Myszowy model współkolonizacji pochwy przez Candida albicans i Streptococcus agalactiae

Podsumowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę jednoczesnej kolonizacji pochwy myszy przez Candida albicans oraz Streptococcus agalactiae. Może on zostać wykorzystany do badania interakcji polimikrobowych, oddziaływań między gospodarzem a mikroorganizmami oraz odpowiedzi organizmu gospodarza na te drobnoustroje.

Streszczenie

Z ludzkiego traktu pochwowego izoluje się zróżnicowane mikroby, a wiele organizmów zasiedlających tę niszę potrafi przełączać się między stylem życia komensalnym a patogennym. Na wyniki przebiegu choroby wpływają czynniki takie jak skład społeczności mikroorganizmów oraz środowisko gospodarza, jednak mechanizmy determinujące te wyniki nie są dobrze poznane. W niniejszej pracy opisujemy mysi model służący do badania interakcji międzykrólestwowych oraz odpowiedzi gospodarza na Candida albicans i Streptococcus agalactiae (Grupa B Streptococcus, GBS), patobionty kolonizujące żeński układ rozrodczy (FGT). Pojawiające się dowody sugerują, że C. albicans Kolonizacja jest czynnikiem ryzyka nosicielstwa GBS ze względu na częstą koizolację tych drobnoustrojów. W czasie ciąży kolonizacja GBS może prowadzić do niekorzystnych wyników. w tym zapalenie błon płodowych i martwy urodzenie. GBS mogą zostać przekazane również płodowi wewnątrzmacicznie lub noworodka podczas porodu i jest główną przyczyną zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków. Kolonizacja dróg rodnych jest krytycznym etapem poprzedzającym wystąpienie choroby wywołanej przez GBS, a nisza ta wywiera liczne presje selekcyjne, na które mogą wpływać C. albicans kolonizacji. Niniejszy protokół opisuje model jednoczesnej C. albicans-współkolonizacja pochwy GBS przy zastosowaniu leczenia antybiotykowego i pojedynczej dawki 17β-estradiolu w celu ustanowienia C. albicans kolonizacji, po której następuje odstawienie antybiotyków i inokulacja GBS. Obciążenie mikrobiologiczne w świetle pochwy jest ilościowo określane w trakcie eksperymentu za pomocą płukania, natomiast obciążenie w całymFemale Genital Tract (FGT) jest określane poprzez sekcję, homogenizację i wysiew z pochwy, szyjki macicy oraz macicy. Metoda ta umożliwi zbadanie mechanizmów, za pomocą których bezpośrednie i pośrednie interakcje polimikrobowe wpływają na styl życia i patogenezę tych dwóch organizmów, a także na odpowiedź immunologiczną gospodarza w FGT.

Wprowadzenie

Streptococcus agalactiae (Grupa B Streptococcus, GBS) jest Gram-dodatnim bakteryjnym patobiontem, który kolonizuje wiele miejsc polimikrobowych, w tym przewód pokarmowy i drogi rodne. Chociaż kolonizacja pochwy jest zazwyczaj bezobjawowa, w czasie ciąży GBS może przedostać się z dróg rodnych do macicy i przeniknąć przez nienaruszone błony, powodując zakażenie płynu owodniowego i łożyska. W związku z tym stanowi on główny czynnik ryzyka niekorzystnych wyników ciąży, zakażeń płodu oraz chorób noworodków^1,2Jako jedna z głównych przyczyn zakażeń inwazyjnych u noworodków, kluczowe jest scharakteryzowanie czynników wpływających na ryzyko transmisji i zakażenia. Przedporodowa profilaktyka antybiotykowa może ograniczyć transmisję pionową oraz wczesne występowanie choroby wywołanej przez GBS u noworodków.^3,4; wiązano go jednak ze wzrostem wskaźników oporności na antybiotyki oraz potencjalnymi długofalowymi skutkami związanymi z podawaniem antybiotyków w okresie prenatalnym lub we wczesnym dzieciństwie^5,6,7,8Czynniki te sprawiają, że konieczne jest opracowanie bardziej celowanych interwencji zapobiegawczych i terapeutycznych.

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że skład mikrobiomu oraz interakcje polimikrobowe wpływają na homeostazę i prawdopodobieństwo wystąpienia choroby⁹. Dominacja GBS w ludzkim mikrobiomie pochwy została powiązana ze spadkiem liczebności Lactobacillus, a zaobserwowano również interakcje specyficzne dla gatunków i szczepów , które mogą mieć zróżnicowany wpływ na kolonizację in vitro oraz in vivo^10,11. Wcześniej nasza grupa badawcza opracowała mysi model kolonizacji pochwy przez GBS, aby zbadać korelacje gospodarza i bakterii dotyczące kondycji GBS¹². Procedura ta polega na podaniu myszom pojedynczej dawki 17β-estradiolu, a następnego dnia na inokulacji dopochwowej GBS. Model ten wykorzystywano do charakterystyki znaczenia białek powierzchniowych GBS, regulacyjnych sieci sygnałowych oraz sekrecji toksyn w utrzymywaniu kolonizacji i naciekaniu tkanek FGT. Ponadto odkryliśmy, że GBS wykazuje złożone interakcje z innymi bakteriami w drogach pochwy, w tym z Akkermansia muciniphila oraz Enterococcus faecalis^13,14,15, co pokazuje, jak styl życia i przetrwanie GBS są kształtowane przez obecność sąsiadujących drobnoustrojów.

Choć istniejący model został dostosowany do badania interakcji międzybakteryjnych, w celu badania innych drobnoustrojów wymagane były dodatkowe modyfikacje. Grzyby są niedostatecznie zbadanym składnikiem mikrobiomu pochwy, a za pomocą przedstawionego tutaj modelu dążyliśmy do opracowania narzędzia do badania kolonizacji grzybiczej oraz interakcji grzybkowo-bakteryjnych in vivo. Najczęściej izolowanym grzybem z ludzkiego przewodu rodnego jest Candida albicans, który kolonizuje ponad 70% osób¹⁶. C. albicans jest polimorficzny i może przechodzić morfogenezę, aby przełączać się między morfotypem drożdżakowym a nitkowatym. Filamentacja wiąże się z odrębnym zestawem ekspresji genów^17,18. Niedawno doniesiono, że niektóre z tych genów specyficznych dla strzępek zapewniają przewagę adaptacyjną w kontekście kolonizacji polimikrobowej^19,20,21.

W kilku badaniach zgłoszono współizolację C. albicans i GBS z wymazów z pochwy u ludzi, a nasza grupa badawcza stwierdziła niedawno, że u osób skolonizowanych przez C. albicans występuje znacznie wyższa częstość nosicielstwa GBS²². Opracowaliśmy system in vivo do badania trójstronnych interakcji między grzybami komensalnymi, bakteriami a gospodarzem. Badania nad grzybami u konwencjonalnych myszy zazwyczaj wymagają leczenia antybiotykami, aby przełamać oporność na kolonizację indukowaną przez bakterie i ustanowić trwałą kolonizację²³. Aby osiągnąć ten cel bez zaburzania zdolności GBS do kolonizacji, podajemy myszom koktajl antybiotyków, inokulujemy je C. albicans, a po ustanowieniu kolonizacji przerywamy ekspozycję na antybiotyki, aby umożliwić późniejszą kolonizację przez GBS. Proces ten został zoptymalizowany w taki sposób, aby zarówno C. albicans, jak i GBS kolonizowały drogi rodne przy podobnym obciążeniu i w podobnym czasie, co umożliwia bezpośrednie interakcje w obrębie pochwy. Niniejszy protokół opisuje metodę przygotowania myszy za pomocą antybiotyków, podania 17β-estradiolu, ustanowienia kolonizacji zarówno przez grzyby, jak i bakterie oraz pobierania próbek płuczek i tkanek do późniejszej analizy.

Protokół

Prace ze zwierzętami przedstawione w niniejszym manuskrypcie zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kolorado Anschutz zgodnie z protokołem nr 00316. Na poniższej osi czasu dzień 0 odnosi się do dnia inokulacji S. agalactiae.

1. Podaj antybiotyki przed inokulacją.

1. Przygotować stężone roztwory ampicyliny, neomycyny i gentamycyny o stężeniu 50 mg/mL każdy, rozpuszczając je w wodzie pitnej dla myszy. Roztwór antybiotyków wysterylizować za pomocą filtra 0,22 µm.
2. Dodać roztwór antybiotyków do wody pitnej dla myszy w rozcieńczeniu 1:100, dodając 1 mL roztworu na każde 99 g wody.
3. Po 7 dniach wymienić wodę, powtarzając kroki 1.1 i 1.2.
4. Podać antybiotyki przez co najmniej 7–10 dni przed rozpoczęciem eksperymentu, jednak całkowity czas leczenia antybiotykami nie może przekroczyć 14 dni.

2. Synchronizacja cykli rujowych myszy (dzień -3).

1. Do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL dodać 17β-estradiol w ilości 0,5 mg na mysz, wraz z niewielką nadwyżką, aby zrekompensować przyleganie zawiesiny do ścianek probówki. Szczelnie zamknąć probówkę i krótko wymieszać na wirówce typu vortex w celu rozbicia grudek.
   UWAGA: Ponieważ 17β-estradiol może przenikać do organizmu poprzez kontakt z skórą lub błonami śluzowymi, należy ostrożnie obchodzić się z tym odczynnikiem i stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
2. Za pomocą filtra 0,45 µm wysterylizować olej sezamowy w ilości 100 µL na każde 0,5 mg 17β-estradiolu, wprowadzając go bezpośrednio do probówki stożkowej zawierającej 17β-estradiol. Stężenie wynosi 5 mg/mL. Szczelnie zamknąć i dokładnie wymieszać roztwór na wirówce typu vortex, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
3. Przygotować sterylne strzykawki 1 mL (jedna na mysz), odciągając tłok do znacznika 0,15 mL i ustawiając je tak, aby tłok był skierowany w dół, a końcówka Luer Lock w górę.
4. Pobrać zawiesinę 17β-estradiolu do nowej sterylnej strzykawki 10 mL za pomocą sterylnej igły 18G 1,5” i wykorzystać ją do napełnienia przygotowanych strzykawek 1 mL ilością 100 µL zawiesiny.
5. Każdą strzykawkę 1 mL zamknąć sterylną igłą 26G 0,5”.
6. Przygotować zawiesinę 100 µL oleju sezamowego zawierającą 0,5 mg 17β-estradiolu i podać jedną dawkę każdej myszy drogą domięśniową na jeden dzień przed inokulacją C. albicans.

3. Inokulacja myszy C. albicans (dzień -2).

1. Na jeden dzień przed inokulacją (w tym samym dniu, w którym podawano 17β-estradiol), przygotować 5 mL nocnej hodowli C. albicans w bulionie Yeast Peptone Dextrose w inkubatorze w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
2. W dniu inokulacji przenieść alikwot nocnej hodowli do sterylnej probówki do mikrocentryfugi i wirować z prędkością ≤10,000 × g przez 7–8 s lub do czasu powstania osadu.
3. Usunąć nadsącz i resuspendować osad w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
4. Za pomocą hemocytometru obliczyć stężenie zawiesiny.
5. Przenieść alikwot zawiesiny do nowej sterylnej probówki do mikrocentryfugi, ponownie odwirować osad i zawiesić w świeżym sterylnym PBS, aby uzyskać stężenie końcowe 10⁹ komórek C. albicans/mL przy objętości końcowej wynoszącej co najmniej 10 µL na mysz. Na przykład, jeśli stężenie wynosi 2 × 10⁸ komórek/mL i jest 10 myszy, należy odwirować 500 µL i resuspendować w 100 µL.
6. Każdej myszy podać dopochwowo 10 µL zawiesiny C. albicans w PBS o stężeniu 10⁹ komórek/mL (10⁷ komórek/mysz).
   1. Utrzymać każdą mysz, chwytając skórę na karku kciukiem i palcem wskazującym niedominującej ręki, a następnie obracając nadgarstek tak, aby grzbiet myszy spoczywał w dłoni. Użyć palca serdecznego i małego do unieruchomienia ogona.
   2. Pobrać 10 µL zawiesiny C. albicans do sterylnego końcówki pipety. Wprowadzić końcówkę na głębokość około 5–10 mm do światła pochwy, dostosowując głębokość do anatomii myszy.
   3. Podać inokulum C. albicans do pochwy i wycofać końcówkę pipety.
   4. Po zwolnieniu karku trzymać mysz za ogon, aby unieść tylną część ciała. Pozwolić myszy poruszać się na dwóch przednich łapach przez około 1 min lub do czasu, aż inokulum C. albicans przestanie być widoczne.

4. Wymiana wody pitnej (dzień -1).

1. Jeden dzień po inokulacji C. albicans, co przypada na dzień przed inokulacją S. agalactiae, przenieś myszy do czystych klatek.
2. Upewnij się, że myszy mają dostęp do świeżej wody bez antybiotyków.

5. Oznaczenie ilości C. albicans w świetle pochwy (dzień -1).

1. W dniu -1 przygotować jedną sterylną probówkę do mikrocentryfugi oraz 100 µL sterylnego PBS na jedną mysz.
2. Unieruchomić każdą mysz zgodnie z opisem w kroku 3.6.1.
3. Pobrać 50 µL PBS do sterylnego końcówki pipety. Wprowadzić końcówkę na głębokość około 1–5 mm do światła pochwy i 3–5 razy pipetować całą objętość PBS w górę i w dół. Przenieść PBS do sterylnej probówki do mikrocentryfugi.
4. Powtórzyć krok 5.3, aby uzyskać łącznie 100 µL płynu do płukania.
5. Wymieszać zawartość probówki do mikrocentryfugi na wirówce typu vortex, a następnie wykonać 10-krotne rozcieńczenia seryjne aż do rozcieńczenia 1:10 000 w sterylnym PBS.
6. Nanieść 10 µL rozcieńczonych zawiesin oraz 25 µL nierozcieńczonego płynu do płukania na chromogenne pożywki agarowe selektywne dla Candida.
7. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 48 h. Kolonie C. albicans będą gładkie i będą miały kolor morski lub zielony.

6. Inokulacja myszy S. agalactiae (dzień 0).

1. Na jeden dzień przed inokulacją (tego samego dnia, w którym wymieniana jest woda pitna), należy wyhodować 3 ml nocnej kultury S. agalactiae w bulionie Todda Hewitta (THB) w warunkach statycznych w temperaturze 37 °Inkubator CO2.
2. W dniu inokulacji rozcieńczyć kulturę nocną w stosunku 1:10 w 4 ml pożywki THB i inkubować statycznie w temperaturze 37 °inkubator do czasu osiągnięcia fazy średnio-logarytmicznej (gęstość optyczna przy 600 nm [OD₆₀₀] od 0,4 do 0,5) w czasie około 1,5–2 h.
3. Przenieś kulturę w fazie średniego wzrostu logarytmicznego do sterylnej stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 3 000 × g przez 5 min lub do czasu utworzenia osadu.
4. Usunąć nadsącz poprzez aspirację, a następnie zawiesić osad w 300 µL sterylnego PBS.
5. Wykorzystaj resuspendowany osad do przygotowania co najmniej 100 µL z S. agalactiae zawiesiny na mysz, plus dodatkowe 500 µL, w sterylnym PBS przy OD₆₀₀ 0,4 (około 10⁸ jednostki tworzące kolonie [CFU]/ml; łącznie ≥1,5 ml dla 10 myszy).
   UWAGA: Niektóre S. agalactiae szczepy mogą różnić się pod względem OD₆₀₀stosunek OD do CFU/ml. Określ, która wartość OD₆₀₀ odpowiada wartości 10⁸ wartość CFU/ml z wyprzedzeniem.
6. Przenieś zawiesinę do nowej sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 3 000 × g przez 5 min lub do czasu utworzenia osadu.
7. Odssać nadsącz i resuspender osad w 1/10^th początkowej objętości sterylnego PBS (jeśli odwirowano 1,5 ml zawiesiny, resuspender w 150 µL). Zawiesina ta będzie miała stężenie 10⁹ CFU/ml i służyć jako inokulum bakteryjne.
8. Wykonaj rozcieńczenia seryjne i wysej 50 µl µL szczepionki na agarze Todd-Hewitt, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 h w celu określenia dokładnego stężenia inokulum.
9. Zaszczep każdą mysz dopochwowo dawką 10 µL z S. agalactiae zawieszone w PBS w stężeniu 10⁹ CFU/ml (10⁷ CFU/mysz) stosując tę samą technikę, co w krokach 3.6.1–3.6.4.

7. Ilościowe oznaczenie obciążenia C. albicans i S. agalactiae w świetle pochwy (począwszy od dnia +1).

1. Zacznij dzień po inokulacji S. agalactiae, pobierając 100 µL płynu z płukania pochwy i wykonując rozcieńczenia seryjne przy użyciu tej samej techniki, co w krokach 5.1–5.5.
2. Wykonaj podwójny posiew 10 µL rozcieńczonych zawiesin oraz 25 µL nierozcieńczonego płynu z płukania na chromogenne pożywki agarowe selektywne dla Candida oraz selektywne dla StrepB.
3. Inkubuj płytki z Candida w temperaturze 30 °C przez 48 h. Kolonie C. albicans będą gładkie i będą miały kolor morski lub zielony.
4. Inkubuj płytki ze StrepB w temperaturze 37 °C przez 24 h. Kolonie S. agalactiae będą gładkie i będą miały kolor różowy lub jasnofioletowy.
5. Powtarzaj kroki 7.1–7.4 codziennie lub w odpowiednich odstępach czasu, aby monitorować obciążenie mikrobiologiczne w świetle pochwy.

8. Oznaczenie ilościowe obciążenia C. albicans oraz S. agalactiae w tkankach żeńskiego układu rozrodczego (punkt końcowy eksperymentu).

1. Przygotować trzy probówki z nakrętką o pojemności 2 mL, wypełnione dla każdej myszy około 0,4–0,5 g kulek cyrkonowych o średnicy 1 mm oraz 500 µL sterylnego PBS, w celu pobrania tkanek (pochwy, szyjki macicy i macicy). Przygotować również jedną sterylną probówkę do mikrocentryfugi i 100 µL sterylnego PBS dla każdej myszy do pobrania płukanin. Zapisać masę każdej probówki z nakrętką, aby służyła jako punkt odniesienia przy obliczaniu masy tkanek.
2. Uśmiercić mysz metodą zatwierdzoną przez instytucję, taką jak uduszenie CO₂ i zwichnięcie stawów szyjnych. Do sterylizacji nożyczek i pincety użyć 70% etanolu.
3. Unieść tylną część ciała myszy za ogon i pobrać płukaniny z pochwy, stosując technikę opisaną w krokach 5.3–5.4.
4. Spryskać brzuch myszy 70% etanolem i za pomocą wysterylizowanych nożyczek otworzyć jamę brzuszną. Za pomocą pincety odsunąć skórę i przesunąć przewód pokarmowy, aby odsłonić tkanki układu rozrodczego.
5. Za pomocą wysterylizowanych nożyczek usunąć pęcherz moczowy oraz tłuszcz trzewny i błony zasłaniające macicę. Oddzielić rogi macicy od jajników, przecinając tkankę między trzonem macicy a każdym z jajników.
6. Za pomocą wysterylizowanej pincety chwycić przewód pochwowy w punkcie poniżej szyjki macicy. Unosić, aż cały przewód pochwowy będzie widoczny, a następnie za pomocą wysterylizowanych nożyczek wykonać cięcie poprzeczne jak najbliżej sromu, unikając przecięcia tkanki skórnej. Usunąć cały układ rozrodczy i umieścić go w sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm.
7. Za pomocą sterylnej żyletki wykonać dwa cięcia poprzeczne poniżej i powyżej szyjki macicy, oddzielając pochwę, szyjkę macicy i macicę. Posiekać każdą z tkanek, wykonując dodatkowo od 2 do 5 cięć strzałkowych i poprzecznych na każdej z nich. Umieścić każdą tkankę w odpowiedniej, przygotowanej probówce z nakrętką.
8. Zważyć każdą probówkę z nakrętką i obliczyć masę każdej tkanki, odejmując wartość z kroku 8.1. Szczelnie zakręcić każdą probówkę, homogenizować za pomocą kulek (bead-beat) przy 3 450 rpm przez 1 min, umieścić probówki w lodzie na 1 min, a następnie ponownie homogenizować przy 3 450 rpm przez 1 min.
9. Wykonać rozcieńczenia seryjne i wysiać każdy homogenat tkankowy oraz próbkę płukanin zgodnie z metodą opisaną w krokach 5.5–5.6. Inkubować płytki zgodnie z opisem w krokach 7.3–7.4.

Wyniki

Aby scharakteryzować kolonizację pochwy przez GBS i C. albicans, myszy poddano inokulacji domięśnej szczepem C. albicans SC5314 lub kontrolnym roztworem PBS, a następnie szczepem GBS COH1. Szczep ten reprezentuje hiperwirulentny serotyp kapsularny III, typ sekwencyjny 17, którego izolaty najczęściej wiążą się z inwazyjnymi chorobami noworodków i zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych¹. Myszy, u których jeden dzień po inokulacji nie stwierdzono kolonizacji przez GBS, wykluczono z ana...

Dyskusja

Kolonizacja pochwy przez GBS stanowi krytyczne ryzyko dla zdrowia matki, płodu oraz noworodka. Modele in vivo są niezbędne do zrozumienia czynników determinujących kolonizację oraz do opracowania terapii zapobiegawczych. W niniejszym opracowaniu opisujemy model mysi służący do jednoczesnej kolonizacji pochwy myszy przez GBS i C. albicans, oceny obciążenia mikrobiologicznego w świetle pochwy i FGT oraz pobierania odpowiednich tkanek do dalszych analiz. Model ten został opracowany w celu badania interakcj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
filtr 0.22 µm	Sigma-Aldrich	SLGSR33SB
filtr 0.45 µm	Sigma-Aldrich	SLHAR33SB
strzykawka 1 mL z końcówką Luer Lock	McKesson	16-S1C
koraliki cyrkonowe 1.0 mm	Research Products International	9835
strzykawka 10 mL z końcówką Luer Lock	McKesson	16-S10C
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E8875	UWAGA: 17β-estradiol może być wchłaniany przez skórę i błony śluzowe. Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE) i zachować ostrożność podczas używania.
igła 18G 1.5"	BD	305196
probówka 2 mL z nakrętką	Fisher Scientific	02-681-374
igła 26G 0.5"	McKesson	16-N2605
Agar	Alpha Biosciences	A01-102
Ampicylina	Research Products International	A40040
CHROMagar Candida	CHROMagar	CA222
CHROMagar StrepB	CHROMagar	SB282
Gentamycyna	VWR Life Science	0304
Neomycyna	Research Products International	N20040
Fosforanowy bufor solny (PBS)	Fisher Scientific	BP2944
Olej sezamowy	Sigma-Aldrich	S3547
Pożywka Todd-Hewitt	Research Products International	T47500
Pożywka drożdżowo-peptonowo-dekstrozowa (YPD)	BD	242810