Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany proces wyświetlania na powierzchni drożdży dla kierowane ewolucji proteaz

DOI:

10.3791/72559

⸱

4 sierpnia 2026

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną procedurę kierowanej ewolucji proteaz wirusowych w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem systemu selekcji opartego na wyświetlaniu na powierzchni. Opisuje projektowanie biblioteki wstawianych fragmentów DNA oraz kaset substratowych, elektroporację zoptymalizowaną dla wysokiej efektywności transformacji, selekcję opartą na sortowaniu komórek z aktywacją fluorescencyjną dla rozszczepienia proteaz i sekwencjonowanie wzbogaconych wariantów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kierunkowa ewolucja naśladuje naturalny proces ewolucyjny w szybkim, kontrolowanym środowisku laboratoryjnym, aby opracować białka o pożądanych funkcjach lub cechach. Przesiewanie dużego zbioru mutantów kodujących białka pozwala na selekcję funkcjonalną pożądanych wariantów do zastosowań w biotechnologii, medycynie i biologii syntetycznej. Stosując ten protokół, przeprowadzamy kierunkowaną ewolucję w Saccharomyces cerevisiae, aby opracować warianty proteazy o wysokiej specyficzności dla obcego sekwencji substratu. Wyświetlamy te warianty proteazy na powierzchni komórki drożdży, aby ułatwić selekcję pożądanych wariantów za pomocą sortowania komórek z aktywacją fluorescencji (FACS) przez wiele rund wzbogacania. Cztery kluczowe elementy kasety substratowej są współwyrażane z biblioteką proteaz: białko fuzyjne składające się z (i) podjednostki receptora adhezji drożdży Aga2, (ii) sekwencji substratu do selekcji i (iii) przeciwnej selekcji, (iv) sekwencji tagów epitopowych oraz opcjonalnej sekwencji sygnałowej ponownego pobrania z siateczki endoplazmatycznej (ER). Komórki drożdży, w których tylko sekwencja substratu do selekcji jest rozcinana, są izolowany za pomocą wielobarwnego FACS za pomocą fluorescencyjnych (fitoerytryna/izotiocyjanian fluoresceiny–oznaczonych) przeciwciał przeciwko epitopom. Przedstawiamy szczegóły zoptymalizowanego, krok po kroku protokołu prowadzenia kampanii ewolucji proteazy, w tym projektowanie biblioteki wstawianych fragmentów DNA i projektowanie kasety substratowej, elektroporacja komórek drożdży z wysoką efektywnością transformacji (do 109 transformantów na mikrogram DNA), selekcja oparta na FACS, wzbogacanie i sekwencjonowanie zmutowanych wariantów. Demonstrujemy nasz protokół kierunkowanej ewolucji ewoluując proteazę nuklearnej inkluzji wirusa mozaiki tytoniu A (TEVp) z cięcia jej naturalnej sekwencji substratu, ENLYFQ↓S, do cięcia nowej sekwencji, ENLYFE↓S.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cysteinowe proteazy z rodziny Potyviridae, szczególnie proteazy inkluzji jądrowych A (NIa), stanowią w dużej mierze niewykorzystaną źródło sekwencjonowanych endopeptydaz. Z ponad 3800 scharakteryzowanych członków rodziny, proteazy NIa ciąć odrębną siedmioaminokwasową sekwencję substratu. Rodzina potywirusa oferuje zróżnicowane zestawy proteaz do inżynierii programowalnych systemów kontroli białek, budowy ortogonalnych obwodów genetycznych opartych na proteazach i opracowywania narzędzi biotechnologicznych o sekwencjonowanej specyficzności1,2. Mimo tej naturalnej różnorodności, tylko dwie proteazy NIa, TEVp i proteaza wirusa mozaiki żyłkowo-żyłkowej tytoniu (TVMVp), zostały dokładnie scharakteryzowane i opracowane do szerokiego zastosowania laboratoryjnego i biotechnologicznego3,4. Ten ograniczony zestaw proteaz ograniczony zakres projektowania dla wieloskładnikowych obwodów, które wymagają ortogonalnych aktywności proteaz5, motywując wysiłki na rzecz dalszej ekspansji i charakteryzacji proteaz NIa poprzez kierowaną ewolucję6,7.

Wyświetlanie na powierzchni drożdży stało się jedną z najpotężniejszych platform dla kierowanej ewolucji, umożliwiając przesiewowe badanie bibliotek białek o wysokiej wydajności za pomocą sortowania komórek aktywowanej fluorescencyjnie (FACS)6,7. Na przykład system sekwestracji w retikulum endoplazmatycznym drożdży (YESS) łączy aktywność proteazy z wyświetlaniem na powierzchni przez ścieżkę sekrecyjną S. cerevisiae6,7. System YESS został zastosowany do inżynierii nowych specyficzności proteazy-substratu i wykazał przydatność dla wieloraundowych kampanii kierowanej ewolucji. W tym systemie warianty proteaz są współekspresowane z białkiem fuzyjnym zawierającym kasetę substratu cięcia z markerami epitopu, a kotwica powierzchniowa Aga1p jest ekspresowana w szczepie drożdży EBY100. Różnicowe znakowanie fluorescującymi przeciwciałami odróżnia cięte od nieciętych kaset substratu wyświetlanych na powierzchni komórek. Ten mechanizm wyświetlania zależny od aktywności jest bezpośrednio zgodny z iteracyjną selekcją opartą na FACS dla bibliotek 107 lub więcej wariantów6,7.

Podstawowym warunkiem wstępnym kierowanej ewolucji jest zdolność do wprowadzania bibliotek wariantów w wystarczającej skali, aby osiągnąć adekwatne pokrycie docelowe przestrzeni sekwencji. Dla bibliotek mutagenezii sajt-saturacyjnej obejmujących wiele pozycji aminokwasowych, wydajności transformacji w wymiarze 108 do 109 unikalnych transformantów są potrzebne, aby upewnić się, że różnorodność wprowadzona do biblioteki jest dobrze reprezentowana w sortowanej populacji. Istnieje kilka metod wprowadzania egzogennego DNA do S. cerevisiae, każda z różnymi limitami przepustowości. Konwencjonalna metoda transformacji chemicznej używa acetylanu litu/pojedynczego łańcucha DNA nośnego/polietylenoglikolu (LiAc/ssDNA/PEG) ze względu na prostotę i dostępność. Jednak zazwyczaj osiąga wydajności transformacji tylko 104–106 jednostek tworzących kolonie (CFU) na mikrogram DNA, nie wystarczające dla wariacji sekwencji potrzebnej dla dużych kampanii bibliotek8. Natomiast metoda elektroporacyjna stosuje wysokonapięciowe pole elektryczne, aby przejściowo uporządkować błonę komórkową i ułatwić przyjęcie DNA. Elektroporacja osiąga spójnie najwyższe wydajności transformacji wśród dostępnych metod transformacji, przy czym zoptymalizowane protokoły raportują wydajności 108–109 CFU9. Zaobserwowano, że wydajność elektroporacji w S. cerevisiae jest krytycznie wrażliwa na fazę wzrostu komórki, masę DNA i skład buforu, zapewniając ramy, które od tego czasu zostały szeroko przystosowane do ewolucji kierowanej w skali bibliotek9.

Protokół opisany tutaj używa szczepu S. cerevisiae EBY100, szeroko przyjętego szczepu gospodarza dla wyświetlania na powierzchni drożdży. EBY100 został zaprojektowany przez Boder i Wittrup poprzez zintegrowanie kasety ekspresji AGA1 pod kontrolą galaktozo-indukowanego promotora GAL1 do chromosomowego locus AGA1 szczepu rodzicielskiej, niedeficiency protease BJ546510. Szczep jest komercyjnie dostępny od ATCC (numer katalogowy MYA-4941; depozyt K.D. Wittrup), nosząc genotyp MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). W rezultacie zarówno Aga1p, jak i fuzja kasety substratu Aga2p są ekspresowane z tego samego galaktozo-indukowanego promotora, upewniając, że dwie podjednostki są współindukuje i

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z użyciem rekombinantowego S. cerevisiae przeprowadzono zgodnie z zasadami i procedurami Komitetu Biobezpieczeństwa Instytucjonalnego i Komitetu Bezpieczeństwa Chemicznego na Uniwersytecie Teksańskim w Dallas. Z rekombinantowymi szczepami drożdży postępowano zgodnie z wymogami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1) zgodnie z ustalonymi instytucjonalnymi praktykami mikrobiologicznymi. Elektroporację, hodowlę i fluoresceinowo-aktywne sortowanie komórek (FACS) przeprowadzano zgodnie z zatwierdzonymi instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego. Kultury drożdży i zanieczyszczone materiały jednorazowego użytku dezaktywowano i usunięto jako odpady bioniebezpieczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie wektora i wstawienia

  1. Generowanie bibliotek proteaz potywirusowych poprzez mutagenezę nasycającą miejsce
    1. Projektowanie za pomocą oprogramowania do projektowania sekwencji, które nakładają się na oligonukleotydy do przodu i do tyłu o długości 30-50 merów, aby wygenerować mutantową bibliotekę proteaz. Zastąp kodon dziki w odpowiednim oligonukleotydzie degenerowanym kodonem NNS, gdzie N oznacza A, T, G lub C, a S oznacza G lub C, dla pozycji przeznaczonych do mutagenezy.
    2. Projektowanie nakładania 3′ między każdą parą oligonukleotydów do przodu i do tyłu o temperaturze topienia (Tm) 55-60 °C. Zaprojektuj pierwszy i ostatni oligonukleotyd tak, aby zawierały nakładanie 50 nt z wektorem wyświetlania na powierzchni drożdży poza miejscami restrykcyjnymi.
    3. Upewnij się, że przynajmniej jeden koniec wstawienia dokładnie nakłada się na jeden koniec zlinearyzowanego wektora, aby ułatwić rekombinację homologiczną13. Unikaj luk między sąsiednimi oligonukleotydami14.
    4. Resuspenduj oligonukleotydy do 100 µM z dejonizowaną wodą H2O. W sterylnym 1,5 mL probówce połącz 0,5 µL każdego oligonukleotydu do końcowej objętości 200 µL (końcowe stężenie 250 nM dla każdego oligonukleotydu).
    5. Skonfiguruj reakcję PCR z komponentami wymienionymi w Tabeli 1, aby skomponować bibliotekę proteaz, używając warunków termocyklowania w Tabeli 2.
    6. Skonfiguruj drugą reakcję PCR za pomocą zewnętrznych oligonukleotydów do przodu i do tyłu (Tabela 3), używając pierwszego złożonego produktu PCR jako szablonu. Zwiększ produkt jak pokazano w Tabeli 4.
    7. Uruchom drugi produkt PCR na żelu agarozy 1% z bromkiem etydyny (0,5 µg/mL) przy 240 V przez 30 min. Wyciąć pasmo odpowiadające oczekiwanej długości DNA.
      UWAGA: UWAGA: Bromek etydyny jest mutagenem i należy z nim obchodzić się za pomocą odpowiedniego wyposażenia ochronnego (PPE), w tym płaszcza laboratoryjnego, rękawic nitrylowo-kauczukowych i okularów ochronnych. Unikaj kontaktu ze skórą i wdychania. Usuwaj żele, bufory i materiały jednorazowe zawierające bromek etydyny jako odpady chemiczne zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi bezpieczeństwa.
    8. Oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu. Eluuj w 50 µL dejonizowanej wody H2O.
    9. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Przechowuj DNA w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Każda 50 µL reakcja 2nd PCR da około 0,5-1,0 µg całkowitego DNA. Ponieważ każda elektroporacja wymaga 12 µg biblioteki proteaz (czyli wstawienia), skaluj odpowiednio reakcje.
  2. Montaż kaset substratowych
    1. Przygotuj płytki z agarem LB i płynne pożywki LB-chloramfenikolowe. Zobacz receptury w Tabeli 5.
    2. Zaprojektuj zestaw nakładających się oligonukleotydów o długości 30 merów w kierunku do przodu i do tyłu dla montażu kaset substratowych. Zaprojektuj 5′ końce każdego oligonukleotydu do tyłu i oligonukleotydu do przodu następnego fragmentu tak, aby pasowały przez 4 nukleotydy.
    3. Resuspenduj liofilizowano oligonukleotydy do 100 µM za pomocą dejonizowanej wody H2O.
    4. Wymieszaj reagenty jak w Tabeli 6.
    5. Użyj programu cyklowania w Tabeli 7 do analizy i fosforylowania mieszanki oligonukleotydów.
    6. Rozcieńcz analizowane oligonukleotydy 4-krotnie w dejonizowanej wodzie H2O, aby uzyskać końcowe stężenie 1,25 µM.
    7. Połącz analizowaną mieszankę oligonukleotydów z wektorem (np. pDD1523), zgodnie z Tabelą 8.
    8. Przeprowadź montaż Golden Gate, zgodnie z programem cyklowania w Tabeli 9.
      UWAGA: Na przykład plazmid pDD1523 ma miejsce restrykcji typu IIS (BsmBI) poniżej promotora GAL1/10. Sukcesywny montaż umoż

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywne tworzenie biblioteki jest kluczowe dla zapewnienia wystarczającego pokrycia przestrzeni mutacyjnej. Aby uniknąć utraty rzadkich wariantów funkcjonalnych, liczba transformantów powinna osiągać od 10× do 100× teoretycznego rozmiaru biblioteki. Ponieważ wydajność transformacji w S. cerevisiae zależy od stężenia komórek i jest najwyższa w komórkach we wczesnej i środkowej fazie logarytmicznej16, zoptymalizowano początkową gęstość komórek przed elektroporacją. Kultury drożdży przesiewano przy początkowych wartościach OD600 w zakresie 1,0–4,0 i inkubowano przez 4 h (n = 2–4 niezależne eksperymenty biologiczne), po czym końcowe wartości OD600 naniesiono na krzywą wzrostu S. cerevisiae, aby potwierdzić, że komórki pozostały w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego (Rysunek 5A, Rysunek uzupełniający 1).

Elektroporacja tych kultur z użyciem 4 µg plazmidowego DNA (n = 2 niezależne eksperymenty biologiczne) wykazała, że wydajność transformacji różniła się znacząco w zależności od początkowych warunków OD600 (jednoczynnikowa ANOVA, p = 8,92 × 10−7). W porównaniu z kulturami rozpoczynanymi przy OD600 = 1,0, wszystkie wyższe początkowe gęstości komórek wykazały znacząco większą wydajność transformacji (test wielokrotnych porównań Dunnetta; OD600 = 1,5, skorygowane p = 0,0020; OD600 ≥ 2,0, skorygowane p < 0,0001), przy czym najwyższą wydajność transformacji zaobserwowano przy początkowej wartości OD600 wynoszącej 4,0. Aby wykorzystać naturalną zdolność komórek drożdży do rekombinacji homologicznej, przeprowadziliśmy również elektroporację komórek drożdży z użyciem 4 µg zlinearyzowanego wektora plazmidowego i 12 µg wkładu (tj. biblioteki proteaz) (n = 2 niezależne eksperymenty biologiczne). Wydajność transformacji różniła się znacząco pomiędzy testowanymi początkowymi warunkami OD600 (jednoczynnikowa ANOVA, p = 0,0023). W porównaniu z kulturami rozpoczynanymi przy OD600 = 1,0, wydajności transformacji były znacząco wyższe przy OD600 = 3,0 (skorygowane p = 0,0018), 3,5 (skorygowane p = 0,0062) oraz 4,0 (skorygowane p = 0,0024) (test wielokrotnych porównań Dunnetta). Najwyższą wydajność transformacji zaobserwowano przy umiarkowanej początkowej gęstości subkultury (OD600 = 3,0), co wskazuje na optymalną równowagę między kompetencją komórek a wydajnością rekombinacji w tych warunkach (Rycina 5B). W porównaniu z transformacją samym plazmidem, ko-elektroporacja zlinearyzowanego wektora i wkładu biblioteki proteaz (n = 2 niezależne powtórzenia biologiczne) dała znacząco wyższą wydajność transformacji we wszystkich testowanych początkowych warunkach OD600 (dwuczynnikowa ANOVA dla wydajności transformacji po transformacji log10, p = 9,40 × 10−12). Średnio ko-elektroporacja spowodowała średnio 121-krotny wzrost wydajności transformacji (95% CI, 63–233-krotny) w stosunku do transformacji samym plazmidem (Rycina 5B).

Podczas analizy FACS komórek drożdży zawierających bibliotekę zmutowanej proteazy oraz kasetę selekcji substratu (Ryc. 6A), komórki będą wykazywać albo skróconą kasetę lub proteazę, która nadal rozcina substrat kontroselekcyjny (Q1), wyrażać niefunkcjonalne warianty proteazy (Q2), albo wyrażać warianty proteazy, które skutecznie rozcinają wyłącznie substrat selekcyjny (Q3). Komórki drożdży wyrażające niefunkcjonalne warianty pojawiły się jako dominująca populacja rozciągająca się wzdłuż przekątnej na wykresach PE względem FITC, co odzwierciedla współwystępowanie obu sygnałów (Ryc. 6A, Q2). W przeciwieństwie do nich, funkcjonalne warianty, które rozcięły substrat selekcyjny, oszczędzając natywny substrat (kontroselekcyjny), utworzyły odrębną populację poza przekątną, charakteryzującą się wysoką intensywnością sygnału PE oraz średnią do niskiej intensywności sygnału FITC (Ryc. 6A, Q3). Zastosowanie rygorystycznej strategii bramkowania w celu wyizolowania tej populacji poza przekątną doprowadziło do progresywnego wzbogacania wariantów funkcjonalnych w kolejnych rundach sortowania10. Wzbogacenie to jest widoczne jako coraz wyraźniejsza grupa komórek oddzielona od grupy na przekątnej (Ryc. 6B, od lewej do prawej). Brak wyraźnej populacji poza przekątną może wskazywać na niską jakość biblioteki, niewystarczającą ekspresję lub nieoptymalne warunki barwienia. Jako kontrola negatywna, Ryc. 6C,D przedstawia elektroporowane, indukowane, niebarwione komórki drożdży oraz odpowiadające im histogramy fluorescencji FITC i PE.

W obrębie wzbogaconej populacji poza przekątną można dalej wyodrębnić subpopulacje na podstawie intensywności FITC. Komórki wykazujące średni sygnał FITC mogą być sortowane oddzielnie od tych o niskim sygnale FITC. Sekwencjonowanie tych odrębnych populacji ujawniło unikalne profile mutacji (Tabela 11), co wskazuje, że zróżnicowana wydajność cięcia wiąże się z różnymi wariantami proteazy.

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie wektora i wkładki. (A) Generowanie bibliotek proteazy potyviralnej poprzez mutagenezę nasycenia miejsc. (B) Montaż kasety substratu i integracja z wektorem do ekspozycji drożdżowej (pDD1523). (C) Linearyzacja wektora do ekspozycji drożdżowej (pDD1524) poprzez trawienie restrykcyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Elektroporacja kasety substratu oraz biblioteki zmutowanej proteazy amplifikowanej metodą PCR do kompetentnych komórek EBY100. (Przerywana ramka) Cyrkularyzacja in vivo plazmidu zawierającego zarówno proteazę, jak i kasetę substratu. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Indukcja, barwienie i sortowanie cytometryczne komórek drożdży. (A) Indukcja biblioteki proteaz i kasety substratu. (B) Barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi: Barwienie przeciwciałami anty-HA znakowanymi izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) oraz anty-FLAG znakowanymi fikoerytryną (PE). (C) Barwione komórki są sortowane przy użyciu fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). (D) Odzyskiwanie komórek posortowanych metodą FACS w pośrodkach selekcyjnych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rysunek 4: Odzyskiwanie plazmidów i sekwencjonowanie posortowanych komórek drożdży. (A) Wysiew posortowanych komórek drożdży. (B) Ekstrakcja plazmidów z poszczególnych kolonii drożdży. (C) Transformacja E. coli wyekstrahowanymi plazmidami. (D) Ekstrakcja plazmidów z poszczególnych kolonii E. coli. (E) Sekwencjonowanie Nanopore wyekstrahowanych plazmidów. Ikony kolb i probówek zaadaptowane odpowiednio z DBCLS i Helicase 11 za pośrednictwem Bioicons (https://bioicons.com) i dostosowane zgodnie z warunkami licencji Creative Commons Attribution 4.0 International License (CC BY 4.0). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Krzywe wzrostu drożdży w różnych mediach wzrostowych i wpływ początkowej gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) subkultury na wydajność elektroporacji drożdży. (A) Krzywe wzrostu drożdży w 1 × Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD), 2 × YPD, syntetycznym agarze z dekstrozą i kwasami kazeinowymi bez antybiotyków (SDCAA-) oraz syntetycznym agarze z dekstrozą i kwasami kazeinowymi z antybiotykami (SDCAA+). (B) Wydajność transformacji drożdży elektroporowanych 4 µg wektora plazmidowego przy różnych początkowych wartościach OD600 subkultury oraz wydajność transformacji z użyciem zlinearyzowanego wektora (4 µg) i wstawki z biblioteki proteaz (12 µg) przy tych samych wartościach początkowych OD600. Dane w (A) przedstawiono jako OD600 ± SD z dwóch niezależnych eksperymentów biologicznych (n = 2). Dane w (B) przedstawiono jako średnią liczbę transformantów na jedną elektroporację na logarytmicznej osi y, gdzie poszczególne powtórzenia biologiczne zaznaczono kółkami (n = 2). Istotność statystyczną dla eksperymentów optymalizacji elektroporacji plazmidu oraz wektora z wstawką określono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) dla wartości wydajności elektroporacji przekształconych logarytmicznie (log10), a następnie za pomocą testu wielokrotnych porównań Dunnetta, przyjmując OD600 = 1,0 jako grupę kontrolną. ns, brak istotności; p < 0,01 (**); p < 0,0001 (****). Istotność statystyczną różnicy między wydajnością transformacji samego plazmidu a wektora z wstawką określono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) dla wartości wydajności transformacji przekształconych logarytmicznie (log10). p < 0,0001 (****). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wzbogacanie klonów drożdży metodą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS). (A) Schematyczna reprezentacja strategii bramkowania. Komórki podzielono na trzy regiony: Q1, komórki z niską fluorescencją fikocyjaniny (PE); Q2, komórki z wysoką fluorescencją PE i wysoką fluorescencją izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC); oraz Q3, komórki z wysoką fluorescencją PE i niską do umiarkowanej fluorescencją FITC. Komórki z regionu Q3 zostały zebrane w celu wzbogacenia. (B) Reprezentatywne wykresy FACS z jednej niezależnej kampanii ewolucyjnej, pokazujące sekwencyjne rundy sortowania z coraz większą rygorystycznością bramkowania FITC. Komórki z umiarkowaną i niską fluorescencją FITC zbierano oddzielnie do sekwencjonowania. Procenty wskazują frakcję żywych, pojedynczych komórek drożdży w obrębie bramkowanej populacji. (C) Reprezentatywny wykres FACS pokazujący elektroporowane, niebarwione komórki drożdży jako kontrolę negatywną. (D) Histogramy intensywności fluorescencji FITC-A (lewo) i PE-A (prawo) odpowiadające danym przedstawionym na (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Mieszanina reakcyjna dla pierwszej rundy amplifikacji PCR biblioteki proteaz. Skład reakcji PCR wykorzystywanej do pierwszej rundy amplifikacji biblioteki proteaz, zawierający końcowe stężenia i ilości każdego odczynnika w reakcji o objętości 50 µL. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Warunki cykliczne dla pierwszej rundy amplifikacji PCR biblioteki proteaz.Program cykli termicznych został zastosowany podczas pierwszej rundy amplifikacji PCR biblioteki proteaz. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Mieszanina reakcyjna dla drugiej rundy amplifikacji PCR biblioteki proteaz. Skład reakcji PCR wykorzystywanej do drugiej rundy amplifikacji biblioteki proteaz, zawierający stężenia końcowe i ilości każdego odczynnika w reakcji o objętości 50 µL. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Warunki cykliczności dla drugiej rundy amplifikacji PCR biblioteki proteaz. Program cykli termicznych zastosowano do drugiej rundy amplifikacji PCR biblioteki proteaz. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Pożywki i odczynniki do elektroporacji i hodowli drożdży. Opis tabelaryczny masy wymaganej z każdego składnika chemicznego do przygotowania określonych ilości 1 × i 2 × ekstraktu drożdżowego, peptonu i dekstrozy (YPD), buforu do elektroporacji, buforu kondycjonującego, pożywki do odzysku, syntetycznej dekstrozy z kwasami kazeinowymi i antybiotykami (SDCAA+), syntetycznej galaktozy z kwasami kazeinowymi i antybiotykami (SGCAA+), pożywki Lysogeny Broth (LB), pożywki LB z chloramfenikolem, pożywki Super Optimal Broth (SOB) oraz pożywki Super Optimal Broth z represją kataboliczną (SOC). Dołączono instrukcje przygotowania roztworów zapasowych, takich jak 2 M sorbitol, 1 M ditiotreitol (DTT) i 2 M octan litu (LiAc). Podano dodatkowe instrukcje przygotowania płytek agarowych SDCAA, LB i YPD. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Mieszanina reakcyjna do hybrydyzacji i fosforylacji oligonukleotydów. Skład mieszaniny reakcyjnej stosowanej do jednoczesnej hybrydyzacji i fosforylacji oligonukleotydów w celu montażu kasety substratu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 7: Warunki cykliczne dla hybrydyzacji i fosforylacji oligonukleotydów. Program temperaturowy stosowany do hybrydyzacji i fosforylacji oligonukleotydów w celu montażu kasety substratowej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 8: Mieszanina reakcyjna dla metody Golden Gate assembly w celu połączenia kasety substratu i plazmidu wektora. Skład reakcji Golden Gate assembly wykorzystywanej do ligacji kasety substratu do plazmidu wektora. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 9: Warunki cykliczne dla montażu Golden Gate kasety substratu i plazmidu wektora. Program cykli termicznych zastosowany do montażu Golden Gate. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 10: Mieszanina reakcyjna do linearyzacji plazmidu wektora. Skład reakcji trawienia restrykcyjnego stosowanego do linearyzacji plazmidu wektora przed konstrukcją biblioteki. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 11: Wyniki sekwencjonowania nanoporowego wariantów TEVp rozszczepiających ENLYFES. Plazmidy wyekstrahowano z komórek drożdży po czwartej i ostatniej sesji FACS. Mutacje w każdym klonie przedstawiono w odniesieniu do sekwencji typu dzikiego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający 1: Zależność między początkową a końcową gęstością hodowli EBY100 podczas pasażowania. Hodowle EBY100 pasażowano przy różnych początkowych wartościach OD600, a końcową wartość OD600 mierzono po inkubacji w identycznych warunkach wzrostu (30 °C, 220 rpm). Końcowa gęstość hodowli wzrastała liniowo wraz ze wzrostem początkowej wartości OD600 (R2 = 0.969, p = 5.77 × 10−5). Punkty danych reprezentują średnie ± SD z (n = 2–4) niezależnych powtórzeń biologicznych.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Racjonalne projektowanie biblioteki mutagenezy TEVp. Schematyczna reprezentacja TEVp (PDB ID: 1LVB) z czterema resztami (złote), znajdującymi się w odległości <5Å od reszty P1 (fioletowej), wybranymi do nasyconej mutagenezy miejsce.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ewolucja ukierunkowana to metoda wysoko-przepustowa, która wykorzystuje iteracyjne cykle dywersyfikacji i selekcji, aby zidentyfikować białka o zwiększonej lub nowej funkcji biochemicznej17. W tym protokole szczegółowo opisujemy zoptymalizowany przepływ pracy do ewolucji rozpoznawania proteazy-substrat za pomocą systemu prezentacji na powierzchni komórki w S. cerevisiae. System prezentacji na powierzchni komórki przypisuje aktywność proteazy do wykrywalnego fenotypu opartego na fluorescencji, umożliwiając wzbogacanie klonów FACS na podstawie pożądanych klonów. Przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące biblioteki proteaz i montażu kasetek substratów, wysokowydajnej elektroporacyjnej transformacji, bramek i sortowania FACS oraz ostatecznego sekwencjonowania wariantów proteaz.

Jednym z najważniejszych kroków w ukierunkowanej ewolucji jest zapewnienie wystarczającej różnorodności biblioteki i pokrycia potencjalnych mutacji17. Nasze eksperymenty dotyczące efektywności elektroporacyjnej wykazują, że początkowy hodowany OD600 3,0 daje najwyższą efektywność transformacji, przekraczającą 109 CFU. Ta skala, osiągnięta dzięki zoptymalizowanej elektroporacji drożdży, znacznie przekracza skalę konwencjonalnych metod transformacji chemicznej i umożliwia adekwatne pokrycie dużych bibliotek kombinacyjnych8,9. Dokładne bramy i sortowanie FACS są niezbędne do oddzielania komórek, które wykazują pożądane właściwości kleiściowe od tych, które wykazują niespecyficzną kleiść. Podczas wielu rund selekcji opartych na FACS, strategia bramek staje się coraz surowsza, aby selektywnie wzbogacić pożądane warianty proteaz. Jeśli bramy są zbyt szerokie, niepożądane komórki mogą być sortowane razem z pożądanymi wariantami. Surową bramę (np. coraz niższe progi dla sygnału FITC w kolejnych rundach) pozwala na wzbogacenie populacji komórek o warianty proteaz o wyższej specyficzności i aktywności w stosunku do nowej sekwencji substratu docelowego10. Zgodnie z poprzednimi kampaniami7,18, przeprowadziliśmy mutageneza kodonu NNS czterech reszt w kieszeni wiązania substratu TEVp, które wchodzą w interakcję z resztą substratu P1, Q (T146, D148, H167, S170) (Dodatkowa Figura 2). Wykresy FACS przedstawione na Rysunku 6B przedstawiają pojedynczy reprezentatywny eksperyment sortowania ilustrujący strategię bramek i przepływ wzbogacania. Co ciekawe, nasze wyniki kampanii wyprodukowały warianty TEVp o innym zestawie mutacji aminokwasowych (Tabela 11). Wyniki te potwierdzają kluczową cechę ewolucji proteaz: wiele ścieżek ewolucyjnych może prowadzić do tego samego celu.

Modyfikacje i strategie rozwiązywania problemów mogą być potrzebne podczas przeprowadzania eksperymentów. Na przykład, podczas elektroporacyjnej transformacji, praca na lodzie, gdy jest to wskazane i ostrożne ponowne zawieszenie peletek komórkowych na każdym etapie, zapewnia, że komórki są żywe i zdrowe przed elektroporacją. Komórki drożdży są delikatne podczas kroków elektroporacyjnych aż do etapu odzyskiwania po wzroście. Ponadto, modyfikacja płynu powłokowego FACS może być wymagana, aby zapobiec skupianiu się komórek drożdży. Płyn powłokowy jest powszechnie stosowany w maszynach FACS i może zawierać środki konserwujące, które hamuje wzrost bakterii i grzybów. Dlatego płyn powłokowy można zastąpić czystym PBS, aby zapobiec śmierci komórek podczas sortowania.

System prezentacji na powierzchni drożdży wymaga odpowiednio sfałdowanych białek, aby pomyślnie przejść przez ścieżkę sekrecyjną. Niektóre warianty proteaz mogą stracić aktywność z powodu błędnego składania, co prowadzi do fałszywych pozytywów podczas selekcji FACS spowodowanych niespecyficzną kleiścią lub tłem fluorescencji. Warto zwrócić uwagę na dobrze scharakteryzowane źródła fałszywych pozytywów dla kampanii opartych na plazmidzie, jak ta. Ponieważ kleiść jest odczytywana jako utrata C-końcowego tagu epitope, każda mutacja, która zakłóca ten tag, daje ten sam fenotyp niskiego FITC, jak prawdziwa kleiść; takie mutacje tagów powstają podczas dużej skali rekombinacji homologicznej i mogą wzbogacać się w kolejnych rundach sortowania. Zintegrowanie chromosomowe kasetki substratu stałej zostało niedawno wykazane jako zmniejszające ten problem19. Protokół opiera się na użyciu biblioteki wstawionej, zachowując stałą wektor (zawierającą kasetkę substratu). Dlatego ten protokół nie jest odpowiedni dla osób, które chcą ewoluować zarówno biblioteki proteaz, jak i substratów.

Platforma YESS opracowała ogólną ścieżkę do reprogramowania specyficzności proteazy-substrat18. Ostatnie ulepszenia obejmują: dodanie tytracjalnej kontroli enzymu/substratu w YESS2.07, sprzężenie do sekwencjonowania nowej generacji, umożliwiając wysokorozdzielcze profilowanie specyficzności20 oraz zintegrowanie reporterów chromosomowych, aby zmniejszyć szum eks

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów. Dane surowce wspierające ten protokół, w tym pliki FASTQ sekwencjonowania Nanopore, pliki cytometrii przepływowej (FCS) oraz dane źródłowe wykorzystane do generowania rysunków i tabel oraz plazmidy pDD1523 i pDD1524, zostały zdeponowane w Zenodo i są publicznie dostępne pod adresem 10.5281/zenodo.20746804

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Dingal za ich rady, wiedzę specjalistyczną i dyskusje. Dziękujemy również UTD Flow Cytometry Core za infrastrukturę i wsparcie. M.B.L. jest wspierany przez UTD Eugene McDermott Graduate Fellowship. Badania te były wspierane przez UTD Startup Fund oraz granty National Institutes of Health-NIGMS dla laboratorium P.C.D.P.D. (R35GM150967).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czynniki aktywne
10 mM dNTP MixNEBN0447SReakcje PCR (Tabele 1, 3)
10X PBS, pH 7.4FisherBP3994Bufor podstawowy do barwienia (Kroki 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction BufferNEBB9027SSprzedane osobno; również dołączone do polimerazy Q5
Agar, BactoBD Difco281230-500gPłytki agar SDCAA (Tabela 5); 15 g/L
Agaroza (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagentsBP160-500Elektroforeza żelowa
Anti-FLAG PE AntibodyBioLegend637309Barwienie FACS; anty-FLAG połączone z PE
Anti-HA Tag Antibody [FITC]GenScriptA01621Barwienie FACS; anty-HA połączone z FITC
Bacto Casamino AcidsBD Difco223120Media SDCAA+, SGCAA+, SCAA (Tabela 5); 5 g/L
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0Przygotowanie mediów LB/SOB; 20 g/L w YPD (Tabela 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction VSigma-Aldrich126575-10GM0.5% w PBS; bufor do barwienia (Kroki 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SZłote łączenie kasety substratowej (Tabela 8)
Roztwór chlorku wapnia (1M)Sigma-Aldrich21115-100mLBufor elektroporacyjny: 1 mM końcowe (Tabela 5)
Kolce do rolowania ColiRollers®Sigma-Aldrich71013-3Sterilizuj, wkładając do butelek z reagentami i autoklawuj w 121ºC, 15 psi, przez 15 min.
D-GalaktozaThermo FisherA12813.30250 g; 20% w/v stężenie dla indukcji SGCAA+ (Tabela 5)
D-SorbitolThermo Fisher1327300.10Bufor elektroporacyjny (1 M) i media do wzrostu (Tabela 5)
Dekstroza (D-Glukoza), bezwonnaSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, 20% w/v dekstryna (Tabela 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsSigmaY0626-250G6.7 g/L w SDCAA/SGCAA (Tabela 5)
Difco YPD Broth (wstępnie zmieszane)BD242820-500gGotowe alternatywa YPD; 500 g
DL-Ditiotreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GBufor kondycjonujący: 10 mM końcowe; pobierz 250 μL, przechowuj -20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification KitOmega Bio-tekD6492-02Oczyszczanie produktu PCR
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmega Bio-tekD2500-01Oczyszczanie żelu po PCR i reakcji restrykcyjnych (Kroki 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Oczyszczanie plazmidu (Krok 4.2)
Glicerol (≥99%)FisherBP229-450% v/v stężenie dla szczepów glicerolowych (Krok 4.1.1)
Siarczan kanamacyny FisherBP906-5SDCAA+ i SGCAA+: 50 μg/mL końcowe; zastępuje Sigma K0879-5G
KLD Enzyme MixNEBM0554SKinaza-Ligaza-DpnI; kierunkowa mutageneza
KLD Reaction BufferNEBB0554AUżywany z KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGKultura ciekawa E. coli
Octan litu dihydrat (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Bufor kondycjonujący: 0.1 M końcowe; dodaj przed DTT (Tabela 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)RPIL24020-2000.0Hodowla E. coli; zastępuje Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino AcidsSigma2240-500GMAlternatywne źródło kwasów kasamino
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Roztwór Penicyliny-Streptomycyny, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X końcowe
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SLinearyzacja wektora (Tabela 10); używaj wersji HF
Q5 HF DNA PolymeraseNEBM0492SWysoko-wiernościowa polimeraza; alternatywa dla Q5 Hot Start
Q5 High GC EnhancerNEBB9028ADla reakcji PCR z wysokim zawartością GC
Q5 Hot Start DNA PolymeraseNEBM0491LSkładanie i amplifikowanie PCR (Tabele 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)NEBB6004SDostarczany z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471–487.
  2. Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.
  3. Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312–318.
  4. Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108–115.
  5. Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284–2301.
  6. Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167–174.
  7. Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63–71.
  8. Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31–34.
  9. Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155–159.
  10. Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553–557.
  11. Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22–28.
  12. Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651–5656.
  13. Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201–216.
  14. Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893–901.
  15. Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.
  16. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163–168.
  17. Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995–10000.
  18. Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229–7234.
  19. Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.
  20. Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510–518.
  21. Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.
  22. Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474–1483.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bioin ynieriaNumer 234Numer 234Warto pustaNumerproteazamutogenezaPotyviridaeSaccharomyces cerevisiaeelektroporacjacytometria przep ywowa
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły