Niniejszy protokół opisuje podejścia in vivo i in vitro w celu zbadania, w jaki sposób N-laktojlofenyloalanina wpływa na cukrzycową kardiomiopatię, lipidowy metabolizm serca oraz syntezę cholesterolu, ze szczególnym uwzględnieniem szlaku kinazy białkowej aktywowanej przez adenozynomonofosforan podjednostki alfa 1/reduktazy HMG-CoA (3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
N-laktylofenyloalanina poprawia funkcję serca w mysim modelu kardiomiopatii cukrzycowej poprzez regulację metabolizmu lipidów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kardiomiopatia cukrzycowa (DCM) jest jednym z najpoważniejszych powikłań cukrzycy. N-laktylofenyloalanina (Lac-Phe), endogenny metabolit, może wspomagać utratę masy ciała i poprawiać homeostazę glukozy. Celem niniejszego badania było zbadanie efektu terapeutycznego Lac-Phe w przypadku DCM oraz dalsza analiza mechanizmu leżącego u podłoża tego działania. Myszy z cukrzycą typu 2 i DCM leczono za pomocą Lac-Phe. Lac-Phe poprawiła kurczliwość serca, łagodziła przebudowę patologiczną i zmniejszyła akumulację lipidów w sercu. In vitro efekty działania Lac-Phe badano na komórkach H9c2 stymulowanych wysokim stężeniem glukozy i kwasem palmitowym. Lac-Phe zmniejszyła akumulację lipidów poprzez ograniczenie syntezy cholesterolu w komórkach H9c2. Mechanistycznie Lac-Phe promowała fosforylację i aktywację kinazy białkowej aktywowanej przez AMP alfa 1 (AMPKα1). Następnie aktywowana AMPKα1 fosforylowała i hamowała swój cel w dół szlaku, reduktazę HMG-CoA (HMGCR), co prowadziło do zmniejszenia syntezy cholesterolu i w konsekwencji do złagodzenia zaburzeń metabolizmu lipidów w komórkach H9c2. Wyniki te wskazują, że Lac-Phe poprawia metabolizm lipidów w komórkach H9c2 w przebiegu DCM poprzez szlak AMPKα1/HMGCR, zwiększając tym samym kurczliwość serca i łagodząc przebudowę patologiczną. Lac-Phe może stanowić potencjalną metodę terapeutyczną w leczeniu kardiomiopatii cukrzycowej.
Wprowadzenie
Cukrzyca jest chorobą metaboliczną charakteryzującą się uporczywą hiperglikemią1. W ciągu ostatnich dwóch dekad cukrzyca stała się jedną z dziesięciu głównych przyczyn zgonów na całym świecie, a każdego roku z powodu cukrzycy i jej powikłań umiera ponad sześć milionów ludzi2. Kardiomiopatia cukrzycowa (DCM), patologiczny stan serca będący następstwem cukrzycy, stanowi jedno z najpoważniejszych powikłań związanych z tą chorobą3,4. Stanowi ona niezależny czynnik ryzyka niewydolności serca i charakteryzuje się strukturalnymi oraz funkcjonalnymi zmianami mięśnia sercowego5,6, w tym włóknieniem serca i hipertrofią kardiomiocytów, co ostatecznie prowadzi do dysfunkcji zarówno rozkurczowej, jak i skurczowej. Chociaż w leczeniu DCM stosuje się obecnie kilka konwencjonalnych terapii sercowo-naczyniowych, takich jak β-blokery, inhibitory konwertazy angiotensyny oraz blokery receptorów angiotensyny II typu 17,8, ich skuteczność w warunkach klinicznych pozostaje suboptimalna. Ponieważ mechanizmy leżące u podłoża DCM nie zostały jeszcze dokładnie zbadane9, obecnie brakuje jasnej strategii terapeutycznej ukierunkowanej na tę chorobę10,11. Manifestacje kliniczne DCM postępują od bezobjawowej dysfunkcji rozkurczowej we wczesnym stadium, poprzez dysfunkcję skurczową i kliniczną niewydolność serca w stadium późnym, aż po zgon12,13. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zbadania i opracowania skutecznych opcji leczenia tego stanu.
Zaburzony metabolizm lipidów jest kluczową cechą DCM14. W DCM podwyższony poziom wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) we krwi może prowadzić do nadmiernego poboru kwasów tłuszczowych przez kardiomiocyty15,16. Metabolizm kwasów tłuszczowych w kardiomiocytach zależy głównie od utleniania kwasów tłuszczowych. Z czasem utlenianie kwasów tłuszczowych w kardiomiocytach staje się niewystarczające do całkowitego zmetabolizowania wszystkich przyjętych kwasów tłuszczowych, co prowadzi do gromadzenia się nadmiaru kwasów tłuszczowych i ich metabolitów pośrednich w kardiomiocytach17. To nadmierne obciążenie lipidami indukuje lipotoksyczność, zaburza dostawy energii do mięśnia sercowego oraz nasila stres oksydacyjny i reakcje zapalne w sercu, co w konsekwencji powoduje poważne uszkodzenia kardiomiocytów18,19. W związku z tym aktywna regulacja metabolizmu lipidów w sercu może stanowić potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu DCM20.
N-laktojlo-fenyloalanina (Lac-Phe) jest endogennym metabolitem, którego stężenie gwałtownie wzrasta po wysiłku fizycznym21. Mechanistycznie Lac-Phe jest syntetyzowana przez cytozolowy enzym karnozyny dipeptydaza 2 (CNDP2) poprzez kondensację mleczanu i fenyloalaniny. Ta ścieżka biosyntetyczna jest szeroko rozpowszechniona w różnych typach komórek, w tym w makrofagach, komórkach nabłonkowych i mezenchymalnych komórkach macierzystych, które wydzielają Lac-Phe do krwiobiegu po aktywności fizycznej22. Wykazano, że przewlekłe podawanie Lac-Phe skutecznie redukuje spożycie pokarmów, zmniejsza otyłość oraz masę ciała i poprawia homeostazę glukozy21. Niedawne badanie wykazało, że Lac-Phe może poprawić zdolność metabolizmu lipidów w mikrogleju/makrofagach po urazie rdzenia kręgowego23. Co ciekawe, badania wskazują, że zarówno ostre, jak i przewlekłe podawanie metforminy, leku pierwszego rzutu w leczeniu cukrzycy typu 2, może podnosić poziom Lac-Phe oraz że Lac-Phe pośredniczy w działaniu przeciwootyłościowym metforminy22. Ponadto Sha i wsp. wykazali niedawno, że Lac-Phe łagodzi śmierć komórek mięśnia sercowego poprzez niwelowanie dysfunkcji mitochondriów, poprawiając tym samym przebieg niewydolności serca indukowanej przez poprzeczną konstrikcję aorty (TAC)24. Przedłużona hiperglikemia i otyłość są istotnymi czynnikami przyczyniającymi się do rozregulowania metabolizmu lipidów w DCM25. Podsumowując, dowody te sugerują, że Lac-Phe może mieć potencjalny efekt terapeutyczny w DCM. Jednak do tej pory rola Lac-Phe konkretnie w DCM nie została zbadana.
W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że egzogenne podawanie Lac-Phe myszom z cukrzycową kardiomiopatią skutecznie poprawiło kurczliwość serca i złagodziło patologiczne przebudowy mięśnia sercowego. Stwierdzono, że Lac-Phe poprawiło funkcję serca u myszy z DCM poprzez regulację zaburzeń metabolizmu lipidów. Lac-Phe zmniejszyło gromadzenie się kropel lipidowych (LD) w kardiomiocytach myszy z DCM oraz obniżyło zawartość cholesterolu w sercu. Pod względem mechanistycznym Lac-Phe promowało fosforylację i aktywację kinazy białkowej aktywowanej przez AMP alfa 1 (AMPKα1), co w konsekwencji prowadziło do fosforylacji reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A (HMGCR). Fosforylacja HMGCR obniża jej aktywność, co skutkuje zmniejszeniem produkcji cholesterolu i tym samym poprawą zaburzeń metabolizmu lipidów w kardiomiocytach. Wyniki te stanowią teoretyczną podstawę dla potencjalnego leczenia DCM za pomocą Lac-Phe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół badania na zwierzętach został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Etyczną Szpitala Nanjing Drum Tower (numer zatwierdzenia: 2025AE1065, 26 września 2025 r.) i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi opisanymi w Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8. wydanie), opublikowanych przez Narodowe Instytuty Zdrowia Stanów Zjednoczonych.
Zwierzęta
W badaniu wykorzystano trzydzieści 5-tygodniowych samców myszy C57BL/6J. Po jednym tygodniu adaptacji żywieniowej wszystkie myszy przebywały w warunkach z dostępem do pokarmu i wody, w cyklu dobowym 12 h dzień/noc, przy temperaturze 22°C ± 2°C i wilgotności 40%–60%. W celu stworzenia modelu mysiego DCM zastosowano dietę wysokotłuszczową (HFD) w połączeniu z niską dawką STZ (Rycina 1A). Cztery tygodnie po rozpoczęciu podawania diety wysokotłuszczowej (HFD; 60% tłuszczu, 20% białka i 20% węglowodanów), myszy poddano nocnemu głodzeniu, a następnie podano im streptozotocynę (STZ; 8 mg/mL rozpuszczona w buforze cytryścianowym, pH 4,5) poprzez wstrzyknięcie dosytronne w dawce 35 mg/kg/dobę przez trzy kolejne dni. Myszy z grupy kontrolnej otrzymywały dietę kontrolną (10% tłuszczu, 20% białka i 70% węglowodanów) oraz równoważne objętości buforu cytryścianowego. Po dodatkowych 15 tygodniach utrzymywania diety wysokotłuszczowej, myszy spełniające oba kryteria: losowe stężenie glukozy we krwi ≥13,3 mmol/L oraz frakcja wyrzutowa lewej komory (LVEF) <55%, uznano za pomyślnie stworzone modele DCM. Zweryfikowane myszy DCM ponumerowano i za pomocą tablicy liczb losowych przypisano do grup DCM oraz DCM + Lac-Phe. Około połowy myszy nie rozwinęło modelu; zwierzęta te zostały poddane eutanazji zgodnie z wymogami etycznymi dotyczącymi zwierząt. W skrócie myszy podzielono na trzy grupy: kontrolną, DCM oraz DCM + Lac-Phe (n = 10 dla każdej grupy). Wszystkie 10 myszy w każdej grupie przeszło echokardiografię, pomiar masy ciała oraz OGTT. Po 28-dniowym okresie leczenia pobrano serca do dalszych analiz. W każdej grupie znajdowało się 10 myszy. Z tej liczby trzy myszy z grupy wykorzystano do sekwencjonowania transkryptomu, trzy do transmisyjnej mikroskopii elektronowej i barwienia histologicznego, a trzy do analizy ekspresji białek. Pozostała mysz w każdej grupie została zachowana jako rezerwa. Po pomyślnym stworzeniu modelu DCM, Lac-Phe rozpuszczono w soli fizjologicznej do stężenia końcowego 10 mg/mL. Myszy w grupie DCM + Lac-Phe otrzymywały Lac-Phe dosytronnie w dawce 50 mg/kg/dobę przy objętości wstrzyknięcia 5 mL/kg, raz dziennie przez 28 kolejnych dni. Myszy w grupach kontrolnej i DCM otrzymywały równoważną objętość soli fizjologicznej jako kontrolę nośnika.
Rycina 1Lac-Phe poprawia funkcję serca i remodelowanie patologiczne u myszy z kardiomiopatią cukrzycową. (A) Schemat modelu mysiego DCM indukowanego HFD/STZ oraz protokołu leczenia Lac-Phe. (B) Masa ciała myszy w grupach kontrolnej, DCM oraz DCM + Lac-Phe podczas 4-tygodniowego okresu leczenia; n = 10 na grupę. (C) Doustny test tolerancji glukozy (OGTT) w wskazanych grupach; n = 10 na grupę. (D) Reprezentatywne obrazy echokardiograficzne w 0., 2. i 4. tygodniu leczenia. (E,F) Ilościowe oznaczenie frakcji wyrzutowej lewej komory (LVEF) (E) oraz skrócenia frakcyjnego (FS) (F); n = 10 na grupę. (G) Reprezentatywne barwienia hematoksyliną i eozyną (H&przebarwione sekcje serca. Pasek skali = 1 mm. (H,I) Reprezentatywne barwienie trichromem Massona sekcji serca (H) oraz ilościowe określenie obszaru włóknienia (I); n = 3 na grupę. Pasek skali = 50 μm(J,K) Reprezentatywne barwienie aglutyniną z zarodków pszenicy (WGA) przekrojów serca (J) oraz kwantyfikacja względnej powierzchni kardiomiocytów (K); n = 3 na grupę. Pasek skali = 20 μmDane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe P < 0.05, **P < 0.001. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Funkcja serca
Po znieczuleniu wziewnym izofluranem myszy unieruchomiono w pozycji grzbietnej na platformie z kontrolą temperatury (37°C). Wymiary lewej komory oraz prędkość przepływu krwi przez zastawkę mitralną podczas rozkurczu i skurczu zmierzono za pomocą echokardiografu wyposażonego w przetwornik 40 MHz, na podstawie których obliczono LVEF oraz frakcję skrócenia (FS). Od każdej myszy zarejestrowano trzy kolejne cykle serca.
Obróbka komórek
Komórki H9c2 hodowano w podłożu Dulbecco’s modified Eagle’s uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37°C w atmosferze z dodatkiem 5% CO₂. Przesiewanie komórek przeprowadzano co 2–3 dni po osiągnięciu 70%–80% konfluencji. Do celów eksperymentalnych komórki wysiano na szalkach 10 cm, a następnie podzielono na trzy grupy: kontrolną, grupę wysokiej zawartości glukozy/kwasu palmitynowego (HG/PA) oraz grupę HG/PA + Lac-Phe. Komórki w grupach HG/PA oraz HG/PA + Lac-Phe poddano najpierw działaniu 0,25 mM kwasu palmitynowego i 50 mM glukozy przez 24 h. Następnie komórki w grupie HG/PA + Lac-Phe traktowano 10 μg/mL Lac-Phe przez kolejne 24 h przy zachowaniu ekspozycji na HG/PA; komórki w grupie HG/PA otrzymały równą objętość PBS w tych samych warunkach HG/PA. W eksperymentach z inhibicją p-AMPK dodano 10 μM AMPK-IN-3 (rozpuszczonego w DMSO) jednocześnie z Lac-Phe na 24 h, natomiast odpowiadające im grupy kontrolne otrzymały równą objętość DMSO. W eksperymentach z atorwastatyną komórki H9c2 w warunkach HG/PA traktowano 10 μM atorwastatyny przez 24 h, samodzielnie lub w połączeniu z 10 μg/mL Lac-Phe.
Barwienie histologiczne
Po 28 dniach podawania Lac-Phe pobrano serca myszy i utrwalono przez imersję w 4% paraformaldehydzie (pH 7,4) przez 24 h. Utrwalone tkanki serca zatopiono w parafinie i pocięto na plastry o grubości 6 μm. Przekroje tkankowe zabarwiono hematoksyliną i eozyną, aglutyniną z zarodków pszenicy oraz trichromem Massona. Wszystkie procedury barwienia przeprowadzono ściśle zgodnie z protokołami producentów. Wykonano obrazowanie całych preparatów przy powiększeniu 20× przy użyciu wysokorozdzielczego mikroskopu w polu jasnym wyposażonego w system kamer cyfrowych.
Analiza Western blot
Stężenie białka określono za pomocą metody Bradforda. Lizaty tkanek rozdzielono metodą SDS-PAGE na żelach z 10% (w/v) akryloamidem, a następnie poddano elektroforetycznemu transferowi na membrany z polifluorku winylidenu. Miejsca niespecyficznego wiązania zablokowano 5% albuminą surowicy bydlęcej przez 2 h w temperaturze pokojowej. Następnie membrany inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałami pierwszorzędowymi (rozcieńczenie 1:1 000), po czym wykonano sześć przemyć w buforze TBST (po 5 min każde) na wytrząsarce. Membrany inkubowano następnie z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:5 000) przez 2 h w temperaturze pokojowej, po czym wykonano kolejne sześć przemyć w buforze TBST (po 5 min każde). Prążki białkowe zwizualizowano przy użyciu zestawu odczynników do wzmocnionej chemiluminescencji. Kwantyfikację wyników western blot przeprowadzono za pomocą analizy densytometrycznej w oprogramowaniu ImageJ. Wszystkie przeciwciała użyte w tej badaniu wyszczególniono w Table of Materials.
Transkryptomika
Całkowite RNA wyizolowano z tkanki serca myszy C57BL/6J przy użyciu odczynnika TRIzol oraz zestawów RNeasy mini. Jakość RNA oceniono za pomocą bioanalizatora 2100, co wykazało wysoką czystość i integralność RNA. Biblioteki RNA-seq przygotowano zgodnie z instrukcją zestawu VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit i zsekwencjonowano przy użyciu systemu Illumina NovaSeq 6000 (single-read, 150 bp). Geny o różnym poziomie ekspresji zidentyfikowano za pomocą programu DESeq2, przyjmując za statystycznie istotne skorygowaną wartość P < 0,05 oraz bezwzględną zmianę log₂ fold change > 1. Przeprowadzono analizę wzbogacenia Gene Ontology (GO) dla genów o różnym poziomie ekspresji, a istotność wzbogacenia tych genów w kategoriach GO obliczono przy użyciu algorytmu rozkładu hipergeometrycznego.
Barwienie Oil Red O oraz barwienie lipidów LD540
Tkankę serca zatopiono w związku OCT, a następnie pocięto na sekcje o grubości 10 μm. Mrożone sekcje pozostawiono przez 30 min w temperaturze pokojowej w celu wyrównania temperatury, a następnie utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 10 min. Po przemyciu buforem PBS sekcje umieszczono w 60% alkoholu izopropylowym na 15 s i pokryto roztworem roboczym Oil Red O na 30 min. Następnie sekcje potraktowano 60% alkoholem izopropylowym przez 15 s i trzykrotnie przemyto buforem PBS. W przypadku barwienia lipidów LD540, komórki H9c2 przemyto buforem PBS i utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 10 min w temperaturze pokojowej. Następnie komórki inkubowano z 10 μM LD540 przez 30 min w temperaturze pokojowej.
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
Świeże tkanki serca myszy pocięto na kawałki o rozmiarach 1–2 mm3, utrwalono w utrwalaczu do mikroskopii elektronowej w temperaturze 4°C przez 4 h, a następnie przemyto wodą dwukrotnie destylowaną i zanurzono w roztworach etanolu o stopniowo zwiększonym stężeniu. Próbki zatopiono, pocięto na skrawki, a następnie poddano obserwacji pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.
Zawartość cholesterolu całkowitego (TC)
Poziomy całkowitego cholesterolu (TC) w próbkach surowicy oraz komórek H9c2 zmierzono przy użyciu zestawu Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
Doustny test obciążenia glukozą (OGTT)
Myszy poddano 14-godzinnemu postowi (od 19:00 do 9:00), a następnie podano im doustnie glukozę (roztwór zapasowy 20%, 2 g/kg). Poziom glukozy we krwi oznaczano w próbkach pobranych z żyły ogonowej w 0, 15, 30, 60 i 120 min po podaniu preparatu.
Pomiar z użyciem zestawu do liczenia komórek-8 (CCK-8)
Do pomiaru żywotności komórek wykorzystano test CCK-8. Komórki H9c2 wysiano do płytek 96-dołkowych z początkową gęstością 3 × 104 komórek/dołek. Po 24 h traktowaniu różnymi stężeniami Lac-Phe w warunkach HG/PA, do 100 μL pożywki hodowlanej w każdym dołku dodano 10 μL odczynnika z zestawu, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 h. Absorbancję mierzono przy 450 nm za pomocą wielofunkcyjnego czytnika płytek mikrodołkowych w celu wyznaczenia wartości gęstości optycznej (OD).
Dokowanie molekularne
Struktury krystaliczne Lac-Phe oraz AMPKα1 pobrano z bazy PubChem26. Proces dokowania molekularnego przeprowadzono przy użyciu oprogramowania CB-DOCK227.
Analiza statystyczna
Wszystkie pomiary echokardiograficzne, barwienia histologiczne i analizy ilościowe obrazów zostały przeprowadzone przez badaczy, którzy nie znali przydziału grup. Wszystkie analizy danych wykonano przy użyciu programów Prism oraz SPSS 20.0. Każdy eksperyment powtórzono co najmniej trzy razy, a dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Homogeniczność wariancji oceniono za pomocą testu Levene'a. Normalność rozkładu potwierdzono poprzez graficzną analizę reszt. Porównania między wieloma grupami przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Tukeya dla porównań parzystych. W przypadku danych z OGTT zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA), gdzie grupę traktowano jako czynnik międzyobiektowy, a czas jako czynnik wewnątrzobiektowy, a następnie przeprowadzono test post hoc Bonferroniego. Wartość P < 0.05 uznano za istotną statystycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Lac-Phe poprawia funkcję serca u myszy z kardiomiopatią cukrzycową
Indukowaliśmy kardiomiopatię rozstrzeniową (DCM) u myszy C57BL/6J, stosując dietę wysokotłuszczową (HFD) w połączeniu z iniekcjami STZ (Rycina 1A) i losowo przydzielono myszy z pomyślnie wywołanym DCM do grupy nieleczonej (grupa DCM) oraz grupy leczonej Lac-Phe, przy czym myszy C57BL/6J służyły jako kontrola negatywna. Zgodnie z badaniem przeprowadzonym przez Li i współpracowników....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym badaniu przedstawiamy dowody potwierdzające efekt terapeutyczny Lac-Phe w DCM. Lac-Phe poprawił przebudowę serca oraz funkcję serca w DCM, redukując jednocześnie produkcję cholesterolu w kardiomiocytach i łagodząc zaburzenia metabolizmu lipidów. Pod względem mechanistycznym Lac-Phe zwiększył fosforylację AMPKα1. W konsekwencji zwiększona fosforylacja AMPKα1 wiązała się ze zwiększoną fosforylacją i inhibicją jego downstreamowego celu, HMGCR, co prowadziło do redukcji syntezy cholesterolu i ostatecznie do złag...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Konflikt interesów:
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Pragniemy wyrazić naszą szczerą wdzięczność badaczom i personelowi Clinical College w Nanjing Drum Tower Hospital oraz szpitalowi klinicznemu przy Medical School, Nanjing University, za wsparcie techniczne. Badania te były finansowane z grantów Narodowej Fundacji Nauk Naturalnych Chin (nr grantów 81870291 i 82300384), Chińskiej Fundacji Nauk Postdoktorskich (nr grantu 2023M731625) oraz Fundacji Nauk Naturalnych Prowincji Jiangsu (nr grantu BK20220175). Dziękujemy również za zasoby i wsparcie kolaboracyjne zapewnione przez Institute of Advanced Synthesis na Nanjing Tech University.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AMPK-IN-3 (inhibitor p-AMPK) | MedChemExpress (MCE) | HY-132921 | Stosowany przy 10 μM podczas eksperymentów z inhibicją AMPK w celu zahamowania sygnalizacji AMPK w komórkach traktowanych Lac-Phe. |
| Zestaw do oznaczania cholesterolu i estrów cholesterylu Amplex Red | Beyotime | S0211S | Stosowany do oznaczenia całkowitego poziomu cholesterolu w próbkach surowicy oraz komórek H9c2. |
| przeciw-AMPKα1 | Technologia sygnalizacji komórkowej | 2532; RRID: AB_330331 | Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy AMPK metodą western blotα1. |
| przeciw-GAPDH | Technologia sygnalizacji komórkowej | 5174; RRID: AB_10622025 | Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy GAPDH metodą western blot. |
| anty-HMGCR | Abcam | ab174830; RRID: AB_2749818 | Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy HMGCR metodą western blot. |
| Przeciwciało anty-p-AMPKα1 (Thr172) | Technologia sygnalizacji komórkowej | 2535; RRID: AB_331250 | Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy western blot fosforylowanej kinazy AMPKα1. |
| Przeciwciało anty-p-HMGCR (Ser872) | Abcam | ab124350 | Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy western blot fosforylowanego HMGCR. |
| Przeciwciało anty-IgG królicze, sprzężone z HRP | Technologia sygnałowania komórkowego | 7074; RRID: AB_2099233 | Stosowany w rozcieńczeniu 1:5 000 do detekcji w technice western blot. |
| Przeciw-β$\alpha$-tubulina | Technologia sygnalizacji komórkowej | 2128; RRID: AB_823664 | Przeciwciało pierwszorzędowe użyte do analizy western blot w celu oznaczenia β-tubulina. |
| Atorwastatyna | MedChemExpress (MCE) | HY-17379 | Stosowany samodzielnie lub w połączeniu z Lac-Phe w celu oceny wpływu na akumulację lipidów, całkowity poziom cholesterolu oraz fosforylację HMGCR w komórkach H9c2 traktowanych HG/PA. |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A7906 | Stosowane w stężeniu 5% w celu zablokowania nieswoistego wiązania podczas analizy western blot. |
| Odczynnik/zestaw do oznaczenia metodą Bradforda | Thermo Fisher Scientific | 23200 | Stosowane do oznaczenia stężenia białka przed analizą western blot. |
| myszy C57BL/6J (5-tygodniowe, samce) | Centrum Badań nad Modelami Zwierzęcymi Uniwersytetu w Nankinie | N/A | Wykorzystywane do stworzenia mysiego modelu kardiomiopatii cukrzycowej indukowanej dietą wysokotłuszczową (HFD) oraz streptozotocyną (STZ). |
| Zestaw do zliczania komórek-8 (CCK-8) | Sharebio | SB-CCK8S | Stosowane do pomiaru żywotności komórek H9c2 po przeprowadzeniu zabiegu. |
| Bufor cytrynianowy | Przygotowano we własnym zakresie | Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski. | Przygotowano w pH 4,5 i użyto do rozpuszczenia STZ oraz jako odpowiednią kontrolę nośnika. |
| Dieta kontrolna (10% tłuszczu, 20% białka, 70% węglowodanów) | Research Diets, Inc. | D12450J | Stosowana jako dieta dla myszy z grupy kontrolnej. |
| D-(+)-glukoza | Sigma-Aldrich | Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które mają zostać przetłumaczone z języka angielskiego na język polski. | Stosowane do traktowania komórek HG/PA oraz do testu doustnej próby obciążenia glukozą. |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Stosowany jako rozpuszczalnik dla AMPK-IN-3 oraz jako odpowiadająca mu kontrola nośnika. |
| Dulbecco’zmodyfikowana pożywka Eagle’pożywka s | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Stosowane jako podstawowe pożywka hodowlana dla komórek H9c2. |
| Echinokardiograf z przetwornikiem 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 3100 LT; przetwornik 40 MHz | Stosowane do pomiaru wymiarów lewej komory oraz prędkości przepływu krwi przez zastawkę mitralną, a także do wyznaczenia LVEF i FS. |
| Fiksatyw do mikroskopu elektronowego | ServiceBio | G1102 | Stosowane do utrwalania świeżej tkanki serca myszy do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Stosowane w stopniowo zwiększanych stężeniach do odwadniania podczas przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. |
| Płodowa surowica bydlęca | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10099141 | Stosowane w stężeniu 10% jako dodatek do pożywki hodowlanej komórek H9c2. |
| Linia komórkowa H9c2 | Sunncell | RRID: CVCL_0286 | Wykorzystywany jako in vitro model komórek sercowych w eksperymentach z zastosowaniem HG/PA oraz Lac-Phe. |
| Barwienie hematoksyliną i eozyną | ServiceBio | G1005-1/2 | Stosowane do oceny histologicznej tkanki serca. |
| Dieta wysokotłuszczowa (60% tłuszczu w przeliczeniu na kcal) | Research Diets, Inc. | D12492 | Stosowane wraz z niską dawką STZ w celu stworzenia mysiego modelu kardiomiopatii cukrzycowej. |
| Mikroskop w polu jasnym o wysokiej rozdzielczości | Leica | DM2500 | Stosowane do obrazowania całych preparatów barwionej tkanki serca przy powiększeniu 20x× powiększenie |
| ImageJ | National Institutes of Health | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | Stosowane do densytometrycznej kwantyfikacji wyników western blot. |
| Izofluran | Sigma-Aldrich | 792632 | Stosowane do znieczulenia podczas echokardiografii u myszy. |
| Alkohol izopropylowy | Sigma-Aldrich | I9516 | Stosowane w stężeniu 60% podczas barwienia Oil Red O zamrożonych przekrojów serca. |
| Barwienie lipidów LD540 | Beyotime | C2050S-1 | Stosowane przy 10 μM do barwienia lipidów wewnątrzkomórkowych. |
| Masson’barwienie trichromowe Massona | ServiceBio | G1006 | Stosowane do barwienia histologicznego tkanki serca. |
| N-laktoilofenyloalanina (Lac-Phe) | MedChemExpress (MCE) | HY-146098 | Podawano myszom z DCM i stosowano w celu leczenia komórek H9c2 poddanych działaniu HG/PA. |
| roztwór roboczy Oil Red O | ServiceBio | G1015-100ML | Stosowane do barwienia lipidów w mrożonych przekrojach tkanki serca. |
| Zestaw do wydajnej chemiluminescencji Omni-ECL | EpiZyme | SQ203L | Stosowany do chemiluminescencyjnej wizualizacji prążków białkowych po przeprowadzonym western blottingu. |
| Kwas palmitynowy | Sigma-Aldrich | P0500 | Stosowane w stężeniu 0,25 mM wraz z wysokim stężeniem glukozy w celu stworzenia modelu komórek H9c2 traktowanych HG/PA. |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | Przygotowany jako roztwór 4% i stosowany do utrwalania tkanki oraz komórek serca przed barwieniem histologicznym lub lipidowym. |
| Penicylina-streptomycyna | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Stosowane w stężeniu 1% w pożywce do hodowli komórek H9c2. |
| bufor fosforanowo-solny (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Stosowany do płukania podczas procedur barwienia oraz jako odpowiedni nośnik w eksperymentach z traktowaniem komórek. |
| Prism | Oprogramowanie GraphPad | Wersja 8.0 | Stosowane do analizy statystycznej danych eksperymentalnych. |
| membrana transferowa z PVDF, 0.45 μm | Thermo Fisher Scientific | 88518 | Stosowany do elektroforetycznego przeniesienia białek podczas analizy western blot. |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | Stosowany do izolacji/oczyszczania całkowitego RNA z tkanki serca myszy. |
| Roztwór chlorku sodu, 0,9% (sól fizjologiczna) | Sigma-Aldrich | S8776 | Stosowany do rozpuszczania Lac-Phe oraz jako kontrola nośnika dla myszy z grupy kontrolnej i grupy DCM. |
| SPSS | IBM | Wersja 20.0 | Stosowane do analizy statystycznej danych eksperymentalnych. |
| Streptozotocyna (STZ) | Sigma-Aldrich | S0130 | Podawano wraz z dietą wysokotłuszczową (HFD) w celu stworzenia mysiego modelu kardiomiopatii cukrzycowej. |
| Bufor TBS z Tween-20 (20×) | Thermo Fisher Scientific | 28360 | Stosowany do płukania membran po inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi podczas analizy western blot. |
| Związek Tissue-Tek O.C.T. | Sakura Finetek | 4583 | Stosowane do zatapiania tkanki serca przed przygotowaniem skrawków mrożonych do barwienia Oil Red O. |
| Mikroskop elektronowy transmisyjny | HITACHI | HT7800 | Stosowane do badania zmian ultrastrukturalnych w tkance serca myszy. |
| Odczynnik TRIzol | Invitrogen | 15596026 | Stosowane do izolacji całkowitego RNA z tkanki serca myszy. |
| Zestaw do przygotowania bibliotek RNA-seq VAHTS Universal V10 | Vazyme | NR616-01 | Stosowane do przygotowania bibliotek RNA-seq do analizy transkryptomicznej. |
| Lektyna z kiełków pszenicy (WGA) | ServiceBio | W7024 | Stosowane do oceny histologicznej tkanki serca. |
Bibliografia
- Pan KL, Hsu YC, Chang ST, Chung CM, Lin CL. The role of cardiac fibrosis in diabetic cardiomyopathy: from pathophysiology to clinical diagnostic tools. Int J Mol Sci. 2023;24(10):8604.
- Saeedi P, et al. Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edition. Diabetes Res Clin Pract. 2019;157:107843.
- Zou R, et al. PGAM5-mediated PHB2 dephosphorylation contributes to diabetic cardiomyopathy by disrupting mitochondrial quality surveillance. Research. 2022;2022:0001.
- Jia G, DeMarco VG, Sowers JR. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in diabetic cardiomyopathy. Nat Rev Endocrinol. 2016;12(3):144–53.
- Low Wang CC, Hess CN, Hiatt WR, Goldfine AB. Clinical update: cardiovascular disease in diabetes mellitus: atherosclerotic cardiovascular disease and heart failure in type 2 diabetes mellitus—mechanisms, management, and clinical considerations. Circulation. 2016;133(24):2459–502.
- Liu P, Zhang Z, Chen H, Chen Q. Pyroptosis: mechanisms and links with diabetic cardiomyopathy. Ageing Res Rev. 2024;94:102182.
- Park JJ. Epidemiology, pathophysiology, diagnosis and treatment of heart failure in diabetes. Diabetes Metab J. 2021;45(2):146–57.
- Gilca GE, et al. Diabetic cardiomyopathy: current approach and potential diagnostic and therapeutic targets. J Diabetes Res. 2017;2017:1310265.
- Nakamura K, et al. Pathophysiology and treatment of diabetic cardiomyopathy and heart failure in patients with diabetes mellitus. Int J Mol Sci. 2022;23(7):3587.
- Han X, et al. Cardiomyocyte OTUD1 drives diabetic cardiomyopathy via directly deubiquitinating AMPKα2 and inducing mitochondrial dysfunction. Nat Commun. 2025;16(1):666.
- Jia G, Hill MA, Sowers JR. Diabetic cardiomyopathy: an update of mechanisms contributing to this clinical entity. Circ Res. 2018;122(4):624–38.
- Yao Y, Yang B, Shi J. TiO(x)(OH)(4-2x) nanosheets with catalytic antioxidative activity alleviate oxidative injury in diabetic cardiomyopathy. J Am Chem Soc. 2025;147(4):3885–95.
- Seferovic PM, et al. Diabetic myocardial disorder: a clinical consensus statement of the Heart Failure Association of the ESC and the ESC Working Group on Myocardial & Pericardial Diseases. Eur J Heart Fail. 2024;26(9):1893–903.
- Wang H, et al. Inhibition of fatty acid uptake by TGR5 prevents diabetic cardiomyopathy. Nat Metab. 2024;6(6):1161–77.
- Zhao Y, et al. Ferroptosis: roles and molecular mechanisms in diabetic cardiomyopathy. Front Endocrinol. 2023;14:1140644.
- Nakamura M. Lipotoxicity as a therapeutic target in obesity and diabetic cardiomyopathy. J Pharm Pharm Sci. 2024;27:12568.
- Nakamura M, et al. Glycogen synthase kinase-3α promotes fatty acid uptake and lipotoxic cardiomyopathy. Cell Metab. 2019;29(5):1119–34.e12.
- Ritchie RH, Abel ED. Basic mechanisms of diabetic heart disease. Circ Res. 2020;126(11):1501–25.
- Thakur M, Tupe RS. Lipoxin and glycation in SREBP signaling: insight into diabetic cardiomyopathy and associated lipotoxicity. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2023;164:106698.
- Dhar A, et al. A comprehensive review of the novel therapeutic targets for the treatment of diabetic cardiomyopathy. Ther Adv Cardiovasc Dis. 2023;17:17539447231210170.
- Li VL, et al. An exercise-inducible metabolite that suppresses feeding and obesity. Nature. 2022;606(7915):785–90.
- Xiao S, et al. Lac-Phe mediates the effects of metformin on food intake and body weight. Nat Metab. 2024;6(4):659–69.
- Ying W, et al. N-lactoyl-phenylalanine modulates lipid metabolism in microglia/macrophage via the AMPK-PGC1α-PPARγ pathway to promote recovery in mice with spinal cord injury. J Neuroinflammation. 2025;22(1):167.
- Sha L, et al. N-Lac-Phe ameliorates myocardial cell death by improving mitochondrial dysfunction, ultimately improving TAC-induced heart failure. Cardiovasc Drugs Ther. 2026;40:1391–401.
- Ke J, Pan J, Lin H, Gu J. Diabetic cardiomyopathy: a brief summary on lipid toxicity. ESC Heart Fail. 2023;10(2):776–90.
- PubChem. PubChem. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/. Accessed August 15, 2026.
- Liu Y, Yang X, Gan J, et al. CB-Dock2: improved protein-ligand blind docking by integrating cavity detection, docking and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W159–W164.
- GeneCards. GeneCards: the Human Gene Database. Version 6.1, June 17, 2026.
- Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules. Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W357–W364.
- Jo Y, DeBose-Boyd RA. Post-translational regulation of HMG CoA reductase. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2022;14(12):a041253.
- Steinberg GR, Hardie DG. New insights into activation and function of the AMPK. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(4):255–72.
- Istvan ES, Deisenhofer J. Structural mechanism for statin inhibition of HMG-CoA reductase. Science. 2001;292(5519):1160–4.
- Beaudry D, et al. Statin therapy in cardiovascular diseases other than atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 2007;9(1):25–32.
- Koch CG. Statin therapy. Curr Pharm Des. 2012;18(38):6284–90.
- Dewanjee S, et al. Autophagy in the diabetic heart: a potential pharmacotherapeutic target in diabetic cardiomyopathy. Ageing Res Rev. 2021;68:101338.
- Madonna R, et al. Empagliflozin inhibits excessive autophagy through the AMPK/GSK3β signalling pathway in diabetic cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2023;119(5):1175–89.
- Madhavi YV, et al. Targeting AMPK in diabetes and diabetic complications: energy homeostasis, autophagy and mitochondrial health. Curr Med Chem. 2019;26(27):5207–29.
- Fang C, et al. The AMPK pathway in fatty liver disease. Front Physiol. 2022;13:970292.
- Liu S, et al. AICAR-induced activation of AMPK inhibits TSH/SREBP-2/HMGCR pathway in liver. PLoS One. 2015;10(5):e0124951.
- Zhou H, et al. Empagliflozin rescues diabetic myocardial microvascular injury via AMPK-mediated inhibition of mitochondrial fission. Redox Biol. 2018;15:335–46.
- Lu QB, et al. METRNL ameliorates diabetic cardiomyopathy via inactivation of cGAS/STING signaling dependent on LKB1/AMPK/ULK1-mediated autophagy. J Adv Res. 2023;51:161–79.
- Wang D, et al. FGF1(ΔHBS) prevents diabetic cardiomyopathy by maintaining mitochondrial homeostasis and reducing oxidative stress via AMPK/Nur77 suppression. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):133.
- He L. Metformin and systemic metabolism. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(11):868–81.
- Yang F, et al. Metformin inhibits the NLRP3 inflammasome via AMPK/mTOR-dependent effects in diabetic cardiomyopathy. Int J Biol Sci. 2019;15(5):1010–9.
- Regitz-Zagrosek V, Gebhard C. Gender medicine: effects of sex and gender on cardiovascular disease manifestation and outcomes. Nat Rev Cardiol. 2023;20(4):236–47.
- Evrony GD, Hinch AG, Luo C. Applications of single-cell DNA sequencing. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2021;22:171–97.
- Verboom K, et al. Smarter single cell total RNA sequencing. Nucleic Acids Res. 2019;47(16):e93.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny