Artykuł badawczy

N-laktylofenyloalanina poprawia funkcję serca w mysim modelu kardiomiopatii cukrzycowej poprzez regulację metabolizmu lipidów

21 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72633

⸱

1 września 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 3Institute of Advanced Synthesis, School of Chemistry and Molecular Engineering, Nanjing Tech University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje podejścia in vivo i in vitro w celu zbadania, w jaki sposób N-laktojlofenyloalanina wpływa na cukrzycową kardiomiopatię, lipidowy metabolizm serca oraz syntezę cholesterolu, ze szczególnym uwzględnieniem szlaku kinazy białkowej aktywowanej przez adenozynomonofosforan podjednostki alfa 1/reduktazy HMG-CoA (3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A).

Streszczenie

Kardiomiopatia cukrzycowa (DCM) jest jednym z najpoważniejszych powikłań cukrzycy. N-laktylofenyloalanina (Lac-Phe), endogenny metabolit, może wspomagać utratę masy ciała i poprawiać homeostazę glukozy. Celem niniejszego badania było zbadanie efektu terapeutycznego Lac-Phe w przypadku DCM oraz dalsza analiza mechanizmu leżącego u podłoża tego działania. Myszy z cukrzycą typu 2 i DCM leczono za pomocą Lac-Phe. Lac-Phe poprawiła kurczliwość serca, łagodziła przebudowę patologiczną i zmniejszyła akumulację lipidów w sercu. In vitro efekty działania Lac-Phe badano na komórkach H9c2 stymulowanych wysokim stężeniem glukozy i kwasem palmitowym. Lac-Phe zmniejszyła akumulację lipidów poprzez ograniczenie syntezy cholesterolu w komórkach H9c2. Mechanistycznie Lac-Phe promowała fosforylację i aktywację kinazy białkowej aktywowanej przez AMP alfa 1 (AMPKα1). Następnie aktywowana AMPKα1 fosforylowała i hamowała swój cel w dół szlaku, reduktazę HMG-CoA (HMGCR), co prowadziło do zmniejszenia syntezy cholesterolu i w konsekwencji do złagodzenia zaburzeń metabolizmu lipidów w komórkach H9c2. Wyniki te wskazują, że Lac-Phe poprawia metabolizm lipidów w komórkach H9c2 w przebiegu DCM poprzez szlak AMPKα1/HMGCR, zwiększając tym samym kurczliwość serca i łagodząc przebudowę patologiczną. Lac-Phe może stanowić potencjalną metodę terapeutyczną w leczeniu kardiomiopatii cukrzycowej.

Wprowadzenie

Cukrzyca jest chorobą metaboliczną charakteryzującą się uporczywą hiperglikemią1. W ciągu ostatnich dwóch dekad cukrzyca stała się jedną z dziesięciu głównych przyczyn zgonów na całym świecie, a każdego roku z powodu cukrzycy i jej powikłań umiera ponad sześć milionów ludzi2. Kardiomiopatia cukrzycowa (DCM), patologiczny stan serca będący następstwem cukrzycy, stanowi jedno z najpoważniejszych powikłań związanych z tą chorobą3,4. Stanowi ona niezależny czynnik ryzyka niewydolności serca i charakteryzuje się strukturalnymi oraz funkcjonalnymi zmianami mięśnia sercowego5,6, w tym włóknieniem serca i hipertrofią kardiomiocytów, co ostatecznie prowadzi do dysfunkcji zarówno rozkurczowej, jak i skurczowej. Chociaż w leczeniu DCM stosuje się obecnie kilka konwencjonalnych terapii sercowo-naczyniowych, takich jak β-blokery, inhibitory konwertazy angiotensyny oraz blokery receptorów angiotensyny II typu 17,8, ich skuteczność w warunkach klinicznych pozostaje suboptimalna. Ponieważ mechanizmy leżące u podłoża DCM nie zostały jeszcze dokładnie zbadane9, obecnie brakuje jasnej strategii terapeutycznej ukierunkowanej na tę chorobę10,11. Manifestacje kliniczne DCM postępują od bezobjawowej dysfunkcji rozkurczowej we wczesnym stadium, poprzez dysfunkcję skurczową i kliniczną niewydolność serca w stadium późnym, aż po zgon12,13. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zbadania i opracowania skutecznych opcji leczenia tego stanu.

Zaburzony metabolizm lipidów jest kluczową cechą DCM14. W DCM podwyższony poziom wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) we krwi może prowadzić do nadmiernego poboru kwasów tłuszczowych przez kardiomiocyty15,16. Metabolizm kwasów tłuszczowych w kardiomiocytach zależy głównie od utleniania kwasów tłuszczowych. Z czasem utlenianie kwasów tłuszczowych w kardiomiocytach staje się niewystarczające do całkowitego zmetabolizowania wszystkich przyjętych kwasów tłuszczowych, co prowadzi do gromadzenia się nadmiaru kwasów tłuszczowych i ich metabolitów pośrednich w kardiomiocytach17. To nadmierne obciążenie lipidami indukuje lipotoksyczność, zaburza dostawy energii do mięśnia sercowego oraz nasila stres oksydacyjny i reakcje zapalne w sercu, co w konsekwencji powoduje poważne uszkodzenia kardiomiocytów18,19. W związku z tym aktywna regulacja metabolizmu lipidów w sercu może stanowić potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu DCM20.

N-laktojlo-fenyloalanina (Lac-Phe) jest endogennym metabolitem, którego stężenie gwałtownie wzrasta po wysiłku fizycznym21. Mechanistycznie Lac-Phe jest syntetyzowana przez cytozolowy enzym karnozyny dipeptydaza 2 (CNDP2) poprzez kondensację mleczanu i fenyloalaniny. Ta ścieżka biosyntetyczna jest szeroko rozpowszechniona w różnych typach komórek, w tym w makrofagach, komórkach nabłonkowych i mezenchymalnych komórkach macierzystych, które wydzielają Lac-Phe do krwiobiegu po aktywności fizycznej22. Wykazano, że przewlekłe podawanie Lac-Phe skutecznie redukuje spożycie pokarmów, zmniejsza otyłość oraz masę ciała i poprawia homeostazę glukozy21. Niedawne badanie wykazało, że Lac-Phe może poprawić zdolność metabolizmu lipidów w mikrogleju/makrofagach po urazie rdzenia kręgowego23. Co ciekawe, badania wskazują, że zarówno ostre, jak i przewlekłe podawanie metforminy, leku pierwszego rzutu w leczeniu cukrzycy typu 2, może podnosić poziom Lac-Phe oraz że Lac-Phe pośredniczy w działaniu przeciwootyłościowym metforminy22. Ponadto Sha i wsp. wykazali niedawno, że Lac-Phe łagodzi śmierć komórek mięśnia sercowego poprzez niwelowanie dysfunkcji mitochondriów, poprawiając tym samym przebieg niewydolności serca indukowanej przez poprzeczną konstrikcję aorty (TAC)24. Przedłużona hiperglikemia i otyłość są istotnymi czynnikami przyczyniającymi się do rozregulowania metabolizmu lipidów w DCM25. Podsumowując, dowody te sugerują, że Lac-Phe może mieć potencjalny efekt terapeutyczny w DCM. Jednak do tej pory rola Lac-Phe konkretnie w DCM nie została zbadana.

W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że egzogenne podawanie Lac-Phe myszom z cukrzycową kardiomiopatią skutecznie poprawiło kurczliwość serca i złagodziło patologiczne przebudowy mięśnia sercowego. Stwierdzono, że Lac-Phe poprawiło funkcję serca u myszy z DCM poprzez regulację zaburzeń metabolizmu lipidów. Lac-Phe zmniejszyło gromadzenie się kropel lipidowych (LD) w kardiomiocytach myszy z DCM oraz obniżyło zawartość cholesterolu w sercu. Pod względem mechanistycznym Lac-Phe promowało fosforylację i aktywację kinazy białkowej aktywowanej przez AMP alfa 1 (AMPKα1), co w konsekwencji prowadziło do fosforylacji reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A (HMGCR). Fosforylacja HMGCR obniża jej aktywność, co skutkuje zmniejszeniem produkcji cholesterolu i tym samym poprawą zaburzeń metabolizmu lipidów w kardiomiocytach. Wyniki te stanowią teoretyczną podstawę dla potencjalnego leczenia DCM za pomocą Lac-Phe.

Protokół

Protokół badania na zwierzętach został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Etyczną Szpitala Nanjing Drum Tower (numer zatwierdzenia: 2025AE1065, 26 września 2025 r.) i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi opisanymi w Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8. wydanie), opublikowanych przez Narodowe Instytuty Zdrowia Stanów Zjednoczonych.

Zwierzęta

W badaniu wykorzystano trzydzieści 5-tygodniowych samców myszy C57BL/6J. Po jednym tygodniu adaptacji żywieniowej wszystkie myszy przebywały w warunkach z dostępem do pokarmu i wody, w cyklu dobowym 12 h dzień/noc, przy temperaturze 22°C ± 2°C i wilgotności 40%–60%. W celu stworzenia modelu mysiego DCM zastosowano dietę wysokotłuszczową (HFD) w połączeniu z niską dawką STZ (Rycina 1A). Cztery tygodnie po rozpoczęciu podawania diety wysokotłuszczowej (HFD; 60% tłuszczu, 20% białka i 20% węglowodanów), myszy poddano nocnemu głodzeniu, a następnie podano im streptozotocynę (STZ; 8 mg/mL rozpuszczona w buforze cytryścianowym, pH 4,5) poprzez wstrzyknięcie dosytronne w dawce 35 mg/kg/dobę przez trzy kolejne dni. Myszy z grupy kontrolnej otrzymywały dietę kontrolną (10% tłuszczu, 20% białka i 70% węglowodanów) oraz równoważne objętości buforu cytryścianowego. Po dodatkowych 15 tygodniach utrzymywania diety wysokotłuszczowej, myszy spełniające oba kryteria: losowe stężenie glukozy we krwi ≥13,3 mmol/L oraz frakcja wyrzutowa lewej komory (LVEF) <55%, uznano za pomyślnie stworzone modele DCM. Zweryfikowane myszy DCM ponumerowano i za pomocą tablicy liczb losowych przypisano do grup DCM oraz DCM + Lac-Phe. Około połowy myszy nie rozwinęło modelu; zwierzęta te zostały poddane eutanazji zgodnie z wymogami etycznymi dotyczącymi zwierząt. W skrócie myszy podzielono na trzy grupy: kontrolną, DCM oraz DCM + Lac-Phe (n = 10 dla każdej grupy). Wszystkie 10 myszy w każdej grupie przeszło echokardiografię, pomiar masy ciała oraz OGTT. Po 28-dniowym okresie leczenia pobrano serca do dalszych analiz. W każdej grupie znajdowało się 10 myszy. Z tej liczby trzy myszy z grupy wykorzystano do sekwencjonowania transkryptomu, trzy do transmisyjnej mikroskopii elektronowej i barwienia histologicznego, a trzy do analizy ekspresji białek. Pozostała mysz w każdej grupie została zachowana jako rezerwa. Po pomyślnym stworzeniu modelu DCM, Lac-Phe rozpuszczono w soli fizjologicznej do stężenia końcowego 10 mg/mL. Myszy w grupie DCM + Lac-Phe otrzymywały Lac-Phe dosytronnie w dawce 50 mg/kg/dobę przy objętości wstrzyknięcia 5 mL/kg, raz dziennie przez 28 kolejnych dni. Myszy w grupach kontrolnej i DCM otrzymywały równoważną objętość soli fizjologicznej jako kontrolę nośnika.

figure-protocol-1
Rycina 1Lac-Phe poprawia funkcję serca i remodelowanie patologiczne u myszy z kardiomiopatią cukrzycową. (A) Schemat modelu mysiego DCM indukowanego HFD/STZ oraz protokołu leczenia Lac-Phe. (B) Masa ciała myszy w grupach kontrolnej, DCM oraz DCM + Lac-Phe podczas 4-tygodniowego okresu leczenia; n = 10 na grupę. (C) Doustny test tolerancji glukozy (OGTT) w wskazanych grupach; n = 10 na grupę. (D) Reprezentatywne obrazy echokardiograficzne w 0., 2. i 4. tygodniu leczenia. (E,F) Ilościowe oznaczenie frakcji wyrzutowej lewej komory (LVEF) (E) oraz skrócenia frakcyjnego (FS) (F); n = 10 na grupę. (G) Reprezentatywne barwienia hematoksyliną i eozyną (H&przebarwione sekcje serca. Pasek skali = 1 mm. (H,I) Reprezentatywne barwienie trichromem Massona sekcji serca (H) oraz ilościowe określenie obszaru włóknienia (I); n = 3 na grupę. Pasek skali = 50 μm(J,K) Reprezentatywne barwienie aglutyniną z zarodków pszenicy (WGA) przekrojów serca (J) oraz kwantyfikacja względnej powierzchni kardiomiocytów (K); n = 3 na grupę. Pasek skali = 20 μmDane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe P < 0.05, **P < 0.001. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Funkcja serca

Po znieczuleniu wziewnym izofluranem myszy unieruchomiono w pozycji grzbietnej na platformie z kontrolą temperatury (37°C). Wymiary lewej komory oraz prędkość przepływu krwi przez zastawkę mitralną podczas rozkurczu i skurczu zmierzono za pomocą echokardiografu wyposażonego w przetwornik 40 MHz, na podstawie których obliczono LVEF oraz frakcję skrócenia (FS). Od każdej myszy zarejestrowano trzy kolejne cykle serca.

Obróbka komórek

Komórki H9c2 hodowano w podłożu Dulbecco’s modified Eagle’s uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37°C w atmosferze z dodatkiem 5% CO₂. Przesiewanie komórek przeprowadzano co 2–3 dni po osiągnięciu 70%–80% konfluencji. Do celów eksperymentalnych komórki wysiano na szalkach 10 cm, a następnie podzielono na trzy grupy: kontrolną, grupę wysokiej zawartości glukozy/kwasu palmitynowego (HG/PA) oraz grupę HG/PA + Lac-Phe. Komórki w grupach HG/PA oraz HG/PA + Lac-Phe poddano najpierw działaniu 0,25 mM kwasu palmitynowego i 50 mM glukozy przez 24 h. Następnie komórki w grupie HG/PA + Lac-Phe traktowano 10 μg/mL Lac-Phe przez kolejne 24 h przy zachowaniu ekspozycji na HG/PA; komórki w grupie HG/PA otrzymały równą objętość PBS w tych samych warunkach HG/PA. W eksperymentach z inhibicją p-AMPK dodano 10 μM AMPK-IN-3 (rozpuszczonego w DMSO) jednocześnie z Lac-Phe na 24 h, natomiast odpowiadające im grupy kontrolne otrzymały równą objętość DMSO. W eksperymentach z atorwastatyną komórki H9c2 w warunkach HG/PA traktowano 10 μM atorwastatyny przez 24 h, samodzielnie lub w połączeniu z 10 μg/mL Lac-Phe.

Barwienie histologiczne

Po 28 dniach podawania Lac-Phe pobrano serca myszy i utrwalono przez imersję w 4% paraformaldehydzie (pH 7,4) przez 24 h. Utrwalone tkanki serca zatopiono w parafinie i pocięto na plastry o grubości 6 μm. Przekroje tkankowe zabarwiono hematoksyliną i eozyną, aglutyniną z zarodków pszenicy oraz trichromem Massona. Wszystkie procedury barwienia przeprowadzono ściśle zgodnie z protokołami producentów. Wykonano obrazowanie całych preparatów przy powiększeniu 20× przy użyciu wysokorozdzielczego mikroskopu w polu jasnym wyposażonego w system kamer cyfrowych.

Analiza Western blot

Stężenie białka określono za pomocą metody Bradforda. Lizaty tkanek rozdzielono metodą SDS-PAGE na żelach z 10% (w/v) akryloamidem, a następnie poddano elektroforetycznemu transferowi na membrany z polifluorku winylidenu. Miejsca niespecyficznego wiązania zablokowano 5% albuminą surowicy bydlęcej przez 2 h w temperaturze pokojowej. Następnie membrany inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałami pierwszorzędowymi (rozcieńczenie 1:1 000), po czym wykonano sześć przemyć w buforze TBST (po 5 min każde) na wytrząsarce. Membrany inkubowano następnie z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:5 000) przez 2 h w temperaturze pokojowej, po czym wykonano kolejne sześć przemyć w buforze TBST (po 5 min każde). Prążki białkowe zwizualizowano przy użyciu zestawu odczynników do wzmocnionej chemiluminescencji. Kwantyfikację wyników western blot przeprowadzono za pomocą analizy densytometrycznej w oprogramowaniu ImageJ. Wszystkie przeciwciała użyte w tej badaniu wyszczególniono w Table of Materials.

Transkryptomika

Całkowite RNA wyizolowano z tkanki serca myszy C57BL/6J przy użyciu odczynnika TRIzol oraz zestawów RNeasy mini. Jakość RNA oceniono za pomocą bioanalizatora 2100, co wykazało wysoką czystość i integralność RNA. Biblioteki RNA-seq przygotowano zgodnie z instrukcją zestawu VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit i zsekwencjonowano przy użyciu systemu Illumina NovaSeq 6000 (single-read, 150 bp). Geny o różnym poziomie ekspresji zidentyfikowano za pomocą programu DESeq2, przyjmując za statystycznie istotne skorygowaną wartość P < 0,05 oraz bezwzględną zmianę log₂ fold change > 1. Przeprowadzono analizę wzbogacenia Gene Ontology (GO) dla genów o różnym poziomie ekspresji, a istotność wzbogacenia tych genów w kategoriach GO obliczono przy użyciu algorytmu rozkładu hipergeometrycznego.

Barwienie Oil Red O oraz barwienie lipidów LD540

Tkankę serca zatopiono w związku OCT, a następnie pocięto na sekcje o grubości 10 μm. Mrożone sekcje pozostawiono przez 30 min w temperaturze pokojowej w celu wyrównania temperatury, a następnie utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 10 min. Po przemyciu buforem PBS sekcje umieszczono w 60% alkoholu izopropylowym na 15 s i pokryto roztworem roboczym Oil Red O na 30 min. Następnie sekcje potraktowano 60% alkoholem izopropylowym przez 15 s i trzykrotnie przemyto buforem PBS. W przypadku barwienia lipidów LD540, komórki H9c2 przemyto buforem PBS i utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 10 min w temperaturze pokojowej. Następnie komórki inkubowano z 10 μM LD540 przez 30 min w temperaturze pokojowej.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)

Świeże tkanki serca myszy pocięto na kawałki o rozmiarach 1–2 mm3, utrwalono w utrwalaczu do mikroskopii elektronowej w temperaturze 4°C przez 4 h, a następnie przemyto wodą dwukrotnie destylowaną i zanurzono w roztworach etanolu o stopniowo zwiększonym stężeniu. Próbki zatopiono, pocięto na skrawki, a następnie poddano obserwacji pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Zawartość cholesterolu całkowitego (TC)

Poziomy całkowitego cholesterolu (TC) w próbkach surowicy oraz komórek H9c2 zmierzono przy użyciu zestawu Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit zgodnie z instrukcjami producenta.

Doustny test obciążenia glukozą (OGTT)

Myszy poddano 14-godzinnemu postowi (od 19:00 do 9:00), a następnie podano im doustnie glukozę (roztwór zapasowy 20%, 2 g/kg). Poziom glukozy we krwi oznaczano w próbkach pobranych z żyły ogonowej w 0, 15, 30, 60 i 120 min po podaniu preparatu.

Pomiar z użyciem zestawu do liczenia komórek-8 (CCK-8)

Do pomiaru żywotności komórek wykorzystano test CCK-8. Komórki H9c2 wysiano do płytek 96-dołkowych z początkową gęstością 3 × 104 komórek/dołek. Po 24 h traktowaniu różnymi stężeniami Lac-Phe w warunkach HG/PA, do 100 μL pożywki hodowlanej w każdym dołku dodano 10 μL odczynnika z zestawu, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 h. Absorbancję mierzono przy 450 nm za pomocą wielofunkcyjnego czytnika płytek mikrodołkowych w celu wyznaczenia wartości gęstości optycznej (OD).

Dokowanie molekularne

Struktury krystaliczne Lac-Phe oraz AMPKα1 pobrano z bazy PubChem26. Proces dokowania molekularnego przeprowadzono przy użyciu oprogramowania CB-DOCK227.

Analiza statystyczna

Wszystkie pomiary echokardiograficzne, barwienia histologiczne i analizy ilościowe obrazów zostały przeprowadzone przez badaczy, którzy nie znali przydziału grup. Wszystkie analizy danych wykonano przy użyciu programów Prism oraz SPSS 20.0. Każdy eksperyment powtórzono co najmniej trzy razy, a dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Homogeniczność wariancji oceniono za pomocą testu Levene'a. Normalność rozkładu potwierdzono poprzez graficzną analizę reszt. Porównania między wieloma grupami przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Tukeya dla porównań parzystych. W przypadku danych z OGTT zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA), gdzie grupę traktowano jako czynnik międzyobiektowy, a czas jako czynnik wewnątrzobiektowy, a następnie przeprowadzono test post hoc Bonferroniego. Wartość P < 0.05 uznano za istotną statystycznie.

Wyniki

Lac-Phe poprawia funkcję serca u myszy z kardiomiopatią cukrzycową

Indukowaliśmy kardiomiopatię rozstrzeniową (DCM) u myszy C57BL/6J, stosując dietę wysokotłuszczową (HFD) w połączeniu z iniekcjami STZ (Rycina 1A) i losowo przydzielono myszy z pomyślnie wywołanym DCM do grupy nieleczonej (grupa DCM) oraz grupy leczonej Lac-Phe, przy czym myszy C57BL/6J służyły jako kontrola negatywna. Zgodnie z badaniem przeprowadzonym przez Li i współpracowników.21wybrano dawkę terapeutyczną Lac-Phe w ilości 50 mg/kg. Po pomyślnym utworzeniu modelu grupa leczona Lac-Phe otrzymywała egzogenne wstrzyknięcia Lac-Phe przez cztery tygodnie, natomiast grupa nieleczona otrzymywała wstrzyknięcia równoważnej objętości soli fizjologicznej. W porównaniu z grupą DCM myszy z kardiomiopatią cukrzycową leczone Lac-Phe wykazały znaczną redukcję masy ciała po czterech tygodniach (Rysunek 1B). Test OGTT wykazał, że w porównaniu z grupą kontrolną negatywną, myszy w grupie DCM miały istotnie podwyższony poziom glukozy w krwi we wszystkich mierzonych punktach czasowych, co wskazuje na upośledzoną tolerancję glukozy. W przeciwieństwie do nich, myszy z DCM leczone Lac-Phe wykazały poprawę tolerancji glukozy (Rycina 1C). Analiza echokardiograficzna wykazała, że w porównaniu z myszami z grupy kontrolnej negatywnej, myszy z DCM wykazywały znacznie obniżoną frakcję wyrzutową lewej komory (LVEF) oraz frakcję skracania (FS) (Rysunek 1D–F). Leczenie Lac-Phe zwiększyło LVEF i FS u myszy z DCM. Analiza histopatologiczna z użyciem H&Barwienie E pokazało patologiczną hipertrofię w tkance serca myszy z DCM w porównaniu z myszami kontrolnymi (Rysunek 1G). Leczenie Lac-Phe wyraźnie złagodziło przerost mięśnia sercowego. Barwienie trichromem Massona dodatkowo wykazało, że Lac-Phe znacząco złagodziło włóknienie mięśnia sercowego w sercach z DCM (Rysunek 1HJa). Barwienie WGA wykazało, że Lac-Phe znacząco zredukowało pole przekroju kardiomiocytów w sercach z DCM (Rysunek 1J,K). Eksperymenty te wykazują, że egzogenna administracja Lac-Phe skutecznie poprawia funkcję serca i łagodzi remodelowanie patologiczne u myszy z DCM.

Lac-Phe łagodzi zaburzenia metabolizmu lipidów w DCM

Aby dokładniej wyjaśnić mechanizm działania Lac-Phe w DCM, przeprowadziliśmy analizę transkryptomiczną tkanek serca myszy. Po pozyskaniu danych wykonano analizy GO i szlaków KEGG. GSEA procesu metabolicznego kwasów tłuszczowych oraz analiza wzbogacenia szlaków KEGG wykazały zmiany w szlakach związanych z metabolizmem lipidów (Ryc. 2A,B). Aby dalej zbadać, w jaki sposób Lac-Phe działa w sercach myszy z DCM, przeprowadziliśmy analizę TEM (Ryc. 2C,D), aby sprawdzić, czy leczenie Lac-Phe zmieniło morfologię ultrastrukturalną serc myszy z DCM. Obrazowanie TEM wykazało znaczny wzrost gęstości LD w sercach myszy z DCM w porównaniu z myszami kontrolnymi, natomiast podanie Lac-Phe skutecznie zredukowało tę gęstość LD. Biorąc pod uwagę uznaną istotność zaburzeń metabolizmu lipidów w DCM, dodatkowo oceniliśmy gromadzenie lipidów w sercu za pomocą barwienia Oil Red O (Ryc. 2E,F). Analiza histologiczna wykazała wyraźnie zwiększone gromadzenie lipidów w sercach myszy z DCM, podczas gdy leczenie Lac-Phe zredukowało to gromadzenie lipidów. Leczenie Lac-Phe obniżyło również poziom TC w surowicy myszy z DCM (Ryc. 2G). Aby dobrać odpowiednią dawkę Lac-Phe do eksperymentów in vitro, zastosowaliśmy test CCK-8 w celu pomiaru żywotności komórek H9c2 traktowanych różnymi stężeniami Lac-Phe w warunkach HG/PA (Ryc. 2H). Komórki H9c2 traktowane Lac-Phe w stężeniu 10 μg/mL w warunkach HG/PA wykazały najwyższy wskaźnik przeżywalności spośród badanych stężeń. W związku z tym do kolejnych eksperymentów wybraliśmy dawkę 10 μg/mL Lac-Phe. Komórki H9c2 poddane działaniu HG/PA wykazały znaczne gromadzenie lipidów, co potwierdzono barwieniem LD540 i ilościową analizą fluorescencji (Ryc. 2I,J), a zawartość TC była również zwiększona (Ryc. 2K). Leczenie Lac-Phe odwróciło te zmiany, znacząco redukując zarówno gromadzenie lipidów, jak i poziomy TC w komórkach H9c2. Wspólnie te wyniki eksperymentalne wykazują, że Lac-Phe skutecznie łagodzi gromadzenie lipidów w sercu i poprawia zaburzenia metabolizmu lipidów u myszy z DCM oraz redukuje gromadzenie lipidów i poziomy TC w komórkach H9c2 traktowanych HG/PA.

figure-results-1
Rycina 2. Lac-Phe łagodzi zaburzony metabolizm lipidów w kardiomiopatii cukrzycowej. (A) Analiza wzbogacenia zestawów genów (GSEA) procesu metabolicznego kwasów tłuszczowych w grupach Control i DCM. (B) Analiza wzbogacenia szlaków Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) porównująca grupy DCM i DCM + Lac-Phe. (C) Reprezentatywne obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) tkanek serca, gdzie czerwone strzałki wskazują krople lipidowe (LDs). Pasek skali = 2 μm. (D) Ilościowe oznaczenie średniej liczby LDs na 100 μm2; n = 3 na grupę. (E,F) Reprezentatywne barwienie Oil Red O tkanek serca (E) i ilościowe oznaczenie względnej powierzchni dodatniej dla Oil Red O (F); n = 3 na grupę. Pasek skali = 20 μm. (G) Względne poziomy cholesterolu całkowitego (TC) w surowicy we wskazanych grupach; n = 3 na grupę. (H) Żywotność komórek mierzona testem CCK-8 w komórkach H9c2 traktowanych 0, 1, 5, 10 lub 20 μg/mL Lac-Phe w warunkach HG/PA. (I,J) Reprezentatywne barwienie LD540 komórek H9c2 (I) i ilościowe oznaczenie średniej intensywności fluorescencji LD540 (J); n = 3 na grupę. Paski skali = 200 μm. (K) Poziomy TC w komórkach H9c2 we wskazanych grupach; n = 3 na grupę. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Lac-Phe zwiększa fosforylację HMGCR w sercach myszy z DCM oraz w komórkach H9c2

Aby zidentyfikować potencjalne cele, poprzez które Lac-Phe poprawia metabolizm lipidów, przeskanowano białka związane z DCM za pomocą bazy GeneCards28 oraz przewidziano białka potencjalnie oddziałujące z Lac-Phe przy użyciu SwissTargetPrediction29 (Rysunek 3A). Porównując wyniki, zidentyfikowano sześć potencjalnych genów docelowych (Rysunek 3B). Analiza tych sześciu genów wykazała, że HMGCR jest kluczowym regulatorem metabolizmu cholesterolu i odgrywa również centralną rolę w DCM (Rysunek 3C)30. Aby ustalić, czy Lac-Phe reguluje metabolizm lipidów za pośrednictwem HMGCR, zbadano najpierw stosunek p-HMGCR/HMGCR w sercach myszy. Analiza Western blot wykazała, że stosunek p-HMGCR/HMGCR był obniżony w sercach myszy z DCM, podczas gdy leczenie Lac-Phe zwiększyło ten stosunek (Rysunek 3D,E). Wyniki te są zgodne ze zwiększoną fosforylacją HMGCR i zmniejszoną aktywnością HMGCR po zastosowaniu Lac-Phe. Eksperymenty in vitro wykazały, że w warunkach HG/PA stosunek p-HMGCR/HMGCR był obniżony w komórkach H9c2, natomiast leczenie Lac-Phe zwiększyło ten stosunek (Rysunek 3F,G). Wyniki te demonstrują, że Lac-Phe zwiększa fosforylację HMGCR w sercach myszy z DCM oraz w komórkach H9c2 traktowanych HG/PA, co potwierdza udział HMGCR w efektach Lac-Phe na metabolizm lipidów.

figure-results-2
Rysunek 3. Lac-Phe zwiększa fosforylację HMGCR w sercach myszy z kardiomiopatią cukrzycową oraz w komórkach H9c2. (A) Diagram Venna przedstawiający nakładanie się białek związanych z DCM i przewidywanych białek związanych z Lac-Phe. (B) Sześć białek wspólnych związanych z DCM i Lac-Phe. (C) Sieć oddziaływań białko-białko pokazująca HMGCR w sieci białek związanych z DCM. (D,E) Reprezentatywne obrazy western blot dla p-HMGCR i HMGCR w tkankach serca z wskazanych grup (D) oraz kwantyfikacja stosunku p-HMGCR/HMGCR (E); n = 3 na grupę. (F,G) Reprezentatywne obrazy western blot dla p-HMGCR i HMGCR w komórkach H9c2 z wskazanych grup (F) oraz kwantyfikacja stosunku p-HMGCR/HMGCR (G); n = 3 na grupę. β-Tubulinę zastosowano jako kontrolę ładowania. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. *P < 0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Połączenie Lac-Phe z atorwastatyną poprawia metabolizm lipidów w komórkach H9c2

Aby dalej ocenić wpływ Lac-Phe na metabolizm lipidów za pośrednictwem HMGCR, zastosowano atorwastatynę jako kontrolę. Eksperymenty in vitro wykazały, że w warunkach HG/PA łączna terapia Lac-Phe i atorwastatyną spowodowała większą redukcję akumulacji lipidów niż sama terapia atorwastatyną. Barwienie LD540 i kwantyfikacja fluorescencji wykazały, że połączone zastosowanie Lac-Phe i atorwastatyny zmniejszyło akumulację LD w komórkach H9c2 (Rycina 4A,B). Pomiar zawartości TC wykazał podobny efekt (Rycina 4C). Analiza Western blot wykazała, że łączna terapia Lac-Phe i atorwastatyną znacząco zwiększyła stosunek p-HMGCR/HMGCR (Rycina 4D,E). Wyniki te wskazują, że połączone zastosowanie Lac-Phe i atorwastatyny wiąże się ze zmniejszoną akumulacją lipidów i poziomem TC oraz zwiększoną fosforylacją HMGCR w komórkach H9c2.

figure-results-3
Rycina 4Połączenie Lac-Phe z atorwastatyną poprawia metabolizm lipidów w komórkach H9c2. (A,B) Reprezentatywne barwienie LD540 komórek H9c2 z określonych grup traktowania (A) oraz analiza ilościowa średniej intensywności fluorescencji LD540 (B); n = 3 na grupę. Pasek skali = 200 μm(C) Poziomy cholesterolu całkowitego (TC) w komórkach H9c2 z wskazanych grup badawczych; n = 3 na grupę. (D, E) Reprezentatywne obrazy western blot dla p-HMGCR i HMGCR w komórkach H9c2 z wskazanych grup badawczych (D) oraz ilościowe oznaczenie stosunku p-HMGCR/HMGCR (E); n = 3 na grupę. β– W качестве kontroli ładowania wykorzystano tubulinę. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Lac-Phe zwiększa fosforylację AMPKα1

Aby dalej zbadać mechanizm molekularny, za pomocą którego Lac-Phe reguluje HMGCR, ponownie przeanalizowaliśmy dane z transkryptomu serca myszy. Poprzez analizę KEGG danych transkryptomicznych zidentyfikowaliśmy 160 ścieżek różnicowo wzbogaconych między grupami DCM a kontrolną oraz 89 ścieżek różnicowo wzbogaconych między grupami DCM a DCM + Lac-Phe (Rycyna 5A). Sześćdziesiąt ścieżek było wspólnych dla tych dwóch porównań. Z tych 60 nakładających się ścieżek wybraliśmy ścieżkę AMPK. AMPK odgrywa krytyczną rolę w regulacji metabolizmu lipidów w DCM31. Ponadto AMPK znajduje się powyżej HMGCR w kaskadzie sygnałowej (Rycina 5B). Postawiliśmy hipotezę, że Lac-Phe może regulować HMGCR poprzez modulację AMPK, co w ostateczności poprawia metabolizm lipidów. Aby przetestować tę hipotezę, wykonaliśmy najpierw dokowanie molekularne AMPKα1 i Lac-Phe z wykorzystaniem CB-DOCK2. Wyniki dokowania molekularnego wykazały, że najlepiej oceniona przewidywana konformacja wiązania między Lac-Phe a AMPKα1 miała powinowactwo wynoszące −7,6 kcal/mol (Rycina 5C). Wyniki te sugerują potencjalną interakcję między Lac-Phe a AMPKα1, ale nie potwierdzają bezpośredniego wiązania wewnątrzkomórkowego. Aby ustalić, czy Lac-Phe wpływa na ścieżkę AMPK w DCM, zbadaliśmy fosforylację AMPKα1 w sercach myszy z DCM. Analiza Western blot wykazała, że stosunek p-AMPKα1/AMPKα1 był zmniejszony w sercach myszy z DCM, natomiast leczenie Lac-Phe zwiększyło ten stosunek (Rycina 5D,E). Eksperymenty in vitro wykazały, że w warunkach HG/PA stosunek p-AMPKα1/AMPKα1 był zmniejszony w komórkach H9c2, podczas gdy leczenie Lac-Phe zwiększyło ten stosunek (Rycina 5F,G). Odkrycia te wskazują, że Lac-Phe zwiększa fosforylację AMPKα1 w sercach myszy z DCM oraz w komórkach H9c2 traktowanych HG/PA.

figure-results-4
Rycina 5. Lac-Phe zwiększa fosforylację AMPKα1 w sercach myszy z kardiomiopatią cukrzycową oraz w komórkach H9c2. (A) Diagram Venna przedstawiający nakładanie się wyników wzbogacenia szlaków dla porównań DCM/Kontrola oraz DCM + Lac-Phe/DCM. (B) Schemat ilustrujący fosforylację AMPK i HMGCR oraz związaną z tym inhibicję syntezy cholesterolu. (C) Przewidywana trójwymiarowa interakcja dokowania molekularnego pomiędzy Lac-Phe a AMPKα1; powinowactwo wiązania = −7,6 kcal/mol. (D,E) Reprezentatywne obrazy western blot dla p-AMPKα1 i AMPKα1 w tkankach serca z zaznaczonych grup (D) oraz kwantyfikacja stosunku p-AMPKα1/AMPKα1 (E); n = 3 na grupę. (F,G) Reprezentatywne obrazy western blot dla p-AMPKα1 i AMPKα1 w komórkach H9c2 z zaznaczonych grup (F) oraz kwantyfikacja stosunku p-AMPKα1/AMPKα1 (G); n = 3 na grupę. Jako kontrola ładunku wykorzystano GAPDH. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. *P < 0,05, **P < 0,01. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Hamowanie AMPK osłabia indukowane przez Lac-Phe fosforylowanie HMGCR oraz poprawę metabolizmu lipidów w komórkach H9c2

Następnie do komórek H9c2 poddanych działaniu Lac-Phe dodano inhibitor p-AMPK. Inhibitor p-AMPK zmniejszył stosunek p-AMPKα1/AMPKα1 (Rycina 6A,B) oraz obniżył stosunek p-HMGCR/HMGCR (Rycina 6C,D). Wyniki te wskazują, że hamowanie fosforylacji AMPK wiąże się ze zmniejszoną fosforylacją HMGCR podczas traktowania Lac-Phe. Inhibitor p-AMPK osłabił również wpływ Lac-Phe na metabolizm lipidów. Barwienie LD540 i kwantyfikacja fluorescencji wykazały zwiększoną akumulację lipidów w komórkach H9c2 traktowanych inhibitorem p-AMPK w porównaniu z komórkami otrzymującymi Lac-Phe bez hamowania AMPK (Rycina 6E,F). Poziomy TC w komórkach H9c2 również wzrosły po inhibicji AMPK (Rycina 6G). Wyniki te wspólnie potwierdzają udział sygnalizacji AMPKα1/HMGCR w efektach działania Lac-Phe na metabolizm lipidów. Lac-Phe zwiększył fosforylację AMPKα1, co wiązało się ze zwiększoną fosforylacją HMGCR oraz zmniejszoną akumulacją lipidów i poziomami TC. Inhibicja AMPK osłabiła te efekty w komórkach H9c2, co wspiera hipotezę, że Lac-Phe poprawia metabolizm lipidów poprzez regulację szlaku AMPKα1/HMGCR.

figure-results-5
Rysunek 6. Hamowanie AMPK łagodzi działanie Lac-Phe na fosforylację HMGCR i akumulację lipidów w komórkach H9c2. (A,B) Reprezentatywne obrazy western blot dla p-AMPKα1 i AMPKα1 w komórkach H9c2 traktowanych HG/PA, Lac-Phe i/lub AMPK-IN-3 zgodnie z oznaczeniami (A) oraz ilościowe oznaczenie stosunku p-AMPKα1/AMPKα1 (B); n = 3 na grupę. (C,D) Reprezentatywne obrazy western blot dla p-HMGCR i HMGCR w komórkach H9c2 z określonych grup traktowania (C) oraz ilościowe oznaczenie stosunku p-HMGCR/HMGCR (D); n = 3 na grupę. GAPDH i β-tubulina służyły odpowiednio jako kontrole ładunku w (A) i (C). (E,F) Reprezentatywne barwienie LD540 komórek H9c2 z określonych grup traktowania (E) oraz ilościowe oznaczenie średniej intensywności fluorescencji LD540 (F); n = 3 na grupę. Pasek skali = 200 μm. (G) Poziomy cholesterolu całkowitego (TC) w komórkach H9c2 z określonych grup traktowania; n = 3 na grupę. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Łącznie wyniki eksperymentów in vivo i in vitro wspierają proponowany mechanizm, według którego Lac-Phe zwiększa fosforylację AMPKα1 oraz HMGCR, co wiąże się z obniżeniem poziomu cholesterolu i akumulacji lipidów, a także poprawą funkcji serca i ograniczeniem przebudowy patologicznej w DCM. Proponowany szlak AMPKα1/HMGCR leżący u podstaw efektów Lac-Phe został przedstawiony schematycznie na Rysunku 7.

figure-results-6
Rycina 7. Proponowany mechanizm, poprzez który Lac-Phe poprawia metabolizm lipidów w kardiomiopatii cukrzycowej poprzez szlak AMPK/HMGCR. Schemat przedstawiający proponowany mechanizm, w którym Lac-Phe promuje fosforylację AMPKα1, a następnie fosforylację HMGCR, co wiąże się ze zmniejszoną akumulacją kropel lipidowych i lipotoksycznością w kardiomiopatii cukrzycowej. AMPK, kinaza białkowa aktywowana AMP; HMGCR, reduktaza HMG-CoA; LD, kropelka lipidowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostępność danych:

Surowe dane stanowiące podstawę wyników niniejszego badania zostały zdeponowane w bazie Zenodo i są publicznie dostępne pod adresem https://zenodo.org/records/21991371 

Dyskusja

W niniejszym badaniu przedstawiamy dowody potwierdzające efekt terapeutyczny Lac-Phe w DCM. Lac-Phe poprawił przebudowę serca oraz funkcję serca w DCM, redukując jednocześnie produkcję cholesterolu w kardiomiocytach i łagodząc zaburzenia metabolizmu lipidów. Pod względem mechanistycznym Lac-Phe zwiększył fosforylację AMPKα1. W konsekwencji zwiększona fosforylacja AMPKα1 wiązała się ze zwiększoną fosforylacją i inhibicją jego downstreamowego celu, HMGCR, co prowadziło do redukcji syntezy cholesterolu i ostatecznie do złagodzenia zaburzeń metabolizmu lipidów w kardiomiocytach. Podsumowując, badanie to wykazuje, że Lac-Phe poprawia lipidowy metabolizm serca w DCM poprzez szlak sygnalizacyjny AMPK/HMGCR. Schematyczne podsumowanie głównych wyników oraz proponowany mechanizm przedstawiono na Rysunku 7.

Zaburzenia metabolizmu lipidów są jednym z kluczowych czynników przyczyniających się do uszkodzenia mięśnia sercowego w DCM15. Nadmierna akumulacja lipidów w kardiomiocytach prowadzi do lipotoksyczności, co skutkuje dysfunkcją kardiomiocytów i patologicznym remodelingiem serca16. Długotrwała hiperglikemia oraz otyłość są istotnymi czynnikami prowadzącymi do zaburzeń metabolizmu lipidów25. Wykazano, że Lac-Phe jest substancją endogenną, która może skutecznie ograniczać spożycie pokarmów, zmniejszać otyłość i masę ciała oraz poprawiać homeostazę glukozy21. Niedawne doniesienia wykazały również, że Lac-Phe może regulować metabolizm lipidów w mikrogleju/makrofagach podczas uszkodzenia rdzenia kręgowego23, co dowodzi, że Lac-Phe potrafi regulować metabolizm lipidów w innym modelu choroby. Jako metabolit endogenny, rola Lac-Phe w chorobach metabolicznych wzbudziła znaczne zainteresowanie. Jednak rola Lac-Phe w DCM nie została jeszcze w pełni zbadana. Nasze badanie ujawniło rolę Lac-Phe w metabolizmie lipidów kardiomiocytów w DCM. Poprzez analizę transkrypcyjną stwierdziliśmy, że leczenie Lac-Phe wiązało się ze zmianami w szlakach związanych z metabolizmem lipidów w sercach myszy z DCM. Barwienie Oil Red O oraz obserwacje TEM potwierdziły zmniejszoną akumulację lipidów w sercach myszy z DCM leczonych Lac-Phe. Wyniki te sugerują, że Lac-Phe wykazuje działanie kardioprotekcyjne w DCM poprzez redukcję akumulacji lipidów w sercu i łagodzenie patologicznego remodelingu. Eksperymenty in vitro wykazały również, że podanie Lac-Phe złagodziło akumulację lipidów w komórkach H9c2 poddanych warunkom HG/PA.

HMGCR jest zależnym od NADPH, enzymem ograniczającym tempo w szlaku mewalonianowym30. HMGCR katalizuje przekształcanie HMG-CoA w mewalonian, co jest krytycznym etapem biosyntezy cholesterolu30,31,32. HMGCR stanowi cel terapeutyczny istotny w kontekście chorób układu sercowo-naczyniowego oraz DCM33. W praktyce klinicznej hamowanie HMGCR jest uznaną metodą redukcji ryzyka sercowo-naczyniowego34. Nasze dane eksperymentalne wykazują, że Lac-Phe zwiększa fosforylację HMGCR w sercach myszy z cukrzycą typu 2, co jest zgodne z hamowaniem aktywności HMGCR i zmniejszeniem syntezy cholesterolu. Badania in vitro dodatkowo wykazały, że podanie Lac-Phe zwiększyło fosforylację HMGCR w komórkach H9c2 wystawionych na warunki HG/PA, czemu towarzyszyło obniżenie poziomu cholesterolu. Lac-Phe w połączeniu z lekiem obniżającym poziom cholesterolu, atorwastatyną, wywołał również silniejsze efekty niż sama atorwastatyna w badanych warunkach eksperymentalnych. W komórkach H9c2 traktowanych atorwastatyną, dodanie Lac-Phe zwiększyło fosforylację HMGCR i zmniejszyło akumulację lipidów. Wyniki te potwierdzają zasadność celowania w fosforylację HMGCR poprzez Lac-Phe w celu ograniczenia produkcji cholesterolu i przywrócenia równowagi metabolizmu lipidów w DCM. Należy jednak dalej badać, czy Lac-Phe może stanowić bezpieczną i skuteczną strategię terapeutyczną dla pacjentów z DCM.

AMPK, kluczowy enzym w mitochondrialnym metabolizmie energetycznym, odgrywa centralną rolę w badaniach nad chorobami metabolicznymi, takimi jak cukrzyca35,36. Poprzez regulację fosforylacji i defosforylacji AMPK pełni istotną rolę w lipidowym metabolizmie serca. Fosforylowana AMPK reprezentuje jej aktywną formę37. p-AMPK promuje wniknięcie kwasów tłuszczowych do mitochondriów w celu przeprowadzenia FAO poprzez regulację CPT-138. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami39, nasze wyniki wykazały, że zwiększona fosforylacja AMPK była powiązana ze zwiększoną fosforylacją HMGCR i zredukowaną syntezą cholesterolu. U myszy z DCM wywołanym przez STZ i HFD przewlekła hiperglikemia może prowadzić do zmian w poziomach p-AMPK w sercu40. We wczesnym stadium cukrzycy, gdy funkcja serca nie uległa zmianie, poziomy p-AMPK w sercu mogą pozostać niezmienione10,37,41. W zaawansowanej cukrzycy, przy utrzymującej się hiperglikemii przez ponad 8 tygodni, rozpoczyna się patologiczne przebudowywanie serca, a poziomy p-AMPK mogą ulec obniżeniu10. Utrzymanie aktywacji AMPK zostało zaproponowane jako skuteczna strategia zapobiegania DCM10,42. Wykazano, że metformina, lek powszechnie stosowany w leczeniu cukrzycy typu 2, aktywuje szlak AMPK, jednak doniesiono, że ma ona neutralny wpływ na serce43,44. Co ciekawe, zarówno ostre, jak i przewlekłe podawanie metforminy może zwiększać poziomy Lac-Phe22. Obserwacje te sugerują możliwość, że Lac-Phe może przyczyniać się do sygnalizacji metabolicznej związanej z aktywacją AMPK; jednak niniejsze badanie nie wykazuje, aby egzogenna Lac-Phe wywierała bardziej specyficzny lub bezpieczniejszy efekt niż metformina.

W naszym badaniu fosforylacja AMPKα1 była wyraźnie zmniejszona w modelu DCM w stadium późnym, co przedstawiono na rysunku 5D,E, a wynik ten jest zgodny z poprzednimi badaniami42. Analiza transkryptomiczna wykazała zmiany obejmujące szlak AMPK w sercach myszy z cukrzycą typu 2 leczonych Lac-Phe, a analiza western blot wykazała zwiększenie fosforylacji AMPKα1 po zastosowaniu Lac-Phe. Dokowanie molekularne zasugerowało potencjalną interakcję pomiędzy Lac-Phe a AMPKα1, co jest zgodne z niedawnym badaniem23. Co istotne, samo dokowanie molekularne nie dowodzi bezpośredniego wiązania wewnątrzkomórkowego pomiędzy Lac-Phe a AMPKα1. Eksperymenty in vitro wykazały, że zastosowanie inhibitora AMPK hamowało fosforylację AMPKα1, czemu towarzyszyło zmniejszenie fosforylacji HMGCR. Po dodaniu inhibitora AMPK efekty działania Lac-Phe uległy osłabieniu, co zbiegło się ze zwiększoną akumulacją lipidów i podwyższoną zawartością cholesterolu w komórkach H9c2. Łącznie wyniki te potwierdzają udział sygnalizacji AMPKα1/HMGCR w efektach działania Lac-Phe na metabolizm lipidów. Lac-Phe zwiększył fosforylację AMPKα1, co wiązało się ze zwiększoną fosforylacją HMGCR, obniżeniem poziomu cholesterolu oraz zmniejszeniem akumulacji lipidów; inhibicja AMPK osłabiła te efekty.

Niniejsze badanie obarczone jest kilkoma ograniczeniami. Po pierwsze, wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono na samcach myszy. Chociaż wykazaliśmy terapeutyczny efekt Lac-Phe w DCM u samców myszy C57BL/6J, płeć jest istotnym czynnikiem wpływającym na choroby układu sercowo-naczyniowego45. W związku z tym nie wiadomo, czy Lac-Phe wykazuje takie same efekty u samic myszy. Po drugie, sekwencjonowanie transkryptomu przeprowadzono na próbkach z całego serca, co mogło zamaskować zmiany specyficzne dla poszczególnych typów komórek w sercu po zastosowaniu leczenia Lac-Phe. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek mogłoby dostarczyć głębszego wglądu w heterogeniczność komórkową i molekularną leżącą u podstaw zaobserwowanych efektów46,47 i stanowi alternatywną metodę dalszej weryfikacji tej hipotezy. Wreszcie, ze względu na ograniczenia sprzętu do ultrasonografii wykorzystanego w tym badaniu, nie byliśmy w stanie ocenić funkcji rozkurczowej serca u myszy. W związku z tym niezbędne są dalsze badania w celu wyjaśnienia terapeutycznych efektów Lac-Phe w DCM, oceny potencjalnych efektów zależnych od płci, zbadania odpowiedzi specyficznych dla typów komórek, oceny funkcji rozkurczowej oraz dalszego wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw zaobserwowanych efektów. Podsumowując, niniejsze badanie dostarcza dowodów wspierających uznanie Lac-Phe za potencjalny endogenny metabolit istotny w leczeniu DCM. Co więcej, nasze wyniki wspierają proponowany mechanizm, według którego Lac-Phe zmniejsza akumulację lipidów w kardiomiocytach podczas DCM poprzez szlak AMPKα1/HMGCR. Konkretnie, Lac-Phe zwiększył fosforylację AMPKα1, co wiązało się ze zwiększoną fosforylacją HMGCR, zmniejszoną syntezą cholesterolu i akumulacją lipidów oraz złagodzeniem przebudowy patologicznej. Dalsze badania są wymagane, aby ustalić interakcję molekularną między Lac-Phe a AMPKα1 oraz określić potencjalne zastosowania translacyjne tych odkryć.

Oświadczenia

Konflikt interesów:

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy wyrazić naszą szczerą wdzięczność badaczom i personelowi Clinical College w Nanjing Drum Tower Hospital oraz szpitalowi klinicznemu przy Medical School, Nanjing University, za wsparcie techniczne. Badania te były finansowane z grantów Narodowej Fundacji Nauk Naturalnych Chin (nr grantów 81870291 i 82300384), Chińskiej Fundacji Nauk Postdoktorskich (nr grantu 2023M731625) oraz Fundacji Nauk Naturalnych Prowincji Jiangsu (nr grantu BK20220175). Dziękujemy również za zasoby i wsparcie kolaboracyjne zapewnione przez Institute of Advanced Synthesis na Nanjing Tech University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AMPK-IN-3 (inhibitor p-AMPK)MedChemExpress (MCE)HY-132921Stosowany przy 10 μM podczas eksperymentów z inhibicją AMPK w celu zahamowania sygnalizacji AMPK w komórkach traktowanych Lac-Phe.
Zestaw do oznaczania cholesterolu i estrów cholesterylu Amplex RedBeyotimeS0211SStosowany do oznaczenia całkowitego poziomu cholesterolu w próbkach surowicy oraz komórek H9c2.
przeciw-AMPKα1Technologia sygnalizacji komórkowej2532; RRID: AB_330331Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy AMPK metodą western blotα1.
przeciw-GAPDHTechnologia sygnalizacji komórkowej5174; RRID: AB_10622025Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy GAPDH metodą western blot.
anty-HMGCRAbcamab174830; RRID: AB_2749818Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy HMGCR metodą western blot.
Przeciwciało anty-p-AMPKα1 (Thr172)Technologia sygnalizacji komórkowej2535; RRID: AB_331250Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy western blot fosforylowanej kinazy AMPKα1.
Przeciwciało anty-p-HMGCR (Ser872)Abcamab124350Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy western blot fosforylowanego HMGCR.
Przeciwciało anty-IgG królicze, sprzężone z HRPTechnologia sygnałowania komórkowego7074; RRID: AB_2099233Stosowany w rozcieńczeniu 1:5 000 do detekcji w technice western blot.
Przeciw-β$\alpha$-tubulinaTechnologia sygnalizacji komórkowej2128; RRID: AB_823664Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy western blot w celu oznaczenia β-tubulina.
AtorwastatynaMedChemExpress (MCE)HY-17379Stosowany samodzielnie lub w połączeniu z Lac-Phe w celu oceny wpływu na akumulację lipidów, całkowity poziom cholesterolu oraz fosforylację HMGCR w komórkach H9c2 traktowanych HG/PA.
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906Stosowane w stężeniu 5% w celu zablokowania nieswoistego wiązania podczas analizy western blot.
Odczynnik/zestaw do oznaczenia metodą BradfordaThermo Fisher Scientific23200Stosowane do oznaczenia stężenia białka przed analizą western blot.
myszy C57BL/6J (5-tygodniowe, samce)Centrum Badań nad Modelami Zwierzęcymi Uniwersytetu w NankinieN/AWykorzystywane do stworzenia mysiego modelu kardiomiopatii cukrzycowej indukowanej dietą wysokotłuszczową (HFD) oraz streptozotocyną (STZ).
Zestaw do zliczania komórek-8 (CCK-8)SharebioSB-CCK8SStosowane do pomiaru żywotności komórek H9c2 po przeprowadzeniu zabiegu.
Bufor cytrynianowyPrzygotowano we własnym zakresiePonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski.Przygotowano w pH 4,5 i użyto do rozpuszczenia STZ oraz jako odpowiednią kontrolę nośnika.
Dieta kontrolna (10% tłuszczu, 20% białka, 70% węglowodanów)Research Diets, Inc.D12450JStosowana jako dieta dla myszy z grupy kontrolnej.
D-(+)-glukozaSigma-AldrichPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które mają zostać przetłumaczone z języka angielskiego na język polski.Stosowane do traktowania komórek HG/PA oraz do testu doustnej próby obciążenia glukozą.
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Stosowany jako rozpuszczalnik dla AMPK-IN-3 oraz jako odpowiadająca mu kontrola nośnika.
Dulbecco’zmodyfikowana pożywka Eagle’pożywka sGibco, Thermo Fisher Scientific11965092Stosowane jako podstawowe pożywka hodowlana dla komórek H9c2.
Echinokardiograf z przetwornikiem 40 MHzFUJIFILM VisualSonicsVevo 3100 LT; przetwornik 40 MHzStosowane do pomiaru wymiarów lewej komory oraz prędkości przepływu krwi przez zastawkę mitralną, a także do wyznaczenia LVEF i FS.
Fiksatyw do mikroskopu elektronowegoServiceBioG1102Stosowane do utrwalania świeżej tkanki serca myszy do transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
EtanolSigma-AldrichE7023Stosowane w stopniowo zwiększanych stężeniach do odwadniania podczas przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Płodowa surowica bydlęcaGibco, Thermo Fisher Scientific10099141Stosowane w stężeniu 10% jako dodatek do pożywki hodowlanej komórek H9c2.
Linia komórkowa H9c2SunncellRRID: CVCL_0286Wykorzystywany jako in vitro model komórek sercowych w eksperymentach z zastosowaniem HG/PA oraz Lac-Phe.
Barwienie hematoksyliną i eozynąServiceBioG1005-1/2Stosowane do oceny histologicznej tkanki serca.
Dieta wysokotłuszczowa (60% tłuszczu w przeliczeniu na kcal)Research Diets, Inc.D12492Stosowane wraz z niską dawką STZ w celu stworzenia mysiego modelu kardiomiopatii cukrzycowej.
Mikroskop w polu jasnym o wysokiej rozdzielczościLeicaDM2500Stosowane do obrazowania całych preparatów barwionej tkanki serca przy powiększeniu 20x× powiększenie
ImageJNational Institutes of HealthProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Stosowane do densytometrycznej kwantyfikacji wyników western blot.
IzofluranSigma-Aldrich792632Stosowane do znieczulenia podczas echokardiografii u myszy.
Alkohol izopropylowySigma-AldrichI9516Stosowane w stężeniu 60% podczas barwienia Oil Red O zamrożonych przekrojów serca.
Barwienie lipidów LD540BeyotimeC2050S-1Stosowane przy 10 μM do barwienia lipidów wewnątrzkomórkowych.
Masson’barwienie trichromowe MassonaServiceBioG1006Stosowane do barwienia histologicznego tkanki serca.
N-laktoilofenyloalanina (Lac-Phe)MedChemExpress (MCE)HY-146098Podawano myszom z DCM i stosowano w celu leczenia komórek H9c2 poddanych działaniu HG/PA.
roztwór roboczy Oil Red OServiceBioG1015-100MLStosowane do barwienia lipidów w mrożonych przekrojach tkanki serca.
Zestaw do wydajnej chemiluminescencji Omni-ECLEpiZymeSQ203LStosowany do chemiluminescencyjnej wizualizacji prążków białkowych po przeprowadzonym western blottingu.
Kwas palmitynowySigma-AldrichP0500Stosowane w stężeniu 0,25 mM wraz z wysokim stężeniem glukozy w celu stworzenia modelu komórek H9c2 traktowanych HG/PA.
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Przygotowany jako roztwór 4% i stosowany do utrwalania tkanki oraz komórek serca przed barwieniem histologicznym lub lipidowym.
Penicylina-streptomycynaGibco, Thermo Fisher Scientific15140122Stosowane w stężeniu 1% w pożywce do hodowli komórek H9c2.
bufor fosforanowo-solny (PBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10010023Stosowany do płukania podczas procedur barwienia oraz jako odpowiedni nośnik w eksperymentach z traktowaniem komórek.
PrismOprogramowanie GraphPadWersja 8.0Stosowane do analizy statystycznej danych eksperymentalnych.
membrana transferowa z PVDF, 0.45 μmThermo Fisher Scientific88518Stosowany do elektroforetycznego przeniesienia białek podczas analizy western blot.
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Stosowany do izolacji/oczyszczania całkowitego RNA z tkanki serca myszy.
Roztwór chlorku sodu, 0,9% (sól fizjologiczna)Sigma-AldrichS8776Stosowany do rozpuszczania Lac-Phe oraz jako kontrola nośnika dla myszy z grupy kontrolnej i grupy DCM.
SPSSIBMWersja 20.0Stosowane do analizy statystycznej danych eksperymentalnych.
Streptozotocyna (STZ)Sigma-AldrichS0130Podawano wraz z dietą wysokotłuszczową (HFD) w celu stworzenia mysiego modelu kardiomiopatii cukrzycowej.
Bufor TBS z Tween-20 (20×)Thermo Fisher Scientific28360Stosowany do płukania membran po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi podczas analizy western blot.
Związek Tissue-Tek O.C.T.Sakura Finetek4583Stosowane do zatapiania tkanki serca przed przygotowaniem skrawków mrożonych do barwienia Oil Red O.
Mikroskop elektronowy transmisyjnyHITACHIHT7800Stosowane do badania zmian ultrastrukturalnych w tkance serca myszy.
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026Stosowane do izolacji całkowitego RNA z tkanki serca myszy.
Zestaw do przygotowania bibliotek RNA-seq VAHTS Universal V10VazymeNR616-01Stosowane do przygotowania bibliotek RNA-seq do analizy transkryptomicznej.
Lektyna z kiełków pszenicy (WGA)ServiceBioW7024Stosowane do oceny histologicznej tkanki serca.

Bibliografia

  1. Pan KL, Hsu YC, Chang ST, Chung CM, Lin CL. The role of cardiac fibrosis in diabetic cardiomyopathy: from pathophysiology to clinical diagnostic tools. Int J Mol Sci. 2023;24(10):8604.
  2. Saeedi P, et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 2019;157:107843.
  3. Zou R, et al. PGAM5-mediated PHB2 dephosphorylation contributes to diabetic cardiomyopathy by disrupting mitochondrial quality surveillance. Research. 2022;2022:0001.
  4. Jia G, DeMarco VG, Sowers JR. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in diabetic cardiomyopathy. Nat Rev Endocrinol. 2016;12(3):144–53.
  5. Low Wang CC, Hess CN, Hiatt WR, Goldfine AB. Clinical update: cardiovascular disease in diabetes mellitus: atherosclerotic cardiovascular disease and heart failure in type 2 diabetes mellitus—mechanisms, management, and clinical considerations. Circulation. 2016;133(24):2459–502.
  6. Liu P, Zhang Z, Chen H, Chen Q. Pyroptosis: mechanisms and links with diabetic cardiomyopathy. Ageing Res Rev. 2024;94:102182.
  7. Park JJ. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis and treatment of heart failure in diabetes. Diabetes Metab J. 2021;45(2):146–57.
  8. Gilca GE, et al. Diabetic cardiomyopathy: current approach and potential diagnostic and therapeutic targets. J Diabetes Res. 2017;2017:1310265.
  9. Nakamura K, et al. Pathophysiology and treatment of diabetic cardiomyopathy and heart failure in patients with diabetes mellitus. Int J Mol Sci. 2022;23(7):3587.
  10. Han X, et al. Cardiomyocyte OTUD1 drives diabetic cardiomyopathy via directly deubiquitinating AMPKα2 and inducing mitochondrial dysfunction. Nat Commun. 2025;16(1):666.
  11. Jia G, Hill MA, Sowers JR. Diabetic cardiomyopathy: an update of mechanisms contributing to this clinical entity. Circ Res. 2018;122(4):624–38.
  12. Yao Y, Yang B, Shi J. TiO(x)(OH)(4-2x) nanosheets with catalytic antioxidative activity alleviate oxidative injury in diabetic cardiomyopathy. J Am Chem Soc. 2025;147(4):3885–95.
  13. Seferovic PM, et al. Diabetic myocardial disorder: a clinical consensus statement of the Heart Failure Association of the ESC and the ESC Working Group on Myocardial & Pericardial Diseases. Eur J Heart Fail. 2024;26(9):1893–903.
  14. Wang H, et al. Inhibition of fatty acid uptake by TGR5 prevents diabetic cardiomyopathy. Nat Metab. 2024;6(6):1161–77.
  15. Zhao Y, et al. Ferroptosis: roles and molecular mechanisms in diabetic cardiomyopathy. Front Endocrinol. 2023;14:1140644.
  16. Nakamura M. Lipotoxicity as a therapeutic target in obesity and diabetic cardiomyopathy. J Pharm Pharm Sci. 2024;27:12568.
  17. Nakamura M, et al. Glycogen synthase kinase-3α promotes fatty acid uptake and lipotoxic cardiomyopathy. Cell Metab. 2019;29(5):1119–34.e12.
  18. Ritchie RH, Abel ED. Basic mechanisms of diabetic heart disease. Circ Res. 2020;126(11):1501–25.
  19. Thakur M, Tupe RS. Lipoxin and glycation in SREBP signaling: insight into diabetic cardiomyopathy and associated lipotoxicity. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2023;164:106698.
  20. Dhar A, et al. A comprehensive review of the novel therapeutic targets for the treatment of diabetic cardiomyopathy. Ther Adv Cardiovasc Dis. 2023;17:17539447231210170.
  21. Li VL, et al. An exercise-inducible metabolite that suppresses feeding and obesity. Nature. 2022;606(7915):785–90.
  22. Xiao S, et al. Lac-Phe mediates the effects of metformin on food intake and body weight. Nat Metab. 2024;6(4):659–69.
  23. Ying W, et al. N-lactoyl-phenylalanine modulates lipid metabolism in microglia/macrophage via the AMPK-PGC1α-PPARγ pathway to promote recovery in mice with spinal cord injury. J Neuroinflammation. 2025;22(1):167.
  24. Sha L, et al. N-Lac-Phe ameliorates myocardial cell death by improving mitochondrial dysfunction, ultimately improving TAC-induced heart failure. Cardiovasc Drugs Ther. 2026;40:1391–401.
  25. Ke J, Pan J, Lin H, Gu J. Diabetic cardiomyopathy: a brief summary on lipid toxicity. ESC Heart Fail. 2023;10(2):776–90.
  26. PubChem. PubChem. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/. Accessed August 15, 2026.
  27. Liu Y, Yang X, Gan J, et al. CB-Dock2: improved protein-ligand blind docking by integrating cavity detection, docking and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W159–W164.
  28. GeneCards. GeneCards: the Human Gene Database. Version 6.1, June 17, 2026.
  29. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules. Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W357–W364.
  30. Jo Y, DeBose-Boyd RA. Post-translational regulation of HMG CoA reductase. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2022;14(12):a041253.
  31. Steinberg GR, Hardie DG. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(4):255–72.
  32. Istvan ES, Deisenhofer J. Structural mechanism for statin inhibition of HMG-CoA reductase. Science. 2001;292(5519):1160–4.
  33. Beaudry D, et al. Statin therapy in cardiovascular diseases other than atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 2007;9(1):25–32.
  34. Koch CG. Statin therapy. Curr Pharm Des. 2012;18(38):6284–90.
  35. Dewanjee S, et al. Autophagy in the diabetic heart: a potential pharmacotherapeutic target in diabetic cardiomyopathy. Ageing Res Rev. 2021;68:101338.
  36. Madonna R, et al. Empagliflozin inhibits excessive autophagy through the AMPK/GSK3β signalling pathway in diabetic cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2023;119(5):1175–89.
  37. Madhavi YV, et al. Targeting AMPK in diabetes and diabetic complications: energy homeostasis, autophagy and mitochondrial health. Curr Med Chem. 2019;26(27):5207–29.
  38. Fang C, et al. The AMPK pathway in fatty liver disease. Front Physiol. 2022;13:970292.
  39. Liu S, et al. AICAR-induced activation of AMPK inhibits TSH/SREBP-2/HMGCR pathway in liver. PLoS One. 2015;10(5):e0124951.
  40. Zhou H, et al. Empagliflozin rescues diabetic myocardial microvascular injury via AMPK-mediated inhibition of mitochondrial fission. Redox Biol. 2018;15:335–46.
  41. Lu QB, et al. METRNL ameliorates diabetic cardiomyopathy via inactivation of cGAS/STING signaling dependent on LKB1/AMPK/ULK1-mediated autophagy. J Adv Res. 2023;51:161–79.
  42. Wang D, et al. FGF1(ΔHBS) prevents diabetic cardiomyopathy by maintaining mitochondrial homeostasis and reducing oxidative stress via AMPK/Nur77 suppression. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):133.
  43. He L. Metformin and systemic metabolism. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(11):868–81.
  44. Yang F, et al. Metformin inhibits the NLRP3 inflammasome via AMPK/mTOR-dependent effects in diabetic cardiomyopathy. Int J Biol Sci. 2019;15(5):1010–9.
  45. Regitz-Zagrosek V, Gebhard C. Gender medicine: effects of sex and gender on cardiovascular disease manifestation and outcomes. Nat Rev Cardiol. 2023;20(4):236–47.
  46. Evrony GD, Hinch AG, Luo C. Applications of single-cell DNA sequencing. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2021;22:171–97.
  47. Verboom K, et al. Smarter single cell total RNA sequencing. Nucleic Acids Res. 2019;47(16):e93.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza cholesteroluaktywacja AMPKinhibicja HMGCRprzebudowa patologicznahomeostaza glukozy
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.