Niniejsze badanie sugeruje, że dimetylosulfoksyd (DMSO) może łagodzić indukowany krzemionką stan zapalny i włóknienie płuc u myszy. Analizy transkryptomiczne i eksperymentalne wskazują, że jego działanie ochronne może wiązać się z supresją szlaku sygnałowego IL-6/STAT3 oraz obniżeniem ekspresji MMP12, co dostarcza potencjalnych spostrzeżeń terapeutycznych w leczeniu krzemicy.
Szybki raport
Potencjalny udział osi sygnalizacyjnej IL-6/STAT3/MMP12 w działaniu przeciwzwłóknieniowym DMSO w eksperymentalnej krzemicy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem niniejszego badania jest zbadanie przeciwzapalnych i przeciwzwłóknieniowych efektów dimetylosulfotlenku (DMSO) w mysim modelu krzemicy, aby w ten sposób ocenić jego potencjalną wartość terapeutyczną.
Model krzemicy u myszy opracowano poprzez instylację donosową, a leczenie DMSO podano za pomocą iniekcji doszpikowej. Eksperyment prowadzono przez okres 1 miesiąca. Od wszystkich myszy pobrano tkankę płuc; podzbiór próbek poddano analizie transkryptomicznej, a geny różnicowo wyrażone zidentyfikowano przy użyciu pakietu limma. Analizy wzbogacenia ontologii genów (GO) oraz bazy Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) przeprowadzono za pomocą programu ClusterProfiler w celu zbadania funkcji genów i związanych z nimi szlaków. Pozostałe próbki poddano ocenie histopatologicznej z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (HE) oraz barwienia trichromem Massona, natomiast analizę Western blot wykonano w celu walidacji wyników transkryptomicznych.
Niniejsze badanie sugeruje, że DMSO może łagodzić proces włóknienia w pylicy krzemowej poprzez modulowanie osi sygnalizacyjnej IL-6/STAT3-MMP12. W mysim modelu pylicy krzemowej indukowanej krzemionką DMSO złagodziło związaną z chorobą utratę masy ciała i zmniejszyło odkładanie kolagenu. Analiza transkryptomiczna wykazała, że DMSO hamuje aktywność wielu szlaków związanych z włóknieniem i pozwoliła zidentyfikować 51 kluczowych genów, w tym MMP12, którego ekspresja była znacząco obniżona. Analiza Western blot dodatkowo potwierdziła zmniejszoną ekspresję MMP12, której towarzyszył wyraźny spadek poziomów IL-6 oraz p-STAT3, co sugeruje, że szlak IL-6/STAT3 może odgrywać kluczową rolę w regulacji ekspresji MMP12.
DMSO może łagodzić reakcje zapalne i włóknienie płuc w pylicy krzemowej poprzez hamowanie aktywacji szlaku sygnalizacyjnego IL-6/STAT3, co prowadzi do zmniejszenia ekspresji MMP12.
Wprowadzenie
Krzemica jest jedną z głównych postaci zawodowej pylicy płuc1, charakteryzującą się uporczywym zapaleniem płuc i nieodwróchnym włóknieniem płuc wynikającym z długotrwałej ekspozycji na pył krzemionkowy2,3. Patogeneza krzemicy jest bardzo złożona. Choć poprzednie badania wykazały, że aberracyjna aktywacja makrofagów4, nadmierna proliferacja fibroblastów, przejście nabłonkowo-mezenchymalne oraz nieprawidłowe odkładanie składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są kluczowymi czynnikami rozwoju włóknienia5,6, podstawowe mechanizmy molekularne leżące u podstaw błędnego koła zapalno-włóknistego pozostają nie w pełni poznane. Warto zauważyć, że rodzina metaloproteinaz macierzy (MMP) odgrywa kluczową rolę w przebudowie ECM i progresji patologicznego włóknienia7. Wśród nich metaloproteinaza macierzy 12 (MMP12), wydzielana specyficznie przez makrofagi, degraduje kluczowe składniki ECM, takie jak elastyna, fibronektyna i kolagen typu IV, oraz odgrywa istotną rolę w patogenezie chorób włóknistych, w tym przewlekłej obturacyjnej choroby płuc8. Niedawne badania sugerują ponadto, że MMP12 pochodząca z makrofagów może dodatkowo promować włóknienie poprzez uszkadzanie komórek śródbłonka w procesie włóknienia płuc9.
Dimetylosulfotlenek (DMSO), związek o niskiej masie cząsteczkowej o zróżnicowanej aktywności biologicznej10, wykazuje działanie przeciwzapalne w wielu chorobach zapalnych, w tym w zapaleniu pęcherza moczowego, i został zatwierdzony przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do leczenia zapalenia pęcherza śródmiąższowego11. Niedawne badania sugerują, że DMSO może w pewnym stopniu spowalniać postęp włóknienia poprzez hamowanie uwalniania czynników zapalnych i redukcję odpowiedzi stresu oksydacyjnego12. Badania przeprowadzone przez Ingrid Elisię i współpracowników wykazały, że DMSO specyficznie hamuje aktywację szlaków sygnałowych ERK1/2, p38 MAPK, JNK oraz PI3K/Akt w monocytach ludzkich w modelach krwi pełnej, wywierając tym samym swoje działanie przeciwzapalne13.
Chociaż wykazano, że rodzina MMP odgrywa kluczową rolę w procesie włóknienia w krzemicy, żadne badania nie dowiodły jednoznacznie, czy DMSO może wpływać na progresję patologiczną krzemicy poprzez regulację ekspresji MMP. W związku z tym niniejsze badanie stanowi analizę przeciwzapalnych i przeciw włóknieniowych efektów DMSO w mysim modelu krzemicy, mającą na celu ujawnienie kluczowej sieci genów regulacyjnych oraz mechanizmu molekularnego interwencji z użyciem DMSO i zapewnienie teoretycznego wsparcia dla innowacyjnych strategii terapeutycznych opartych na MMP.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Nauki i Technologii Uniwersytetu Nauki i Technologii w Anhui (numer zatwierdzenia GZ2025-048) i były ściśle zgodne z krajowymi normami dotyczącymi dobrostanu zwierząt laboratoryjnych (GB/T 35892-2018) w Chinach. Rysunek 1 przedstawia schemat badania.
Przygotowanie roztworów
Przygotowanie zawiesiny krzemionki:
Krzemionkę krystaliczną (SiO₂, 80%, wielkość cząstek 1–5 µm) wysterylizowano w autoklawie. Sterylny proszek krzemionkowy rozproszono następnie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mg/mL, a zawiesinę dokładnie zhomogenizowano za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego bezpośrednio przed podaniem, aby zapewnić jednorodność zawiesiny cząstek.
Przygotowanie roztworu DMSO:
W warunkach aseptycznych DMSO (≥99,9%) rozcieńczono sterylną solą fizjologiczną w celu przygotowania około 10% (v/v) roztworu DMSO, który następnie zhomogenizowano za pomocą sonikacji. Każdej myszy wstrzyknięto roztwór DMSO w dawce 0,9 g/kg, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą14,15.
Zwierzęta doświadczalne
W badaniu wykorzystano trzydzieści dwie zdrowe samce myszy C57BL/6J w wieku 8–12 tygodni, które przed rozpoczęciem eksperymentów poddano aklimatyzacji przez 1 tydzień. Myszy zostały losowo przydzielone do czterech grup eksperymentalnych (n = 8 na grupę) przy użyciu metody randomizacji generowanej komputerowo: grupy kontrolnej, grupy DMSO, grupy krzemionki oraz grupy krzemionka+DMSO. Wielkość próby określono na podstawie wcześniejszych badań z wykorzystaniem tego samego mysiego modelu pylicy krzemowej oraz naszego wstępnego doświadczenia eksperymentalnego, które wykazało, że 8 zwierząt na grupę jest wystarczających do wykrycia różnic histopatologicznych i molekularnych między grupami. Zwierzęta przebywały w standardowych warunkach laboratoryjnych przy kontrolowanej temperaturze, 12-godzinnym cyklu światła/ciemności oraz z wolnym dostępem do pożywienia i wody. Przed rozpoczęciem badania ustalono humanitarne punkty końcowe; żadne z zwierząt nie spełniło zdefiniowanych wcześniej kryteriów wczesnej eutanazji.
Ustanowienie modelu pylicy krzemowej i interwencja lekowa
Krzemicę wywołano poprzez pojedynczą instylację donosową 60 µL sterylnej zawiesiny krystalicznej krzemionki (10 mg/mL). Po wprowadzeniu znieczulenia myszy ułożono w pozycji grzbietnej. Po zaobserwowaniu głębokiego i spowolnionego oddechu, 60 µL zawiesiny krzemionki ostrożnie wprowadzano kroplowo do nozdrzy, umożliwiając spontaniczne wdechnięcie zawiesiny do płuc16. Myszy w grupie podającej DMSO otrzymywały dootrzewnowe iniekcje roztworu DMSO w stałej dawce dwa razy w tygodniu, w odstępach 3–4 dni między iniekcjami, przez jeden miesiąc z rzędu. Myszy w pozostałych grupach traktowano analogicznie, podając zamiast tego taką samą objętość sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Przez cały okres eksperymentu prowadzono codzienny monitoring masy ciała. W 30. dniu po wywołaniu modelu wszystkie myszy poddano eutanazji, a tkanki płuc pobrano w warunkach sterylnych. Eutanazję przeprowadzono poprzez zwichnięcie stawów szyjnych po dootrzewnowym podaniu tribromoetanolu (0,2 mL/10 g) w celu wprowadzenia znieczulenia. Część tkanek płuc zakonserwowano w ciekłym azocie do sekwencjonowania transkryptomu. Część tkanek utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 48 h przed barwieniem patologicznym, a pozostałe tkanki przechowywano w temperaturze -80 °C do późniejszych eksperymentów molekularnych. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt były zgodne z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi etyki badań na zwierzętach.
Ocena histopatologiczna, w tym ocena włóknienia według skali Ashcrofta, została przeprowadzona niezależnie przez dwóch badaczy, którzy nie znali przydziału grup eksperymentalnych.
Badanie patomorfologiczne płuc
Utrwalone tkanki płuc odwodniono, przejrzystowano i zatopiono w blokach parafiny, a następnie pocięto na skrawki o grubości 5 µm.
barwienie hematoksyliną i eozyną (HE): Przekroje barwiono hematoksyliną przez 3–5 min, różnicowano w roztworze kwasowym, niebiescono pod bieżącą wodą, a następnie barwiono kontrastowo eozyną przez 5 min. Po odwodnieniu w szeregu stężeń etanolu przekroje przejrzystowano w ksylenie i zamykano neutralną żywicą17.
Barwienie trichromem Massona: Przekroje barwiono sekwencyjnie hematoksyliną, czerwoną barwą Lichuna (fuksyną kwasową), kwasem fosfomolibdowym oraz Bright Green. Po dyferencjacji w środowisku kwasowym preparaty odwodniono, prześwietlono w ksylenie i zamontowano w żywicy neutralnej18,19.
Sekwencjonowanie transkryptomu
Tkanki płuc myszy z czterech grup doświadczalnych pobrano bezpośrednio po uśmierceniu zwierząt i zamrożono gwałtownie w ciekłym azocie. Całkowite RNA wyekstrahowano przy użyciu odczynnika TRIzol zgodnie z instrukcjami producenta. Oceniono stężenie i czystość RNA, a integralność RNA sprawdzono za pomocą Bioanalizatora z wbudowanym oprogramowaniem. Za akceptowalne uznano próbki o wartościach RIN powyżej 8,0. Przygotowanie bibliotek obejmowało wzbogacenie mRNA poly(A) przy użyciu kulek Oligo(dT), fragmentację RNA, syntezę cDNA, ligację adapterów oraz amplifikację PCR. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina, uzyskując około 6,2–6,4 Gb czystych danych na próbkę. Wszystkie surowe dane z sekwencjonowania wygenerowane w niniejszym badaniu zostały zdeponowane w bazie danych Gene Expression Omnibus (GEO) pod numerem dostępu GSE311671.
Oczyszczone odczyty dopasowano do genomu referencyjnego Mus musculus (mm8) przy użyciu algorytmu STAR. Poziomy ekspresji genów określono jako surowe liczby odczytów. Analizę ekspresji różnicowej przeprowadzono za pomocą pakietu limma w środowisku R. Przed modelowaniem liniowym surowe dane liczbowe przekształcono za pomocą funkcji voom w celu oszacowania zależności między średnią a wariancją i wygenerowania wag precyzji. Surowe wartości P skorygowano pod kątem wielokrotnego testowania metodą Benjamini-Hochberga (BH), a geny z |log₂FoldChange| > 1,5 oraz wskaźnikiem fałszywych odkryć (FDR) < 0,05 uznano za różnicowo wyrażone. Analizy wzbogacenia funkcjonalnego przeprowadzono za pomocą pakietu clusterProfiler w środowisku R. Analizę wzbogacenia ontologii genów (GO) przeprowadzono w celu zidentyfikowania istotnie wzbogaconych kategorii procesów biologicznych (BP), komponentów komórkowych (CC) i funkcji molekularnych (MF), natomiast analizę wzbogacenia ścieżek Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) wykonano w celu zidentyfikowania istotnie wzbogaconych szlaków sygnalizacyjnych. Istotność wzbogacenia oceniono za pomocą testu hipergeometrycznego, a wartości P skorygowano dla wielokrotnych porównań metodą Benjamini-Hochberga. Terminy GO oraz ścieżki KEGG ze skorygowaną wartością P (padj) < 0,05 uznano za istotnie wzbogacone20,21,22,23.
Detekcja metodą Western blot
Świeżą tkankę płuc myszy pobrano i zhomogenizowano z odpowiednią objętością buforu do lizy RIPA (radioimmunoprecipitation assay). Po wirowaniu zebrano nadsącz, a stężenie białek oznaczono za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA. Następnie próbki zmieszano z buforem do nakładania i podgrzano w temperaturze 100 °C przez 10 min. Rozdział białek przeprowadzono w 10% żelach do elektroforezy w poliakryloamidzie z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) przy napięciu 200 V przez 30 min. Następnie białka przeniesiono elektroforetycznie na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) przy stałym natężeniu prądu 300 mA przez 30 min. Membranę zablokowano 5% mlekiem odtłuszczonym, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko β-Actin (1:1500), IL-6 (1:1000), STAT3 (1:800), p-STAT3 (1:1500) oraz MMP12 (1:800). Następnego dnia membranę przemyto buforem TBST i inkubowano z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 1 h, po czym wykonano dodatkowe przemycia buforem TBST. Prążki białkowe zwizualizowano przy użyciu substratu chemiluminescencyjnego, a kwantyfikację białek przeprowadzono za pomocą oprogramowania ImageJ.
Analizę Western blot przeprowadzono z wykorzystaniem trzech niezależnych powtórzeń biologicznych z każdej grupy eksperymentalnej. Próbki białek przygotowano z tkanek płuc poszczególnych myszy, przy czym każde powtórzenie biologiczne reprezentowało jedno niezależne zwierzę.
Analiza statystyczna
Wszystkie dane eksperymentalne przeanalizowano przy użyciu programu GraphPad Prism 9.5. Wcześniej przeprowadzono testy normalności rozkładu i homogeniczności wariancji. Do porównania dwóch grup zastosowano test t Studenta, natomiast w przypadku porównań wielogrupowych wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) wraz z testem post-hoc Tukeya. Wartość P ≤ 0.05 uznano za statystycznie istotną.
Wyniki
DMSO łagodzi indukowane krzemionką włóknienie płuc u myszy (Rysunek 2)
Aby ocenić wpływ DMSO na procesy patologiczne i zmiany w tkance płuc w modelu krzemicy, utworzono cztery grupy eksperymentalne (Rysunek 2A). Zmiany masy ciała monitorowano przez okres 1 miesiąca.
Wyniki wykazały, że u myszy w grupie z krzemicą odnotowano ciągły spadek masy ciała, podczas gdy w grupie Silica+DMSO zaobserwowano początkową utratę wagi, po której nastąpiła regeneracja po interwencji z DMSO (Rysunek 2F). Po 30 dniach ekspozycji na krzemionkę pobrano tkanki płucne i oceniono zmiany zapalne oraz włókniste za pomocą barwienia HE (Rysunek 2B) oraz barwienia trichromem Massona (Rysunek 2C). Włóknienie płuc oceniono na przekrojach barwionych HE metodą Ashcrofta24, co wykazało niższą punktację włóknienia w grupie Silica+DMSO w porównaniu z grupą Silica (Rysunek 2D). Barwienie Massona dodatkowo wykazało, że odkładanie włókien kolagenowych w grupie Silica było rozległe i gęste, zajmując około 40% powierzchni tkanki płucnej, co było wartością wyższą niż 10% zaobserwowane w grupie kontrolnej (Rysunek 2E), sugerując, że ekspozycja na krzemionkę wywoła ciężkie włóknienie płuc. W przeciwieństwie do tego, odkładanie kolagenu w grupie Silica+DMSO zostało zredukowane do 20%, co wskazuje, że DMSO może łagodzić indukowane krzemionką włóknienie płuc poprzez hamowanie nadmiernej akumulacji kolagenu.
Analiza transkryptomu identyfikuje geny różnicowo ekspresowane związane z traktowaniem DMSO u myszy narażonych na krzemionkę
W celu zbadania przeciwzapalnych i przeciwzwłóknieniowych efektów dimetylosulfotlenku (DMSO) w modelu krzemicy przeprowadzono sekwencjonowanie transkrypcyjne próbek tkanki płuc pobranych od myszy doświadczalnych (Rycina 3). Geny różnicowo wyrażone (DEG) zidentyfikowano za pomocą algorytmu limma, przyjmując kryteria selekcji: |log2(fold change)| > 1,5 oraz skorygowaną wartość P (wskaźnik fałszywych odkryć [FDR]) < 0,05.
Analiza transkryptomu wykazała, że w porównaniu z grupą kontrolną, w grupie krzemionkowej (Silica) stwierdzono 132 geny o istotnie różnym poziomie ekspresji (Rysunek 3A), w tym 117 genów o nadrzędnej regulacji (upregulated) i 15 o regulacji w dół (downregulated). W szczególności geny takie jak Saa3 i MMP12 wykazywały wyraźnie zwiększoną ekspresję. Wzorzec ten został dodatkowo potwierdzony analizą mapy ciepła z klastrowaniem hierarchicznym (Rysunek 3C), która wykazała spójne profile ekspresji genów w poszczególnych próbkach.
W porównaniu między grupami Silica+DMSO i Silica zidentyfikowano łącznie 3 054 genów o istotnie różnej ekspresji (Rysunek 3B), w tym 1 39 genów o nadekspresji i 1 65 genów o obniżonej ekspresji. Odpowiednia mapa ciepła (Rysunek 3D) wykazała znaczne zmiany transkrypcyjne po zastosowaniu DMSO, z wyraźną downregulacją genów, w tym Lcn2 i MMP12. W szczególności kluczowe geny, które wykazywały nadekspresję w grupie Silica, takie jak MMP12, Saa3 i Spp1, wykazały wyraźną downregulację w grupie Silica+DMSO. Wyniki te sugerują, że DMSO może łagodzić patologię związaną z pylicą krzemową poprzez hamowanie ekspresji mediatorów prozapalnych i profibrotycznych.
Oś sygnałowa IL-6/STAT3/MMP12 może brać udział w efektach ochronnych DMSO w przypadku włóknienia płuc wywołanego krzemionką
Aby zbadać zależności między genami o różnym poziomie ekspresji (DEGs), na podstawie danych transkrypcyjnych skonstruowano sieć interakcji genów (Rysunek 4A). MMP12 zdawał się zajmować centralną pozycję w sieci. W celu dalszego zbadania potencjalnych powiązań na poziomie białek, przy użyciu bazy danych STRING wygenerowano przewidywaną sieć interakcji białko-białko (PPI) (Rysunek 4B). Analiza STRING zasugerowała potencjalne powiązania funkcjonalne między MMP12 a kilkoma kluczowymi DEGs, w tym IL-6, STAT3, SPP1 i MMP19. Ponieważ STRING integruje dowody z różnych źródeł, powiązania te są przewidywanymi relacjami funkcjonalnymi.
Przeprowadzono analizę Western blot w celu ilościowego oznaczenia poziomów ekspresji białek IL-6, STAT3, p-STAT3 oraz MMP12 (Rysunek 4C–F). Wyniki wykazały, że w porównaniu z grupą kontrolną poziomy ekspresji białek IL-6 oraz p-STAT3 były znacznie podwyższone w grupie Silica, a ekspresja białka MMP12 również wykazywała tendencję wzrostową. Po zastosowaniu DMSO poziomy ekspresji tych trzech białek uległy znacznemu obniżeniu. Warto zauważyć, że całkowita ekspresja białka STAT3 pozostała na stosunkowo stałym poziomie we wszystkich grupach eksperymentalnych.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Wszystkie surowe dane z sekwencjonowania wygenerowane w niniejszym badaniu zostały zdeponowane w bazie danych Gene Expression Omnibus (GEO) pod numerem dostępowym GSE31671. Surowe obrazy z badania są dostępne w folderze uzupełniającym (Supplementary File 1).
Rycina 1Schemat projektu badania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 2DMSO łagodzi włóknienie płuc u myszy z krzemicą. (A) Schematyczny diagram planu eksperymentalnego. Strzałki w różnych kolorach reprezentują różne schematy podawania. (B) Barwienie tkanki płuc hematoksyliną i eozyną. Przy powiększeniu 20× pasek skali wynosi 50 µm; przy powiększeniu 40× pasek skali wynosi 20 µm. (C) Barwienie Massona tkanki płucnej (niebieski: włókna kolagenowe; czerwony: włókna mięśniowe). Przy powiększeniu 20× pasek skali wynosi 50 µm; przy powiększeniu 40× pasek skali wynosi 20 µm. (D). Wyniki oceny włóknienia w różnych grupach na podstawie barwienia HE. n = 8, P ≤ 0,01. (E) Względna powierzchnia kolagenu w barwieniu Massona w tkance płucnej różnych grup. n = 8, P ≤ 0,001. (F) Zmiany masy ciała myszy w ciągu 30 dni. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Porównanie wielu zestawów danych przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a testy post hoc wykonano metodą Tukeya. n = 8, P(czas) ≤ 0,01, P(grupa) ≤ 0,01. N: grupa kontrolna; S: grupa krzemionkowa; SD: grupa krzemionka + DMSO; D: grupa DMSO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3Sekwencjonowanie transkryptomu ujawnia regulację genów przez DMSO w łagodzeniu krzemicy. (A,B) Wykres wulkaniczny (volcano plot) genów różnicowo ekspresyjnych pomiędzy grupą krzemionkową (S) a grupą kontrolną (N), oraz pomiędzy grupą krzemionkową z DMSO (SD) a grupą krzemionkową (S). (C,D) Mapa ciepła grupy krzemionkowej (S) w porównaniu z grupą kontrolną (N) oraz grupy krzemionkowej z DMSO (SD) w porównaniu z grupą krzemionkową (S). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4DMSO redukuje ekspresję białek IL-6 i STAT3. (A) Diagram sieci genów o istotnie zróżnicowanej ekspresji. (B) diagram interakcji sieci STRING dla MMP12 i genów powiązanych. (C–F) Analiza Western blot ekspresji białek β-aktyny, IL-6, MMP12, STAT3 i p-STAT3. Analiza wartości szarości białek β-aktyny, IL-6 (*P = 0,0257, *P = 0,0195), MMP12 (**P = 0,013, *P = 0,0318), STAT3 (P = 0,3205, P = 0,2347) oraz p-STAT3 (*P = 0,0123, **P = 0,096) za pomocą techniki Western blot. Analizę immunoblottingu przeprowadzono w trzech powtórzeniach (n = 3). N: grupa kontrolna; S: grupa krzemionkowa; SD: grupa krzemionka + DMSO; D: grupa DMSO. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Plik uzupełniający 1: Surowe dane z niniejszego badania.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Krzemica pozostaje jedną z najcięższych zawodowych chorób płuc na świecie, charakteryzującą się uporczywym stanem zapalnym i postępującą włóknieniem płuc, co w znacznym stopniu upośledza funkcję płuc i jakość życia pacjentów25. W niniejszym badaniu, z wykorzystaniem mysiego modelu indukowanego krzemionką, systematycznie analizujemy potencjalne działanie ochronne dimetylosulfotlenku (DMSO) we wczesnej fazie choroby. Uzyskane wyniki sugerują, że leczenie DMSO osłabia infiltrację komórek zapalnych i łagodzi patologiczne zmiany włókniste, co wskazuje, że DMSO może pełnić rolę modulującą we wczesnych fazach krzemicy. Wcześniejsze badania eksperymentalne wykazały, że DMSO wykazuje działanie ochronne przeciw włóknieniu płuc zarówno u szczurów, jak i u myszy. Haschek i wsp. donieśli, że DMSO łagodzi włókniste zmiany w płucach w eksperymentalnych modelach zwierzęcych, choć podstawowe mechanizmy molekularne pozostały niejasne26. Zgodnie z tymi odkryciami, nasze analizy transkryptomiczne i ekspresji białek dodatkowo sugerują, że DMSO może łagodzić indukowane krzemionką włóknienie płuc poprzez modulację szlaków sygnalizacji zapalnej, dostarczając tym samym dodatkowych informacji mechanistycznych na temat jego potencjalnej aktywności przeciw włóknieniowej.
DMSO jest polarnym rozpuszczalnikiem aprotonowym o wysokiej przenikalności tkankowej27 i posiada dobrze udokumentowane właściwości przeciwzapalne oraz przeciwbólowe, dzięki czemu był stosowany w różnych schorzeniach związanych ze stanem zapalnym, w tym w zapaleniu pęcherza śródmiąższowym, reumatoidalnym zapaleniu stawów oraz chondromalacji stawów28,29,30. Ponadto wcześniejsze badania wykazały, że DMSO łagodzi włóknienie płuc i uszkodzenia płuc w eksperymentalnych modelach zwierzęcych, co sugeruje, że DMSO wykazuje działanie ochronne przeciwko włókniejącym chorobom płuc, prawdopodobnie dzięki swoim właściwościom przeciwzapalnym i zdolności do wychwytywania wolnych rodników26. Na poziomie molekularnym zgłoszono, że DMSO hamuje szlaki sygnalizacyjne NF-κB i MAPK, co prowadzi do zmniejszenia ekspresji IL-6 w makrofagach RAW264.7 stymulowanych LPS31. Należy zauważyć, że wysokie dawki DMSO mogą powodować toksyczność systemową, a uszkodzenia wielu narządów zgłaszano przy dawkach przekraczających 8 g/kg14; dlatego w celu uzyskania efektów terapeutycznych przy jednoczesnym ograniczeniu toksyczności przyjęto protokół wielokrotnego podawania niskich dawek.
Dzięki zintegrowaniu analiz transkryptomicznych i histopatologicznych zaobserwowaliśmy, że leczenie DMSO złagodziło stan zapalny płuc i włóknienie u myszy narażonych na działanie krzemionki, co towarzyszyło obniżeniu ekspresji IL-6. Profilowanie transkryptomiczne wskazało ponadto na redukcję ekspresji MMP12 po zastosowaniu DMSO. MMP12, wydzielane głównie przez makrofagi32, jest zaangażowane w progresję włóknienia w krzemicy, POChP oraz w uszkodzeniu płuc indukowanym bleomycyną poprzez regulację szlaków profibrotycznych, w tym TGF-β1, EGR1 i CYR6133,34,35. W niniejszym badaniu zaobserwowana redukcja ekspresji MMP12 sugeruje jego potencjalny udział w działaniach przeciwzapalnych i przeciwvłóknieniowych związanych z leczeniem DMSO. Co ważne, MMP12 ułatwia degradację nadmiarowych złogów macierzy zewnątrzkomórkowej podczas ustępowania włóknienia, promując tym samym przebudowę tkanki i usuwanie blizn36.
Makrofagi są kluczowymi czynnikami stymulującymi produkcję cytokin prozapalnych w pylicy krzemowej indukowanej krzemionką37. Aktywowane makrofagi wydzielają IL-6 oraz TNF-α, które przyczyniają się do stanu zapalnego i włóknienia38. IL-6 wiąże się z kompleksem receptorowym gp130, aby aktywować szlak JAK–STAT, w szczególności STAT3, wpływając tym samym na fenotyp makrofagów i promując procesy profibrotyczne39,40,41,42. W niniejszym badaniu zastosowanie DMSO znacząco obniżyło poziom ekspresji IL-6, STAT3 oraz MMP12, co wskazuje, że DMSO może modulować oś IL-6/STAT3 i pośrednio hamować ekspresję MMP12. Wcześniejsze badania wykazały, że oś IL-6–STAT3 odgrywa kluczową rolę regulacyjną w różnych modelach włóknienia płuc, a jej przedłużona aktywacja jest ściśle powiązana z nasileniem włóknienia i progresją choroby43,44. STAT3 zostało zaproponowane jako ważny węzeł sygnałowy łączący odpowiedzi zapalne z przebudową włóknistą, a jego aktywacja może regulować MMP12, zwiększając tym samym jego aktywność transkrypcyjną45. Ponadto sygnalizacja STAT3 bierze udział w polaryzacji makrofagów, napędzając przejście makrofagów z prozapalnego fenotypu M1 do profibrotycznego fenotypu M246,47, podczas gdy makrofagi M2 stanowią jedno z głównych komórkowych źródeł MMP1248. Zatem jednoczesne obniżenie poziomu STAT3 i MMP12 zaobserwowane w obecnym badaniu sugeruje, że DMSO może redukować ekspresję MMP12, przynajmniej częściowo, poprzez modulację sygnalizacji STAT3. Należy jednak zaznaczyć, że niniejsze badanie zostało zaprojektowane przede wszystkim w celu zidentyfikowania potencjalnych mechanizmów molekularnych na podstawie profilowania transkrypcyjnego połączonego z walidacją in vivo. Choć skoordynowane zmiany w poziomach IL-6, STAT3 i MMP12 wspierają tezę o udziale osi sygnalizacyjnej IL-6/STAT3/MMP12 w działaniu przeciwfibrotycznym DMSO, obecne dowody nie ustanawiają bezpośredniego związku przyczynowo-skutkowego między aktywacją STAT3 a regulacją MMP12. W związku z tym wymagane są dodatkowe badania mechanistyczne, aby dokładniej wyjaśnić bezpośrednie interakcje regulacyjne w obrębie tej ścieżki sygnalizacyjnej.
Niniejsze badanie posiada kilka ograniczeń. Po pierwsze, wnioski z tej pracy oparto na profilowaniu transkrypcyjnym w połączeniu z analizami histopatologicznymi i ekspresji białek w mysim modelu krzemicy. Choć wyniki te wspierają tezę o udziale osi sygnalizacyjnej IL-6/STAT3/MMP12, nie ustanawiają one bezpośredniej zależności przyczynowo-skutkowej między aktywacją STAT3 a regulacją MMP12. Po drugie, nie przeprowadzono walidacji mechanistycznej, w tym badań in vitro na makrofagach oraz eksperymentów ratunkowych z wykorzystaniem manipulacji genetycznej lub farmakologicznej ścieżki IL-6/STAT3 oraz MMP12. Ponadto nie uwzględniono pozytywnej kontroli przeciwfibrotycznej, co ogranicza bezpośrednie porównanie DMSO z uznanymi terapiami. Przyszłe badania obejmujące walidację mechanistyczną oraz klinicznie istotne leki przeciwfibrotyczne, takie jak pirfenidon lub nintedanib, pozwolą na dalsze wyjaśnienie mechanizmu molekularnego i potencjału terapeutycznego DMSO w krzemicy.
Podsumowując, uzyskane wyniki sugerują, że DMSO łagodzi zapalenie i włóknienie indukowane przez makrofagi w krzemicy wywołanej krzemionką, prawdopodobnie poprzez modulację osi sygnalizacyjnej IL-6/STAT3/MMP12. Wyniki te stanowią wstępny dowód wspierający potencjalny udział osi sygnalizacyjnej IL-6/STAT3/MMP12 w działaniu przeciw włóknieniowym DMSO oraz wskazują na MMP12 jako potencjalny cel molekularny do przyszłych badań.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy serdecznie dziękują firmie Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. za udostępnienie platformy oraz profesorowi Deyong Ge i Lei Xu za wsparcie techniczne.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10% SDS-PAGE | Servicebio | G2177 | |
| Zestaw do oznaczania białek metodą BCA | Servicebio | G2026 | |
| Myszy C57BL/6J | Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd. | No: SCXY(Su)2011-0003 | |
| Krzemionka krystaliczna | Sigma Aldrich | No.S5631 | |
| DMSO | Servicebio | GC203006 | |
| IL-6 | Affinity Biosciences | DF6087 | |
| bufor do nakładania próbek | Bioteke | P0015L | |
| MMP12 | Servicebio | GB115475 | |
| p-STAT3 | Servicebio | GB150001 | |
| bufor do lizy RIPA | Servicebio | G2002 | |
| Przeciwciało wtórne | Servicebio | GB23303 | |
| mleko odtłuszczone | Servicebio | GC310001 | |
| STAT3 | Servicebio | GB11176 | |
| β-aktyna | Servicebio | GB11001 |
Bibliografia
- Leung, C. C., Yu, I. T. S., Chen, W. Silicosis. Lancet. 379 (9830), 2008-2018 (2012).
- Fazio, J. C., et al. Silicosis among immigrant engineered stone (quartz) countertop fabrication workers in California. JAMA Intern Med. 183 (9), 991-998 (2023).
- Tian, Y., et al. Nebulized inhalation of LPAE-HDAC10 inhibits acetylation-mediated ROS/NF-κB pathway for silicosis treatment. J Control Release. 364, 618-631 (2023).
- Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
- Zhou, Q., et al. Activation of Sirtuin3 by honokiol ameliorates alveolar epithelial cell senescence in experimental silicosis via the cGAS-STING pathway. Redox Biol. 74, 103224 (2024).
- Yang, S., et al. Single-cell transcriptome sequencing–based analysis: Probing the mechanisms of glycoprotein NMB regulation of epithelial cells involved in silicosis. Part Fibre Toxicol. 20, 29 (2023).
- Robert, S., et al. Involvement of matrix metalloproteinases (MMPs) and inflammasome pathway in molecular mechanisms of fibrosis. Biosci Rep. 36 (4), e00360 (2016).
- Dorjay Tamang, J. S., et al. An overview of matrix metalloproteinase-12 in multiple disease conditions, potential selective inhibitors, and drug designing strategies. Eur J Med Chem. 283, 117154 (2025).
- Zhou, X., et al. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733 (2024).
- De Abreu Costa, L., et al. Dimethyl sulfoxide (DMSO) decreases cell proliferation and TNF-α, IFN-γ, and IL-2 cytokine production in cultures of peripheral blood lymphocytes. Molecules. 22 (11), 1789 (2017).
- Kawasaki, Y., Katayama, H., Kato, S. Effectiveness of DMSO intravesical therapy for lower urinary symptoms of primary amyloidosis localized in the urinary bladder: A case report. Hinyokika Kiyo. 59 (7), 453-456 (2013).
- Taghavi, S., et al. Dimethyl sulfoxide as a novel therapy in a murine model of acute lung injury. J Trauma Acute Care Surg. 97, 32-38 (2024).
- Elisia, I., et al. DMSO represses inflammatory cytokine production from human blood cells and reduces autoimmune arthritis. PLoS One. 11 (3), e0152538 (2016).
- Aita, K., et al. Apoptosis in murine lymphoid organs following intraperitoneal administration of dimethyl sulfoxide (DMSO). Exp Mol Pathol. 79 (3), 265-271 (2005).
- Gad, S. C., et al. Tolerable levels of nonclinical vehicles and formulations used in studies by multiple routes in multiple species with notes on methods to improve utility. Int J Toxicol. 35 (2), 95-178 (2016).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicol Lett. 353, 1-12 (2021).
- Zhou, X., et al. ANXA9 facilitates S100A4 and promotes breast cancer progression through modulating STAT3 pathway. Cell Death Dis. 15 (4), 260 (2024).
- Dong, L., et al. Hypoxic hUCMSC-derived extracellular vesicles attenuate allergic airway inflammation and airway remodeling in chronic asthma mice. Stem Cell Res Ther. 12, 4 (2021).
- Gentile, G., Tambuzzi, S., Boracchi, M., Andreola, S., Zoja, R. Paradoxal dyeing affinity's inversion of the connective tissue at Goldner's Masson trichrome staining as a peculiar characteristic of compressed and exsiccated cadaveric skin. Leg Med (Tokyo). 52, 101905 (2021).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
- Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb). 2 (3), 100141 (2021).
- Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology resource: Enriching a GOld mine. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D325-D334 (2021).
- Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Inoshiguro-Watanabe, M. KEGG: Integrating viruses and cellular organisms. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D545-D551 (2021).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Liu, T., et al. Whole transcriptome sequencing identifies key lncRNAs, circRNAs, and mRNAs for exploring the pathogenesis and therapeutic target of mouse pneumoconiosis. Gene. 901, 148169 (2024).
- Haschek, W. M., Baer, K. E., Rutherford, J. E. Effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on pulmonary fibrosis in rats and mice. Toxicology. 54 (2), 197-205 (1989).
- Reimer, L., et al. Low-dose DMSO treatment induces oligomerization and accelerates aggregation of α-synuclein. Sci Rep. 12, 3737 (2022).
- Colucci, M., et al. New insights into dimethyl sulfoxide (DMSO) effects on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacol Res. 57 (6), 419-425 (2008).
- Obara, K., et al. Dimethyl sulfoxide enhances acetylcholine-induced contractions in rat urinary bladder smooth muscle by inhibiting acetylcholinesterase activities. Biol Pharm Bull. 46 (2), 354-358 (2023).
- Moss, N. P., et al. A prospective, randomized trial comparing intravesical dimethyl sulfoxide (DMSO) to bupivacaine, triamcinolone, and heparin (BTH) for newly diagnosed interstitial cystitis/painful bladder syndrome (IC/PBS). Neurourol Urodyn. 42 (3), 615-622 (2023).
- Han, H., Kang, J. K., Ahn, K. J., Hyun, C. DMSO alleviates LPS-induced inflammatory responses in RAW264.7 macrophages by inhibiting NF-κB and MAPK activation. BioChem. 3 (2), 91-101 (2023).
- Shapiro, S. D. Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: Biological consequences. Curr Opin Cell Biol. 10 (5), 602-608 (1998).
- Kang, H. R., et al. Transforming growth factor (TGF)-β1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent, Bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12. J Biol Chem. 282 (10), 7723-7732 (2007).
- Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37 (2), 210-221 (2007).
- Niu, H., et al. Matrix metalloproteinase 12 modulates high-fat diet-induced glomerular fibrogenesis and inflammation in a mouse model of obesity. Sci Rep. 6, 20171 (2016).
- Huang, Q., et al. Regulation of liver fibrosis by matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase and research advances in related therapeutic drugs. J Clin Hepatol. 38 (6), 1420-1425 (2022).
- Cao, Z., et al. A novel pathophysiological classification of silicosis models provides some new insights into the progression of the disease. Ecotoxicol Environ Saf. 202, 110834 (2020).
- Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. Int J Mol Sci. 22 (18), 10063 (2021).
- Pedroza, M., et al. Interleukin-6 contributes to inflammation and remodeling in a model of adenosine-mediated lung injury. PLoS One. 6 (7), e22667 (2011).
- Ataie-Kachoie, P., Pourgholami, M. H., Morris, D. L. Inhibition of the IL-6 signaling pathway: A strategy to combat chronic inflammatory diseases and cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 24 (2), 163-173 (2013).
- Robinson, M. B., et al. IL-6 trans-signaling increases expression of airways disease genes in airway smooth muscle. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (2), L129-L138 (2015).
- Garbers, C., Rose-John, S. Dissecting interleukin-6 classic and trans-signaling in inflammation and cancer. Methods Mol Biol. 2691, 207-224 (2023).
- Chakraborty, D., et al. Author correction: Activation of STAT3 integrates common profibrotic pathways to promote fibroblast activation and tissue fibrosis. Nat Commun. 12, 7259 (2021).
- O'Donoghue, R. J. J., et al. Genetic partitioning of interleukin-6 signalling in mice dissociates Stat3 from Smad3-mediated lung fibrosis. EMBO Mol Med. 4 (9), 939-951 (2012).
- Gao, Y., Zhou, X., Zhou, Y., Zhao, L. IL-9 and its receptor promote the progression of chronic obstructive pulmonary disease by activating macrophages through the STAT3 pathway. J China Med Univ. 52, 921-927 (2023).
- Wang, Y., et al. Xuanfei Baidu decoction protects against macrophage-induced inflammation and pulmonary fibrosis via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway. J Ethnopharmacol. 283, 114701 (2022).
- Liu, T., Zhang, Z., Shen, W., Wu, Y., Bian, T. MicroRNA let-7 induces M2 macrophage polarization in COPD emphysema through the IL-6/STAT3 pathway. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 18, 575-591 (2023).
- Guo, X., et al. Involvement of M2 macrophage polarization in PM2.5-induced COPD by upregulating MMP12 via IL4/STAT6 pathway. Ecotoxicol Environ Saf. 283, 116793 (2024).