Paradygmat rozpoznawania społecznego u myszy w celu rozróżnienia relacji krótkoterminowych i długoterminowych

Podsumowanie

W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółową procedurę  pomiaru rozpoznawania społecznego pomiędzy nowymi, krótkoterminowymi  oraz długoterminowymi relacjami  z wykorzystaniem behawioralnego paradygmatu doświadczalnego czterech kubków (Four Cups). Opisujemy zalety i potencjalne zastosowania tego paradygmatu, a także istotne informacje  niezbędne do prawidłowej interpretacji wyników. 

Streszczenie

Pamięć społeczna to zdolność do zapamiętywania i rozpoznawania osobników tego samego gatunku. Jest to fundamentalny aspekt zachowania ssaków, wykazujący korzyści dla przetrwania u ssaków wysoce socjalnych, takich jak myszy i ludzie. Gryzonie, w szczególności myszy, stanowią ugruntowany model zwierzęcy szeroko wykorzystywany do badania pamięci społecznej oraz leżących u jej podstaw mechanizmów. Większość istniejących pamięć społeczna paradygmaty oceniają przede wszystkim krótkotrwałe rozpoznawanie społeczne, w którym czas trwania relacji oraz poziom znajomości między podmiotem a czynnikiem wynosi od 5 do 15 min. W związku z tym istniejące paradygmaty oraz badania z przeszłości nie rejestruj wspomnień społecznych z długotrwałych relacji i skup się na dychotomii nowości versus krótkotrwałej znajomości, pozostawiając istnieje znaczna luka w naszym mechanicznym rozumieniu pamięci społecznej. Aby ją wypełnić, opracowaliśmy prosty test pozwalający uchwycić reakcje myszy na różne stopnie zapoznania, co pozwala na umieszczenie złożonego procesu przypominania sobie informacji społecznych w kontekście możliwym do zaobserwowania i ilościowego określenia. W paradygmacie czterech kubków mysz badana swobodnie bada an arena zawierający cztery perforowane kubki umieszczone w każdym z narożników. W kubkach tych znajduje się trzy odczynnik myszy o różnym stopniu znajomości (bodźce społeczne): mysz znana długoterminowo (współmieszkaniec z klatki; 1 miesiąc wspólnego zakwaterowania), mysz znana krótkoterminowo (10 minut wcześniejszej ekspozycji), nowa mysz tego samego gatunku oraz pusty kubek jako kontrola. Samce myszy CD-1 wykazują preferencję do badania myszy nowej oraz znanej długoterminowo nad badaniem myszy krótkotrwale oswojonych w tym paradygmacie. To zadanie demonstruje rozpoznawanie stopnia znajomości i minimalizowanie zachowań agresywnych, przy jednoczesnym kontrolując pod kątem historia ekspozycji. Ten nowatorski test stanowi platformę do bezpośredniego porównywania neuronalne mechanizmy zachowań społecznych pamięć długotrwała, krótkotrwała i nowa osób. Paradygmat czterech kubków służy jako nowatorska pomiar dla długoterminowe rozpoznawanie znajomości, które uzupełni istniejące testy rozpoznawania krótkoterminowego. 

Wprowadzenie

Pamięć społeczna jest kluczową cechą zachowań społecznych ssaków i jest szczególnie rozwinięta u gatunków wysoce społecznych, takich jak myszy i ludzie. U gryzoni rozpoznawanie innych osobników leży u podstaw dynamiki behawioralnej krytycznej dla przetrwania w obrębie rodzin i grup osobników tego samego gatunku, w tym spójności grupy, hierarchii dominacji, zachowań kopulacyjnych i opieki rodzicielskiej^1,2. Oprócz ewolucyjnie korzystnej roli w przetrwaniu zwierząt, zaburzenia pamięci społecznej u ludzi są powszechną cechą wielu zaburzeń neuropsychiatrycznych i neurologicznych, w tym zaburzeń spektrum autyzmu, schizofrenii i choroby Alzheimera^3,4,5,6. Ponieważ rozpoznawanie społeczne jest fundamentalne dla codziennego funkcjonowania gatunków społecznych i ma jasne znaczenie kliniczne, opracowanie testów behawioralnych, które dokładnie oddają jego wielowymiarowy charakter i podłoże neuronalne, jest niezwykle istotne. Chociaż istniejące paradygmaty mierzą niektóre aspekty rozpoznawania społecznego u myszy, większość testów została zaprojektowana tak, aby oceniać preferencje nowości poprzez porównywanie relacji nowych i krótkotrwałych tworzonych w ciągu minut lub godzin, a nie kwantyfikować rozpoznawanie długotrwałych relacji społecznych.   

Istniejące podejścia, takie jak paradygmat trzech komór lub paradygmaty habituacji i dyshabituacji, oceniają preferencję nowości po jedynie krótkiej wcześniejszej ekspozycji, często ograniczonej do 5–15 minut.^7,8,9,10,11Te metody dostarczyliśmy istotny wgląd w mechanizmy neuronalne z te krótkotrwałe społeczne pamięć u myszy^12,13. Jednakże, naturalistyczne pamięci społeczne oraz funkcje społeczne muszą uwzględniać odrębne mechanizmy występujące w relacjach długoterminowych, wypracowany poprzez długotrwałe współżycie hierarchie społeczne lub partnerzy do kojarzenia. Choć w niektórych badaniach stosuje się paradygmat trzech komór z wykorzystaniem osobników z jednego miotu¹⁴ lub znajome myszy kwaterowane razem z osobnikiem przez maksymalnie 72 h^15,16głównym zastosowaniem tego paradygmatu nadal pozostaje prosta dychotomia: nowa vs znana mysz. Ogranicza to możliwość porównań pomiędzy wieloma różnymi znanymi myszami. Ugruntowane paradygmaty rozpoznawania społecznego są ukierunkowane na badanie w zakresie relacji krótkoterminowych, identyfikujemy wyraźną lukę w naszej wiedzy na temat mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw społecznego rozpoznawania w relacjach długoterminowych.   

Aby rozwiązać to ograniczenie, opracowaliśmy paradygmat czterech kubków: prosty i elastyczny test zaprojektowany w celu zróżnicowania rozpoznawanie wielu poziomów znajomości społecznej w obrębie jednej sesji testowej. W tym paradygmacie mysz badana eksploruje cztery narożniki otwartej areny, każdy zawierający a perforowany kubek trzymanie a konspecyficzny lub kontrolną pustą probówkę. Kubki zawierają osobnika tego samego gatunku, z którym badany zwierzę przebywa w jednej klatce od dłuższego czasu (współmieszkańca klatki), a krótkotrwałe oswojenie konspecyficzny z ograniczoną wcześniejszą ekspozycją (10 min), a nowatorski mysz oraz an Tekst źródłowy jest pusty. Proszę dostarczyć treść do przetłumaczenia. kontrolna. Czas badania służy jako ilościowy wskaźnik rozpoznawania społecznego i preferencji społecznych. Taka konfiguracja umożliwia jednoczesne porównania pomiędzy różnymi poziomami zaznajomienia, przy jednoczesnym zminimalizowaniu bezpośrednich interakcji fizycznych oraz potencjalnych agresywnych starć. 

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Florydy.  

1. Przygotowanie i zakwaterowanie zwierząt  

1. We wszystkich eksperymentach należy wykorzystać dorosłe myszy tej samej płci utrzymywane w grupach .  Przed badaniami eksperymentalnymi myszy należy poddawać manipulacjom przez co najmniej 2 dni, aby przyzwyczaić je do dotyku i zmniejszyć poziom lęku.
2. Myszy należy trzymać w standardowych klatkach laboratoryjnych w odwróconym cyklu światło-ciemność, z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. 
   UWAGA: W reprezentatywnych eksperymentach wykorzystano dorosłe myszy CD-1 i C57BL/6 (w wieku 3–4 miesięcy). Myszy utrzymywano w grupach po 3–4 zwierzęta w klatce. Reprezentatywne zestawy danych obejmowały 10 samców CD-1, 12 samic CD-1 oraz 31 samców C57BL/6. Badania behawioralne należy przeprowadzać w fazie aktywności badanego zwierzęcia (fazie ciemnej). Myszy uwzględnione w niniejszym badaniu poddawano testom w godzinach 9:00–18:00 i utrzymywano w odwróconym cyklu światło-ciemność (faza ciemna od 8:00 do 20:00).
3. Jako długotrwale znanego osobnika definiuje się współmieszka tej samej linii i płci , która zamieszkiwała tę samą klatkę z badaną myszą przez minimum 3–4 tygodnie przed testami. 
4. Należy wybrać krótkotrwale znane oraz nowe osobniki konspecyficzne tej samej linii i płci co badana mysz. 
5. Należy upewnić się, że nowe myszy nie miały wcześniej kontaktu fizycznego ani węchowego z badaną myszą. 
6. Nowego osobnika oraz osobnika krótkotrwale znanego należy wybrać z różnych klatek domowych, aby uniknąć podobnych sygnałów węchowych u tych dwóch zwierząt.
   UWAGA: Należy zapisywać przybliżony wiek wszystkich wykorzystanych zwierząt i ograniczyć wielokrotne wykorzystywanie tych samych nowych oraz krótkotrwale znanych osobników w ciągu jednego dnia. W przypadku ponownego wykorzystania osobników, należy zapewnić przerwę >2 h w klatce domowej pomiędzy próbami testowymi, aby uniknąć stresu u zwierząt.

2. Przygotowanie areny 

1. Umieść czysty, kwadratowa arena otwartego pola (49,5 cm x 49,5 cm x 49,5 cm; Tabela materiałów) w cichym pomieszczeniu do testów behawioralnych.
2. Oświetl obszar za pomocą jednej wysokiej lampy lub lampy podsufitowej ustawionej na około 8–20 luksów.  
3. Umieść cztery identycznie zważone perforowane plastikowe kubki w każdym z narożników areny (Rysunek 1A).
   1. W miarę możliwości należy używać kubków identycznych pod względem wizualnym. W przypadku zastosowania kubków w różnych kolorach należy przeprowadzić przeciwbilansowanie przydziału i rozmieszczenia kubków w kolejnych próbach.
   2. Przyciskaj dwie strony każdego naczynia przemyć przeciwko ścianom areny w celu ograniczenia dostępu, co minimalizuje zachowania ukrywania się i standaryzuje kąty badania. 
   3. Należy używać kubków, które są wystarczająco ciężkie, aby zapobiec ucieczce, i wystarczająco wysokie, aby zapobiec wspinaniu się.
      UWAGA: W niniejszym badaniu reprezentatywne kubki z danymi oraz lokalizacja agenta zostały spseudorandomizowane pomiędzy badanymi poprzez obracanie kolorowych plastikowych kubków zgodnie z ruchem wskazówek zegara, podczas gdy typ agenta zmieniał się przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w kolejnych próbach.
4. Miejsce kamera wystarczająco wysoki, aby cały test pudełko znajduje się w kadrze, aby uniknąć martwych pól podczas kodowania behawioralnego. Należy zachować minimalne odblaski i zapewnić stałe oświetlenie całej powierzchni dna pudełka (Rycina 1A).
5. Dokładnie oczyść podłoże areny oraz kubki pomiędzy próbami, używając odpowiedni środek dezynfekujący, następnie przemyto wodą w celu usunięcia resztek zapachowych. 
6. Należy pozwolić na całkowite wyschnięcie areny przed ponownym wprowadzeniem osobników. zwierzęta 

3. Habituacja do areny w dniu 0

1. Umieść badany obiekt oraz jego współmieszkańców z klatki w arenie zawierającej cztery puste perforowane kubki i pozwól im na swobodną eksplorację przez 20 min.
   UWAGA: W przypadku eksperymentów z użyciem uwięzi należy poddać badane obiekty habituacji indywidualnie. Może być konieczne przeprowadzenie dodatkowych sesji habituacji. Zaleca się przeprowadzenie habituacji przez kilka dni, jeśli myszy nie eksplorują w pełni całej areny po pierwszym dniu.
2. Usuń wszystkie myszy z areny i przenieś je z powrotem do klatki macierzystej.
3. Umieść wszystkie agenty społeczne pod kubkami na 10 min, aby przyzwyczaić je do ograniczenia ruchów. Habituuj agentów z tej samej klatki macierzystej jednocześnie, po jednym w każdym kubku (Rycina 1B).
4. Oczyść arenę oraz kubki przed wprowadzeniem myszy z nowej klatki macierzystej.
   UWAGA: Przed rozpoczęciem sesji pozwól myszom odpocząć przez co najmniej 15 min po transporcie do pomieszczenia.

4. Poziom bazowy 

1. Przygotuj arenę zgodnie z sekcją 2. Zachowaj tę samą konfigurację areny przez wszystkie dni eksperymentu. 
2. Umieść badany osobnik w arenie zawierającej cztery puste kubki i pozwól na swobodną eksplorację przez 10 min.
   UWAGA: Nie przerywaj nagrywania w żadnym momencie, aby zapewnić ciągły zapis podczas wszystkich etapów bieżącej próby.  

5. Akwizycja krótkoterminowa 

1. Użyj obciążonego perforowanego kubka, aby ograniczyć ruchy badanego zwierzęcia, umieszczając pod nim wyznaczonego agenta  „krótkoterminowego znajomego” . Alternatywnie wystaw badanego na działanie agenta krótkoterminowego w czystej klatce.
2. W przypadku wyboru ekspozycji w arenie, umieść wyznaczonego krótkoterminowego znajomego agenta pod jednym perforowanym kubkiem w arenie, pozostawiając pozostałe trzy kubki puste. 
3. Wypuść badanego i pozostaw go na swobodną eksplorację przez 10 min (Rysunek 1B).
   UWAGA: W przypadku zastosowania metody ekspozycji na agenta krótkoterminowego w arenie, należy zmieniać róg wykorzystywany dla agenta krótkoterminowego w zależności od badanego zwierzęcia, aby uniknąć błędu przestrzennego. 

6. Odstęp między próbami (ITI) 

1. Odbierz  krótkotrwale zapoznanego  agenta  i umieść go z powrotem w jego domowej klatce. Pozostaw mysz badaną samotnie w arenie , aby mogła swobodnie poruszać się przez 10 min. 
2. Przygotuj  nowe  oraz długotrwale zapoznane  myszy agenty do fazy testowej.   
   UWAGA: Krótkotrwale zapoznanego agenta należy umieścić w tym samym kubku, który był używany podczas krótkotrwałego zapoznawania (sekcja 5). Jest to zalecane w celu uniknięcia efektu nowości w lokalizacji przestrzennej w przypadku przeprowadzania krótkotrwałego zapoznawania w arenie.

7. Faza rozpoznawania społecznego 

1. Umieść dodatkowy obciążony perforowany kubek na myszy badanej.
2. Umieść po jednej myszy pod każdym z trzech obciążonych perforowanych kubków: znajomego z długoterminowej współdzielonej klatki (cagemate), znajomego z krótkoterminowej interakcji oraz nową osobniczkę tego samego gatunku. Pozostaw wyznaczony czwarty kubek pusty jako kontrolę.  
   UWAGA: Oznacz góry kubków, aby zidentyfikować położenie bodźców podczas oceny behawioralnej.
3. Zdejmij perforowany kubek z myszy badanej znajdującej się w centrum areny i pozwól na swobodną eksplorację przez 10 min (Rycina 1A).
4. Usuń wszystkie myszy po zakończeniu 10 min interwału i zatrzymaj nagrywanie.
5. Wróć wszystkie myszy do ich macierzystych klatek. 
6. Dokładnie wyczyść arenę i kubki przed kolejną próbą.  
   UWAGA: Miej przygotowane zapasowe kubki na wypadek uszkodzenia.

8. Ocena behawioralna

1. Zaimportuj wszystkie nagrane filmy do oprogramowania do analizy behawioralnej umożliwiającego ręczną adnotację, takiego jak Behavioral Observation Research Interactive Software (BORIS).
   UWAGA: Ocena behawioralna nie była przeprowadzana w sposób zaślepiony pod kątem lokalizacji współmieszkańców klatki, ponieważ etykiety z identyfikatorem agenta znajdowały się nad każdym kubkiem i były widoczne na filmach, a numer klatki można było wywnioskować. Osoby oceniające nie zwracały aktywnej uwagi na widoczne etykiety i nie znały tożsamości agenta nowego oraz krótkoterminowego. Wszyscy oceniający stosowali predefiniowane definicje operacyjne zachowań badawczych oraz zstandaryzowane kryteria oceny.
2. Zdefiniuj macierz behawioralną przed rozpoczęciem oceny.
3. Zdefiniuj epizod badania jako sytuację, w której mysz badana umieszcza nos w odległości  1 cm od kubka,  wykazując trwałą posturę badawczą. 
   UWAGA: Za epizody badania należy uznawać gryzienie i żucie skierowane w stronę kubka.
4. Ręcznie adnotuj całkowity czas trwania badania dla każdego kubka w trakcie 10-minutowej fazy testu rozpoznawania społecznego. Oceń poziom bazowy i nabywanie zgodnie z potrzebami.
   UWAGA: Można zastosować zautomatyzowane śledzenie pozy z półkolistym obszarem zainteresowania o promieniu 1 cm wokół każdego kubka.
5. Eksportuj adnotowane dane do następującej analizy statystycznej.

Wyniki

Zgodnie z protokołem paradygmatu czterech kubków, samce myszy szczepu CD-1 wykazały zróżnicowane zachowania w badaniu społecznym w stosunku do osobników długotrwale znanych (współmieszkańców klatki), krótkotrwale znanych oraz nowych osobników tego samego gatunku (Rysunek 2). Dla każdego agenta obliczono indeks dyskryminacji (DI) na podstawie liczby sekund spędzonych na badaniu tego agenta w porównaniu do pustego kubka, obliczany jako (agent − pusty)/(agent + pusty) podczas 10-minutowej fazy ...

Dyskusja

Istnieją kluczowe kwestie dotyczące zastosowania paradygmatu czterech kubków w celu efektywnego i wiarygodnego pomiaru tych dynamik społecznych w innych warunkach laboratoryjnych. Habituacja w dniu 0 zmniejsza niespołeczną eksplorację areny i kubków napędzaną nowością, co w przeciwnym razie mogłoby maskować badanie społeczne podczas testów^7,8,9. Precyzyjna kontrola czasu trwania krótkotrwałego zapoznania jest również niezbędna, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie do oceny behawioralnej	Behavioral Observation Research Interactive Software	Wersja 9.12.7	Oprogramowanie do ręcznej adnotacji zdarzeń
Arena open-field	Rafferty Machine and Tool	Wykonana na zamówienie	Strukturalna płyta z włókna szklanego FRP, kwadratowa arena (49.5 cm x 49.5 cm x 49.5 cm); nieprzezroczyste ściany; jeśli arena jest przezroczysta, należy zakryć zewnętrzne ściany papierem, aby zminimalizować rozproszenie uwagi zwierzęcia
Kamera nadbudowana	Logitech	Logitech C920x HD Pro PC Webcam	Kamera umożliwiająca ciągły zapis wideo; zamontowana nad środkiem areny
Perforowane kubki	Chinco Store	ONG-Chinco-0279	wymiary kubków: 4.01"L x 4.01"W x 4.52"H; perforowane kubki plastikowe lub metalowe, mogą być kwadratowe lub cylindryczne
Prism	Graph Pad	Wersja 10.6.0	Oprogramowanie do analizy danych; można użyć innego oprogramowania