wszystkie studzienki wykorzystywane w eksperymencie powinny zawierać wyłącznie medium do analizy (tj. przed wysianiem komórek).
   5. Dopuszczalny siew komórek do 96-dołkowej płytki zintegrowanej z mikroelektrodami
      1. Przeprowadź trypsynizację komórek dopuszczalnych w kolbie T25, postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji dotyczącej pasażowania komórek dopuszczalnych.
      2. Należy policzyć komórki resuspenderowane w medium testowym i przeprowadzić następujące obliczenia:
         1. Oblicz całkowitą liczbę żywych komórek w zawiesinie, korzystając z gęstości żywych komórek: Całkowita liczba żywych komórek = gęstość żywych komórek × objętość zawiesiny
         2. Dostosuj zawiesinę komórkową do końcowej gęstości (np. 0,30–0,35 × 10⁶ komórek/ml dla Vero CCL-81, co odpowiada około 15 000–18 000 komórek na 50 µLlub 0,12 × 10⁶ komórek/ml dla HEK293A, co odpowiada 6 000 komórek na 50 µL).
            UWAGA: Wcześniej ustalono, że gęstości wysiewu te są optymalne dla każdego modelu wirus-komórka. Właściwa gęstość wysiewu komórek jest kluczowa, ponieważ zastosowanie zbyt dużej lub zbyt małej liczby komórek może wpłynąć na czułość analizy.
      3. Wyjmij płytkę mikrotitracyjną zawierającą 50 µL pożywki do testu z urządzenia i przenieś ją do BSC w celu wysiewania komórek.
      4. Odmierzyć 50 µL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki płytki za pomocą pipety wielokanałowej w trybie odwrotnego pipetowania w celu zminimalizowania powstawania pęcherzyków powietrza, tak aby objętość końcowa w każdej studzience wynosiła 100 µL.
   6. Po dodaniu komórek pozostawić płytkę w BSC w temperaturze pokojowej przez 30 min, aby zapewnić równomierny rozkład komórek na dnie każdej studni.
   7. Włóż płytkę z powrotem do uchwytu instrumentu znajdującego się wewnątrz 37 °C inkubator z 5% CO2₂.
      UWAGA: W przypadku użycia wielu płytek należy każdą z nich wyraźnie oznakować i upewnić się, że została ona umieszczona w tym samym uchwycie, który był używany podczas pomiaru tła.
   8. Przejdź do Układ przejdź do karty i otwórz Komórka zakładka. Wybrać odpowiednie dołki, wprowadzić komórki dopuszczalne Nazwa i Numeri kliknij w Zastosuj aby zapisać informacje. Informacje o komórkach można wprowadzać lub aktualizować w dowolnym momencie trwania eksperymentu.
   9. Dodaj krok 2 na Harmonogram zakładkę, korzystając z domyślnych ustawień rejestracji (100 przejść i 15-minutowy odstęp), a następnie kliknij Start w celu rozpoczęcia ciągłego nocnego monitorowania adhezji i proliferacji komórek.
      UWAGA: Ten etap służy jako pomiar kontroli jakości (QC) komórek przed inokulacją wirusa. Ponieważ indeks komórkowy (CI) odzwierciedla adhezję i proliferację komórek, wartości CI uzyskane w okresie od 18 do 24 godzin po wysianiu są wykorzystywane jako kluczowy wskaźnik QC. Powtarzalność zachowania komórek w różnych eksperymentach jest niezbędna dla optymalnej odtwarzalności testu. Należy zauważyć, że zarówno amplituda CI, jak i profile kinetyczne są specyficzne dla danego typu komórek. Na przykład po inkubacji nocnej zdrowe komórki Vero CCL-81 wysiane w zagęszczeniu 18 000 komórek/dołek zazwyczaj wykazują indeks komórkowy w zakresie 6–8, podczas gdy zdrowe komórki HEK293A wysiane w zagęszczeniu 6 000 komórek/dołek zazwyczaj wykazują indeks komórkowy w zakresie 0,8–1,2.
2. Dzień 1: Przesiewowe badanie agentów przeciwwirusowych w oparciu o impedancję
   UWAGA: Przed przeprowadzeniem testu przesiewowego należy odpowiednio miareczkować wirusa w celu określenia optymalnego rozcieńczenia roboczego. Krok ten pozwala ustalić stężenie wirusa, które zapewnia wysoką i powtarzalną wydajność testu przy jednoczesnym spełnieniu zdefiniowanych przez użytkownika wymagań, takich jak pożądany czas trwania badania. Na przykład w protokole neutralizacji przeciwciał¹¹do testu neutralizacji wybrano wielokrotność zakażenia (MOI) wynoszącą 0,01, ponieważ pozwoliło to uzyskać całkowity (100%) efekt cytopatyczny (CPE) w ciągu 40 h po inokulacji. W teście opartym na impedancji całkowity CPE objawia się spadkiem indeksu komórkowego (Cell Index) lub znormalizowanego indeksu komórkowego (Normalized Cell Index) do zera. Podczas screeningu związków przeciwwirusowych zastosowano MOI wynoszące 1, a 100% CPE zaobserwowano w ciągu 70 h po inokulacji. Protokół miareczkowania wirusa przeprowadzono zgodnie z uznanymi procedurami opisanymi w poprzednim raporcie¹²Jeśli w analizie wykorzystywane są wirusy zakaźne, należy upewnić się, że przestrzegano wszystkich właściwych środków ostrożności. Należy zapoznać się z sekcją dotyczącą wytycznych bezpieczeństwa w zakresie obchodzenia się z wirusami zakaźnymi.
   1. Przygotować wirusa w określonym stężeniu oraz sporządzić rozcieńczenia seryjne przeciwciała lub związku przeciwwirusowego w medium testowym.
   2. W przypadku testów neutralizacji przeciwciał monoklonalnych należy wymieszać 60 µL wirusa w 4× końcowe stężenie w analizie z 60 µL przeciwciała w stężeniu 4× końcowe stężenie w teście i inkubować w 37 °C przez 1 h przed dodaniem do komórek permisywnych. Po wymieszaniu wirus i przeciwciało znajdują się w stężeniu 2× ich ostatecznych stężeń w analizie. W przeciwieństwie do nich, w testach przesiewowych związków przeciwwirusowych nie jest wymagana inkubacja wstępna wirusa ze związkiem.
   3. Przejdź do Układ przejdź do karty i wybierz Leczenie zakładka do wprowadzania informacji o leczeniu lekami przeciwwirusowymi w odpowiednich studzienkach.
   4. Wybierz studzienki dla tej samej serii badawczej, a następnie wprowadź Nazwa odczynników i wprowadzić początkowe Rozcieńczanie lub StężenieNa przykład, jeśli stężenie początkowe wynosi 10 µg/mL, wprowadź 10 i wybierz µg/mL jako „Jednostka”. Wprowadź 3 jako Współczynnik rozcieńczenia oraz określ Kierunek rozcieńczenia (np. od góry do dołu).
      UWAGA: Po kliknięciu w Zastosujstężenia lub rozcieńczenia czynnika przeciwwirusowego zostaną automatycznie obliczone i zapisane na podstawie wprowadzonego układu płytki oraz wyświetlone w odpowiednich studzienkach. Obliczone wartości są również zapisywane w celu późniejszej analizy danych. Wprowadzenie informacji o wirusie (np. Nazwa i Rozcieńczanie) jest opcjonalne, ponieważ w teście zastosowano jedną stałą wartość MOI dla wszystkich studni traktowanych wirusem.
   5. Wyznaczyć studzienki poddane wyłącznie działaniu wirusa jako kontrole pozytywne, wybierając odpowiednie studzienki i klikając Kontrola dodatnia pod Typ dołka.
   6. Wyznaczyć studzienki niezinfekowane jako kontrole negatywne, postępując zgodnie z opisanym powyżej krokiem i sprawdzając Kontrola negatywna pod Typ dołka.
      UWAGA: Prawidłowe przypisanie studzienek zawierających wyłącznie wirusy oraz studzienek niezarażonych jako Kontrola dodatnia i Kontrola negatywnaodpowiednio, przy użyciu Typ studzienki odpowiednie ustawienie jest kluczowe, ponieważ wartości CI z tych studzienek są wykorzystywane we wszystkich obliczeniach związanych z neutralizacją (np. %neutralizacji). Do obliczeń dotyczących CPE (np. %CPE) wymagane są wyraźnie wyznaczone studzienki kontroli negatywnej. W przypadku testów neutralizacji przeciwciał silnie zaleca się umieszczenie na tej samej płytce przeciwciał kontroli pozytywnej i negatywnej, aby zapewnić dokładną interpretację danych. Jednakże przeciwciała kontrolne te powinny zostać oznaczone jako Próbki pod Typ studzienki.
   7. Gdy test jest gotowy do dodania czynnika przeciwwirusowego, należy nacisnąć Przerwij aktualny krok przycisk umożliwiający pominięcie pozostałych przejść (sweep) w Kroku 2 i przejście do następnego etapu.
   8. Kliknij w Odblokuj płytkę przycisk, a następnie wyjąć płytkę z uchwytu i umieścić ją w BSC.
   9. Ostrożnie nanieś 100 µL mieszaniny wirusa z przeciwciałami lub mieszaniny wirusa z związkiem przeciwwirusowym do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej, tak aby końcowa objętość w studzience wynosiła 200 µLInokulum zawiera wirusa oraz przeciwciało lub związek przeciwwirusowy w stężeniu 2× ich końcowe stężenia w teście, które po dodaniu do komórek zostają rozcieńczone do końcowych stężeń roboczych.
   10. Po umieszczeniu płytki z powrotem w uchwycie, przejdź do Harmonogram przejdź do karty i dodaj Krok 3. Określ liczbę Skanowania oraz Interwałl między przeskanowaniami. Należy upewnić się, że całkowity czas skanowania (liczba przeskanowań × interwał) przekracza przewidywany czas trwania terapii. Kliknij w Start aby wznowić akwizycję danych i kontynuować analizę.
       UWAGA: Wyznaczenie oddzielnego kroku (np. Kroku 3) po dodaniu środka przeciwwirusowego ułatwia identyfikację okresu monitorowania po zastosowaniu leczenia. Zawsze programuj każdy krok (z wyjątkiem Kroku 1) na czas dłuższy niż przewidywany czas trwania analizy. Po osiągnięciu zaprogramowanego czasu pracy instrument przestanie rejestrować pomiary, co spowoduje brak punktów danych.
3. Dzień 1 i kolejne: Analiza danych
   1. Aby przejrzeć zapisy w czasie rzeczywistym i/lub analizę odpowiedzi komórkowych podczas akwizycji danych, należy przejść do Analiza danych zakładka, wybierz konkretny punkt czasowy lub przedział czasowy, a następnie zaznacz i dodaj studzienki, które mają zostać uwzględnione w analizie i wyświetlone na wykresie.
   2. Wybierz parametry z Oś Y menu rozwijane. Gdy Znormalizowany wskaźnik komórkowy wybrano (NCI), należy określić Czas normalizacji, punkt czasowy bezpośrednio przed rozpoczęciem leczenia, z rozwijanej listy czasu. %CPE lub %Neutralizacja można również wyświetlić, wybierając odpowiednią opcję z rozwijanego menu osi Y.
      UWAGA: Przyrząd wykorzystuje bezwymiarowy parametr, indeks komórkowy (Cell Index, CI), do reprezentowania impedancji. W celu oceny różnic w działaniu preparatów przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu naturalnej zmienności między poszczególnymi studzienkami zaleca się stosowanie znormalizowanego indeksu komórkowego (Normalized Cell Index, NCI).
   3. Przejdź do Parametr sekcja dotycząca Analiza danych zakładka umożliwiająca obliczenie i wygenerowanie różnych typów wykresów, takich jak wykres słupkowy oraz krzywe zależności dawka-odpowiedź oparte na regresji logistycznej 4-parametrowej (4PL, ze zmiennym nachyleniem) dla określonego punktu czasowego (np. w połowie czasu trwania lub w punkcie końcowym testu). Alternatywnie, IC₅₀ wartość wyznaczona na podstawie pola pod krzywą (AUC) indeksu komórkowego (Cell Index) lub znormalizowanego indeksu komórkowego po przeprowadzeniu zabiegu pozwala na określenie całkowitej odpowiedzi na dawkę środków przeciwwirusowych w całym okresie leczenia.
   4. Po zakończeniu testu kliknij w Pauzanastępnie naciśnij przycisk Odblokuj płytkę przycisk. Wyjąć płytkę z uchwytu i elektronicznie Uwolnienie to poprzez ten Płytka menu

3. Wytyczne dotyczące bezpieczeństwa przy pracy z wirusami zakaźnymi

1. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym podwójne rękawiczki, przyłbicę oraz fartuch laboratoryjny. Jest to zdecydowanie zalecane podczas pracy z wirusami.
2. Materiały zawierające wirusy oraz ich naniesienie na płytki należy wykonywać wyłącznie wewnątrz sprawnej komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC).
3. Transport fiolek z wirusem oraz płytek zawierających wirusy do i z BSC należy przeprowadzać w szczelnym pojemniku do transportu materiałów biologicznych.
4. Przed i po pracy z materiałami zawierającymi wirusy w BSC należy dokładnie spryskać wszystkie powierzchnie wewnętrzne środkiem dezynfekcyjnym i odczekać 5 min, aby zapewnić całkowitą inaktywację wirusa. Następnie należy przetrzeć powierzchnie i zdezynfekować je 70% etanolem w celu usunięcia pozostałości środka dezynfekcyjnego.
5. Po zakończeniu testu przesiewowego leków przeciwwirusowych opartego na impedancji, należy wyjąć wszystkie płytki z urządzenia i przetransportować je w szczelnym pojemniku do transportu materiałów biologicznych bezpośrednio do czystej komory BSC.
6. Przygotować świeży 20% roztwór wybielacza i dodać go do każdego dołka na płytkach testowych. Pozostawić wybielacz na 10 min, a następnie odessać go ze wszystkich dołków i zutylizować płytki.
7. Wszystkie płytki testowe, pipety serologiczne, końcówki do pipet, probówki i inne jednorazowe elementy plastikowe, które mogły mieć kontakt z wirusem, należy zdekontaminować wybielaczem i wyrzucić do wyznaczonych worków na odpady biologiczne.
8. Plastikowe elementy wielorazowego użytku, takie jak statywy na probówki i pipety, należy spryskać środkiem dezynfekcyjnym i przetrzeć.

Wyniki

Bezznacznikowy odczyt impedancji w czasie rzeczywistym ujawnia indukowany przez wirusa efekt cytopatyczny (CPE) oraz ochronę przeciwwirusową
Jak pokazano na Rysunku 2A, komórki gospodarza HEK293A wysiano do 96-dołkowej płytki zintegrowanej z mikroelektorodami w gęstości 6 000 komórek na dołek¹³. Po 24-godzinnej inkubacji dodano adenowirus typu 5 przy MOI równym 1, w obecności lub w absence związków przeciwwirusowych. Odpowiedzi komórkowe na infekcję wirusową i leczenie przeciwwirusowe były stale monitorowane za pomocą bezznacznikowych pomiarów impedancji w czasie rzeczywistym. W przypadku braku wirusa komórki proliferowały nieprzerwanie przez 80-godzinny okres monitorowania, osiągając konfluencję, co objawiło się stałym wzrostem impedancji, a następnie plateau. Infekcja adenowirusem początkowo pozwalała na wzrost komórek przez około 20 h, po czym zaobserwowano wyraźny CPE, co doprowadziło do szybkiego spadku sygnału impedancji do poziomu bazowego około 65 h po infekcji. Leczenie stawudyną (50 µM) lub rybawiryną (20 µM) miało minimalny wpływ na indukowany przez wirusa CPE, a przebiegi impedancji były bardzo zbliżone do tych obserwowanych w komórkach zainfekowanych samym wirusem. Gancyklowir (50 µM) wykazał umiarkowaną aktywność przeciwwirusową, co potwierdziła częściowa regeneracja znormalizowanego indeksu komórkowego (Normalized Cell Index). W przeciwieństwie do nich, cidofovir (50 µM) i brincidofovir (1 µM) znacząco osłabiły CPE, generując profile impedancji porównywalne z tymi obserwowanymi w niezinfekowanych komórkach kontrolnych negatywnych. Warto zaznaczyć, że żaden z badanych związków w stężeniach przetestowanych w badaniach wstępnych nie wpływał znacząco na indeks komórkowy w porównaniu z kontrolami traktowanymi samym rozpuszczalnikiem (dane nie przedstawiono).

W teście neutralizacji przeciwciał opartym na impedancji, komórki Vero CCL-81 wysiano z gęstością 18 000 komórek na studzinkę na płytce 96-dołkowej z zintegrowanymi mikroelektrodami i hodowano przez 24 h przed infekcją. W dniu badania przeciwciała monoklonalne inkubowano wstępnie z rVSV–LASV przy MOI wynoszącym 0,01 przez 1 h przed dodaniem do komórek. W przypadku badanych przeciwciał monoklonalnych (mAbs) zaobserwowano odmienne profile neutralizacji. Dla przejrzystości Rysunek 2B przedstawia reprezentatywne wyniki dla przeciwciał wykazujących silną, częściową lub brak aktywności neutralizującej. Przeciwciała nienneutralizujące wywołały pełny efekt cytopatyczny (CPE), a krzywe impedancji pokrywały się z krzywymi kontroli z samym wirusem. Przeciwciała o średniej aktywności neutralizującej częściowo redukowały indukowaną przez wirusa cytotoksyczność, co skutkowało zmniejszonym, ale wykrywalnym CPE. Z kolei przeciwciała w pełni neutralizujące całkowicie zahamowały CPE, utrzymując sygnały impedancji porównywalne z kontrolami niezinfekowanych komórek. Wspólnie profile impedancji te pozwoliły na wyraźne rozróżnienie pomiędzy nienneutralizującymi, częściowo neutralizującymi i w pełni neutralizującymi przeciwciałami monoklonalnymi.

Ilościowe oznaczenie i charakterystyka aktywności przeciwwirusowej
Po wykazaniu zdolności testu RTCA opartego na impedancji do identyfikacji „trafień” (hits) z biblioteki leków i przeciwciał monoklonalnych (mAbs), w kolejnym etapie badania podjęto próbę charakterystyki skuteczności głównych związków i przeciwciał. Stopniowe zwiększanie stężenia leku przeciwwirusowego brincidofowiru od 15,6 nM do 1 000 nM prowadzi do skokowego wzrostu sygnału impedancji; im wyższe stężenie leku, tym bardziej komórki zachowują się podobnie do nieinfectedznej kontroli (Rysunek 3A). Ponadto samo zastosowanie brincidofowiru spowodowało niewielki wzrost NCI tylko przy najwyższym testowanym stężeniu (1100 nM). Jednak przy stężeniach poniżej 1100 nM NCI umiarkowanie spadło, choć efekt ten nie był zależny od dawki. Wynik ten wskazuje, że powrót indeksu komórkowego (Cell Index) był przypisywalny wyłącznie aktywności przeciwwirusowej leku, a nie bezpośredniemu wzmocnieniu proliferacji lub adhezji komórek (Rysunek 3B). Wykreślenie pola pod krzywą znormalizowanego indeksu komórkowego (AUC) w funkcji stężenia brincidofowiru pozwoliło uzyskać krzywą dawka-odpowiedź, która wykazuje doskonałe dopasowanie (R² wynoszące 0,99) i wskazuje IC₅₀ na poziomie 265 nM (Rysunek 3C). W teście neutralizacji przeciwciał, pod koniec pomiaru (około 50 h po podaniu leku), oprogramowanie systemu automatycznie obliczyło procenty neutralizacji dla każdego stężenia mAb, a następnie wyznaczono wartości IC₅₀. Jak pokazano na Rysunku 3D, w przeciwieństwie do negatywnego przeciwciała kontrolnego rANDV-5, trzy pozostałe przeciwciała mAb, r37.2D, r25.1C i r12.1F, wykazały wysoką aktywność przeciwwirusową, z wartościami IC₅₀ wynoszącymi odpowiednio 4 315 ng/mL, 83 ng/mL lub 232 ng/mL^14,15.

Rycina 1: Schematyczny przebieg analizy przesiewowej leków przeciwwirusowych opartej na pomiarze impedancji. Dzień 0, Krok 1: Komórki Permisywne wysiano na mikropłytki, a wzrost komórek monitorowano w uchwycie instrumentu umieszczonym w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO₂ przez około 24 h. Dzień 1, Krok 2: Przygotowano wirusa przy stałym MOI oraz szeregowe rozcieńczenia środków przeciwwirusowych. W przypadku testów neutralizacji przeciwciałami, wirusa inkubowano z przeciwciałami w 37 °C przez 1 h przed dodaniem mieszaniny do komórek. Krok 3: Mieszaniny wirusa i środków przeciwwirusowych dodano do komórek. Dzień 1 i kolejne, Krok 4: Wywołany przez wirusa efekt CPE monitorowano w sposób ciągły za pomocą pomiarów impedancji przez kilka dni. Krok 5: Dane analizowano w czasie rzeczywistym lub po zakończeniu analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Monitorowanie aktywności przeciwwirusowej w czasie rzeczywistym za pomocą pomiarów indeksu komórkowego (Cell Index) opartych na impedancji. (A) Przesiewowe badanie leków przeciwwirusowych oceniane za pomocą analizy impedancji. Wszystkie związki testowano w stężeniu 50 µM, z wyjątkiem rybawiryny (20 µM) i brincidofowiru (1 µM) w obecności adenowirusa typu 5 przy MOI równym 1. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech powtórzonych studzienek. Rysunek został zaadaptowany z pracy Zhang i wsp.¹³. (B) Test neutralizacji przeciwciał monoklonalnych oparty na impedancji. Przedstawiono reprezentatywne profile indeksu komórkowego dla przeciwciał monoklonalnych niewykazujących neutralizacji (pełny CPE, kolor czerwony), neutralizacji częściowej (częściowy CPE, kolor pomarańczowy) lub silnej neutralizacji (brak wykrywalnego CPE, kolor czarny). Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina 3: Ilościowe oznaczenie aktywności przeciwwirusowej z wykorzystaniem impedancji. (A) Dynamiczne zmiany znormalizowanego indeksu komórkowego (Normalized Cell Index) w czasie rzeczywistym po zastosowaniu zwiększających się stężeń brincidofowiru w połączeniu z infekcją adenowirusem typu 5 przy MOI wynoszącym 1. (B) Dynamiczne zmiany znormalizowanego indeksu komórkowego w czasie rzeczywistym po zastosowaniu zwiększających się stężeń samego brincidofowiru. (C) Pole pod krzywymi impedancji przedstawiono jako funkcję stężenia brincidofowiru w celu uzyskania krzywej dawka-odpowiedź. (A) i (C) opracowano na podstawie Zhang et al.¹³. (D) Reprezentatywne krzywe neutralizacji rVSV–LASV Lineage IV (Josiah) dla przeciwciał monoklonalnych r37.2D, r25.1C, r12.1F oraz rANDV-5 włączonego jako kontrola negatywna. Przeciwciała monoklonalne 37.2D, 25.1C, 12.1F i ANDV-5 zostały wytworzone rekombinacyjnie na podstawie istniejącej literatury (patrz sekcja Wyniki). Przedstawione dane są reprezentatywnymi krzywymi z dwóch niezależnych eksperymentów i podano je jako średnią ± SD z trzech powtórznych studni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Podobnie jak wszystkie testy oparte na komórkach, test przesiewowy przeciwirusowy RTCA wymaga optymalizacji dla każdego systemu wirus-komórka. Ponieważ test ten wykrywa indukowany przez wirusa efekt cytopatyczny (CPE) poprzez zmiany impedancji, zależy on od permisywnego modelu komórkowego, który wspiera replikację wirusa i mierzalny CPE. Wirusy, które nie generują wykrywalnego impedencyjnie CPE, mogą nie być odpowiednie do tego podejścia; w takich przypadkach, przy dostępności swoistych przeciwciał przeciwwirusowych, można zastosować alternatywne metody, takie jak FRNT. Innym istotnym aspektem jest fakt, że zmiany w indeksie komórkowym (Cell Index) nie są wywoływane wyłącznie przez indukowaną wirusem cytolizę. Zmiany w morfologii, adhezji, proliferacji i przytwierdzaniu się komórek mogą również wpływać na sygnały impedancji i potencjalnie zakłócać ocenę aktywności przeciwwirusem. Dlatego wpływ czynników przeciwwirusowych na Cell Index powinien zostać oceniony w badaniach wstępnych lub za pomocą odpowiednich kontroli z samym czynnikiem. W niniejszym badaniu, aby maksymalnie zwiększyć liczbę ocenianych czynników na jednej płytce, przed testem przesiewowym przeprowadzono próby z samymi czynnikami przeciwwirusowymi w celu ustalenia efektów bazowych każdego kandydata w obecności braku infekcji wirusowej. Na wydajność testu wpływają również takie czynniki, jak gęstość siewu komórek, czas inokulacji wirusem oraz warunki pożywki, które mogą oddziaływać na wzrost komórek, replikację wirusa, rozwój CPE oraz powtarzalność testu^7,10,16. W związku z tym systematyczna optymalizacja jest niezbędna dla uzyskania wiarygodnych i rzetelnych wyników przeciwwirusowych badań przesiewowych opartych na RTCA.

Po ustaleniu optymalnych warunków testu, pomyślna implementacja testów przeciwwirusowych w czasie rzeczywistym opartych na impedancji wymaga spójnego siewu komórek, zdrowych komórek oraz stabilnych warunków pomiarowych. Wysoka zmienność między poszczególnymi studzienkami jest często spowodowana nierównomiernym rozkładem komórek lub niedokładnym pipetowaniem; dlatego zawiesiny komórkowe należy dokładnie wymieszać przed siewem, a płytki powinny pozostać w RT przez 30 min po siewie, aby wspomóc jednorodne osiadanie komórek i zredukować efekty brzegowe. Zaleca się wykonanie co najmniej trzech powtórzeń dla każdego wariantu traktowania, a dodatkowe powtórzenia dla kontroli negatywnej (niezainfekowanej) i pozytywnej (tylko wirus) są wysoce zalecane, ponieważ wartości te służą jako punkty odniesienia do obliczeń %CPE i %Neutralizacji dla wszystkich warunków traktowania. Jeśli indukowany przez wirusa efekt CPE jest słaby lub niespójny, należy zweryfikować jakość zapasu wirusa oraz stan zdrowia podatniej linii komórkowej. Aby zachować zakaźność wirusa, należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, przygotowując jednorazowe alikwoty wirusa dla każdego eksperymentu. Wreszcie, w celu zminimalizowania zmienności eksperymentalnej i poprawy powtarzalności testu, wysoce zaleca się stosowanie banku komórek zawierającego komórki podatne o stałej liczbie pasażów. Jeśli indeks komórkowy (Cell Index) zmierzony bezpośrednio przed infekcją (zazwyczaj około 24 h po siewie) spadnie poniżej ustalonego punktu odniesienia dla danej linii komórkowej, co wskazuje na nieoptymalny stan zdrowia lub wzrost komórek, eksperyment należy przerwać. W takim przypadku należy rozmrozić nową fiolkę kriokonserwowanych komórek i powtórzyć test przesiewowy przeciwirusowy.

Gdy test przesiewowy przeciwirusowy jest przeprowadzany w dobrze kontrolowanych i zoptymalizowanych warunkach, co wykazują przedstawione tutaj dane z przesiewu, test oparty na impedancji może dokładnie ilościowo określić redukcję CPE w czasie rzeczywistym przez środki przeciwirusowe. W przeciwieństwie do tradycyjnych podejść opierających się na pracochłonnych pomiarach końcowych, ciągły i nieinwazyjny odczyt impedancji umożliwia podłużne monitorowanie pełnego spektrum wywołanych przez wirusa uszkodzeń komórkowych oraz profili kinetycznych odpowiedzi przeciwirusowych. Ta zdolność pomiaru w czasie rzeczywistym ułatwia identyfikację optymalnych okien czasowych dla wykrywania nie tylko wczesnych, ale także opóźnionych efektów przeciwirusowych, które mogą zostać pominięte w konwencjonalnych testach końcowych.

Ponadto opisany tutaj protokół RTCA zapewnia szybszy i znacznie uproszczony schemat pracy w badaniach przesiewowych leków przeciwwirusowych w porównaniu z metodami tradycyjnymi. Analiza wymaga jedynie początkowego etapu wysiewu komórek, po którym następuje dodanie wirusa w obecności lub w braku czynników przeciwwirusowych. Nie jest wymagane żadne dodatkowe obchodzenie próbek ani przetwarzanie po analizie. Konfiguracja eksperymentalna i analiza danych są dodatkowo usprawnione dzięki dostosowanemu modułowi oprogramowania Virology, który umożliwia zautomatyzowany obliczanie parametrów powszechnie stosowanych w VRNT, w tym %CPE, %neutralizacji oraz najwyższego rozcieńczenia lub najniższego stężenia czynnika przeciwwirusowego, które osiąga zdefiniowany przez użytkownika poziom neutralizacji. Łącznie zalety te pozwalają na szybkie i równoległe badanie znacznie większej liczby warunków analizy (porównania leków, rozszerzone rozcieńczenia itp.), niż jest to zazwyczaj możliwe przy użyciu metod tradycyjnych.

Choć opisany tutaj test został opracowany w formacie płytki 96-dołkowej, przy zastosowaniu odpowiednich warunków analizy opisanych powyżej, można go dostosować do formatu płytki 384-dołkowej. Aby umożliwić przeprowadzenie tego testu opartego na impedancji z większą przepustowością, można zastosować zautomatyzowany system RTCA oparty na impedancji, który pozwala na jednoczesne przetwarzanie do czterech płytek 384-dołkowych.

Poza przesiewaniem leków przeciwwirusowych, metoda RTCA może być stosowana w badaniach nad terapią skojarzoną, w serologii oraz w badaniach nad ucieczką immunologiczną wirusów. Poprzez pomiar zdolności przeciwciał terapeutycznych lub surowic immunologicznych do zapobiegania indukowanemu przez wirusa efektowi CPE, test ten zapewnia bezznacznikową ocenę aktywności neutralizującej i ochronnych odpowiedzi immunologicznych w czasie rzeczywistym po zakażeniu lub szczepieniu. Dodatkowo porównywanie profili neutralizacji w różnych wariantach wirusa może ujawnić zmiany w podatności związane z ucieczką immunologiczną. W połączeniu z sekwencjonowaniem genomicznym podejście to może ułatwić identyfikację wariantów opornych na przeciwciała i wesprzeć rozwój nowej generacji szczepionek, terapii przeciwciałami oraz strategii przeciwwirusowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Adenowirus-GFP	Vector Biolabs	1060
Brincidofowir (CMX001)	AdooQ	A13326
CaviCide	Metrex	13-5024	środek dezynfekcyjny
Cidofowir	Selleck	S1516
podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	ATCC	30-2002
E-Plate 96	Agilent	5232368001	płytka 96-dołkowa z zintegrowanymi mikroelektrodami
Płastowe serum bydlęce	Avantor	97068-085
Sód gancyklowiru	Selleck	S5065
komórka HEK293A	Thermo Fisher Scientific	R70507
Wielokanałowy Viaflo	INTEGRA	VIAFLO 96
roztwór penicyliny i streptomycyny	Gibco	10378016
Bufor fosforanowo-solny (1x)	HyClone	SH30256.01
Rekombinowane przeciwciała monoklonalne	Laboratorium Crowe	Nie dotyczy
Rybawiryna	Selleck	S2504
rVSV-LASV (Lin IV)	Laboratorium Crowe	Nie dotyczy
Stawudyna	Selleck	S1398
0,25% trypsyny i 0,53 mM EDTA  (1x)	ATCC	30-2101
12-kanałowe zbiorniki na odczynniki	VistaLab Technologies	3054-1011
Vero CCL-81	ATCC	CCL-81
Moduł wirusologii	Agilent	S2807-90089
system xCELLigence RTCA MP	Agilent	380601040