Artykuł metodologiczny

Myszowy model współkolonizacji pochwy przez Candida albicans i Streptococcus agalactiae

54 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72557

⸱

21 sierpnia 2026

 , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę jednoczesnej kolonizacji pochwy myszy przez Candida albicans oraz Streptococcus agalactiae. Może on zostać wykorzystany do badania interakcji polimikrobowych, oddziaływań między gospodarzem a mikroorganizmami oraz odpowiedzi organizmu gospodarza na te drobnoustroje.

Streszczenie

Z ludzkiego traktu pochwowego izoluje się zróżnicowane mikroby, a wiele organizmów zasiedlających tę niszę potrafi przełączać się między stylem życia komensalnym a patogennym. Na wyniki przebiegu choroby wpływają czynniki takie jak skład społeczności mikroorganizmów oraz środowisko gospodarza, jednak mechanizmy determinujące te wyniki nie są dobrze poznane. W niniejszej pracy opisujemy mysi model służący do badania interakcji międzykrólestwowych oraz odpowiedzi gospodarza na Candida albicans i Streptococcus agalactiae (Grupa B Streptococcus, GBS), patobionty kolonizujące żeński układ rozrodczy (FGT). Pojawiające się dowody sugerują, że C. albicans Kolonizacja jest czynnikiem ryzyka nosicielstwa GBS ze względu na częstą koizolację tych drobnoustrojów. W czasie ciąży kolonizacja GBS może prowadzić do niekorzystnych wyników. w tym zapalenie błon płodowych i martwy urodzenie. GBS mogą zostać przekazane również płodowi wewnątrzmacicznie lub noworodka podczas porodu i jest główną przyczyną zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Kolonizacja dróg rodnych jest krytycznym etapem poprzedzającym wystąpienie choroby wywołanej przez GBS, a nisza ta wywiera liczne presje selekcyjne, na które mogą wpływać C. albicans kolonizacji. Niniejszy protokół opisuje model jednoczesnej C. albicans-współkolonizacja pochwy GBS przy zastosowaniu leczenia antybiotykowego i pojedynczej dawki 17β-estradiolu w celu ustanowienia C. albicans kolonizacji, po której następuje odstawienie antybiotyków i inokulacja GBS. Obciążenie mikrobiologiczne w świetle pochwy jest ilościowo określane w trakcie eksperymentu za pomocą płukania, natomiast obciążenie w całymFemale Genital Tract (FGT) jest określane poprzez sekcję, homogenizację i wysiew z pochwy, szyjki macicy oraz macicy. Metoda ta umożliwi zbadanie mechanizmów, za pomocą których bezpośrednie i pośrednie interakcje polimikrobowe wpływają na styl życia i patogenezę tych dwóch organizmów, a także na odpowiedź immunologiczną gospodarza w FGT.

Wprowadzenie

Streptococcus agalactiae (Grupa B Streptococcus, GBS) jest Gram-dodatnim bakteryjnym patobiontem, który kolonizuje wiele miejsc polimikrobowych, w tym przewód pokarmowy i drogi rodne. Chociaż kolonizacja pochwy jest zazwyczaj bezobjawowa, w czasie ciąży GBS może przedostać się z dróg rodnych do macicy i przeniknąć przez nienaruszone błony, powodując zakażenie płynu owodniowego i łożyska. W związku z tym stanowi on główny czynnik ryzyka niekorzystnych wyników ciąży, zakażeń płodu oraz chorób noworodków1,2Jako jedna z głównych przyczyn zakażeń inwazyjnych u noworodków, kluczowe jest scharakteryzowanie czynników wpływających na ryzyko transmisji i zakażenia. Przedporodowa profilaktyka antybiotykowa może ograniczyć transmisję pionową oraz wczesne występowanie choroby wywołanej przez GBS u noworodków.3,4; wiązano go jednak ze wzrostem wskaźników oporności na antybiotyki oraz potencjalnymi długofalowymi skutkami związanymi z podawaniem antybiotyków w okresie prenatalnym lub we wczesnym dzieciństwie5,6,7,8Czynniki te sprawiają, że konieczne jest opracowanie bardziej celowanych interwencji zapobiegawczych i terapeutycznych.

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że skład mikrobiomu oraz interakcje polimikrobowe wpływają na homeostazę i prawdopodobieństwo wystąpienia choroby9. Dominacja GBS w ludzkim mikrobiomie pochwy została powiązana ze spadkiem liczebności Lactobacillus, a zaobserwowano również interakcje specyficzne dla gatunków i szczepów , które mogą mieć zróżnicowany wpływ na kolonizację in vitro oraz in vivo10,11. Wcześniej nasza grupa badawcza opracowała mysi model kolonizacji pochwy przez GBS, aby zbadać korelacje gospodarza i bakterii dotyczące kondycji GBS12. Procedura ta polega na podaniu myszom pojedynczej dawki 17β-estradiolu, a następnego dnia na inokulacji dopochwowej GBS. Model ten wykorzystywano do charakterystyki znaczenia białek powierzchniowych GBS, regulacyjnych sieci sygnałowych oraz sekrecji toksyn w utrzymywaniu kolonizacji i naciekaniu tkanek FGT. Ponadto odkryliśmy, że GBS wykazuje złożone interakcje z innymi bakteriami w drogach pochwy, w tym z Akkermansia muciniphila oraz Enterococcus faecalis13,14,15, co pokazuje, jak styl życia i przetrwanie GBS są kształtowane przez obecność sąsiadujących drobnoustrojów.

Choć istniejący model został dostosowany do badania interakcji międzybakteryjnych, w celu badania innych drobnoustrojów wymagane były dodatkowe modyfikacje. Grzyby są niedostatecznie zbadanym składnikiem mikrobiomu pochwy, a za pomocą przedstawionego tutaj modelu dążyliśmy do opracowania narzędzia do badania kolonizacji grzybiczej oraz interakcji grzybkowo-bakteryjnych in vivo. Najczęściej izolowanym grzybem z ludzkiego przewodu rodnego jest Candida albicans, który kolonizuje ponad 70% osób16. C. albicans jest polimorficzny i może przechodzić morfogenezę, aby przełączać się między morfotypem drożdżakowym a nitkowatym. Filamentacja wiąże się z odrębnym zestawem ekspresji genów17,18. Niedawno doniesiono, że niektóre z tych genów specyficznych dla strzępek zapewniają przewagę adaptacyjną w kontekście kolonizacji polimikrobowej19,20,21.

W kilku badaniach zgłoszono współizolację C. albicans i GBS z wymazów z pochwy u ludzi, a nasza grupa badawcza stwierdziła niedawno, że u osób skolonizowanych przez C. albicans występuje znacznie wyższa częstość nosicielstwa GBS22. Opracowaliśmy system in vivo do badania trójstronnych interakcji między grzybami komensalnymi, bakteriami a gospodarzem. Badania nad grzybami u konwencjonalnych myszy zazwyczaj wymagają leczenia antybiotykami, aby przełamać oporność na kolonizację indukowaną przez bakterie i ustanowić trwałą kolonizację23. Aby osiągnąć ten cel bez zaburzania zdolności GBS do kolonizacji, podajemy myszom koktajl antybiotyków, inokulujemy je C. albicans, a po ustanowieniu kolonizacji przerywamy ekspozycję na antybiotyki, aby umożliwić późniejszą kolonizację przez GBS. Proces ten został zoptymalizowany w taki sposób, aby zarówno C. albicans, jak i GBS kolonizowały drogi rodne przy podobnym obciążeniu i w podobnym czasie, co umożliwia bezpośrednie interakcje w obrębie pochwy. Niniejszy protokół opisuje metodę przygotowania myszy za pomocą antybiotyków, podania 17β-estradiolu, ustanowienia kolonizacji zarówno przez grzyby, jak i bakterie oraz pobierania próbek płuczek i tkanek do późniejszej analizy.

Protokół

Prace ze zwierzętami przedstawione w niniejszym manuskrypcie zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kolorado Anschutz zgodnie z protokołem nr 00316. Na poniższej osi czasu dzień 0 odnosi się do dnia inokulacji S. agalactiae.

1. Podaj antybiotyki przed inokulacją.

  1. Przygotować stężone roztwory ampicyliny, neomycyny i gentamycyny o stężeniu 50 mg/mL każdy, rozpuszczając je w wodzie pitnej dla myszy. Roztwór antybiotyków wysterylizować za pomocą filtra 0,22 µm.
  2. Dodać roztwór antybiotyków do wody pitnej dla myszy w rozcieńczeniu 1:100, dodając 1 mL roztworu na każde 99 g wody.
  3. Po 7 dniach wymienić wodę, powtarzając kroki 1.1 i 1.2.
  4. Podać antybiotyki przez co najmniej 7–10 dni przed rozpoczęciem eksperymentu, jednak całkowity czas leczenia antybiotykami nie może przekroczyć 14 dni.

2. Synchronizacja cykli rujowych myszy (dzień -3).

  1. Do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL dodać 17β-estradiol w ilości 0,5 mg na mysz, wraz z niewielką nadwyżką, aby zrekompensować przyleganie zawiesiny do ścianek probówki. Szczelnie zamknąć probówkę i krótko wymieszać na wirówce typu vortex w celu rozbicia grudek.
    UWAGA: Ponieważ 17β-estradiol może przenikać do organizmu poprzez kontakt z skórą lub błonami śluzowymi, należy ostrożnie obchodzić się z tym odczynnikiem i stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
  2. Za pomocą filtra 0,45 µm wysterylizować olej sezamowy w ilości 100 µL na każde 0,5 mg 17β-estradiolu, wprowadzając go bezpośrednio do probówki stożkowej zawierającej 17β-estradiol. Stężenie wynosi 5 mg/mL. Szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać roztwór na wirówce typu vortex, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
  3. Przygotować sterylne strzykawki 1 mL (jedna na mysz), odciągając tłok do znacznika 0,15 mL i ustawiając je tak, aby tłok był skierowany w dół, a końcówka Luer Lock w górę.
  4. Pobrać zawiesinę 17β-estradiolu do nowej sterylnej strzykawki 10 mL za pomocą sterylnej igły 18G 1,5” i wykorzystać ją do napełnienia przygotowanych strzykawek 1 mL ilością 100 µL zawiesiny.
  5. Każdą strzykawkę 1 mL zamknąć sterylną igłą 26G 0,5”.
  6. Przygotować zawiesinę 100 µL oleju sezamowego zawierającą 0,5 mg 17β-estradiolu i podać jedną dawkę każdej myszy drogą domięśniową na jeden dzień przed inokulacją C. albicans.

3. Inokulacja myszy C. albicans (dzień -2).

  1. Na jeden dzień przed inokulacją (w tym samym dniu, w którym podawano 17β-estradiol), przygotować 5 mL nocnej hodowli C. albicans w bulionie Yeast Peptone Dextrose w inkubatorze w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
  2. W dniu inokulacji przenieść alikwot nocnej hodowli do sterylnej probówki do mikrocentryfugi i wirować z prędkością ≤10,000 × g przez 7–8 s lub do czasu powstania osadu.
  3. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
  4. Za pomocą hemocytometru obliczyć stężenie zawiesiny.
  5. Przenieść alikwot zawiesiny do nowej sterylnej probówki do mikrocentryfugi, ponownie odwirować osad i zawiesić w świeżym sterylnym PBS, aby uzyskać stężenie końcowe 109 komórek C. albicans/mL przy objętości końcowej wynoszącej co najmniej 10 µL na mysz. Na przykład, jeśli stężenie wynosi 2 × 108 komórek/mL i jest 10 myszy, należy odwirować 500 µL i resuspendować w 100 µL.
  6. Każdej myszy podać dopochwowo 10 µL zawiesiny C. albicans w PBS o stężeniu 109 komórek/mL (107 komórek/mysz).
    1. Utrzymać każdą mysz, chwytając skórę na karku kciukiem i palcem wskazującym niedominującej ręki, a następnie obracając nadgarstek tak, aby grzbiet myszy spoczywał w dłoni. Użyć palca serdecznego i małego do unieruchomienia ogona.
    2. Pobrać 10 µL zawiesiny C. albicans do sterylnego końcówki pipety. Wprowadzić końcówkę na głębokość około 5–10 mm do światła pochwy, dostosowując głębokość do anatomii myszy.
    3. Podać inokulum C. albicans do pochwy i wycofać końcówkę pipety.
    4. Po zwolnieniu karku trzymać mysz za ogon, aby unieść tylną część ciała. Pozwolić myszy poruszać się na dwóch przednich łapach przez około 1 min lub do czasu, aż inokulum C. albicans przestanie być widoczne.

4. Wymiana wody pitnej (dzień -1).

  1. Jeden dzień po inokulacji C. albicans, co przypada na dzień przed inokulacją S. agalactiae, przenieś myszy do czystych klatek.
  2. Upewnij się, że myszy mają dostęp do świeżej wody bez antybiotyków.

5. Oznaczenie ilości C. albicans w świetle pochwy (dzień -1).

  1. W dniu -1 przygotować jedną sterylną probówkę do mikrocentryfugi oraz 100 µL sterylnego PBS na jedną mysz.
  2. Unieruchomić każdą mysz zgodnie z opisem w kroku 3.6.1.
  3. Pobrać 50 µL PBS do sterylnego końcówki pipety. Wprowadzić końcówkę na głębokość około 1–5 mm do światła pochwy i 3–5 razy pipetować całą objętość PBS w górę i w dół. Przenieść PBS do sterylnej probówki do mikrocentryfugi.
  4. Powtórzyć krok 5.3, aby uzyskać łącznie 100 µL płynu do płukania.
  5. Wymieszać zawartość probówki do mikrocentryfugi na wirówce typu vortex, a następnie wykonać 10-krotne rozcieńczenia seryjne aż do rozcieńczenia 1:10 000 w sterylnym PBS.
  6. Nanieść 10 µL rozcieńczonych zawiesin oraz 25 µL nierozcieńczonego płynu do płukania na chromogenne pożywki agarowe selektywne dla Candida.
  7. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 48 h. Kolonie C. albicans będą gładkie i będą miały kolor morski lub zielony.

6. Inokulacja myszy S. agalactiae (dzień 0).

  1. Na jeden dzień przed inokulacją (tego samego dnia, w którym wymieniana jest woda pitna), należy wyhodować 3 ml nocnej kultury S. agalactiae w bulionie Todda Hewitta (THB) w warunkach statycznych w temperaturze 37 °Inkubator CO2.
  2. W dniu inokulacji rozcieńczyć kulturę nocną w stosunku 1:10 w 4 ml pożywki THB i inkubować statycznie w temperaturze 37 °inkubator do czasu osiągnięcia fazy średnio-logarytmicznej (gęstość optyczna przy 600 nm [OD600] od 0,4 do 0,5) w czasie około 1,5–2 h.
  3. Przenieś kulturę w fazie średniego wzrostu logarytmicznego do sterylnej stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 3 000 × g przez 5 min lub do czasu utworzenia osadu.
  4. Usunąć nadsącz poprzez aspirację, a następnie zawiesić osad w 300 µL sterylnego PBS.
  5. Wykorzystaj resuspendowany osad do przygotowania co najmniej 100 µL z S. agalactiae zawiesiny na mysz, plus dodatkowe 500 µL, w sterylnym PBS przy OD600 0,4 (około 108 jednostki tworzące kolonie [CFU]/ml; łącznie ≥1,5 ml dla 10 myszy).
    UWAGA: Niektóre S. agalactiae szczepy mogą różnić się pod względem OD600stosunek OD do CFU/ml. Określ, która wartość OD600 odpowiada wartości 108 wartość CFU/ml z wyprzedzeniem.
  6. Przenieś zawiesinę do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 3 000 × g przez 5 min lub do czasu utworzenia osadu.
  7. Odssać nadsącz i resuspender osad w 1/10th początkowej objętości sterylnego PBS (jeśli odwirowano 1,5 ml zawiesiny, resuspender w 150 µL). Zawiesina ta będzie miała stężenie 109 CFU/ml i służyć jako inokulum bakteryjne.
  8. Wykonaj rozcieńczenia seryjne i wysej 50 µl µL szczepionki na agarze Todd-Hewitt, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 h w celu określenia dokładnego stężenia inokulum.
  9. Zaszczep każdą mysz dopochwowo dawką 10 µL z S. agalactiae zawieszone w PBS w stężeniu 109 CFU/ml (107 CFU/mysz) stosując tę samą technikę, co w krokach 3.6.1–3.6.4.

7. Ilościowe oznaczenie obciążenia C. albicans i S. agalactiae w świetle pochwy (począwszy od dnia +1).

  1. Zacznij dzień po inokulacji S. agalactiae, pobierając 100 µL płynu z płukania pochwy i wykonując rozcieńczenia seryjne przy użyciu tej samej techniki, co w krokach 5.1–5.5.
  2. Wykonaj podwójny posiew 10 µL rozcieńczonych zawiesin oraz 25 µL nierozcieńczonego płynu z płukania na chromogenne pożywki agarowe selektywne dla Candida oraz selektywne dla StrepB.
  3. Inkubuj płytki z Candida w temperaturze 30 °C przez 48 h. Kolonie C. albicans będą gładkie i będą miały kolor morski lub zielony.
  4. Inkubuj płytki ze StrepB w temperaturze 37 °C przez 24 h. Kolonie S. agalactiae będą gładkie i będą miały kolor różowy lub jasnofioletowy.
  5. Powtarzaj kroki 7.1–7.4 codziennie lub w odpowiednich odstępach czasu, aby monitorować obciążenie mikrobiologiczne w świetle pochwy.

8. Oznaczenie ilościowe obciążenia C. albicans oraz S. agalactiae w tkankach żeńskiego układu rozrodczego (punkt końcowy eksperymentu).

  1. Przygotować trzy probówki z nakrętką o pojemności 2 mL, wypełnione dla każdej myszy około 0,4–0,5 g kulek cyrkonowych o średnicy 1 mm oraz 500 µL sterylnego PBS, w celu pobrania tkanek (pochwy, szyjki macicy i macicy). Przygotować również jedną sterylną probówkę do mikrocentryfugi i 100 µL sterylnego PBS dla każdej myszy do pobrania płukanin. Zapisać masę każdej probówki z nakrętką, aby służyła jako punkt odniesienia przy obliczaniu masy tkanek.
  2. Uśmiercić mysz metodą zatwierdzoną przez instytucję, taką jak uduszenie CO2 i zwichnięcie stawów szyjnych. Do sterylizacji nożyczek i pincety użyć 70% etanolu.
  3. Unieść tylną część ciała myszy za ogon i pobrać płukaniny z pochwy, stosując technikę opisaną w krokach 5.3–5.4.
  4. Spryskać brzuch myszy 70% etanolem i za pomocą wysterylizowanych nożyczek otworzyć jamę brzuszną. Za pomocą pincety odsunąć skórę i przesunąć przewód pokarmowy, aby odsłonić tkanki układu rozrodczego.
  5. Za pomocą wysterylizowanych nożyczek usunąć pęcherz moczowy oraz tłuszcz trzewny i błony zasłaniające macicę. Oddzielić rogi macicy od jajników, przecinając tkankę między trzonem macicy a każdym z jajników.
  6. Za pomocą wysterylizowanej pincety chwycić przewód pochwowy w punkcie poniżej szyjki macicy. Unosić, aż cały przewód pochwowy będzie widoczny, a następnie za pomocą wysterylizowanych nożyczek wykonać cięcie poprzeczne jak najbliżej sromu, unikając przecięcia tkanki skórnej. Usunąć cały układ rozrodczy i umieścić go w sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm.
  7. Za pomocą sterylnej żyletki wykonać dwa cięcia poprzeczne poniżej i powyżej szyjki macicy, oddzielając pochwę, szyjkę macicy i macicę. Posiekać każdą z tkanek, wykonując dodatkowo od 2 do 5 cięć strzałkowych i poprzecznych na każdej z nich. Umieścić każdą tkankę w odpowiedniej, przygotowanej probówce z nakrętką.
  8. Zważyć każdą probówkę z nakrętką i obliczyć masę każdej tkanki, odejmując wartość z kroku 8.1. Szczelnie zakręcić każdą probówkę, homogenizować za pomocą kulek (bead-beat) przy 3 450 rpm przez 1 min, umieścić probówki w lodzie na 1 min, a następnie ponownie homogenizować przy 3 450 rpm przez 1 min.
  9. Wykonać rozcieńczenia seryjne i wysiać każdy homogenat tkankowy oraz próbkę płukanin zgodnie z metodą opisaną w krokach 5.5–5.6. Inkubować płytki zgodnie z opisem w krokach 7.3–7.4.

Wyniki

Aby scharakteryzować kolonizację pochwy przez GBS i C. albicans, myszy poddano inokulacji domięśnej szczepem C. albicans SC5314 lub kontrolnym roztworem PBS, a następnie szczepem GBS COH1. Szczep ten reprezentuje hiperwirulentny serotyp kapsularny III, typ sekwencyjny 17, którego izolaty najczęściej wiążą się z inwazyjnymi chorobami noworodków i zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych1. Myszy, u których jeden dzień po inokulacji nie stwierdzono kolonizacji przez GBS, wykluczono z analizy. W ciągu czterodniowego okresu eksperymentalnego myszy skolonizowane wyłącznie przez GBS stopniowo eliminowały GBS z światła pochwy. Większość myszy współkolonizowanych przez C. albicans utrzymuje wysoką liczbę GBS (Rycina 1A,B). C. albicans kolonizuje światło pochwy myszy przez około cztery dni przed jego wyeliminowaniem (Rycina 1C). Wcześniejsze prace z wykorzystaniem tego modelu wykazały, że liczebność GBS w tkankach żeńskiego układu rozrodczego (FGT), w tym w pochwie, szyjce macicy i macicy, jest również wyższa u myszy współkolonizowanych w porównaniu z zwierzętami skolonizowanymi jednym gatunkiem2.

Wykresy kolonizacji GBS; porównanie statystyczne, krzywa przeżywalności, analiza danych CFU/ml w skali logarytmicznej.
Rysunek 1Ilościowe oznaczanie grupy B Streptococcus kolonizacja Myszy CD-1 zostały skolonizowane przez C. albicans (SC5314) lub traktowane roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym jako grupą kontrolną, a następnie poddane inokulacji pochwy GBS (COH1).A) Obciążenie GBS w płukankach z pochwy, przedstawiono wartości median. (B) Procent myszy skolonizowanych w czasie, oceniany poprzez detekcję GBS w płuczkach z pochwy. (C) C. albicans obciążenia w płuczynkach z pochwy, przedstawiono mediany. Trzy niezależne eksperymenty. n = 26-27 myszy na grupę. * p < 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001 przy użyciu testu dla wielu grup t-testy z zastosowaniem testu wielokrotnych porównań Holma-Sidaka (A) lub test log-rank (B). Skróty: GBS = grupa B Streptococcus, Ca = Candida albicans, JTK = jednostki tworzące kolonie. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Kolonizacja pochwy przez GBS stanowi krytyczne ryzyko dla zdrowia matki, płodu oraz noworodka. Modele in vivo są niezbędne do zrozumienia czynników determinujących kolonizację oraz do opracowania terapii zapobiegawczych. W niniejszym opracowaniu opisujemy model mysi służący do jednoczesnej kolonizacji pochwy myszy przez GBS i C. albicans, oceny obciążenia mikrobiologicznego w świetle pochwy i FGT oraz pobierania odpowiednich tkanek do dalszych analiz. Model ten został opracowany w celu badania interakcji grzybo-bakteryjnych oraz interakcji gospodarz-mikrob w kontekście polimikrobowej kolonizacji pochwy. Nasza grupa badawcza wykorzystała ten model do wyjaśnienia mechanizmów, dzięki którym C. albicans wspomaga kolonizację pochwy przez GBS oraz infekcję wstępującą22.

Modele zwierzęce z sukcesem wykorzystywano do zrozumienia interakcji między gospodarzem a mikrobami; jednak włączenie społeczności polimikrobowych do tych modeli może wiązać się z kilkoma specyficznymi wyzwaniami. Głównymi celami przy opracowaniu tego modelu było ustanowienie kolonizacji grzybiczej, zapewnienie czasu na tworzenie strzępek przez C. albicans oraz inokulacja GBS w celu monitorowania dynamiki kolonizacji przed usunięciem któregoś z mikrobów przez organizm gospodarza. Jako grzyb polimorficzny, C. albicans może reagować na szereg sygnałów środowiskowych związanych z gospodarzem poprzez inicjację morfogenezy strzępkowej17. Filamentacji in vivo nadano priorytet w tym modelu  ze względu na narastające dowody wskazujące, że specyficzne dla strzępek interakcje z GBS napędzają symbiozę w FGT. Wykorzystując szczep C. albicans wykazujący ekspresję NRG1 pod kontrolą represyjnego promotora TetO, nasza grupa badawcza wykazała wcześniej, że GBS wykazuje silniejszą koagregację i wyższą adhezję do nabłonka w przypadku C. albicans zablokowanego w formie strzępkowej w porównaniu do formy zablokowanej w formie drożdżakowej22. Koagregacja z C. albicans oraz powiązanie z ludzkimi komórkami nabłonka pochwy są ważnymi determinantami przystosowania GBS w tym środowisku gospodarza. Wykazano, że dodatkowe bakterie , w tym Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa oraz różne gatunki Streptococcus , modulują ekspresję genów związanych z morfogenezą u C. albicans oraz preferencyjnie oddziałują ze strzępkami24. W przyszłości badanie implikacji filamentacji in vivo można przeprowadzić, wykorzystując ten model do kolonizacji myszy szczepami C. albicans zablokowanymi w formie strzępkowej lub drożdżakowej.

Istniejące modele mysie obejmujące inokulację dopochwową C. albicans koncentrowały się głównie na kandydozie wulwopodpochwowej (VVC)25 i były wykorzystywane do charakterystyki stanu nadzapalnego związanego z objawową infekcją26. Nasz model, opisany w niniejszym manuskrypcie, dokładniej odzwierciedla stan kolonizacji. Wcześniejsze prace naszej grupy badawczej wykazały, że w tym modelu współkolonizacja przez C. albicans zmniejsza obfitość cytokin prozapalnych IL-6, CXCL1, CXCL2 i TNFα w porównaniu z kolonizacją samymi GBS, a poziomy tych białek u myszy współkolonizowanych są porównywalne z poziomami u zwierząt naiwnych22. Wskazuje to, że nie obserwujemy środowiska nadzapalnego charakterystycznego dla VVC, pomimo tworzenia się strzępek grzybni w świetle pochwy. Doniesiono, że myszy CD-1 (outbred) są odporne na VVC, co prawdopodobnie wynika z odpowiedniej immunologicznej kontroli wzrostu grzybów27. Co więcej, myszy CD-1 inicjują silną sygnalizację immunologiczną po dopochwowej inokulacji GBS, która jest wystarczająca do opanowania populacji bakterii w ciągu około jednego tygodnia w przypadku braku C. albicans28,29,30, choć wcześniej badaliśmy kolonizację pochwy przez GBS w innych szczepach myszy12. Model opisany w niniejszym manuskrypcie odzwierciedla przejściowy charakter kolonizacji zarówno przez C. albicans, jak i GBS, który obserwuje się u ludzi. Dodatkowo, u ludzi występuje duża zmienność zarówno w zakresie pH, jak i składu mikrobiomu. Model ten charakteryzuje się warunkami pH bliskim obojętnemu (~6.5)31. W mikrobiomie pochwy myszy CD-1 dominują gatunki z rodzin Enterobacteriaceae i rodzaju Proteus13, które są powiązane z tymi samymi typami stanu społeczności mikrobiologicznej pochwy co GBS9,32.

Poprzez podanie myszom antybiotyków oraz pojedynczej dawki 17β-estradiolu przed inokulacją grzybiczą, przygotowujemy środowisko na przyjęcie C. albicans, co ułatwia kolonizację. Leczenie estradiolem dodatkowo zwiększa powtarzalność między eksperymentami poprzez synchronizację fazy cyklu rujowego, a tym samym lokalnego środowiska immunologicznego w momencie inokulacji. Synchronizujemy myszy do fazy proestry w chwili inokulacji C. albicans, co zbiega się ze zmniejszoną liczbą neutrofili i, jak wykazano, sprzyja zwiększeniu obciążenia grzybiczego w FGT33,34. Odstawienie antybiotyków i zastąpienie ich świeżą wodą pitną na wczesnym etapie harmonogramu eksperymentalnego nie tylko ułatwia kolonizację GBS, ale także pozwala rodzimym mikrobom na ponowne zasiedlenie dróg pochwy. Ponadto ograniczenie podawania estradiolu do pojedynczej wczesnej dawki pozwala myszom powrócić do typowej dynamiki cyklu rujowego, mimo że wykazano, iż ciągłe podawanie estradiolu sprzyja kolonizacji12. Skład komórek odpornościowych w mysim FGT zmienia się w trakcie cyklu rujowego, a odpowiedzi immunologiczne błon śluzowych są wysoce reaktywne na steroidowe hormony płciowe35,36,37. W ten sposób unikamy zmiennej zakłócającej w postaci powtarzalnego podawania estradiolu, aby precyzyjnie zbadać wpływ kolonizacji mikrobiologicznej na środowisko gospodarza.

Dane przedstawione w niniejszym badaniu dotyczą szczepu C. albicans SC5314 oraz szczepu GBS COH1. Wybrano SC5314 do opracowania modelu ze względu na jego częste zastosowanie w mykologii, szeroką dostępność narzędzi genetycznych dla tego tła oraz ugruntowaną wiedzę na temat jego biologii i dynamiki in vitro oraz in vivo. Nasza grupa badawcza wykazała również, że szczep C. albicans 529L może zwiększać miano GBS w drogach rodnych samicy (FGT)22. Szczep GBS COH1 został wykorzystany jako reprezentant linii serotypu III, typu sekwencyjnego 17, która wiąże się z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe i inwazyjnymi chorobami noworodków1,2. Model ten wykorzystuje pożywki selekcyjne i różnicujące do ilościowego oznaczenia liczebności GBS oraz C. albicans w płukankach z pochwy i w tkankach. Aby dostosować ten model do użytku z innymi gatunkami bakterii i grzybów, konieczna byłaby optymalizacja odpowiednich warunków wzrostu selektywnego.

Interakcje grzybowo-bakteryjne wyłaniają się jako istotne mediatorzy stylów życia drobnoustrojów38,39. Wiele badań wykazało, że interakcje te mogą znacząco kształtować komensalizm oraz potencjał wirulencji. Dodatkowo środowisko gospodarza wywiera unikalne presje i może wpływać na takie czynniki, jak programowanie metaboliczne, regulony czynników transkrypcyjnych oraz profile oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Dlatego niezbędne jest stosowanie reprezentatywnych modeli in vivo w celu scharakteryzowania sposobu, w jaki mikroby oddziałują ze sobą. Model mysi opisany w niniejszej pracy może być wykorzystany do badania, w jaki sposób kolonizacja pochwy badanymi bakteriami i grzybami wpływa na obciążenie mikrobiologiczne, ekspresję genów oraz odpowiedź gospodarza.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Biuru Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych (Office of Laboratory Animal Resources) na Uniwersytecie Colorado Anschutz, w tym kierownikowi placówki oraz oddanemu personelowi animalarium. Praca ta jest wspierana przez granty NIH R01AI153332 oraz R21AI188719 przyznane K.S.D.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
filtr 0.22 µmSigma-AldrichSLGSR33SB
filtr 0.45 µmSigma-AldrichSLHAR33SB
strzykawka 1 mL z końcówką Luer LockMcKesson16-S1C
koraliki cyrkonowe 1.0 mmResearch Products International9835
strzykawka 10 mL z końcówką Luer LockMcKesson16-S10C
17β-estradiolSigma-AldrichE8875UWAGA: 17β-estradiol może być wchłaniany przez skórę i błony śluzowe. Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE) i zachować ostrożność podczas używania.
igła 18G 1.5"BD305196
probówka 2 mL z nakrętkąFisher Scientific02-681-374
igła 26G 0.5"McKesson16-N2605
AgarAlpha BiosciencesA01-102
AmpicylinaResearch Products InternationalA40040
CHROMagar CandidaCHROMagarCA222
CHROMagar StrepBCHROMagarSB282
GentamycynaVWR Life Science0304
NeomycynaResearch Products InternationalN20040
Fosforanowy bufor solny (PBS)Fisher ScientificBP2944
Olej sezamowySigma-AldrichS3547
Pożywka Todd-HewittResearch Products InternationalT47500
Pożywka drożdżowo-peptonowo-dekstrozowa (YPD)BD242810

Bibliografia

  1. Megli CJ et al. Virulence and pathogenicity of group B Streptococcus.: virulence factors and their roles in perinatal infection. Virulence. 2025;16(1):2451173.
  2. Manuel G et al. Group B streptococcal infections in pregnancy and early life. Clin Microbiol Rev. 2025;38(1):e00154-22.
  3. Verani JR, McGee L, Schrag SJ. Prevention of perinatal group B streptococcal disease: revised guidelines from CDC, 2010. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36.
  4. Prevention of group B streptococcal early-onset disease in newborns: ACOG Committee Opinion Summary, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):489-92.
  5. Hsu CY et al. Global patterns of antibiotic resistance in group B Streptococcu.s: a systematic review and meta-analysis. Front Microbiol. 2025;16:1541524.
  6. Sabroske EM et al. Evolving antibiotic resistance in group B Streptococci. causing invasive infant disease: 1970-2021. Pediatr Res. 2023;93(6):2067-71.
  7. Azad MB et al. Impact of maternal intrapartum antibiotics, method of birth and breastfeeding on gut microbiota during the first year of life: a prospective cohort study. BJOG. 2016;123(6):983-93.
  8. Duong QA, Curtis N, Zimmermann P. The association between prenatal antibiotic exposure and adverse long-term health outcomes in children: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 2025;90(1):106377.
  9. Mejia ME, Robertson CM, Patras KA. Interspecies interactions within the host: the social network of group B Streptococcus. Infect Immun. 2023;91(4):e00440-22.
  10. De Gregorio PR, Juárez Tomás MS, Leccese Terraf MC, Nader-Macías MEF. Preventive effect of Lactobacillus reuteri .CRL1324 on group B Streptococcus vaginal colonization in an experimental mouse model. J Appl Microbiol. 2015;118(4):1034-47.
  11. Shiroda M, Aronoff DM, Gaddy JA, Manning SD. The impact of Lactobacillus. on group B streptococcal interactions with cells of the extraplacental membranes. Microb Pathog. 2020;148:104463.
  12. Patras KA, Doran KS. A murine model of group B Streptococcus .vaginal colonization. J Vis Exp. 2016;(117):e54708.
  13. Burcham LR et al. Interrelated effects of zinc deficiency and the microbiome on group B streptococcal vaginal colonization. mSphere. 2022;7(4):e00264-22.
  14. Marroquin SM, Cohen S, Neely MN, Doran KS. Akkermansia muciniphila impacts group B Streptococcus. vaginal colonization. mBio. 2026;17(6):e02868-25.
  15. Job AM, Doran KS, Spencer BL. A group B streptococcal type VII-secreted LXG toxin mediates interbacterial competition and colonization of the murine female genital tract. mBio. 2024;15(10):e02088-24.
  16. Beigi RH et al. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study. Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):926-30.
  17. Noble SM, Gianetti BA, Witchley JN. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nat Rev Microbiol. 2017;15(2):96-108.
  18. Schille TB et al. Commensalism and pathogenesis of Candida albicans .at the mucosal interface. Nat Rev Microbiol. 2025;23(8):525-40.
  19. Liang SH et al. The hyphal-specific toxin candidalysin promotes fungal gut commensalism. Nature. 2024;627(8004):620-7.
  20. Fróis-Martins R et al. Dynamic expression of candidalysin facilitates oral colonization of Candida albicans. in mice. Nat Microbiol. 2025;10(10):2472-85.
  21. Mauk KE et al. Commensal colonization of Candida albicans. in the mouse gastrointestinal tract is mediated via expression of candidalysin and adhesins. Microbiol Spectr. 2025;13(9):e00567-25.
  22. Cohen S et al. A fungal pathobiont promotes Streptococcus .vaginal persistence and pathogenesis through physical and metabolic interactions. Cell Host Microbe. 2026;34(6):1118-34.e7.
  23. Koh AY. Murine models of Candida .gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 2013;12(11):1416-22.
  24. Allison DL et al. Candida.-bacteria interactions: their impact on human disease. Microbiol Spectr. 2016;4(3):VMBF-0030-2016.
  25. Yano J, Fidel PL Jr. Protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of Candida .vaginitis. J Vis Exp. 2011;(58):e3382.
  26. Ardizzoni A, Wheeler RT, Pericolini E. It takes two to tango: how a dysregulation of the innate immunity, coupled with Candida. virulence, triggers VVC onset. Front Microbiol. 2021;12:692491.
  27. Yano J, Noverr MC, Fidel PL Jr. Vaginal heparan sulfate linked to neutrophil dysfunction in the acute inflammatory response associated with experimental vulvovaginal candidiasis. mBio. 2017;8(2):e00211-17.
  28. Patras KA et al. Group B Streptococcus. CovR regulation modulates host immune signaling pathways to promote vaginal colonization. Cell Microbiol. 2013;15(7):1154-67.
  29. Patras KA, Rösler B, Thoman ML, Doran KS. Characterization of host immunity during persistent vaginal colonization by group B Streptococcus. Mucosal Immunol. 2015;8(6):1339-48.
  30. Spencer BL et al. Characterization of the cellular immune response to group B streptococcal vaginal colonization. J Innate Immun. 2025;17(1):566-78.
  31. Miao J, Willems HME, Peters BM. Exogenous reproductive hormones nor Candida albicans. colonization alter the near neutral mouse vaginal pH. Infect Immun. 2021;89(2):e00550-20.
  32. Rosen GH et al. Group B Streptococcus. and the vaginal microbiota. J Infect Dis. 2017;216(6):744-51.
  33. Latorre MC et al. Vaginal neutrophil infiltration is contingent on ovarian cycle phase and independent of pathogen infection. Front Immunol. 2022;13:1031941.
  34. Gómez-Oro C et al. Progesterone promotes CXCL2-dependent vaginal neutrophil killing by activating cervical resident macrophage-neutrophil crosstalk. JCI Insight. 2024;9(20):e177899.
  35. Winkler I et al. The cycling and aging mouse female reproductive tract at single-cell resolution. Cell. 2024;187(4):981-998.e25.
  36. Seavey MM, Mosmann TR. Estradiol-induced vaginal mucus inhibits antigen penetration and CD8+ T cell priming in response to intravaginal immunization. Vaccine. 2009;27(17):2342-9.
  37. Li S et al. Estrogen action in the epithelial cells of the mouse vagina regulates neutrophil infiltration and vaginal tissue integrity. Sci Rep. 2018;8(1):11247.
  38. Cohen S, Ost KS, Doran KS. Impact of interkingdom microbial interactions in the vaginal tract. PLoS Pathog. 2024;20(3):e1012018.
  39. MacAlpine J, Robbins N, Cowen LE. Bacterial-fungal interactions and their impact on microbial pathogenesis. Mol Ecol. 2023;32(10):2565-81.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Streptokoki grupy Be ski uk ad p ciowyoddzia ywania mi dzykr lestwoweleczenie antybiotykamiilo ciowe oznaczanie obci enia mikrobiologicznegoodpowied immunologiczna gospodarza
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.