Platforma z drukowanego w 3D tuszu poświęcalnego do obrazowania o wysokiej rozdzielczości funkcji komórek śródbłonka w krętych naczyniach i tętniakach

Podsumowanie

Protokół szczegółowo opisuje sposób projektowania i montażu naczyń krwionośnych in vitro z segmentami krętymi lub tętniakami, z wykorzystaniem drukarki ekstruzyjnej lub ręcznej aplikacji pasteryzowanego tuszu ofiarnego, a także sposób oceny przepływu hemodynamicznego i odpowiedzi komórek śródbłonka.

Streszczenie

Krętość naczyń i tętniaki stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia w różnych tkankach ludzkich i typach naczyń krwionośnych. Te zmiany w kształcie naczyń powodują anomalie w dynamice przepływu krwi, co znacząco wpływa na funkcję śródbłonka. Modele zwierzęce tych stanów chorobowych naczyń były w niektórych przypadkach pomocne, ale ich opracowanie jest kosztowne, a wyniki są ograniczone fizjologią danego gatunku zwierzęcia. W odpowiedzi na to, modele 3D organ-on-a-chip (OOC) in vitro stały się potężnym zestawem narzędzi do oceny funkcji naczyniowej i odpowiedzi śródbłonka w komórkach ludzkich. Choć każdy z modeli OOC ma swoje zalety, istnieje potrzeba stworzenia dostępnego systemu do badania przepuszczalności naczyń, która jest kluczowym wskaźnikiem funkcji naczyniowej w naczyniach zakrzywionych i tętniakach przy fizjologicznym szybkości ścinania i ciśnieniu. Przedstawiona tutaj metodologia umożliwia badanie odpowiedzi ludzkich komórek śródbłonka na anomalie przepływu w ekonomicznym systemie modelu naczynia zakrzywionego, z wykorzystaniem podstawowej biodrukarki, która wytwarza naczynia kompatybilne z fizjologicznymi szybkościami przepływu płynów, badaniami przepuszczalności, światłowymi mikroskopami o wysokiej rozdzielczości oraz wsparciem macierzy zewnątrzkomórkowej o fizjologicznej sztywności.

Wprowadzenie

Morfologia naczyń krwionośnych jest ważnym wskaźnikiem funkcji naczyniowej, ponieważ krętość naczyń i tętniaki są kluczowymi cechami charakterystycznymi wielu chorób i zagrożeń zdrowotnych. Krętość naczyniowa może być wrodzona, jak w zespołach Marfana¹, Turnera² i Loeys-Dietza³, lub rozwijać się później w życiu jako cecha charakterystyczna kilku schorzeń, w tym nadciśnienia tętniczego, cukrzycy, nowotworów i prawdopodobnie miażdżycy^4,5,6. Tętniaki tkanek tętniczych, w tym tętnic szyjnych⁷, wieńcowych⁸, udowych⁹, aorty¹⁰ oraz mózgowych¹¹, wiążą się z zachorowalnością i ryzykiem zdrowotnym ze względu na możliwość samoistnej rozwarstwienia lub pęknięcia. Poza wywoływaniem nieprawidłowości przepływu i związanego z tym stanu zapalnego śródbłonka, krętość naczyniowa i tętniaki mogą wskazywać na utajoną dysfunkcję tkanek i stan zapalny. Na przykład u noworodków i dzieci zespół krętości tętnic jest klinicznie prognostyczny dla udaru dziecięcego¹², utrwalonego nadciśnienia płucnego oraz rozwarstwienia aorty^4,13. U dorosłych zapalenie naczyń siatkówki objawia się krętością naczyń siatkówki, która staje się mniej wyraźna w miarę ustępowania stanu zapalnego¹⁴. Kwestia tego, w jaki sposób krętość jest wykrywana i przekształcana w aberrantne sygnały napędzające progresję choroby, pozostaje aktywnym obszarem badań. Przypuszcza się, że komórki śródbłonka wyścielające naczynia krwionośne pełnią rolę głównych sensorów w tym procesie. Zaburzony lub spowolniony przepływ wywołany krętością naczyniową lub tętniakami zmienia naprężenie ścinające, wywołując w śródbłonku zmiany w sygnalizacji zapalnej¹⁵ oraz funkcji barierowej¹⁶. Komórki śródbłonka są bardzo wrażliwe na przepływ cieczy dzięki mechanizmom obejmującym rzęski pierwotne¹⁷, mechanosensytywne białka adhezyjne^18,19 oraz kanały jonowe^20,21, które napędzają sygnalizację mogącą aktywować przeciekanie, stan zapalny i przeprogramowanie śródbłonka^22,23,24. Metody badania odpowiedzi śródbłonka na krętą geometrię naczyniową są zatem istotne dla rozwoju terapii naczyniowych.

Funkcje śródbłonka w stanach chorób naczyniowych modelowano z wykorzystaniem modeli zwierzęcych in vivo, systemów organ-on-a-chip (OOC) oraz metod biodruku. Modele mysie umożliwiają kontrolę ekspresji znanych genów chorobowych i uwzględniają złożoność architektury oraz fizjologii tkanek, w tym udział komórek muralnych i odpornościowych. Modele mysie miażdżycy²⁵, zespołu Marfana²⁶ oraz różnych tętniaków^27,28,29 dostarczają wiedzy na temat patologii związanych z dysfunkcją naczyniową. Pomimo tych zalet, bezpośrednia obserwacja, manipulacja eksperymentalna i kwantyfikacja komórek śródbłonka są trudne do przeprowadzenia, z wyjątkiem metod zbiorczych, takich jak sekwencjonowanie RNA. Ponadto modele zwierzęce wiążą się z kwestiami etycznymi i kosztowymi oraz są ograniczone przez specyficzną dla gatunku fizjologię.

Kilka in vitro Opracowano podejścia typu OOC (organ-on-a-chip), aby badać reakcje ludzkiego śródbłonka na przepływ laminarny i zaburzony^30,31,32w obu układach 2D^33,34 oraz 3D^35,36,37systemy. Rozlegna literatura dotycząca OOC³⁸ w dużej mierze wynikała z postępów w inżynierii biomedycznej, a cechy konstrukcyjne projektowano w celu odpowiedzi na konkretne pytania biomedyczne. W wielu naczyniowych modelach OOC stosuje się podpory z polidimetylosiloksanu (PDMS) w celu kontrolowania architektury naczyń³⁸Modele te zapewniają wysoką rozdzielczość kontroli złożonych geometrii i umożliwiają modelowanie interakcji organowo-naczyniowych, w tym tych obejmujących wątrobę.³⁹, mózg⁴⁰, oraz płuc⁴¹Nadal jednak istnieją pewne ograniczenia. Niska przepuszczalność PDMS i podobnych polimerów dla makromolekuł może ograniczać badania nad funkcją bariery naczyniowej. Ponadto większość utwardzonego PDMS charakteryzuje się sztywnością wynoszącą około 0,8–10 MPa.⁴², choć alternatywne formulacje mogą pozwolić na osiągnięcie bardziej fizjologicznych zakresów wynoszących 8–200 kPa⁴³Szacunki sztywności błony podstawnej naczyń mieszczą się w zakresie od ok. 350 Pa⁴⁴ do ~70 kPa⁴⁵, w zależności od typu naczynia i metodologii pomiarowej, przy czym większość zdrowych błon podstawnych naczyń mieści się w zakresie 2–3 kPa⁴⁶Ponieważ choroby naczyniowe, takie jak miażdżyca i nadciśnienie tętnicze, są częściowo związane ze zwiększoną sztywnością macierzy pozakomórkowej (ECM)^{47,48,49,50,51}, a komórki śródbłonka reagują na sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), dlatego kontrolowanie sztywności w zakresach fizjologicznych jest istotne w in vitro modele. Nowsze podejścia OOC wykorzystują podłoża fizjologiczne, które umożliwiają tworzenie złożonych geometrii^52,53, włączyć wiele typów komórek w celu odtworzenia funkcji narządu^{39,54,55,56,57}lub oddziaływania odporniowo-naczyniowe⁵⁸, modelowanie struktur naczyniowych specyficznych dla pacjenta^59,60or wspierać przedkliniczny rozwój leków^61,62W wielu modelach mikronaczyniowych obejmujących interakcje z innymi typami komórek, komórki śródbłonka samoistnie tworzą naczynia o stosunkowo niekontrolowanej geometrii⁶³Z drugiej strony, systemy OOC umożliwiające uzyskanie zdefiniowanej geometrii naczyń w warunkach kontrolowanego przepływu często wymagają rozbudowanej infrastruktury inżynieryjnej, specjalistycznych materiałów oraz wiedzy eksperckiej.^53,64W związku z tym niezbędne są niezawodne metody dostępne dla osób niebędących ekspertami, które ułatwią badanie zachowania komórek naczyniowych w warunkach istotnych fizjologicznie.

Platformy biodruku kompatybilne z fizjologicznymi hydrożelami ECM zapewniają wszechstronne modele in vitro do badania funkcji śródbłonka w różnych geometriach naczyniowych⁶⁵. Podejścia te wykorzystują albo ukierunkowane osadzanie żeli zawierających komórki śródbłonka w kształcie naczynia krwionośnego⁶⁶, albo tusz poświęcalny w celu wytworzenia otwartych światła rurkowatych osadzonych w ECM, które mogą zostać następnie rozpuszczone, pozostawiając światło, które można zasiedlić komórkami śródbłonka⁵⁴. Biokompatybilne podłoża ECM, w tym żelatyna, kolagen i fibryna, mogą być dostrajane do sztywności zbliżonej do sztywności błony podstawnej naczyń (1–3 kPa⁶⁷) i umożliwiają przeprowadzanie testów przepuszczalności naczyniowej podobnych do tych stosowanych in vivo. Chociaż podejścia te nie osiągają takiej rozdzielczości kształtu i rozmiaru jak wykonawstwo z PDMS, możliwe jest wytworzenie naczyń zakrzywionych, rozgałęzionych i zwężonych^52,66,68. Takie platformy są zatem dobrze dostosowane do modelowania geometrii naczyniowych, w tym naczyń krętych i tętniakowych.

Metoda przedstawiona w niniejszej pracy wykorzystuje podejście do druku 3D oparte na ekstruzji pneumatycznej, trójwymiarowym pozycjonowaniu w skali mikronowej, kontroli temperatury platformy roboczej i głowicy drukującej zawierającej tusz oraz tusz ofiarny, opracowany wcześniej do badania oddziaływań naczyniowo-nerkowych w układach chip^67,69. Tusz ofiarny jest drukowany w pożądanej geometrii naczyniowej, a następnie natychmiast zatapiany w ECM. Następująca zmiana temperatury usuwa tusz, pozostawiając w ECM otwarte światło naczynia, które jest zasiedlane ludzkimi komórkami śródbłonka. Podstawowa ECM składa się z żelatyny i fibryny, co umożliwia szybką żelację i polimeryzację fibryny indukowaną trombiną, zapewniając jednocześnie sztywność mechaniczną odpowiednią dla wielu błon podstawnych naczyń. W celu lepszego odwzorowania składu błony podstawnej naczyń^70,71,72 i promowania adhezji śródbłonka można dodać dodatkowe komponenty ECM, takie jak laminina lub fibronektyna. System jest montowany w wielorazowych komorach Rose⁷³, zawierających metalowe podpory, uszczelki z gumy silikonowej i wysokorozdzielcze szkiełka podstawowe do mikroskopu, co pozwala na połączenie z pompą do cieczy za pomocą igieł z Luer-lock. Alternatywnie, płyty górna i dolna mogą zostać wykonane w druku 3D z kwasu polimlekowego lub materiału wzmocnionego włóknem węglowym. Zmontowany system wytrzymuje ciśnienia generowane przez fizjologiczne przepływy cieczy. Procedura pasteryzacji poprawia również sterylność tuszu ofiarnego bez zmiany jego właściwości fizycznych. Ponadto podejście z wykorzystaniem szablonu igłowego i biotuszów umożliwia wytworzenie prostych naczyń z tętniakiem bez użycia biodrukarki. Powstałe endotelializowane naczynia kręte lub tętniaka można badać w warunkach fizjologicznego przepływu przy użyciu wysokorozdzielczej mikroskopii świetlnej przez około tydzień, co pozwala na badanie ostrych odpowiedzi śródbłonka na zmienioną geometrię naczyniową.

Główną zaletą tego systemu jest jego kompatybilność z mikroskopią świetlną. Naczynia in vitro wytworzone zgodnie z tym protokołem nadają się do kilku metod obrazowania i są szczególnie odpowiednie do mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej z dyskiem obrotowym lub skanowaniem laserowym. Przy wyborze warunków obrazowania należy wziąć pod uwagę rozdzielczość przestrzenną i czasową, czułość oraz odległość roboczą obiektywu. W przypadku większości naczyń wytworzonych za pomocą tego systemu, obiektyw musi mieć wystarczającą odległość roboczą, aby dotrzeć do głębokości około 100–300 µm od szkiełka podstawowego i obrazować przez środek naczynia. Obiektywy o wysokiej aperturze numerycznej są niezbędne do obrazowania struktur śródbłonka o wysokiej rozdzielczości, w tym organelli i adhezji komórkowych, a także do obrazowania na żywo wymagającego wysokiej rozdzielczości czasowej, np. śledzenia koralików fiducjalnych w przepływie. Niektóre analizy wymagające mniej wydajnego wychwytywania fotonów, takie jak pomiary bariery śródbłonka oparte na fluorescencji, mogą być wykonywane przy użyciu obiektywów o niższej aperturze numerycznej, np. obiektywów powietrznych 10–20×.

Protokół opisuje generowanie krętych i tętniakowych naczyń zbudowanych z ludzkich komórek śródbłonka w systemie in vitro, który umożliwia fizjologiczny przepływ płynów i mikroskopię o wysokiej rozdzielczości. Procedura obejmuje projektowanie naczyń, wykonanie komory, przygotowanie tuszu poświęcalnego i druk 3D, przygotowanie ECM i usuwanie tuszu, zasiewanie komórek śródbłonka i ich hodowlę w warunkach przepływu, ocenę przecieku naczyniowego, mapowanie przepływu oraz barwienie immunofluorescencyjne (Rysunek 1).

Protokół

1. Zaprojektuj naczynie

1. Wybierz segment naczynia, który zmieści się w komorze kompatybilnej z mikroskopem. W przypadku komory Rose zachowaj odległość nie większą niż 1,6cm między zbiornikami wlotowym a wylotowym.
2. Zaimportuj obraz z kontrastowej angiografii CT (Rysunek 2A), angiografii rezonansu magnetycznego lub angiografii fluoroskopowej do programu ImageJ/FIJI lub innego programu do analizy obrazu.
3. Użyj narzędzia pomiaru punktowego, aby zdefiniować współrzędne XY wzdłuż osi środkowej naczynia. Wyeksportuj współrzędne do programu arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2B).
   UWAGA: Pliki STL pochodne z angiografii CT można importować bezpośrednio do większości oprogramowań dla drukarek; jednak drukowanie oparte na wielokątach może wymagać wielokrotnych przejść i prowadzić do powstania naczyni plecionych (Rysunek dodatkowy 1). Do drukowania jednoprzejściowego należy użyć bezpośredniego kodu G-code. Z tego powodu preferowane jest mapowanie współrzędnych i projektowanie w G-code. Przykład G-code znajduje się w Plikach dodatkowych.
4. Zmodyfikuj współrzędne XY w arkuszu kalkulacyjnym, aby umieścić środek naczynia w początku układowym grafiki. W razie potrzeby zaimportuj obrys komory, aby potwierdzić, że końcowy wydruk zmieści się w komorze.
5. Wykorzystaj współrzędne XY naczynia do zaprojektowania naczynia w pierwszej warstwie druku (Rysunek 2C). Ustaw wysokość pierwszej warstwy, obejmującej naczynie oraz przyległe zbiorniki wlotowy i wylotowy, na 200µm.
6. Utwórz zbiorniki wlotowe i wylotowe, które umożliwiają wygodne wprowadzenie igieł. W odpowiednich przypadkach stosuj zbiorniki w kształcie rombu, aby efektywnie kierować płyn w stronę wlotu naczynia, minimalizując turbulencje przy wejściu (Rysunek 2).
7. Uwzględnij zbiorniki w pierwszej warstwie druku, tak aby pozostały one połączone z naczyniem. Dodaj 5–9 warstw nad warstwą bazową, aby zapewnić wystarczającą objętość dla igieł wlotowych i wylotowych. W przypadku projektu G-code istotne są następujące szczegóły:
   1. Jeśli dostępna jest kontrola temperatury, ustaw głowicę drukującą i stół roboczy na 37°C za pomocą oprogramowania drukarki lub odpowiednich komend G-code na początku pliku druku.
   2. W przypadku dostępności wielu głowic drukujących, określ głowicę lub ekstruder w kodzie G-code. Skonfiguruj G-code tak, aby korzystał ze współrzędnych bezwzględnych i bezwzględnych odległości ekstruzji.
   3. Dostosuj wysokość warstwy w zależności od rozmiaru i kształtu igieł, ciśnienia przepływu tuszu oraz prędkości głowicy drukującej. Dla opisanych tutaj przykładów zastosuj wysokość warstwy 200µm dla każdej warstwy zbiornika powyżej pierwszej warstwy.
   4. Dla zbiorników zastosuj ciśnienie wsteczne 14–17psi i prędkość głowicy drukującej 6mm/s (G-code: F360). Zwiększ prędkość głowicy do 15mm/s (G-code: F900) dla naczynia.
8. Przetestuj każdy nowy projekt naczynia na szkiełku przedmiotowym bez komory przed wydrukowaniem ostatecznego naczynia.

2. Przygotowanie tuszu poświęcalnego

1. Dodaj 2,1g tlenku polietylenu (PEO) do 60mL zimnej sterylnej wody, aby przygotować 3,5% (w/v) roztwór w sterylnym zamkniętym pojemniku zawierającym sterylny pasek magnetyczny. Mieszaj w temperaturze 4°C przez co najmniej 48h, okresowo sprawdzając, czy cały proszek się rozpuścił.
   UWAGA: Roztwór PEO należy przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze 4°C przez maksymalnie 1 miesiąc.
2. Dodaj 17,5g Pluronic F-127 do 50mL zimnej sterylnej wody, aby przygotować 35% roztwór w sterylnym zamkniętym pojemniku zawierającym sterylny pasek magnetyczny. Mieszaj w temperaturze 4°C przez co najmniej 48h i okresowo sprawdzaj, czy proszek został całkowicie włączony do roztworu.
3. Połącz 11,4mL zimnego 3,5% PEO z 28,6mL zimnego 35% Pluronic F-127 w sterylnej 50mL probówce stożkowej. Mieszaj przez co najmniej 24h w temperaturze 4°C na mieszalniku rotacyjnym.
4. Ustaw probówkę pionowo w temperaturze 4°C przez noc, aby umożliwić wypłynięcie pęcherzyków powietrza z roztworu.
5. Umieść probówkę stożkową zawierającą tusz w kąpieli wodnej i inkubuj w temperaturze 63°C przez 3h. Podczas ogrzewania pozostaw zakrętkę lekko uchyloną, aby umożliwić ucieczkę rozszerzającego się powietrza.
6. Wyjmij probówkę z kąpieli wodnej i pozwól jej stopniowo ostygnąć do temperatury pokojowej. Po ochłodzeniu roztworu mocno zakręć zakrętkę.
7. Umieść spasteryzowany tusz na lodzie na 2 godziny, delikatnie i okazjonalnie agitując, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
8. Wyjmij tłok strzykawki, zakryj otwór igłowy i napełnij strzykawkę do 60%–70% jej pojemności. Włóż tłok, odwróć strzykawkę, zdejmij zakrętkę otworu igłowego i usuń całe uwięzione powietrze.
   UWAGA: Napełnione strzykawki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 1 miesiąc.

3. Wykonanie komory Rose i przygotowanie instalacji hydraulicznej

1. Wykonaj górną i dolną płytkę zaciskową z aluminium lub wydrukuj płyty w technologii 3D, korzystając z dostarczonych plików CAD/STL (Rysunek 2). Uwzględnij wystarczająco duży, ścięty port dolny dla zapewnienia dostępu obiektywowi o wysokiej aperturze numerycznej oraz krawędź wsporczą dla śrub, które stabilnie docisną szkiełka podstawowe do uszczelki.
   UWAGA: Aluminium zapewnia lepsze przewodzenie ciepła podczas mikroskopii na podgrzewanym stole. Części wydrukowane w 3D z PLA lub wzmocnione włóknem węglowym nadają się do prototypowania, lecz mogą wykazywać gorsze przewodnictwo cieplne i mogą ulegać odkształceniom podczas wielokrotnego podgrzewania.
2. Dotnij arkusz silikonu tak, aby pasował do płytek zaciskowych o wymiarach 38mm × 51mm. Wykonaj centralne okno obserwacyjne za pomocą dziurkacza o średnicy 18mm.
3. Nawierć otwory odpowiednie dla wybranej średnicy śrub. Obficie wypłucz gotową uszczelkę wodą, aby usunąć pozostałości silikonu.
4. Zautoklawuj metalowe płytki zaciskowe, śruby, nakrętki i uszczelki silikonowe w zamkniętej kopercie z folii aluminiowej, stosując 20-minutowy cykl suchego ciepła.
5. Zanurz płytki wydrukowane w 3D w 70% etanolu na 1min. Osusz płytki w warunkach sterylnych.
6. Przygotuj odcinki rurek o długości 10–30cm wyposażone w złączki Luer-lock i zaciski rurkowe, odpowiednie rurki do pompy perystaltycznej, kurek trójdrożny, tłumik pulsacji oraz dwuportowy zbiornik na medium (Rysunek 3).
7. Sterylizuj rurki i elementy zbiornika odporne na wysoką temperaturę w autoklawie. Elementy, których nie można autoklawować, sterylizuj poprzez ekspozycję na etanol.

4. Przygotowanie odczynników macierzy zewnątrzkomórkowej

1. Do 1g fibrinogenu z ludzkiej osocza dodaj 12,5mL ciepłego PBS o temperaturze 37°C, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 80mg/mL. Inkubuj w temperaturze 37°C, sporadycznie i delikatnie mieszając, nie używając vortexa.
2. Pozostaw roztwór na 1–2h do czasu rozpuszczenia się fibrinogenu i powstania mętnego roztworu. Rozdziel roztwór do sterylnych probówek i przechowuj w temperaturze −20°C przez maksymalnie 3 miesiące.
3. Do 135mL sterylnego PBS w sterylnej butelce z mieszadłem magnetycznym dodaj 22,5g żelatyny. Mieszaj przez 16h w temperaturze 70°C, okresowo potrząsając butelką, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
4. Dostosuj pH roztworu żelatyny do wartości 7,5, używając 1M NaOH. Przefiltruj roztwór na gorąco za pomocą filtracji próżniowej, podziel na alykwooty i przechowuj w temperaturze 4°C przez maksymalnie 6 miesięcy.
   UWAGA: Przed filtracją pozwól żelatynie napęcznieć przez co najmniej 16h. Podczas filtracji próżniowej utrzymuj roztwór i aparat filtracyjny w temperaturze 37°C, aby zminimalizować zatykanie filtra.
5. Rozpuść trombinę z ludzkiej osocza w sterylnym PBS do stężenia 1,000 U/mL. Delikatnie wymieszaj, podziel na alykwooty i przechowuj w temperaturze −20 °C przez maksymalnie 1 rok.
6. Rozpuść 300mg transglutaminazy w 5 mL PBS i inkubuj w temperaturze 37°C przez 1 h, sporadycznie mieszając. Przefiltruj roztwór sterylnie do nowej probówki i przechowuj w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Roztwór transglutaminazy przygotowuj na świeżo każdego dnia. Proszkową transglutaminazę przechowuj w warunkach beztlenowych w temperaturze 4°C.
7. Rozpuść chlorek wapnia w wodzie, aby przygotować roztwór 1M. Przefiltruj sterylnie roztwór i przechowuj w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 1 rok.

5. Przygotowanie i aktywacja szkiełek nakrywkowych

1. Zanurz czyste szkiełka nakrywkowe w etanolu, a następnie ostrożnie przeprowadź je nad płomieniem palnika Bunsena, aby odparować etanol.
   UWAGA: Etanol jest łatwopalny. Przechowywać zapasy etanolu z dala od otwartego ognia i przeprowadzać sterylizację płomieniem zgodnie z odpowiednimi procedurami przeciwpożarowymi w laboratorium.
2. Umieść szkiełka nakrywkowe w stalowej ramce, uważając, aby nie pękły i nie odprysnęły.
3. Zanurz szkiełka nakrywkowe w 0,5% (3-aminopropyl) trimethoxysilane rozcieńczonym w wodzie na 30–60 min w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji stosuj łagodne mieszanie.
   UWAGA: Należy obchodzić się z (3-aminopropyl) trimethoxysilane, stosując odpowiednie środki ochrony chemicznej i zabezpieczenia techniczne.
4. Przemyj szkiełka nakrywkowe, zmieniając wodę sześciokrotnie, przy łagodnym mieszaniu. Uważaj, aby szkiełka nie wypadły podczas przenoszenia ramki.
5. Wyjmij ramkę z wody, odsącz nadmiar wody i susz w temperaturze 50°C przez 30min.
6. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do ostygnięcia do temperatury pokojowej, przygotowując w tym czasie 0,5% glutaraldehydu w PBS.
   UWAGA: Glutaraldehyd jest toksyczny i drażniący. Roztwór należy przygotowywać i dozować w odpowiednim dygestorium chemicznym, stosując właściwe środki ochrony indywidualnej.
7. Inkubuj szkiełka nakrywkowe w 0,5% glutaraldehydzie przez 60 min przy łagodnym mieszaniu, aby zminimalizować gromadzenie się pęcherzyków powietrza i zapewnić równomierną aktywację.
8. Przepłucz szkiełka nakrywkowe, zmieniając sterylną wodę trzykrotnie, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Aktywowane szkiełka nakrywkowe można przechowywać w desykatorze próżniowym do 2 miesięcy.

6. Powlekanie szkiełek podstawowych warstwą bazową macierzy zewnątrzkomórkowej

1. Podgrzać 1× PBS, roztwór zapasowy żelatyny oraz roztwór zapasowy fibrynogenu do 37°C przez 30–60min.
2. Wyłożyć sterylną szalkę Petriego o średnicy 15cm czystą parafilmem, spryskać powierzchnię 70% etanolem, odlać nadmiar i pozostawić do wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Do probówki stożkowej o pojemności 15mL dodać sekwencyjnie: 1,68 mL ciepłego PBS, 2,5mL roztworu zapasowego żelatyny, 12,5µL 1M CaCl₂, 625µL roztworu zapasowego fibrynogenu oraz 167µL roztworu transglutaminazy.
4. Umieścić mieszaninę ECM w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 30 min.
5. Przygotować dla każdego szkiełka nakrywkowe osobna probówkę 1,7mL zawierającą 5µL roztworu zapasowego trombiny.
6. Dodać 400µL preparatu ECM do probówki z trombiną i wymieszać poprzez jednokrotne pipetowanie, minimalizując powstawanie pęcherzyków powietrza.
7. Natychmiast nanieść 200µL mieszaniny na sterylną parafilm i za pomocą pęsety położyć na kropli jedno aktywowane szkiełko nakrywkowe. Delikatnie docisnąć, aby uzyskać pełne pokrycie.
   UWAGA: Krok ten należy wykonać w ciągu około 20s po połączeniu mieszaniny ECM z trombiną.
8. Przykryć szalkę Petriego i inkubować pokryte szkiełka przez 10min w temperaturze pokojowej, a następnie przez 2h w 37°C w inkubatorze z kontrolą wilgotności.
9. Delikatnie oddzielić każde szkiełko od parafimu, odginając parafilm od szkiełka.
10. Umieścić świeżo pokryte szkiełka stroną z żelem do góry w czystej szalce Petriego w inkubatorze z kontrolą wilgotności i wykorzystać w ciągu 1 dnia.
11. Alternatywnie można inkubować pokryte szkiełka przez noc w inkubatorze bez kontroli wilgotności i wykorzystać w ciągu 2 dni.

7. Biodruk tuszu ofiarnego i jego enkapsulacja w ECM

1. Przed wydrukowaniem naczynia wykonaj wydruki próbne, aby potwierdzić, że zastosowany tusz i parametry drukowania pozwalają uzyskać pożądane wymiary naczynia. Wczytaj plik z projektem do oprogramowania drukarki.
   UWAGA: Stożkowa igła dozująca 32 G z tuszem 25% Pluronic F127/1% PEO pozwala na niezawodne uzyskanie średnic naczyń do około 150µm w warunkach opisanych w niniejszej procedurze. Zoptymalizuj prędkość głowicy drukującej i ciśnienie wsteczne, wykonując proste wydruki linii na szkle.
2. Złóż dolną płytę zaciskową, pokrywkę szkiełkową dolną powleczoną ECM, uszczelkę silikonową oraz górną płytę zaciskową bez górnej pokrywki szkiełkowej, używając dwóch śrub. Umieść złożony element w przykrytej szalce Petriego o średnicy 100 mm i przechowuj w temperaturze 37 °C do czasu użycia w tym samym dniu.
3. Przymocuj igłę drukującą do strzykawki z tuszem i zainstaluj strzykawkę w pneumatycznej drukarce ekstruzyjnej. Podgrzej uprzednio stół drukarski, głowicę drukującą oraz sąsiadującą płytę grzewczą do 37 °C.
4. Przygotuj macierz ECM zgodnie z opisem w Sekcji 6 i utrzymuj ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przygotuj 1,5 mL macierzy na jedną komorę Rose w partiach po 5 mL.
5. Do sterylnej probówki o pojemności 1,7 lub 2 mL przelej 5 µL roztworu zapasu trombiny dla każdej komory. Przygotuj dodatkowe aktywowane, niepowlekane pokrywki szkiełkowe w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
6. Umieść komorę zawierającą pokrywkę szkiełkową powleczoną ECM na stole drukarki i wycentruj ją w punkcie zerowym XY. Obniżaj igłę, aż zetknie się ona z ECM lub powierzchnią szkła w centrum okna komory, i zdefiniuj tę pozycję jako punkt zerowy XYZ.
7. Podnieś igłę i przyłóż maksymalne ciśnienie, aby całkowicie wypełnić ją tuszem i usunąć wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza. Przetrzyj końcówkę igły sterylną chusteczką laboratoryjną.
8. Wydrukuj geometrię naczynia i zbiornika, korzystając z wgranego pliku G-code. Natychmiast po zakończeniu drukowania podnieś igłę i wyjmij komorę.
9. Obejrzyj wydrukowane naczynie pod kątem obecności pęcherzyków powietrza i przerw w strukturze. Odrzuć i wydrukuj ponownie każdą strukturę zawierającą którykolwiek z tych defektów.
10. Umieść komorę na płycie grzewczej o temperaturze 37 °C, wyjmij śruby oraz górną płytę zaciskową i zmieszaj 1 mL przygotowanej macierzy ECM z alikwotem trombiny poprzez jednokrotne pipetowanie.
11. Przenieś aktywowaną mieszaninę ECM do komory naczynia, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza, a następnie natychmiast połóż aktywowaną pokrywkę szkiełkową stroną skierowaną w dół na ECM. Załóż górną płytę zaciskową i dokręć śruby, aż będą stabilnie osadzone, unikając nadmiernego dokręcania.
12. Umieść gotową komorę w przykrytej szalce Petriego o średnicy 100 mm i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 2 h.

8. Generowanie tętniaka przy użyciu szablonu z drutu

1. Wprowadź igły o rozmiarze 21 G przez przeciwległe strony uszczelki silikonowej i wyrównaj je względem siebie.
2. Poddaj sonikacji medyczny drut prowadzący z stali nierdzewnej 304 o średnicy 0,0190 cala w PBS zawierającym 1% BSA, umieszczony w stożkowej probówce o pojemności 15 mL. Wyjmij drut i pozostaw go do wyschnięcia na powietrzu w sterylnym naczyniu Petri wewnątrz komory bezpiecznej.
3. Przeciągnij drut powlekany BSA przez obie igły w uszczelce (Rycina 2). Lekko zagnij jeden z wystających końców, aby ułatwić późniejszą rotację.
4. Autoklawuj zestaw składający się z uszczelki, igieł, drutu i płytki zaciskowej w woreczku z folii.
5. Umieść zestaw igła/uszczelka nad aktywowanym szkiełkiem nakrywką powlekanym ECM.
6. Zamocuj igłę 21 G do strzykawki zawierającej pasteryzowany tusz Pluronic/PEO.
7. Nanieś małą kroplę tuszu poświęcalnego na bok drutu w centrum komory. Nanieś małą kroplę tuszu na każdym połączeniu igły z drutem, aby stworzyć uszczelnienie.
8. Przygotuj mieszaninę ECM i złóż komorę zgodnie z opisem w Sekcjach 7.10–7.12.
9. Po zżelowaniu ECM delikatnie obróć zagięty koniec drutu, aby uwolnić go z ECM i tuszu poświęcalnego. Powoli wyciągnij drut z urządzenia.
10. Wypełnij igłę wlotową PBS za pomocą pipety 200 µL i pozwól PBS odpłynąć przez światło igły. Powtórz czynność raz i przejdź do Sekcji 9.

9. Wypłucz tusz poświęcalny z komory naczynia

1. Podłączyć dren do zbiornika zawierającego zimny (4 °C) PBS z dodatkiem antybiotyków, zamontować trójdrożny kurek i zakończyć dren złączem Luer-lock z igłą sterylną 23 G.
2. Wypełnić dren doprowadzający zimnym PBS za pomocą strzykawki z kurkiem, aż PBS zacznie wypływać z otworu igły. Zaciągnąć zacisk na drenie.
3. Wypełnić drugi odcinek drenu PBS i zakończyć go igłą 23 G. Zaciągnąć zacisk na drenie i usunąć strzykawkę do napełniania.
4. Wprowadzić igłę doprowadzającą przez uszczelkę do zbiornika wlotowego, a igłę odprowadzającą do zbiornika wylotowego. Potwierdzić prawidłowe rozmieszczenie za pomocą mikroskopu odwróconego lub stereomikroskopu.
5. Przenieść cały zestaw do temperatury 4 °C i umieścić zbiornik doprowadzający 30 cm powyżej wlotu. Umieścić wylot 5–10 cm poniżej igły wylotowej naczynia nad pojemnikiem na odpady.
6. Zwolnić zaciski i przepłukać komorę co najmniej 250 mL zimnego PBS. Podczas płukania sprawdzić szczelność systemu oraz obecność pęcherzyków powietrza.

10. Powlecz i wstępnie potraktuj światło naczynia dodatkowymi komponentami ECM

1. Rozcieńczyć fibronektynę do stężenia 20 µg/mL, lamininę do 10 µg/mL lub macierz błony podstawnej w stosunku 1:30 w 3 mL PBS.
2. Dodać świeżo przygotowaną transglutaminazę do rozcieńczonego odczynnika ECM.
3. Pozostawić dreny znajdujące się bezpośrednio przed naczyniem podłączone do wlotu i wylotu.
4. Powoli wstrzyknąć roztwór ECM/transglutaminazy przez naczynie za pomocą strzykawki 1 mL. Powtarzać czynność do momentu, aż przez naczynie przepłynie całe 3 mL roztworu.
5. Zaciśnąć złącza, zamknąć wlot i wylot sterylnymi nasadkami Luer i inkubować w temperaturze 37 °C od 1 h do całej nocy.
6. Przepłukać naczynie 100 mL kompletnej pożywki dla komórek śródbłonka z dodatkiem penicyliny/streptomycyny. Zaciśnąć złącza drenów i zamknąć otwory wylotowe.
   UWAGA: Naczynie wypełnione pożywką można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia. Należy upewnić się, że w świetle naczynia nie pozostały pęcherzyki powietrza.

11. Zasiedlenie naczynia komórkami

1. Inkubować komorę zawierającą matrycę naczynia z ECM w temperaturze 37 °C przez 2 h. Podgrzać do 37 °C kompletną pożywkę do hodowli komórek śródbłonka zawierającą penicylinę/streptomycynę.
2. Trypsynizować komórki śródbłonka z jednej szalki hodowlanej 10 cm lub jednej kolby T75, a następnie zneutralizować trypsynę kompletną pożywką. Przenieść zawiesinę do stożkowej probówki 15 mL i pobrać alikwot do zliczenia komórek.
3. Wirować komórki z prędkością 1 000 × g przez 5 min. Resuspendować osad, aby przygotować 150 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu 5 × 10⁶ komórek/mL.
4. Podłączyć przewód wylotowy do sterylnego zbiornika na odpady i pozostawić zacisk przewodu zamknięty.
5. Odłączyć przewód wlotowy i usunąć pozostałości pożywki z piasty igły wlotowej. Trzymając naczynie pionowo, nanieść pipetą zawiesinę komórkową do piasty igły.
6. Zwolnić zacisk wylotowy, aby umożliwić wpłynięcie zawiesiny komórkowej do naczynia. Ponownie zacisnąć wylot po tym, jak cała zawiesina dostanie się do światła naczynia.
7. Dodać ciepłą, kompletną pożywkę do piasty igły wlotowej, a następnie zamknąć ją sterylnym korkiem Luer. Odłączyć i zakapslować wylot.
8. Inkubować komorę w pozycji prostej w temperaturze 37 °C przez 3 h.
9. Powtórzyć czynności z sekcji 11.5–11.8 i inkubować komorę w pozycji odwróconej w temperaturze 37 °C przez 3 h.
10. Delikatnie przepłukać naczynie 1 mL kompletnej pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 h.
11. Potwierdzić przyleganie komórek śródbłonka za pomocą mikroskopu, delikatnie wypłukać pozostałe nieprzytwierdzone komórki świeżą pożywką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12–24 h.

12. Hodowla naczynia w przepływie

1. Podgrzać 200 mL pożywki kompletnej przez 1 h i odgazować ją pod próżnią za pomocą sterylnej jednostki filtrującej. Ponownie podgrzać pożywkę w nawilżanym inkubatorze CO₂.
2. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza połączyć sekwencyjnie wylot zbiornika z pożywką i kranik trójdrożny, przewody pompy, tłumik pulsacji, opcjonalną pułapkę pęcherzyków, przewody wlotowe, komorę naczynia, przewody wylotowe oraz przewody powrotne do zbiornika z pożywką (Rysunek 3).
3. Wypełnić cały obwód przepływowy pożywką i upewnić się, że nie pozostały w nim pęcherzyki powietrza ani kieszenie powietrzne.
   UWAGA: Przed ponownym połączeniem należy wypełnić złączki i piasty igieł cieczą. Pęcherzyki powietrza dostające się do unaczynionego naczynia mogą spowodować utratę komórek śródbłonka z powodu gwałtownych sił ścinających.
4. Przenieść układ do inkubatora w temperaturze 37 °C i wprowadzić przepływ generujący siłę ścinającą 1 dyn/cm² w naczyniu. Utrzymywać ten przepływ przez 12 h.
5. Zwiększyć przepływ tak, aby uzyskać 12–16 dyn/cm² i utrzymywać go przez 18–24 h przed przeprowadzeniem dalszych analiz. Aby obliczyć przepływ wymagany dla danego naczynia, należy określić długość wydrukowanego naczynia oraz jego średnicę średnią. Korzystając z kalkulatora online, wprowadzić ustalone parametry, zaznaczyć okrągły przekrój poprzeczny, pożywkę z 10% surowicą oraz pomijalny opór przewodów (przewody mają znacznie większą średnicę niż wydrukowane naczynie).
   UWAGA: Naczynia należy użyć jak najszybciej po kondycjonowaniu przepływem. Hodowla trwająca powyżej 1 tygodnia może prowadzić do powstania luk między komórkami śródbłonka, co może być związane z utratą komórek lub modyfikacją ECM przez proteazy śródbłonka.

13. Przeprowadzenie testu przecieku naczyniowego

1. Do 35 mL pełnej pożywki dodać BSA znakowane Alexa 647 lub dekstran 10 kDa znakowany Alexa 647, aby uzyskać stężenie końcowe 5 mg/mL. Roztwór ogrzać do 37 °C.
2. Naczynie inkubować wstępnie z czynnikiem testowym, np. TNFα w stężeniu 250 ng/mL, przez 1–2 h; ten sam czynnik należy dodać do pożywki analitycznej.
3. Przygotować kąpiel wodną o temperaturze 37 °C i ustawić pompę w pobliżu mikroskopu. Uruchomić mikroskop, oprogramowanie do akwizycji danych oraz system podgrzewania stolika, a następnie stabilizować temperaturę stolika w 37 °C przez 30 min przed obrazowaniem.
4. Zatrzymać przepływ w inkubatorze, odłączyć zbiornik z pożywką hodowlaną i przenieść komorę wraz z przewodami na wstępnie ogrzany stolik mikroskopu.
5. Podłączyć pompę do około 20 cm przewodu zakończonego szklaną mikropipetą zawierającą nieznakowaną pożywkę. Włożyć końcówkę mikropipety do pożywki z reporterem fluorescencyjnym, a przewód wylotowy umieścić w naczyniu zbiorczym.
6. Ustawić pompę na szybkość przepływu 0,2 mL/min; nie rozpoczynać przepływu do momentu przygotowania obrazowania.
7. Ustawić ostrość na linii środkowej naczynia, korzystając z obrazowania w kontraście fazowym, a następnie przełączyć na kanał fluorescencji 647. Rozpocząć przepływ z szybkością określoną w sekcji 13.6 i pozyskiwać obrazy co 1–5 min, zależnie od oczekiwanego czasu odpowiedzi.
8. Wygenerować kymografy z pozyskanych obrazów i dopasować liniową krzywą do wartości intensywności po progowaniu. Wyciek określić jako odległość w µm, jaką reporter przebył od zewnętrznej powierzchni naczynia na minutę.

14. Mapowanie przepływu cieczy

1. Wymieszaj na wirówce wortex 10 µm fluorescencyjne kuleczki przez 1 min, a następnie poddaj je sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 1 min. Rozcieńcz kuleczki do stężenia 1.8 × 10⁵beads/mL w 10 mL pożywki kompletnej.
2. Skonfiguruj system przepływowy na stoliku mikroskopu zgodnie z opisem w sekcji 13 dla testu przecieku naczyniowego. Podłącz naczynie do zbierania odpływu i ustaw szybkość przepływu na 0.2 mL/min.
3. Ustaw ostrość na płaszczyznę centralną naczynia, używając obiektywu o odpowiedniej odległości roboczej. Pozyskuj obrazy z maksymalną praktyczną częstotliwością, jaką umożliwiają czas ekspozycji, czułość detektora, intensywność wzbudzenia oraz wydajność zbierania światła.
4. Przeanalizuj sekwencję obrazów time-lapse za pomocą oprogramowania do wektoryzacji obrazu cząstek (PIV).

15. Fixacja i immunostaining naczynia zendotelizowanego

1. Przygotować 40 mL 4% paraformaldehydu w PBS zawierającym 10 mM CaCl₂ i 10 mM MgCl₂.
   UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Roztwory zawierające paraformaldehyd należy przygotowywać i obchodzić się z nimi w odpowiednim dygestorium chemicznym, stosując właściwe środki ochrony osobistej.
2. Zatrzymać przepływ, zacisnąć rurkę doprowadzającą, odłączyć ją od pompy i podłączyć do rurki ssącej używanej w teście przecieku naczyniowego. Włożyć rurkę ssącą do utrwalacza i pozwolić, aby 35 mL cieczy przepłynęło przez naczynie siłą grawitacji.
3. Zacisnąć rurkę i inkubować naczynie w utrwalaczu w temperaturze pokojowej przez 30 min.
4. Przepłukać naczynie siłą grawitacji 25 mL buforu do permeabilizacji zawierającego 0,4% Triton, 20 mM PIPES o pH 6,1, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA i 5,5 mM glukozy. Zacisnąć rurkę i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
5. Przepłukać naczynie buforem blokującym zawierającym 1% BSA, 0,05% Tween 20, 20 mM Tris o pH 7,4, 140 mM NaCl i 5 mM KCl. Inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
6. Rozcieńczyć wybrany przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1:50–1:500 w 100–500 µL buforu blokującego. Usunąć rurkę doprowadzającą i wprowadzić roztwór przeciwciał zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 11 dotyczącą wysiewania komórek.
7. Inkubować naczynie przez noc w 4 °C.
8. Ponownie podłączyć rurkę doprowadzającą i przepłukać naczynie 20 mL PBS.
9. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:200–1:1 000 w buforze blokującym i, jeśli jest wymagane, dodać fluorescencyjną faloidynę w stosunku 1:250. Wprowadzić roztwór zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 15.6 i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej.
10. Przepłukać naczynie 40 mL PBS, zamknąć zaciski rurek i zaślepić końce rurek.
    UWAGA: Barwione naczynie przechowywać w 4 °C i obrazować w ciągu 2 tygodni.
11. Zbarwić F-aktynę fluorescencyjną faloidyną, aparat Golgiego przeciwciałem anty-GM130, a jądra komórkowe barwnikiem DAPI.
12. Przeanalizować obrazy faloidyny za pomocą programu FibrilTool⁷⁴, aby określić średnią orientację włókien stresowych F-aktyny.
13. Wyznaczyć oś między środkami masy każdego jądra a aparatu Golgiego. Przeanalizować i wykreślić wynikowe orientacje w oprogramowaniu do obliczeń numerycznych, jak opisano wcześniej⁷⁵.

Wyniki

Zastosowanie tuszu poświęcalnego do drukowania różnych tkanek rurkowych zostało dobrze opracowane przez kilka grup badawczych, w szczególności przez laboratorium Lewisa, które wytworzyło kanaliki nerkowe wraz z naczyniami krwionośnymi.^67,76Podobne podejścia stosowano do drukowania struktur pęcherzykowych.⁷⁷ oraz guzy unaczynione⁷⁸W niniejszej pracy podejścia te zostały dostosowane w celu wygenerowania geometrii naczyniowych do badania odpowiedzi śródbłonka w warunkach fizjologicznego przepływu płynu (Rysunek 2). Geometrie naczyń zostały przekształcone z obrazu naczyniowego w mapę współrzędnych, a następnie w G-kod w celu zdefiniowania ścieżki druku (Rycina 2A–C). Powstałe podejście umożliwiło wytworzenie matryc naczyń do badania wpływu krętych naczyń oraz tętniaków na zmiany funkcji śródbłonka i organizacji cytoszkieletu (Rycina 2D–G). Wprowadzono również projekt komory Rose możliwy do wydrukowania w technologii 3D, aby wyeliminować konieczność korzystania z usług mechanika (Rysunek 2H). Przykładowy plik G-code do drukowania naczyń znajduje się w Plik uzupełniający 1or odpowiednie pliki CAD komory Rose i uchwytu do stolika znajdują się w Plik uzupełniający 2 i Plik uzupełniający 3odpowiednio. Drukowanie w oparciu o format STL może wymagać wielokrotnych przejść głowicy drukującej, co prowadzi do powstania plecionych geometrii naczyń z oddzielnymi światłami (Rycina dodatkowa 1). Powstała platforma została zaprojektowana tak, aby była dostępna dla biologów komórek naczyniowych z minimalną wiedzą z zakresu bioinżynierii, zapewniając jednocześnie fizjologiczne wartości ciśnienia i przepływu oraz umożliwiając zastosowanie mikroskopii o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 2I).

Po wykonaniu naczynia i jego cellularizacji, urządzenie naczyniowe włączono do zamkniętego układu perfuzyjnego w celu umożliwienia kontrolowanej cyrkulacji medium (Rysunek 3). System składał się z pompy perystaltycznej, trójdrożnego kurka połączonego ze strzykawką do odpowietrzania, pułapki pęcherzykowej, tłumika pulsacji, urządzenia naczyniowego oraz zbiornika na medium, rozmieszczonych sekwencyjnie w obwodzie przepływu (Rysunek 3A). Taka konfiguracja pozwalała na ciągłą cyrkulację medium przez zaprojektowane naczynie, uwzględniając elementy służące do przygotowania układu, usuwania pęcherzyków powietrza oraz tłumienia pulsacji generowanych przez pompę perystaltyczną. Zmontowany system mógł być obsługiwany z urządzeniem naczyniowym umieszczonym w układzie eksperymentalnym, jak pokazano na Rysunku 3B, co stanowiło praktyczną konfigurację do późniejszej perfuzji cellularizowanych naczyń w kontrolowanych warunkach przepływu.

Jedną z modyfikacji wcześniej opisanych metod wykorzystania tuszu poświęcalnego była pasteryzacja tuszu przed drukowaniem. Modyfikacja ta była konieczna, ponieważ stosowanie opublikowanych protokołów przygotowania tuszu prowadziło do zanieczyszczenia kultur pleśnią. Podobnie jak w przypadku innych tuszów na bazie Pluronicu stosowanych w tej aplikacji, tusz 25% Pluronic F127/1% PEO pozostaje w stanie ciekłym w niskich temperaturach i przechodzi w upakowany żel micelarny wraz ze wzrostem temperatury. Ta formulacja ma temperaturę przejścia wynoszącą 15°C, co jest wygodne przy tworzeniu struktur w temperaturach inkubacyjnych i usuwaniu tuszu w 4°C. Podobnie jak czysty Pluronic, materiał ten wykazuje znaczne rozrzedzanie ścinaniem w temperaturze drukowania (Rysunek 4A). Jednak nawet w niskich temperaturach tusz jest zbyt lepki do sterylizacji filtracyjnej przy użyciu standardowych filtrów do hodowli tkankowych i próżni. Chociaż tusz można sterylizować poprzez pasteryzację w temperaturze 70°C lub wyższej przez 20 s, temperatury te nieodwracalnie zmieniają właściwości tuszu i zmniejszają jego lepkość w temperaturze drukowania (dane nie pokazano). Pasteryzacja w niższej temperaturze przez dłuższy czas (63°C przez >1 h) zmniejsza zanieczyszczenie grzybami i innymi mikroorganizmami, nie zmieniając lepkości zespolonej tuszu w temperaturach odpowiednich do drukowania. Charakteryzacja reologiczna z użyciem reometru wyposażonego w geometrię stożek-płyta o średnicy 25 mm wykazała, że tusz surowy i pasteryzowany miały podobne lepkości w zakresie prędkości odkształcania w temperaturach drukowania (Rysunek 4B), co dowodzi, że pasteryzacja nie pogarsza właściwości drukowania. Pasteryzowany tusz umożliwia również dłuższy czas hodowli naczyń bez konieczności stosowania leków przeciwgrzybiczych, które mogą wpływać na funkcję śródbłonka.

Po uprzedniej cellularizacji naczynia, konfluentne komórki śródbłonka powinny pokrywać całe naczynie, co pokazano na Rysunku 5, gdzie na Rysunku 5A przedstawiono projekcję maksymalnej intensywności, a na Rysunku 5B przekrój poprzeczny. Przepływ medium można następnie zwiększyć do fizjologicznych prędkości ścinania, które dla naczyń o przekroju zbliżonym do koła można oszacować za pomocą równania Hagena-Poiseuille'a⁷⁹. W praktyce szybkość przepływu wymaganą do uzyskania pożądanego naprężenia ścinającego można oszacować, uwzględniając lepkość medium i oporność mikrofluidyczną. W typowej hodowli 2D in vitro przepływ medium przy 12 dyn/cm² indukuje u większości typów komórek śródbłonka orientację wzdłuż osi przepływu. Odpowiedź tę można zwizualizować poprzez fluorescencyjne barwienie f-aktyny falloidyną (Rysunek 5D,E) lub poprzez analizę osi aparat Golgi – jądro komórkowe (Rysunek 5D,F); oba te sposoby wykazują orientację anizotropową zgodną z polaryzacją śródbłonka, jak opisano wcześniej¹⁸. Chociaż in vivo występują naprężenia ścinające przekraczające 40 dyn/cm², warunki te nie były tutaj modelowane.

Głównym skutkiem zmiany geometrii naczyń jest zmiana przepływu płynów, na którą komórki śródbłonka reagują poprzez kilka szlaków sygnałowych^80,81. Dostępnych jest kilka metod monitorowania prędkości przepływu krwi, w tym 4D dopplerowski ultradźwięk⁸², 4D obrazowanie przepływu w rezonansie magnetycznym⁸³ oraz obrazowanie laserowego efektu mętności (laser speckle imaging)⁸⁴. Chociaż techniki te oferują istotne zalety in vivo, rozdzielczość lokalnych różnic przepływu w obrębie jednego naczynia może być trudna do uzyskania. Wysoka apertura numeryczna obrazowania w tej platformie umożliwia bezpośrednie śledzenie fluorescencyjnych cząstek (Rycina 6B) oraz mapowanie anomalii przepływu indukowanych przez krzywiznę naczyń z wysoką rozdzielczością przestrzenną przy użyciu obrazowania prędkości cząstek (particle image velocimetry) (Rycina 6C). Na przykład, wzdłuż wewnętrznej krzywizny naczynia obserwuje się wolniejszy przepływ niż wzdłuż krzywizny zewnętrznej (Rycina 6C), co może przyczyniać się do zmienionych reakcji śródbłonka⁸⁵.

Po utworzeniu konfluentnego naczynia drożność oraz funkcję bariery można ocenić poprzez perfuzję makrocząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, takich jak dekstrany lub białka, przez światło naczynia. Drożne naczynia wyścielone komórkami HUVEC ograniczają przenikanie znakowanych fluorescencyjnie dekstranów (Rysunek 6D,F). W przeciwieństwie do tego, ekspozycja na bodźce zaburzające barierę, takie jak TNFα, zwiększa przeciekanie naczyń (Rysunek 6H, J). Lokalne tempo przeciekania można zwizualizować za pomocą analizy kymograficznej (Rysunek 6E,G,I,K). Ponieważ kymograf przedstawia odległość na osi X i czas na osi Y, względne tempo przeciekania można porównać poprzez kwantyfikację nachylenia linii dopasowanych do segmentowanych intensywności fluorescencji (Rysunek 6E,G,I,K). Analizy te umożliwiają ocenę, w jaki sposób lokalna geometria naczynia wpływa na funkcję bariery śródbłonka w odpowiedzi na określone bodźce.

Kluczową zaletą tej platformy jest ulepszony dostęp mikroskopowy w porównaniu z tym, co jest możliwe in vivo. System ten ułatwia również analizę immunohistochemiczną molekularnej organizacji śródbłonka, w szczególności cytoszkieletu aktynowego. Komórki śródbłonka są bardzo cienkie i in vivo otoczone są przez komórki mięśni gładkich, co może utrudniać lokalizację struktur cytoszkieletu specyficznie w obrębie śródbłonka. Platforma ta umożliwia bezpośrednie barwienie i obrazowanie cząsteczek adhezyjnych oraz aktyny filamentowej w komórkach śródbłonka (Rysunek 5) oraz wspiera analizy wieloskładnikowe, które są trudne do przeprowadzenia in vivo, w tym ocenę polaryzacji i podziałów komórek śródbłonka w warunkach przepływu fizjologicznego (Rysunek 5D–F). Połączenie tych testów na jednej platformie umożliwia bezpośrednie badanie zależności między geometrią naczyń, zmienionym przepływem, funkcją bariery, molekularną organizacją śródbłonka a adhezją międzykomórkową.

Rycina 1: Schemat drukowania i wykorzystania trójwymiarowych naczyń krwionośnych na chipie. Schemat blokowy protokołów generowania i wykorzystania trójwymiarowych naczyń krwionośnych na chipie. Czarne okręgi wskazują odpowiadające im numery protokołów. Kolory pól oznaczają temperaturę, w której wykonywany jest dany protokół lub w której inkubowana jest próbka. Schemat obejmuje modelowanie kształtu naczynia, przygotowanie tuszu, przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), przygotowanie komory, drukowanie naczynia, płukanie i powlekanie naczynia, cellularizację, hodowlę przepływową, testy funkcjonalne oraz analizę histologiczną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 2: Drukowanie naczyń i konstrukcja komory. Naczynia mogą być projektowane na podstawie obrazów naczyniowych in vivo w celu odtworzenia geometrii naczyniowej specyficznej dla danego pacjenta. (A) Małe naczynie wieńcowe obrazowane za pomocą tomografii komputerowej (CT) z kontrastem, reprodukowane za zgodą Parekh i wsp.⁸⁶ Pasek skali = 2 mm. (B) Mapa współrzędnych punktów referencyjnych z fragmentu naczynia pokazanego na panelu A, wygenerowana poprzez rejestrację punktów w programie FIJI. (C) Wyjście G-code wygenerowane z mapy współrzędnych przy użyciu oprogramowania sterującego drukarką. Współrzędne X, Y i Z są wskazane w prawym dolnym rogu. (D) Schemat komory Rose zawierającej biodrukowane naczynie. Konstrukcja z górnymi nakrętkami motylkowymi jest kompatybilna z komorą z kwasu polimlekowego (PLA) wydrukowaną w 3D. (E) Komora Rose zawierająca naczynie i zbiorniki wydrukowane z poświęcalnego bioatramentu na szkiełku podstawowym pokrytym ECM. Pasek skali = 9 mm. (F) Schemat komory Rose skonfigurowanej dla modelu tętniaka. Drut przełożony przez igły wlotowe i wylotowe służy jako szablon naczynia, a poświęcalny bioatrament naniesiony na drut służy jako szablon tętniaka. (G) Komora Rose zawierająca drut i szablon z poświęcalnego bioatramentu na szkiełku podstawowym pokrytym ECM. (H) Adapter stolika mikroskopowego z PLA wydrukowany w 3D (po lewej) oraz komora Rose (po prawej), stanowiące alternatywę dla komponentów z obrabianego aluminium. Metalowe zaciski na adapterze stolika są przymocowane do płyty adaptera. Pasek skali = 30 mm. (I) Wydrukowane i przepłukane naczynie w aluminiowej komorze Rose zamontowanej na stoliku mikroskopu z podłączonymi igłami wlotowymi i wylotowymi oraz rurkami. Pasek skali = 20 mm. Skróty: CT = tomografia komputerowa; ECM = macierz zewnątrzkomórkowa; PLA = kwas polimlekowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 3: System przepływu cieczy dla naczynia z komórkami w komorze Rose. (A) Schemat konfiguracji przewodów wykorzystanych do ustanowienia przepływu cieczy przez komorę Rose zawierającą naczynie z komórkami. Strzałki wskazują kierunek przepływu. Ponumerowane komponenty to: (1) pompa perystaltyczna, (2) trójdrożny kurek z strzykawką do zapowietrzania, (3) pułapka pęcherzykowa, (4) tłumik pulsacji, (5) urządzenie do naczyń oraz (6) rezerwuar medium. Wszystkie elementy mające kontakt z medium hodowlanym są sterylizowane przed użyciem. (B) System przepływu cieczy zawierający naczynie z komórkami w komorze Rose umieszczonej w inkubatorze do hodowli tkanek. Numery odpowiadają komponentom przedstawionym na panelu A. Igły wlotowe i wylotowe są przymocowane taśmą dla zapewnienia stabilności. Pasek skali = 40 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Charakterystyka reologiczna bioatramentu poświęcalnego. (A) Lepkość ścinania niepasteryzowanego atramentu 25% Pluronic F127/1% tlenku polietylenu (PEO) jako funkcja szybkości ścinania w temperaturach 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C i 23 °C. (B) Lepkość zespolona jako funkcja częstotliwości kątowej dla niepasteryzowanego i pasteryzowanego atramentu Pluronic F127/PEO w temperaturach 25 °C i 37 °C. Skrót: PEO = tlenek polietylenu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina 5: Obrazowanie i analiza ilościowa utrwalonych i barwionych naczyń upodobnionych do śródbłonka. (A) Projekcja maksymalnej intensywności konfokalnych obrazów fluorescencyjnych (mikroskopia spinning-disk) w pełni zcellularyzowanego naczynia po wstępnym zasiewie i hodowli przy niskim naprężeniu ścinającym (1 dyn/cm²). Naczynie barwiono na obecność VE-cadherin (zielony), F-aktyny (czerwony) oraz DNA przy użyciu DAPI (niebieski). Pasek skali = 50 µm. (B) Zrekonstruowany przekrój poprzeczny xz stosu obrazów z (z-stack) konfokalnej fluorescencji (mikroskopia spinning-disk) w pełni zcellularyzowanego naczynia barwionego fluorescencyjną falloidyną w celu znakowania F-aktyny (czerwony). Pasek skali = 50 µm. (C) Projekcja maksymalnej intensywności stosu obrazów z (z-stack) konfokalnej fluorescencji (mikroskopia spinning-disk) w pełni zcellularyzowanego naczynia po 24 h przepływu przy 12 dyn/cm². F-aktynę znakowano fluorescencyjną falloidyną (czerwony). Pasek skali = 100 µm. (D) Konfokalny obraz fluorescencyjny (mikroskopia spinning-disk) fragmentu naczynia po 24 h hodowli przy naprężeniu ścinającym 16 dyn/cm². Naczynie barwiono na obecność VE-cadherin (żółty), F-aktyny (magenta), markera aparatu Golgiego GM130 (zielony) oraz DNA przy użyciu DAPI (niebieski). Strzałka wskazuje kierunek przepływu. Pasek skali = 30 µm. (E) Reprezentatywna analiza ilościowa średniej orientacji włókien stresowych z kanału F-aktyny z panelu D przy użyciu programu FibrilTool74. Przeanalizowano siatkę 45 obszarów, każdy o powierzchni 1 600 µm², a średnie orientacje włókien przedstawiono na histogramie radialnym względem kierunku przepływu. (F) Reprezentatywna analiza ilościowa osi jądro-Golgi z panelu D jako miara polaryzacji komórek śródbłonka. Wektory od centrum każdego jądra do centrum odpowiadającego aparatu Golgiego przedstawiono na histogramie radialnym względem kierunku przepływu; n = 75 wektorów. Skrót: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Analiza przepływu płynu i przecieku naczyniowego. (A) Schemat geometrii naczynia użytej do analiz w panelach B–K. Litery wskazują przybliżone regiony naczynia odpowiadające poszczególnym panelom. (B) Kodowana kolorystycznie projekcja czasowa sekwencji obrazów fluorescencyjnych z konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym (spinning-disk), pokazująca ruch fluorescencyjnych kuleczek w przepływie przez zakrzywiony region naczynia. Kolor wskazuje numer klatki od 1 do 100; zaznaczono krzywizny zewnętrzną i wewnętrzną. (C) Analiza wektorowej welocymetrii obrazowej cząstek (PIV) pokazująca względną prędkość przepływu w zakrzywionym regionie naczynia. Kolory reprezentują prędkość względną, a strzałki wskazują kierunek i wartość przepływu. Pasek skali = 50 µm. (D–G) Reprezentatywny test bariery naczyniowej w naczyniu nieleczonym, perfundowanym dekstranem 10 kDa znakowanym Alexa 647. (D,D′,D″) Obrazy prostego regionu naczynia pozyskane odpowiednio w 0, 70 i 150 min. Biała linia wskazuje region użyty do kymografu w panelu E. (E) Kymograf prostego regionu z panelu D pokazujący szybkość przecieku wynoszącą 0,39 µm/min, która odpowiada nachyleniu linii przerywanej. (F,F′,F″) Obrazy zakrzywionego regionu naczynia pozyskane w 0, 70 i 150 min. Biała linia wskazuje region użyty do kymografu w panelu G. Pasek skali = 150 µm. (G) Kymograf zakrzywionego regionu z panelu F pokazujący szybkość przecieku wynoszącą 1,01 µm/min, która odpowiada nachyleniu linii przerywanej. (H–K) Reprezentatywny test bariery naczyniowej po preinkubacji z 250 ng/mL czynnika martwicy nowotworów alfa (TNFα). (H,H′,H″) Obrazy prostego regionu naczynia pozyskane odpowiednio w 0, 200 i 400 min. Biała linia wskazuje region użyty do kymografu w panelu I. Pasek skali = 250 µm. (I) Analiza kymograficzna prostego regionu naczynia z panelu H pokazuje szybkość przecieku wynoszącą 2,1 µm/min, która odpowiada nachyleniu linii przerywanej. (J,J′,J″) Obrazy zakrzywionego regionu naczynia pozyskane w 0, 200 i 400 min. Biała linia wskazuje region użyty do kymografu w panelu K. Pasek skali = 250 µm. (K) Analiza kymograficzna zakrzywionego regionu naczynia z panelu J pokazuje szybkość przecieku wynoszącą 6,7 µm/min, która odpowiada nachyleniu linii przerywanej. Gwiazdki w panelach D–K identyfikują odpowiadające końce linii użytych do generowania kymografów. Skróty: PIV = wektorowa welocymetria obrazowa cząstek; TNFα = czynnik martwicy nowotworów alfa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek dodatkowy 1: Drukowanie naczyń przy użyciu programowania drukarki w oparciu o pliki STL. (A) Obraz w kontraście interferencyjnym (DIC) wydrukowanego naczynia utworzonego za pomocą programowania drukarki w oparciu o STL, które kieruje głowicą drukarki do wykonania dwóch przejść, tworząc splotową strukturę naczynia. Pasek skali = 250 µm. (B) Renderowanie 3D przepłukanego splotowego naczynia wypełnionego albuminą surowiczą bydlęcą (BSA) znakowaną Alexa 647. Widoczna jest przerwa między światłami dwóch splotowych pasm. Pasek skali = 100 µm. Skróty: BSA = albuminy surowicze bydlęce; STL = standard tessellation language. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: G-code do drukowania naczynia. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Rysunek CAD komory Rose. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Rysunek CAD adaptera do mocowania stolika. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisano niezawodny system modelowania geometrii naczyniowych związanych z zaburzonym przepływem, w tym naczyń krętych, tętniaków oraz punktów rozgałęzień. Metoda ta umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, mapowanie przepływu oraz ocenę funkcji bariery naczyniowej w ramach platformy dostępnej dla biologów komórkowych z ograniczonym doświadczeniem w dziedzinie bioinżynierii. Chociaż podejście główne wymaga użycia biodrukarki, komercyjnie dostępne drukarki ekstruzyjne obejmują zarówno systemy open-source, jak i bardziej zaawansowane platformy z wieloma głowicami drukującymi. Kluczowe możliwości drukarki obejmują kontrolę temperatury głowicy i tuszu, precyzyjną regulację ciśnienia oraz temperaturę stołu roboczego. Oprócz biodrukowanych naczyń krętych i rozgałęzionych, metoda obejmuje również model tętniaka, który można stworzyć bez użycia biodrukarki. Wspólnie podejścia te ułatwiają badanie funkcji komórek śródbłonka w naczyniach krętych przy użyciu metod mikroskopowych powszechnie dostępnych w laboratoriach biologii komórkowej.

Dostępnych jest wiele systemów modelowych in vitro do badania funkcji naczyniowych^87,88, z których każdy charakteryzuje się odmiennymi zaletami i ograniczeniami. System opisany w niniejszym opracowaniu, dostosowany na podstawie wcześniejszych prac^54,67,69, jest szczególnie odpowiedni do badania wpływu krętości naczyń na funkcję śródbłonka, ponieważ pozwala na bezpośrednie modelowanie geometrii naczyń pochodzących od pacjentów oraz systematyczną zmianę krzywizny naczyniowej w obrębie jednego urządzenia. W innych podejściach modelowano naczynia wieńcowe pacjentów z wykorzystaniem fotopolimeryzowalnego żelatynowego metakrylanu w celu wygenerowania zredukowanych struktur naczyniowych w warunkach przepływu fizjologicznego⁶⁰. Takie systemy oferują dokładne modelowanie naczyń, analizę przepływu oraz możliwość włączenia warstw błony środkowej. Jednak ich całkowity rozmiar oraz wymagane szklane podłoże mogą ograniczać obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz lokalne testy szczelności. Z kolei mniejsze systemy oparte na samoorganizacji komórek śródbłonka pochodzących z iPSC umożliwiają obrazowanie o wysokiej rozdzielczości i mogą zawierać zarówno komórki śródbłonka, jak i komórki mięśni gładkich naczyń⁸⁹. Modele te zapewniają jednak mniejszą kontrolę nad geometrią naczyń, a ustanowienie wysokich wartości przepływu i naprężeń ścinających może być trudne. Przedstawiony system stanowi zatem praktyczne podejście pośrednie, które łączy zdefiniowaną geometrię naczyń z obrazowaniem krętości naczyniowej o wysokiej rozdzielczości.

Główną zaletą tej platformy jest możliwość generowania naczyń zawierających zarówno obszary zakrzywione, jak i proste, co umożliwia bezpośrednie porównanie lokalnej geometrii naczyń w obrębie tej samej próbki przy zachowaniu stałych pozostałych zmiennych eksperymentalnych, co przedstawiono na Rysunku 6. Inną zaletą jest możliwość wykorzystania obrazów naczyń pochodzących od pacjentów, uzyskanych za pomocą angiografii lub tomografii komputerowej z kontrastem. Głównym ograniczeniem w odtwarzaniu naczyń pacjentów jest rozmiar. Naczynia o średnicy mniejszej niż 150µm są trudne do powtarzalnego wydrukowania, natomiast segmenty naczyń przekraczające kilka centymetrów wymagają większych komór montażowych. Segmenty naczyń powinny być również stosunkowo płaskie w trzecim wymiarze, aby można było je wydrukować na podstawowej warstwie matrycy i utrzymać w odległości roboczej obiektywu podczas obrazowania mikroskopowego.

W przyszłych badaniach opisany tutaj system mógłby zostać dalej zmodyfikowany w celu modelowania chorób takich jak miażdżyca, w której geometria naczyń może wpływać na patofizjologię. Aby zwiększyć złożoność fizjologiczną, można by wprowadzić genetycznie zmodyfikowane komórki śródbłonka lub dodatkowe typy komórek, w tym komórki mięśni gładkich i komórki odpornościowe. Wprowadzenie komórek mięśni gładkich pod warstwę śródbłonka, co wykazano w prostszych systemach, mogłoby dostarczyć dodatkowych informacji na temat oddziaływań między mięśnią gładką a śródbłonkiem w kontekście krętości naczyń oraz chorób naczyniowych⁹⁰. Dodatkowe modyfikacje mogłyby obejmować komórki nowotworowe w celu zbadania intravazacji^68,91 oraz wpływu krętości na ten proces. Platforma mogłaby zostać również wykorzystana do zbadania, w jaki sposób zaburzony przepływ zmienia odpowiedzi zapalne^92,93 i potencjalnie przyczynia się do powikłań naczyniowych związanych z infekcjami takimi jak COVID-19⁹⁴. Biorąc pod uwagę szeroki udział układu naczyniowego w zdrowiu i chorobach ludzi, dostępne systemy tego typu mogą ułatwić dalsze badanie funkcji śródbłonka w różnych kontekstach chorobowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(3-Aminopropyl)trimetoksysilan (APTMS), 97%	Sigma-Aldrich	281778	Stosowany do silanizacji i aktywacji szkiełek podstawowych przed przytwierdzeniem ECM.
Sterylna strzykawka 1 mL	Fisher Scientific	14-823-434	Stosowana do podawania odczynników, powlekania naczyń i manipulacji płynami.
1x ług fosforanowo-solny (PBS)	Thermo Fisher Scientific	J61196.AP	Stosowany do przygotowania odczynników, przemywania i płukania naczyń.
Sterylna strzykawka 10 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Stosowana do przygotowania odczynników i przenoszenia płynów.
Probówki stożkowe 15 mL z nakrętką	Fisher Scientific	05-538-59A	Stosowane do przygotowania odczynników, manipulacji komórkami i przechowywania roztworów.
Polistyrenowa szalka Petriego 150 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Stosowana jako sterylny pojemnik roboczy lub inkubacyjny.
Igła 21G	Fisher Scientific	14-817-227	Stosowana do przygotowania szablonu naczynia i dostępu do komory.
Igła 23G	Fisher Scientific	14-817-237	Stosowana do połączeń wlotowych i wylotowych naczynia podczas płukania i perfuzji.
Przezroczysta stożkowa igła dozująca 27G	Nordson	7018417	Stosowana do ekstruzji tuszu poświęcalnego i wizualizacji pęcherzyków powietrza podczas drukowania.
Sterylna strzykawka 3 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Stosowana do przenoszenia płynów i podawania odczynników. Należy potwierdzić numer katalogowy, ponieważ podany numer widnieje również przy strzykawce 10 mL.
Medyczny drut mandrylowy ze stali nierdzewnej 304, średnica 0,0190 cala	Component Supply	GWX-0190-36	Stosowany jako usuwalny szablon dla prostego światła w modelu tętniaka opartym na drucie.
Probówki stożkowe 50 mL z nakrętką	Fisher Scientific	05-526B	Stosowane do przygotowania, mieszania, pasteryzacji i przechowywania odczynników.
Wtórne przeciwciało anty-mysie Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A32723TR	Fluorescencyjne przeciwciało wtórne stosowane do immunobarwienia.
Wtórne przeciwciało anty-królicze Alexa 555	Thermo Fisher Scientific	A-21428	Fluorescencyjne przeciwciało wtórne stosowane do immunobarwienia.
Albuminy surowicy bydlęcej znakowane Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A34785	Fluorescencyjny marker makromolekularny stosowany w testach bariery naczyniowej/przeciekania.
Dekstran znakowany Alexa 647, 10 kDa	Thermo Fisher Scientific	D22914	Fluorescencyjny marker stosowany do oceny funkcji bariery śródbłonowej i przeciekania naczyniowego.
Alexa 647-faloidyna	Thermo Fisher Scientific	A22287	Stosowana do fluorescencyjnego znakowania F-aktyny w celu obrazowania cytoszkieletu i analizy orientacji.
Albumina z surowicy bydlęcej, frakcja V, wolna od kwasów tłuszczowych	Sigma-Aldrich	126575-10GM	Stosowana do blokowania i przygotowania roztworów zawierających białka.
Antybiotyk-antymykotyk, 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Opcjonalny dodatek przeciwdrobnoustrojowy do ECM i pożywki hodowlanej.
Przeciwciało anty-GM130, klon 4A3	Sigma-Aldrich	MABT1363	Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do znakowania aparatu Golgiego w celu analizy polarności śródbłonka.
Królicze monoklonalne przeciwciało anty-VE-kaderyna, D87F2	Abcam	65707	Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wizualizacji połączeń międzykomórkowych śródbłonka.
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C7902	Stosowany w przygotowaniu ECM i buforach do fiksacji. Należy zweryfikować, czy zamierzony odczynnik to chlorek wapnia bezwodny czy uwodniony.
Zestaw złączy	World Precision Instruments	504954	Złącza Luer-do-rurki stosowane do montażu mikrofluidycznego obwodu perfuzyjnego.
Kasetka do barwienia szkiełek podstawowych	Electron Microscopy Sciences	72240	Stosowana do trzymania szkiełek podczas czyszczenia, silanizacji, aktywacji i przemywania.
D-(+)-Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021-100G	Składnik buforu do permeabilizacji stosowanego podczas immunobarwienia.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	Fluorescencyjny barwnik jądrowy stosowany do obrazowania komórek i analizy polarności.
Cyfrowa płyta grzejna	Fisher Scientific	11-475-028	Stosowana do utrzymywania komory naczyniowej i odczynników w temperaturze około 37 °C podczas montażu.
Sól tetrasodowa EGTA	Sigma-Aldrich	E8145-10G	Środek chelatujący stosowany w buforze do permeabilizacji.
Żeńskie złącze Luer z wypustką dla rurek o ID 1/16 cala	Scientific Commodities Inc.	BB330A	Stosowane do łączenia rurek w obwodzie mikrofluidycznym.
Żeński Luer z wypustką ID 1/16 cala, CrystalVu QC	Fisher Scientific	01-000-123	Stosowany do połączeń rurek i komory naczyniowej.
Fibrynogen	Sigma-Aldrich	F8630	Składnik ECM stosowany wraz z żelatyną i trombiną do tworzenia hydrożelu wspierającego naczynie. Weryfikacja źródła: rękopis opisuje ludzki fibrynogen plazmy, podczas gdy dostarczona tabela wskazuje na bydlą plazmę.
Tłumik pulsacji płynu	Darwin Microfluidics	SE-D1606-3NB-PC-31	Stosowany do redukcji pulsacyjnych wahań generowanych przez pompę perystaltyczną.
Przemysłowy wysokotemperaturowy pasek gumy silikonowej	McMaster-Carr	8417K51	Stosowany do wykonania uszczelki dla komory Rose.
Żelatyna ze skóry wieprzowej, wytrzymałość żelu 300, Typ A	Sigma-Aldrich	G2500	Główny składnik ECM stosowany do tworzenia hydrożelu otaczającego światło naczynia.
Szkiełko podstawowe, nr 1,5	VWR	EN-MAS-25X25-1-5-CS	Podłoże do mikroskopii wysokiej rozdzielczości i powierzchnia komory.
Glutaraldehyd, 25%	Electron Microscopy Sciences	16220	Rozcieńczany do aktywacji szkiełek przed przytwierdzeniem ECM.
Zestaw wzrostowy-BBE	ATCC	PCS-100-040	Zestaw suplementów stosowany z podstawową pożywką dla komórek naczyniowych do hodowli komórek śródbłonka.
Zestaw wzrostowy-VEGF	ATCC	PCS-100-041	Suplement wzrostu śródbłonka stosowany z podstawową pożywką dla komórek naczyniowych w razie potrzeby.
Ludzka fibronektyna plazmy	Sigma-Aldrich	FC010	Opcjonalna powłoka ECM światła naczynia stosowana w celu promowania przylegania śródbłonka.
Zacisk do rurek przelotowych	Sigma-Aldrich	Z503371-1PAK	Stosowany do zatrzymywania i regulowania przepływu przez rurki podczas manipulacji komorą i inkubacji.
Cyfrowa pompa perystaltyczna Ismatec Reglo	Masterflex	78018-12	Stosowana do generowania kontrolowanego przepływu płynu przez zkomórkowane naczynia.
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Opcjonalna powłoka ECM światła naczynia do modyfikacji adhezji i polaryzacji śródbłonka.
Zestaw asortymentowy złączy Luer-do-rurek	World Precision Instruments	504954	Stosowany do łączenia rurek, strzykawek i elementów wlotowych/wylotowych komory. Duplikat numeru katalogowego zestawu złączy; zachować jeden wpis, jeśli są identyczne.
Heksahydrat chlorku magnezu	Sigma-Aldrich	M2393-100G	Składnik buforów do fiksacji i permeabilizacji.
Męskie złącze Luer z wypustką dla rurek o ID 1/16 cala	Scientific Commodities Inc.	BB329A	Stosowane do połączeń rurek mikrofluidycznych.
Złącze Luer męskie, ID 1/16 cala	World Precision Instruments	13160-100	Stosowane do łączenia rurek ze strzykawkami i elementami komory.
Matrigel	Sigma-Aldrich	CLS356234-1EA	Opcjonalna powłoka ECM światła naczynia stosowana do przylegania śródbłonka.
Nakrętki do butelek z pożywką	Fisher Scientific	05-719-310	Nakrętki dwuportowe stosowane do budowy sterylnych zbiorników pożywki hodowlanej dla obwodu przepływowego.
Rurki silikonowe klasy Pharma-Grade Nalgene, ID 1/16 cala	Thermo Fisher Scientific	8600-0020	Elastyczne rurki stosowane w mikrofluidycznych obwodach perfuzji i płukania.
Parafilm	Electron Microscopy Sciences	70990-125	Stosowany jako powierzchnia nieprzywierająca podczas polimeryzacji powłok ECM na szkiełkach.
PBS, 10x, pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	70011044	Koncentrowany bufor stosowany do przygotowania roboczych roztworów PBS.
Penicylina/Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific	15140122	Suplement antybiotykowy stosowany w pożywce hodowlanej śródbłonka i roztworach do płukania.
PIPES	Sigma-Aldrich	P1851-25G	Komponent buforujący roztworu do permeabilizacji.
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Komponent termowrażliwy tuszu do drukowania poświęcalnego.
Poliwęglanowy kurek trójdrożny z męskim Luerem	Fisher Scientific	NC9593742	Stosowany do napełniania, przełączania i kontrolowania ścieżek płynowych w obwodzie perfuzyjnym.
Tlenek polietylenu (PEO)	Sigma-Aldrich	372781	Polimerowy składnik formulacji tuszu poświęcalnego.
Mieszalnik obrotowy	Fisher Scientific	88861050	Stosowany do mieszania poświęcalnego tuszu PEO/Pluronic w temperaturze 4 °C.
Kuweta do barwienia szkiełek	MSE Supplies	DWK90020	Stosowana do przemywania, barwienia lub inkubacji szkiełek z odczynnikiem.
Kwadratowe szkiełko podstawowe, nr 2, 25 mm x 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS285525-1000EA	Szkiełko komory; grubsze szkło nr 2 zapewnia większą odporność na stłuczenie i jest kompatybilne z odpowiednimi obiektywami powietrznymi lub wodnymi.
Tępa igła dozująca ze stali nierdzewnej, 21 G, 1 cal	Component Supply	NE-212PL	Stosowana do podawania płynu lub budowy modelu naczynia z szablonu drucianego.
Jednorazowe jednostki filtracyjne próżniowe Steriflip	MilliporeSigma	SE1M179M6	Stosowane do sterylnej filtracji ciepłej żelatyny i innych kompatybilnych roztworów.
Sterylne plastikowe strzykawki 5 mL	Allevi	PSYR5-S	Stosowane do ładowania tuszu poświęcalnego do pneumatycznego druku ekstruzyjnego.
Trombina, z ludzkiej plazmy, wysoka aktywność	Sigma-Aldrich	605195	Stosowana do inicjowania polimeryzacji fibryny podczas tworzenia żelu ECM.
Transglutaminaza	Moo Gloo	1201	Enzym sieciujący stosowany podczas przygotowania i modyfikacji ECM z żelatyny/fibryny.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648466	Detergent stosowany do permeabilizacji komórek śródbłonka przed immunobarwieniem.
Enzym TrypLE Express, 1x, czerwień fenolowa	Thermo Fisher Scientific	12605010	Odczynnik do dysocjacji komórek stosowany do zbierania komórek śródbłonka przed zasiewaniem naczynia.
Tween 20	Sigma-Aldrich	11332465001	Komponent detergentowy buforu blokującego do immunobarwienia.
Podstawowa Pożywka dla Komórek Naczyniowych (Vascular Cell Basal Medium)	ATCC	PCS-100-030	Pożywka podstawowa stosowana do hodowli komórek śródbłonka i eksperymentów perfuzyjnych.