Artykuł metodologiczny

Pomiar naprawy pęknięć dwuniciowych DNA przy użyciu testu DR-white u Drosophila melanogaster

55 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/72635

⸱

14 sierpnia 2026

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

W tym artykule

Podsumowanie

Test DR-white jest wszechstronnym testem z reporterem genetycznym służącym do wykrywania wyników naprawy pęknięć dwuniciowych DNA u organizmu wielokomórkowego Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Tradycyjne badania nad naprawą pęknięć obu nici DNA (DSB) są często ograniczone do analiz biochemicznych lub systemów jednokomórkowych (np. komórek, drożdży). Aby ułatwić badanie naprawy DSB w organizmie wielokomórkowym, stosujemy test DR-white u Drosophila melanogaster. Test DR-white jest prostym, a zarazem wszechstronnym testem reporterowym naprawy DSB, który zawiera pojedynczą sekwencję rozpoznawaną przez I-SceI, mogącą zostać przeciętą poprzez ekspresję meganukleazy I-SceI. Ekspresja I-SceI może być indukowana konstytutywnie, za pomocą szoku termicznego lub pod kontrolą innych promotorów, co umożliwia badanie naprawy specyficznej dla tkanki lub etapu rozwoju. Główną zaletą tego testu jest możliwość rozróżnienia wyników naprawy obejmujących rekombinację homologiczną (HR), niespecyficzne łączenie końców (NHEJ) oraz SSA (single-strand annealing). Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy protokół uznanego testu DR-white, w tym opis krok po kroku procesu indukowania DSB w linii zarodkowej przedmeiotycznej i fenotypowej analizy zdarzeń naprawczych poprzez ocenę potomstwa. Opisano w nim również molekularną analizę zdarzeń naprawczych za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), sekwencjonowania oraz skryptu R TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition). Protokół ten stanowi przydatne narzędzie do badania genetycznych i molekularnych mechanizmów naprawy DNA w modelu organizmalnym.

Wprowadzenie

Integralność genomu jest często wystawiana na próbę przez uszkodzenia DNA, wśród których szczególnie toksyczne są pęknięcia dwuniciowe (DSBs). Jeśli nie zostaną one naprawione, mogą prowadzić do utraty materiału genetycznego, przetasowań chromosomalnych oraz śmierci komórki1. W związku z tym komórki wyewoluowały wiele szlaków naprawy DSBs. Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) bezpośrednio liguje dwa końce DSB, co może prowadzić do powstania indeli w miejscu pęknięcia; SSA (single-strand annealing) wykorzystuje komplementarne sekwencje flankujące miejsce pęknięcia do jego naprawy, co skutkuje delecjami w miejscu pęknięcia; natomiast rekombinacja homologiczna (HR) wykorzystuje sekwencję homologiczną jako matrycę do naprawy2,3.

Historycznie badania nad naprawą DSB ograniczały się do testów biochemicznych4 lub systemów jednokomórkowych, takich jak bakterie5,6, drożdże7,8 oraz hodowle komórkowe ssaków9,10. Chociaż modele te miały kluczowe znaczenie dla identyfikacji głównych białek naprawczych i ich mechanizmów, brakuje im złożoności biologicznej organizmu wielokomórkowego. Drosophila melanogaster stała się popularnym wielokomórkowym systemem modelowym do badania naprawy DNA. Jednak wiele obecnie stosowanych testów jest dostosowanych do konkretnych szlaków naprawczych11; wykorzystuje duże aberracje chromosomalne, takie jak wycięcie elementu P12; lub wymaga czasochłonnych analiz molekularnych13. Test DR-white rozwiązuje te problemy, zapewniając prosty genetyczny reporter naprawy DNA u Drosophila14. Niniejsza praca przedstawia kompletny, praktyczny i szczegółowy protokół krok po kroku wykonywania testów genetycznych i molekularnych w celu pomiaru naprawy DSB w DNA z wykorzystaniem ugruntowanego testu DR-white.

Test wykorzystuje dwie bezpośrednie powtórzenia sekwencji Muszka owocówka biały (wgen, który warunkuje czerwony kolor oczu typu dzikiego (Rycina 1). Obie kopie są niefunkcjonalne: pierwsza, Sce.whitezawiera insercję przenoszącą sekwencję rozpoznawania meganukleazy I-SceI w obrębie miejsca SacI typu dzikiego i wprowadzającą przedwczesny kodon stop; drugi, iwhite, jest skrócony zarówno na końcu 5’, jak i 3’ i służy jako matryca dla naprawy HR. A Muszka owocówka żółty transgen (y+), który odpowiada za brązowy kolor ciała typu dzikiego, znajduje się pomiędzy tymi dwiema biały powtórzenia. Ponieważ DR-biały kaseta zostaje zintegrowana z y w tło mutantów, DR-biały muchy wykazują fenotyp dzikiego typu w postaci brązowego ciała oraz fenotyp mutanta w postaci białych oczu.

DSB można indukować w obrębie Sce.white poprzez krzyżowanie much DR-white z muchami niosącymi transgen I-SceI. Naprawę DSB w linii zarodkowej przedmeiotycznej można zmierzyć poprzez ocenę potomstwa z krzyżówki testowej. Naprawa drogą NHEJ prowadzi do fenotypu rodzicielskiego: brązowego ciała i białych oczu (Rycina 1A), natomiast naprawa drogą HR przywraca sekwencję white typu dzikiego, co skutkuje potomstwem o brązowym ciele i czerwonych oczach (Rycina 1B). Naprawa DSB drogą SSA lub crossing-over mitotyczny prowadzą do utraty pośredniczącego transgenu yellow, co skutkuje muchami o żółtym ciele i białych oczach (Rycina 1C). Aby przeanalizować wyniki naprawy w komórkach somatycznych, zaadaptowaliśmy algorytm Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) w celu wykrywania naprawy NHEJ z przetwarzaniem końców oraz naprawy HR specjalnie dla testu DR-white 15,16.

Test DR-white oferuje kilka zalet w porównaniu do wcześniej opracowanych testów naprawy DNA u Drosophila. Ponieważ pęknięcia są generowane i naprawiane w linii zarodkowej, wyniki naprawy można łatwo wykryć za pomocą analizy fenotypowej. Jednocześnie test ten jest niezwykle wszechstronny. Choć został on zaprojektowany przede wszystkim do pomiaru naprawy HR, może wykrywać wszystkie trzy szlaki naprawy. Opracowaliśmy również dwa dodatkowe, funkcjonalne matryce naprawcze (Rysunek 2). Matryca iwhite.mu zawiera 28 cichych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) i również daje potomstwo z czerwonymi oczami (Rysunek 2A), co ułatwia badania długości odcinków konwersji genowej (GCT) oraz naprawy HR między zróżnicowanymi sekwencjami14. Matryca iwhiteΔ9 zawiera delecję dziewięciu par zasad w miejscu SacI typu dzikiego i daje potomstwo z pomarańczowymi oczami (Rysunek 2B). Cecha ta pozwala badaczom śledzić naprawę HR z różnych matryc, co jest funkcją unikalną dla testu DR-white15.

Protokół

1. Analiza DR-white

  1. Krzyżówki genetyczne (Rysunek 3A)
    UWAGA: W celu zapoznania się ze standardowymi protokołami hodowli i genetyki Drosophila, należy odnieść się do publikacji "Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics" autorstwa Ralpha J. Greenspana17. Informacje o genotypach szczepów znajdują się w Tabeli materiałów.
    1. Utrzymywać muchy w temperaturze 25 °C w 12-godzinnych cyklach światło/ciemność na standardowej pożywce dla Drosophila, posypanej aktywnymi drożdżami.
    2. Przygotować pięć fiolek do szoku termicznego poprzez skrzyżowanie 8–10 dziewiczych samic DR-white z 3–5 samcami niosącymi transgen I-SceI (Krzyżówka 1, Rysunek 3A) w każdej fiolce.
      UWAGA: W zależności od zastosowania można wykorzystać różne transgeny I-SceI . W niniejszym protokole do indukcji szokiem termicznym wykorzystano transgen hsp70-I-SceI11. Aby zapobiec nieszczelnej ekspresji I-SceI w poprzednich pokoleniach, ważne jest, aby transgeny DR-white i I-SceI zostały połączone w jednej musze tylko w tym pokoleniu.
    3. Tego samego dnia przygotować butelki do namnażania szczepu y w. Będą one służyć jako muchy testerowe. Trzy butelki do namnażania są wystarczające dla około 60–80 krzyżówek testerowych.
    4. Hodować fiolki do szoku termicznego i butelki do namnażania y w w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
    5. Trzeciego dnia przenieść muchy z fiolek do szoku termicznego oraz z butelek do namnażania y w na świeżą pożywkę, aby służyły jako zestaw zapasowy.
  2. Szok termiczny/indukcja DSB
    UWAGA: Jeśli nie używa się transgenu I-SceI indukowanego szokiem termicznym, należy przejść do kroku 1.2.5, który zazwyczaj wykonuje się 3 dni po kroku 1.1.5.
    1. Inkubować fiolki do szoku termicznego przez 3 h w 25 °C, aby upewnić się, że całe potomstwo przeszło przez przejście matczyno-zygotyczne.
    2. Poddać oryginalne fiolki szokowi termicznemu w kąpieli wodnej o temperaturze 38 °C przez 1 h. Należy upewnić się, że poziom wody sięga przynajmniej do dołu kuli bawełnianej, aby larwy nie wyczołgały się powyżej linii wody.
    3. Kontrolować temperaturę kąpieli wodnej co 15 min i utrzymywać ją w zakresie 38 ± 0.5 °C, ponieważ wyniki indukcji i naprawy zależą od czasu trwania i temperatury szoku termicznego.
    4. Przenieść fiolki z powrotem do 25 °C.
    5. Następnego dnia dodać do pożywki 1/3 złożonej chusteczki laboratoryjnej, aby wchłonęła nadmiar wilgoci. Jeśli pożywka jest sucha, dodać do chusteczki laboratoryjnej około 100 µL wody. Do butelek do namnażania y w dodać kulkę bawełnianą.
    6. Hodować fiolki poddane szokowi termicznemu przez kolejne 6 dni w 25 °C lub do momentu rozpoczęcia eklozji much.
    7. Oczyścić fiolki zapasowe i butelki do namnażania 3 dni po przeniesieniu. Do zapasowych butelek do namnażania y w dodać kulkę bawełnianą około 4 dni po oczyszczeniu.
      UWAGA: W razie potrzeby fiolki zapasowe można poddać szokowi termicznemu zgodnie z krokami od 1.2.1 do 1.2.6 i przetwarzać zgodnie z opisem poniżej.
  3. Krzyżówki testerowe
    1. Zbierać muchy poddane szokowi termicznemu, niosące transgeny DR-white i I-SceI, przez 4–5 dni po rozpoczęciu eklozji, aby zminimalizować błąd wynikający z etapu rozwoju.
      UWAGA: Muchy poddane pomyślnemu szokowi termicznemu, niosące transgeny DR-white i I-SceI, wykazują mozaikowatość oczu z powodu procesów naprawy w stadium embrionalnym i larwalnym, które rozwinęły się w tkanki dorosłe. Zakres mozaikowatości nie zawsze koreluje z procesami naprawy w linii zarodkowej, a zatem nie powinien być czynnikiem decydującym przy wyborze much eksperymentalnych do krzyżówek testerowych (krok 1.3.3).
    2. Zbierać dziewicze samice y w przez 5 dni. Zbierać 5 dziewiczych samic na każdą przewidywaną liczbę próbek. Zbierać z zapasowych butelek do namnażania, gdy tylko rozpocznie się eklozja.
    3. Przygotować fiolki testerowe, krzyżując jednego samca poddanego szokowi termicznemu z 4–5 dziewiczymi samicami y w (Krzyżówka 2; Rysunek 3A). Samce należy wybierać losowo z połączonej kolekcji z kroku 1.3.1, aby zminimalizować błąd wynikający z etapu rozwoju. Hodować krzyżówki testerowe w 25 °C.
      UWAGA: Aby uniknąć crossing-over między DR-white a I-SceI, najczęściej analizuje się linie zarodkowe samców; można jednak analizować również potomstwo żeńskie. W przypadku analizy potomstwa żeńskiego, fiolki testerowe dla Krzyżówki 2 przygotowuje się w stosunku 2:5 (samice:y w samce) i hoduje przez 5–6 dni (następny krok), aby zapewnić produktywność.
    4. Sprawdzić produktywność 4 dni po przygotowaniu fiolek testerowych, aby ocenić, kiedy należy je oczyścić.
      UWAGA: Potwierdzić, że zniesiono wystarczającą liczbę jaj, aby zapewnić co najmniej 20 mierzalnych potomków, ale nie dopuścić do przeludnienia hodowli, gdyż muchy mogą utknąć w pożywce.
    5. Gdy fiolki testerowe będą gotowe (do 4–5 dni po ustanowieniu krzyżówek testerowych), usunąć muchy i dodać do pożywki 1/3 złożonej chusteczki laboratoryjnej, aby wchłonęła nadmiar wilgoci.
      UWAGA: Na tym etapie można zebrać samce, jeśli wymagane są dalsze analizy (np. genotypowanie molekularne).
    6. Hodować fiolki testerowe przez kolejne 5–6 dni w 25 °C.
  4. Ocenianie
    UWAGA: Dla każdego warunku w każdym eksperymencie genetycznym (np. mutanty homozygotyczne i kontrole heterozygotyczne) przygotowuje się około 25 fiolek testerowych. Każdy eksperyment genetyczny powtarza się 2–3 razy, a dane z poszczególnych fiolek są łączone.
    1. Oceniać potomstwo z Krzyżówki 2 (Rysunek 3A) przez około 9 dni po tym, jak pierwsze muchy zaczną przechodzić eklozję.
    2. Zanurzyć muchy w narkozie za pomocą CO2 lub poprzez przeniesienie much do pustej fiolki bez pożywki i zamrożenie w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 min.
      UWAGA: Jeśli muchy zostaną zamrożone, można je oceniać nawet kilka dni później.
    3. Umieścić muchy na podkładce do much i ocenić odpowiednie fenotypy (Rysunek 3A). Do zestawu danych włączyć tylko fiolki, w których oceniono co najmniej 20 much.
      1. Aby ocenić, najpierw należy wyselekcjonować muchy niosące kasetę DR-white (wykorzystując fluorescencję białka czerwonego [RFP+] jako marker), a następnie ocenić kolor oczu i ciała.
      2. Transgen y+ powiązany z kasetą DR-white skutkuje pośrednim brązowym kolorem ciała, który nie jest w pełni typem dzikim. Aby odróżnić brak DSB/NHEJ (brązowe ciało; y+ w-) od SSA (żółte ciało; y- w-), należy porównać muchy z potomstwem y w, które nie posiadają chromosomu DR-white (RFP-). Zdarzenia SSA będą miały taki sam żółty kolor jak te muchy. Muchy, które są ciemniejsze (bardziej brązowe) od nich, oceniać jako brak DSB/NHEJ.
        UWAGA: Odchylenia od fenotypów opisanych na Rysunku 3A  mogą sugerować kontaminację; taka fiolka nie powinna być oceniana. Choć można oceniać całe martwe muchy, muchy uszkodzone należy odrzucić, jeśli nie można określić ich fenotypu.

2. Analiza TIDE (Rycina 4)

  1. Ekstrakcja genomowego DNA (gDNA)18
    1. Zebrać poddane szokowi termicznemu muchy (lub larwy) niosące oba DR-biały i I-SceI transgen, jak w potomstwie z krzyżówki 1 (Rysunek 3A).
    2. Umieść pojedyncze muchy w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i zamroź szokowo (np. w kąpieli z suchego lodu i etanolu lub w ciekłym azocie).
      UWAGA: Podczas pracy z suchym lodem, ciekłym azotem, etanolem, izopropanolem i innymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej oraz przestrzegać instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa.
      PUNKT PRZERWY:  Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C i przetworzyć później w razie potrzeby. W przypadku analizy much lub larw należy użyć jednej muchy lub larwy na próbkę. W przypadku analizy mniejszych tkanek (np. mózgów, tarczek imaginalnych) należy połączyć próbki, aby zwiększyć wydajność DNA.
    3. Każdą próbkę należy homogenizować w 50 µL Buforu A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA]; 100 mM chlorku sodu; 0,5% dodecylosiarczanu sodu [SDS]) przy użyciu homogenizatora elektrycznego.
    4. Inkubować próbki w łaźni wodnej w temperaturze 65 °C przez 30 min.
    5. Do każdej próbki należy dodać 100 µL buforu B (1,4 M octanu potasu, 4,3 M chlorku litu) i krótko wymieszać, odwracając probówki.
      UWAGA: W przypadku użycia całych much może być wymagana większa objętość w celu pełnej homogenizacji próbek. W takim przypadku należy zachować stosunek objętościowy Buforu A do Buforu B wynoszący 1:2.
    6. Inkubować próbki w lodzie przez co najmniej 30 min.
    7. Wirować próbki przy prędkości około 16 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
    8. Przenieść 125 µL klarownego supernatantu do nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Należy unikać przenoszenia osadu.
    9. Do każdych 125 µL supernatantu dodać 100 µL 100% izopropanolu w temperaturze pokojowej i krótko wymieszać, odwracając probówki.
    10. Wiruj próbki przy prędkości około 16 000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    11. Odssać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu DNA.
      UWAGA: Osad DNA może nie być widoczny na tym etapie. Należy zapamiętać orientację probówek podczas umieszczania ich w mikrocentryfudze i aspirować z przeciwległej strony miejsca, w którym spodziewa się obecności osadu.
    12. Przemyj osady 250 µL lodowatego 70% etanolu, a następnie krótko wymieszaj, delikatnie odwracając probówki.
    13. Odwiruj próbki przy prędkości około 16 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    14. Odssać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu.
      UWAGA: Osad może być bardziej widoczny po przemyciu etanolem. Jeśli nie, zobacz Uwaga do kroku 2.1.11.
    15. Pozostawić probówki niezakorkowane w temperaturze pokojowej, aby odparować pozostały etanol. Należy unikać nadmiernego wysuszenia osadu, ponieważ może on nie ulec całkowitej rekonstytucji.
    16. Należy dodać 20 µL wody wolnej od nukleaz i pozostawić osady do rekonstytucji przez noc w temperaturze 4 °C.
      PRZERWA: Jeśli osad DNA nie rozpuścił się całkowicie, można dodać dodatkową ilość wody.
    17. Następnego dnia należy delikatnie odwrócić probówki i zmierzyć stężenie DNA. Jeśli próbki nie są przetwarzane natychmiast, należy przechowywać je w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: W przypadku ekstrakcji z pojedynczej muchy wydajność wynosi zazwyczaj około 100 ng/µL. Istotne jest pozyskanie próbek wysokiej jakości. A260/A280 absorbancja powinna mieścić się w przedziale od 1,7 do 2,0. Wartości poza tym zakresem sugerują obecność zanieczyszczeń, takich jak białka. A260/A230 powinna mieścić się w przedziale od 2,0 do 2,2. Wartości spoza tego zakresu wskazują na obecność zanieczyszczeń, takich jak etanol i sole buforowe. Próbki o niższej wydajności i słabej jakości mogą prowadzić do nieefektywnej amplifikacji PCR.
  2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
    1. Amplifikować w obrębie Sce.white metodą PCR przy użyciu 100 ng gDNA oraz starterów DR-biały_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) i DR-biały_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) zgodnie z instrukcjami producenta. Należy dołączyć DR-biały próbka much kontrolnych (tj. DR-biały stado rodzicielskie, bez I-SceI transgen obecny). Zastosować następujące warunki cyklowania: 94 °C przez 3 min; {94 °C przez 30 s; touchdown w 66 °C (-0,5 °C / cykl) przez 30 s; 72 °C przez 30 s} x 16 cykli; {94 °C przez 30 s; 58 °C przez 30 s; 72 °C przez 30 s} x 20 cykli; 72 °C przez 5 min; utrzymywać w 12 °C.
      UWAGA: W przypadku zastosowania innego odczynnika może być konieczna korekta warunków cyklicznych.
    2. Nanieś około 2 µL produktu PCR na diagnostyczny żel agarozowy 1% w buforze tris-octan-EDTA (TAE), aby potwierdzić amplifikację Sce.białyOczekiwana wielkość amplikonu wynosi około 1,7 kb.
    3. Oczyszczanie produktów PCR Sce.white amplikonów i zmierz stężenie DNA.
    4. Sekwencjonowanie oczyszczonego produktu PCR z użyciem startera DR-biały_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      UWAGA: Zazwyczaj sekwensujemy 40 ng oczyszczonego produktu PCR, jednak ilość ta może się różnić zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez serwis sekwenowania.
  3. Analiza TIDE
    UWAGA: Większość błędów wynikających z użycia skryptu TIDE R ma swoje źródło w nieprawidłowym formatowaniu kodu.
    1. Pobierz wymagane pakiety R (tj. sangerseqR i Biostrings) ze strony Bioconductor.org. Użyj paska wyszukiwania, aby zlokalizować najnowszą wersję każdego pakietu.
    2. Należy przeanalizować chromatogramy sekwencji w celu potwierdzenia ich wysokiej jakości. Analizie należy poddać wyłącznie chromatogramy z minimalnym tłem lub jego brakiem przed miejscem pęknięcia.
    3. Pobierz pliki śladów sekwencjonowania (z rozszerzeniem .ab1) i umieść wszystkie te pliki w jednym folderze na komputerze. Uprość nazwy plików z sekwencjami w maksymalnym stopniu (np. F1, Het2, Hom3), aby ułatwić edycję skryptów w kolejnych krokach.
    4. Otwórz skrypt TIDE w języku R (Plik uzupełniający 1) w zintegrowanym środowisku programistycznym (IDE) RStudio (patrz Tabela materiałów). W panelu Źródło (Source) zlokalizuj linię rozpoczynającą się od Control <- (Plik uzupełniający 2A) i wprowadź nazwę pliku sekwencji kontrolnej dokładnie tak, jak została zapisana, wraz z rozszerzeniem .ab1, w cudzysłowie.
      UWAGA: „sekwencja kontrolna” to sekwencja PCR z rodzicielskiego DR-biały stok bez I-SceI transgen lub indukcja.
    5. Zlokalizuj linię zaczynającą się od samplename <- wpisz c( a następnie w nawiasach podaj nazwę pliku z sekwencją każdej próbki (Plik uzupełniający 2A). Uwzględnij rozszerzenie .ab1, każdą nazwę pliku umieść w osobnych cudzysłowach i oddziel nazwy plików przecinkami.
    6. Zapisz edytowany plik skryptu TIDE R w tym samym folderze, w którym znajdują się sekwencje przeznaczone do analizy. Nadaj plikowi prostą nazwę, aby uniknąć błędów w kolejnych krokach.
    7. W środowisku IDE przejdź do folderu TIDE, korzystając z karty Files w panelu Output (Plik uzupełniający 2B).
    8. Kliknij w Więcej rozwiń i wybierz Otwórz nowy terminal w tym miejscu (Plik uzupełniający 2C). W panelu Konsola (na dole po lewej stronie) otworzy się nowy terminal.
    9. W nowo otwartym Terminalu wpisz „R” i naciśnij Wprowadź (Plik uzupełniający 2D).
    10. Gdy program R zostanie uruchomiony w terminalu, uruchom skrypt R TIDE, wpisując source("TIDE_analiza.R") i naciśnij Wprowadź (Plik uzupełniający 2E). Terminal uruchomi skrypt i wygeneruje reprezentację graficzną (Plik uzupełniający 2F) oraz plik .csv zawierający surowe dane dla każdej próbki (Plik uzupełniający 2G i Plik uzupełniający 3). Pliki wynikowe są zapisywane w tym samym folderze co skrypt R i pliki z sekwencjami.
      UWAGA: W przypadku ponownego uruchomienia tego samego skryptu R, wszelkie nowo wygenerowane pliki .csv nadpiszą pliki starsze. Jeśli wykonujesz wiele analiz na tych samych plikach, utwórz kopię folderu.
    11. Przeanalizuj dane, otwierając każdy plik .csv.
      1. Zinterpretuj surowe dane jako proporcje indeli w sekwencji próbki. Konwersja genów w wyniku rekombinacji homologicznej z sekwencji rozpoznawanej przez I-SceI do sekwencji SacI typu dzikiego prowadzi do kanonicznej delecji o długości 23 bp; skrypt raportuje tę wartość HR w oddzielnym wierszu na dole wyniku (Plik uzupełniający 2G). Wartość 0-indel oznacza brak DSB lub NHEJ bez powstania indeli. Sumę wszystkich pozostałych wartości indeli należy przyjąć jako NHEJ z przetwarzaniem. Suma NHEJ z przetwarzaniem oraz HR stanowi całkowitą liczbę wykrywalnych zdarzeń naprawy DSB.
      2. Oblicz udziały poszczególnych ścieżek naprawy wśród wykrywalnych zdarzeń naprawy DSB, korzystając z następujących równań:
        NHEJ z przetworzeniem proporcja = (NHEJ z przetworzeniem) / (NHEJ z przetworzeniem + HR)
        proporcja HR = (HR) / (NHEJ z procesowaniem + HR)
        UWAGA: W każdym eksperymencie genetycznym (np. mutanty homozygotyczne i kontrole heterozygotyczne) dla każdego stanu wykorzystuje się około 10–15 próbek. Każdy eksperyment genetyczny powtarza się 2–3 razy, a poszczególne dane są łączone.

Wyniki

Drosophila Wymagania względem Rad51 dla naprawy poprzez rekombinację homologiczną

Pomyślne eksperymenty z linią zarodkową dają oczekiwane klasy fenotypowe przedstawione na Rysunku 3A oraz co najmniej 20 ocenialnych potomków na fiolkę. Nieoczekiwane fenotypy lub mniej niż 20 ocenialnych potomków wskazują na kontaminację lub niewystarczającą produktywność i powinny zostać wykluczone zgodnie z opisem w kroku 1.4.3. W przypadku analizy TIDE pomyślne próbki dają amplikon o wielkości około 1,7 kb oraz chromatogramy z niewielkim tłem przed miejscem pęknięcia; DNA o niskiej wydajności lub zanieczyszczone, a także zaszumione chromatogramy są nieoptymalne i nie powinny być analizowane.

Podczas stosowania testu DR-white z wykorzystaniem indukowanego szokiem termicznym źródła I-SceI, częstotliwość naprawy HR u much typu dzikiego wynosi 38,5 ± 1,2% (średnia ± SEM), podczas gdy SSA występuje w około 3,2 ± 0,35% (Rycina 3B oraz Plik uzupełniający 4). Rad51 (kodowany przez homolog spnA u Drosophila) jest niezbędny do etapu inwazji nici w rekombinacji homologicznej14,19. Zatem utrata Rad51 powinna prowadzić do nieefektywnej HR. Rzeczywiście, w tle DmRad51-/- naprawa HR jest zredukowana do 1,3 ± 0,4%, z jednoczesnym wzrostem naprawy SSA (34,5 ± 1,8%; Rycina 3B oraz Plik uzupełniający 4)14. Jest to najprawdopodobniej spowodowane tym, że zdarzenia naprawcze skierowane na rekombinację homologiczną są naprawiane alternatywnie poprzez wyżarzanie pojedynczej nici sekwencji powtórzonych white.

Drosophila Wkład białka CtIP w efektywną naprawę HR w tkankach somatycznych

Algorytm TIDE umożliwia pomiar wyboru ścieżki naprawy w komórkach somatycznych. W tle niemutacyjnym NHEJ z przetwarzaniem występuje w 59,0% wykrywalnych zdarzeń naprawczych, a HR występuje w 41,0% (Rysunek 4B oraz Plik uzupełniający 4). CtIP odgrywa istotną rolę w inicjacji naprawy HR poprzez promowanie resekcji końców DNA20. W konsekwencji, w tle DmCtIP-/- wybór ścieżki HR jest wyraźnie zredukowany w komórkach somatycznych, z 41,0% w kontrolach heterozygotycznych do 10,9% w mutantach homozygotycznych (Rysunek 4B oraz Plik uzupełniający 4)16. Sugeruje to, że u Drosophila białko CtIP przyczynia się do naprawy HR, ale nie jest dla niej niezbędne.

Schemat testu DR-white przedstawiający ścieżki naprawy DNA; metody HR, NHEJ i SSA z elementami genu Sce.white.
Rycina 1: Test reporterowy pęknięć dwuniciowych (DSB) DR-white oraz wyniki naprawy. Test Direct Repeat of white zawiera dwie niefunkcjonalne kopie genu white: Sce.white (z 23-pz insercją zawierającą miejsce rozpoznawania I-SceI i wprowadzającą przedwczesny kodon stop) oraz iwhite (sekwencję donora uciętą z końca 5′ i 3′). Krzyżowanie much zawierających DR-white i transgen I-SceI powoduje powstanie specyficznego dla miejsca DSB, które można analizować fenotypowo lub molekularnie. Wynikowe fenotypy to (A) potomstwo z białymi oczami (y+ w−), co wskazuje na brak DSB, HR między siostrami lub NHEJ; (B) potomstwo z czerwonymi oczami (y+ w+), co wskazuje na intrachromosomalną HR, która przywraca sekwencję SacI typu dzikiego z donora iwhite; oraz (C) potomstwo z żółtym ciałem i białymi oczami (y− w−), co wskazuje na SSA lub mitotyczny CO. Rycina zaadaptowana z Do et al.14. Skróty: CO = crossing-over; DR-white = Direct Repeat of white; DSB = pęknięcie dwuniciowe; HR = rekombinacja homologiczna; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; SSA = wyżarzanie jednoniciowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat edycji genów: rekombinacja homologiczna, cięcie I-SceI, DR-white.mu, DNA, iwihiteΔ9, miejsca SacI.
Rycina 2: Pochodne testu DR-white. (A) Test DR-white.mu zawiera 28 cichych SNP w sekwencji donora iwhite.mu, co skutkuje 1,4% rozbieżności sekwencji między bezpośrednimi powtórzeniami. Konwersja genowa poszczególnych polimorfizmów różni się w zależności od zdarzeń HR i może być określona poprzez sekwencjonowanie. (B) DR-white z donorem iwhiteΔ9 rozróżnia rekombinację międzyhomologiczną od wewnątrzchromosomalnej. HR z wewnątrzchromosomalnego donora iwhite przywraca sekwencję SacI typu dzikiego i daje potomstwo z czerwonymi oczami. HR z międzyhomologicznego donora iwhiteΔ9 daje potomstwo z pomarańczowymi oczami, ponieważ delecja o długości 9 bp zmniejsza ekspresję genu white. Rycina opracowana na podstawie Do et al.14 oraz Fernandez et al.15. Skróty: DSB = pęknięcie obu nici DNA; HR = rekombinacja homologiczna; SNP = polimorfizm pojedynczego nukleotydu. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ścieżki naprawy genów Drosophila, schemat krzyżówek genetycznych, analiza wykresu słupkowego rozkładu potomstwa.
Rysunek 3: Schemat doświadczalny wykrywania wyników naprawy DSB w linii zarodkowej przedmeiotycznej. (A) Krzyżówka 1 łączy reporter DR-white (lub jego pochodną) z transgenem I-SceI (w tym przykładzie na drugim chromosomie). Potomstwo zawierające zarówno test DR-white, jak i transgen I-SceI zachowuje zdarzenia naprawy w liniach zarodkowych i tkankach somatycznych. Aby przeanalizować poszczególne zdarzenia naprawy w linii zarodkowej przedmeiotycznej, potomstwo niosące oba transgeny krzyżuje się z muchami testerami y w (Krzyżówka 2), a potomstwo ocenia się zgodnie z opisem w Rysunku 1. (B) Pojedyncze zdarzenia naprawy DSB w linii zarodkowej u much typu dzikiego (n = 106 linii zarodkowych) oraz u homozygotycznych mutantów DmRad51 (n = 46 linii zarodkowych). **P < 0,01; ****P < 0,0001 przy zastosowaniu dwuczynnikowej analizy ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Sidaka. Słupki reprezentują średnie; słupki błędów reprezentują SEM. Dane zostały ponownie przeanalizowane z pracy Do et al.14. Skróty: ANOVA = analiza wariancji; CO = crossover; DSB = pęknięcie dwuniciowe; HR = rekombinacja homologiczna; NHEJ = niespecyficzne łączenie końców; SEM = standardowy błąd średniej; SSA = wyżarzanie jednoniciowe. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Proces edycji genów za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera z analizą TIDE; zawiera wykres porównawczy metod naprawy.
Rysunek 4: Schemat eksperymentalny wykrywania wyników naprawy DSB z wykorzystaniem metody Tracking of Indels by DEcomposition. (A) Muchy niosące DR-white oraz indukowany transgen I-SceI są analizowane poprzez ekstrakcję gDNA, amplifikację PCR w obrębie miejsca DSB, sekwencjonowanie metodą Sangera oraz analizę TIDE z użyciem skryptu R. (B) Reprezentatywne dane z mutantów DmCtIP-/- (n = 23) oraz heterozygotycznych kontroli DmCtIP+/-  (n = 31). Wykrywalne zdarzenia naprawy obliczono jako sumę HR oraz NHEJ z przetwarzaniem, wykluczając brak DSB/NHEJ bez indeli. ****P < 0,0001 w teście ANOVA dwuczynnikowym, a następnie w teście wielokrotnych porównań Sidaka. Słupki reprezentują średnie; słupki błędów reprezentują SEM. Dane zostały ponownie przeanalizowane z pracy Thomas et al.16. Skróty: ANOVA = analiza wariancji; DSB = pęknięcie dwuniciowe; gDNA = DNA genomiczne; HR = rekombinacja homologiczna; NHEJ = niehomologiczne łączenie końców; PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; SEM = standardowy błąd średniej; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Skrypt R TIDE do identyfikacji insercji i delecji w chromatogramach sekwencyjnych w stosunku do kontroli bez DSB. Edytowalne przez użytkownika nazwy plików kontrolnych, nazw plików próbek oraz sekwencja docelowa I-SceI są oznaczone pod koniec skryptu. Wymagane dane wejściowe, pliki wyjściowe i interpretacja są opisane w sekcji 2.3. Wymagane są pakiety sangerseqR i Biostrings.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Krok po kroku – przewodnik ze zrzutami ekranu po przepływie pracy skryptu R dla metody TIDE. Panele ilustrują działania w oprogramowaniu opisane w sekcji 2.3.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Przykład wyników TIDE i obliczeń zdarzeń naprawy. Wartość 0-indel oznacza brak DSB lub NHEJ bez insercji i delecji; oddzielny wiersz HR reprezentuje kanoniczny produkt z delecją o długości 23 bp; wszystkie pozostałe procentowe wartości indeli są sumowane jako NHEJ z przetwarzaniem. Całkowita wykrywalna naprawa jest obliczana jako suma HR oraz NHEJ z przetwarzaniem.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Surowe dane stanowiące podstawę rysunku 3B i rysunku 4B, uporządkowane w oddzielnych edytowalnych arkuszach. Dane te zostały ponownie przeanalizowane na podstawie wcześniej opublikowanych badań cytowanych w odpowiednich podpisach pod rysunkami.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wszechstronność systemu DR-white jest krytycznym czynnikiem przyczyniającym się do jego dotychczasowego i przyszłego wpływu na dziedzinę naprawy DNA. Po pierwsze, sekwencja integracji attB w konstrukcie reporterowym DR-white pozwala badaczom na ukierunkowanie reportera w liczne miejsca w genomie Drosophila21, przy czym kilka linii celowanych jest już dostępnych22. Po drugie, dostępność różnych transgenów I-SceI, takich jak ekspresja indukowana szokiem termicznym za pomocą promotora hsp70 (niniejsze badanie), ekspresja konstytutywna za pomocą promotora ubiquitin23 oraz ekspresja w linii zarodkowej przedmeiotycznej za pomocą promotora Bam24, zapewnia liczne konteksty rozwojowe i tkankowo swoiste do badania naprawy DSB. Niezależnie od użytego transgenu  I-SceI, krzyżówki genetyczne muszą być starannie zaplanowane, aby upewnić się, że transgen I-SceI zostanie wprowadzony dopiero w ostatnim krzyżowaniu, co zapewni prawidłową indukcję DSB. Należy zauważyć, że częstotliwość naprawy może znacznie się różnić w zależności od lokalizacji genomicznej DR-white i/lub użytego transgenu I-SceI . Przyszłe eksperymenty mogłyby dodatkowo porównać lokalizacje genomiczne i transgeny I-SceI, aby ustalić, czy to kontekst genomiczny, czy swoistość tkankowa warunkuje naprawę DSB.

Szczególną zaletą testu DR-white oraz jego pochodnych jest możliwość identyfikacji naprawy DSBs poprzez rekombinację homologiczną, NHEJ z przetwarzaniem końców, a w większości przypadków także przez SSA. Choć system ten został zaprojektowany do fenotypowego wykrywania zdarzeń naprawy w linii zarodkowej, umożliwia on również analizę tkanek somatycznych za pomocą analizy algorytmicznej TIDE. Pomimo tych zalet, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia tego testu. Warto zauważyć, że test DR-white może niedoszacowywać częstotliwości HR. Podobnie jak w innych testach z reporterami genetycznymi wykorzystujących DSBs indukowane nukleazą, naprawa drogą HR z chromatydy siostrzanej (intersister HR) jest nieodróżnialna od zdarzenia bez DSB lub od NHEJ bez przetwarzania końców. Zatem przynajmniej część klasy No DSB/NHEJ może stanowić zdarzenia HR. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, należy zachować ostrożność przy wynikach porównujących czynniki genetyczne (takie jak linie mutantów). Inne ograniczenia testu obejmują brak możliwości oceny zdarzeń premeiotycznych, które nie doprowadziły do powstania żywotnego potomstwa. Na przykład zdarzenia DSB, które mogły nie zostać naprawione i skutkowały śmiercią komórki, nie zostaną odnotowane w potomstwie. Choć ogólna płodność może być jakościową miarą śmierci komórek linii zarodkowej, konieczne może być zastosowanie testów komórkowych (takich jak TUNEL). Dodatkowo, analiza skryptem R TIDE dostarcza jedynie proporcji wykrywalnych zdarzeń w populacji komórek. Aby określić konkretne sekwencje indeli, konieczne jest sekwencjonowanie pojedynczych zdarzeń naprawy przy użyciu multipleksowego sekwencjonowania DNA.

Test DR-white wywarł już ogromny wpływ na badania nad naprawą DSB. Jego zastosowanie pozwoliło zidentyfikować czynniki przyczyniające się do naprawy DSB u organizmów wielokomórkowych, w tym wiek25, płeć26, lokalizacja DSB22,26, lokalizacja sekwencji donora15, cykl komórkowy oraz typ tkanki26. Ponadto wykorzystaliśmy ten test do zidentyfikowania kilku białek, które również sterują wyborem ścieżki naprawy i/lub naprawą sekwencji zróżnicowanych u Drosophila, w tym Msh627, Blm28, Rif116 oraz CtIP16,29. Rzeczywiście, ugruntowane wykorzystanie Drosophila jako genetycznego organizmu modelowego z konserwowanymi białkami naprawy DNA zapewnia prosty, wielokomórkowy system do badania czynników genetycznych, komórkowych i organizmalnych, które przyczyniają się do naprawy DSB w złożonych kontekstach biologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów finansowych ani niefinansowych.

Podziękowania

Metoda ta została opracowana w czasie, gdy J.R.L. był beneficjentem grantu badawczego AFAR przyznanego przez American Federation for Aging Research. Praca ta była również wspierana przez National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 i 1R15GM129628) dla J.R.L. Ryciny zostały opracowane przy wsparciu BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tłuczki 0,5 mL wolne od RNAzy/DNAzyFisher Scientific12141363Do homogenizacji próbek do ekstrakcji gDNA
Kulki bawełnianeGenesee Scientific51-101do standardowej hodowli Drosophila
Inkubator chłodniczy Peltiera do DrosophilaShel LabSRI6PFdo standardowej hodowli Drosophila
Linia Drosophila: y[1] w[1]Bloomington Drosophila  Stock CenterRRID:BDSC 1495
Linia Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque LabN/Astworzona przez laboratorium LaRocque poprzez standardową rekombinację linii RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) z Bloomington Drosophila Stock Center; dostępna na prośbę do autora korespondencyjnego
Linia Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/Atest DR-white zintegrowany z linią RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); dostępna na prośbę do autora korespondencyjnego
Linia Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/Atest DR-white.mu zintegrowany z linią RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); dostępna na prośbę do autora korespondencyjnego
Linia Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque LabN/Adonor iwhiteΔ9 zintegrowany z linią RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); dostępna na prośbę do autora korespondencyjnego
Zatwory do butelek Drosophila FlugsGenesee Scientific49-100do standardowej hodowli Drosophila
Fluorescencyjny stereomikroskop (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLdo standardowego "przenoszenia much" Drosophila i ich sortowania na podstawie fluorescencji
Podkładka do much Drosophila FlyStuffGenesee Scientific59-172do standardowego "przenoszenia much" Drosophila
Ręczniki KimwipesKimberly-Clarke06-666A
Kąpiel wodna MyBath 4LMidwest ScientificMB-2000-4do  szoku termicznego
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYdo kwantyfikacji DNA
Pożywka Nutri-fly Bloomington FormulationGenesee Scientific66-121do standardowej hodowli Drosophila
Bezprzewodowy homogenizator z tłuczkiem Pellet PestleDWK Life SciencesK749540-0000Do homogenizacji próbek do ekstrakcji gDNA
Butelki polipropylenoweGenesee Scientific32-130do standardowej hodowli Drosophila
Probówki polistyrenoweGenesee Scientific32-116do standardowej hodowli Drosophila, w tym do szoku termicznego
Starter/oligonukleotyd DR-white_8fN/A; wystarczy dowolna usługa syntezy oligonukleotydówN/A5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
Starter/oligonukleotyd DR-white_8aN/A; wystarczy dowolna usługa syntezy oligonukleotydówN/A5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
Starter/oligonukleotyd DR-white_9fN/A; wystarczy dowolna usługa syntezy oligonukleotydówN/A5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioPositWersja 2023.06.1+524Darmowa wersja do pobrania; dopuszczalna jest każda wersja R Studio, choć przedstawione dane analizowano przy użyciu  wersji 2023.06.1+524
Pakiety R Studio: BiostringsBioconductor.org (Wersja 3.24)Wersja 2.76.0Skrypt R poprosi użytkownika o zainstalowanie tego pakietu
Pakiety R Studio: sangerseqRBioconductor.org (Wersja 3.24)Wersja 1.44.0Skrypt R poprosi użytkownika o zainstalowanie tego pakietu
SapphireAMP Fast PCRTakaraRR350B
StereomikroskopLeicaM60do standardowego "przenoszenia much" Drosophila
Wizard SV Gel and PCR Clean up PromegaA9281

Bibliografia

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p kni cia dwuniciowe DNAnaprawa DSBrekombinacja homologicznanieswoiste czenie ko c wwy arzanie pojedynczej niciMeganukleaza I SceIanaliza PCRanaliza TIDE
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły