Poziom miR‑486‑3p jest obniżony u pacjentów z ostrym zawałem mózgu i zespołem obturacyjnego bezdechu sennego, koreluje ujemnie z ciężkością choroby oraz markerami stanu zapalnego i pozwala przewidzieć złe rokowania w perspektywie 1 roku, co potwierdza jego potencjał jako biomarkera diagnostycznego i prognostycznego.
Artykuł badawczy
Retrospektywne badanie kohortowe poziomu miR-486-3p we krwi obwodowej u pacjentów z ostrym zawałem mózgu i obturacyjnym zespołem bezdechu sennego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostre zawały mózgu (ACI) powikłane zespołem obturacyjnego bezdechu sennego (OSAS) wiążą się z wysokim ryzykiem nawrotu udaru oraz zgonu, jednak liczba skutecznych biomarkerów dla tej współistniejącej choroby pozostaje ograniczona. W to retrospektywne badanie kohortowe włączono 270 pacjentów z ACI w okresie od listopada 2020 do grudnia 2023 roku, których podzielono na grupę ACI (n = 100, wskaźnik bezdechu-hipopnoe [AHI] < 5) oraz grupę ACI z OSAS (n = 170, AHI ≥ 5), przy czym tę ostatnią dodatkowo podzielono na podgrupy z lekkim (5 ≤ AHI < 15, n = 60), umiarkowanym (15 ≤ AHI < 30, n = 75) i ciężkim przebiegiem (AHI ≥ 30, n = 35). Ekspresję serum miR‑486‑3p zmierzono za pomocą RT‑qPCR, a markery zapalne, w tym czynnik martwicy nowotworu-α (TNF‑α), białko C-reaktywne (CRP) oraz czynnik indukowany hipoksją-1α (HIF‑1α), oznaczono metodą ELISA. Wartość diagnostyczną miR‑486‑3p oceniono za pomocą analizy krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), a jego znaczenie prognostyczne oceniono poprzez analizę przeżycia Kaplana-Meiera oraz modele regresji Coxa. Poziom miR-486-3p był wyraźnie niższy w grupie z chorobami współistniejącymi i wykazał wysoką zdolność diagnostyczną (AUC = 0,927). Co istotne, zaobserwowano wyraźną zależność od dawki w podgrupach ciężkości OSAS, gdzie poziom miR‑486‑3p stopniowo spadał, a poziomy TNF‑α i CRP sukcesywnie rosły od łagodnego do ciężkiego stadium OSAS. Analizy korelacji Spearmana wykazały, że miR‑486‑3p był ujemnie skorelowany z AHI, wynikiem w skali NIHSS, TNF‑α oraz CRP. W obserwacji po 1 roku pacjenci z niską ekspresją miR‑486‑3p mieli znacznie gorsze wyniki funkcjonalne w porównaniu z osobami o wysokiej ekspresji. Wieloczynnikowa regresja Coxa potwierdziła, że miR‑486‑3p jest niezależnym czynnikiem ochronnym dla rokowań w okresie 1 roku. Wyniki te sugerują, że miR‑486‑3p może służyć jako nowy biomarker diagnostyczny i prognostyczny dla pacjentów z ACI i OSAS, potencjalnie poprzez jego rolę regulacyjną w zapaleniu ogólnoustrojowym, co uzasadnia dalszą walidację w większych kohortach prospektywnych.
Wprowadzenie
Obstrukcyjny bezdech senny (OBS) jest powszechnym schorzeniem charakteryzującym się powtarzającymi się przerwami w oddychaniu podczas snu1. OBS często współistnieje z chorobami towarzyszącymi, takimi jak zaburzenia metaboliczne, sercowo-naczyniowe, nerkowe, płucne oraz neuropsychiatryczne2. Poza ogólnymi powiązaniami z chorobami układu krążenia i zaburzeniami metabolicznymi, OBS stanowi specyficzne i poważne zagrożenie w przypadku ostrego udaru niedokrwiennego, komplikując do 70% przypadków i zwiększając ryzyko pogorszenia stanu neurologicznego, zgonu oraz nawrotu udaru3,4,5. Ostry zawał mózgu (ACI) stanowi najczęstszą postać udaru. Mimo znaczących postępów w leczeniu ACI w ostatnich latach, większość pacjentów nadal cierpi z powodu ciężkiej niepełnosprawności lub umiera6. Synergistyczne oddziaływanie między ACI a współistniejącym OBS potęguje uszkodzenia niedokrwienne i zapalenie układowe, znacząco podnosząc ryzyko nawrotu udaru, niepełnosprawności i śmiertelności. W związku z tym identyfikacja wiarygodnych biomarkerów do wczesnej diagnostyki i leczenia tego wysokoryzykownego stanu współistniejącego ma kluczowe znaczenie.
MikroRNA (miRNA) wykazują w ostatnich latach ogromny potencjał jako biomarkery. Wśród nich miR-486-3p ma duże znaczenie w chorobach naczyniowo-mózgowych. Wcześniejsze badania wykazały, że ekspresja miR-486-3p jest zahamowana w obturacyjnym bezdechu sennym (OSA)7. Ponadto terapia z użyciem egzosomów zawierających glikoproteinę wirusa wścieklizny oraz miR-486-3p może łagodzić zaburzenia neurobehawioralne, obrzęk mózgu, uszkodzenia bariery krew-mózg oraz neurodegenerację8, co wskazuje na rolę miR-486-3p w urazach mózgu. Po ACI dochodzi do aktywacji mikrogleju w uszkodzonej tkance mózgowej, co sprzyja sekrecji cytokin zapalnych5. OSAS wywołuje objawy przerywanej hipoksji, prowadząc do aktywacji współczulnego układu nerwowego i stresu oksydacyjnego, co w konsekwencji wyzwalają systemową kaskadę reakcji zapalnych9. miR-486-3p jest ściśle powiązany ze stanem zapalnym10. Powyższe dowody sugerują, że miR-486-3p może służyć jako łącznik molekularny pomiędzy hipoksją związaną z OSAS, zapaleniem systemowym a rekonwalescencją po udarze.
Jednak profil jego ekspresji, dokładność diagnostyczna oraz znaczenie prognostyczne u pacjentów z ACI z towarzyszącym OSAS nie zostały systematycznie zbadane, a to, czy koreluje on z ciężkością OSAS lub mediatorami zapalnymi w sposób zależny od dawki, pozostaje nieznane. Aby wypełnić te luki, w niniejszym badaniu oceniono wartość diagnostyczną miR-486-3p dla OSAS u pacjentów z ACI, zbadano jego zależność od dawki w odniesieniu do ciężkości OSAS i markerów zapalnych (TNF-α, CRP oraz HIF-1α) oraz oceniono jego użyteczność prognostyczną dla rocznych wyników funkcjonalnych. Z naszej wiedzy jest to pierwsze kompleksowe badanie wykazujące, że miR-486-3p może służyć jako nowy biomarker diagnostyczny i prognostyczny dla współistnienia ACI i OSAS, potencjalnie poprzez regulację systemowego stanu zapalnego.
Protokół
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Powiązanego z Uniwersytetem Medycznym w Xuzhou (numer zatwierdzenia: XYFY2024-KL238-01) i zostało zwolnione z wymogu uzyskania dodatkowej świadomej zgody od pacjentów. Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli materiałów.
Pacjenci i próbki
Niniejsze badanie było retrospektywnym badaniem kohortowym. W okresie od listopada 2020 r. do grudnia 2023 r. zakwalifikowano kolejno 270 pacjentów z ACI leczonych w szpitalu stowarzyszonym z Xuzhou Medical University. Proces doboru pacjentów przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1. Kwalifikowalne osoby identyfikowano poprzez codzienny przegląd wszystkich nowych przyjęć na oddział udarów. Wystąpienie objawów w ciągu 72 h przed przyjęciem zweryfikowano na podstawie dokumentacji medycznej z oddziału ratunkowego oraz potwierdzono przez certyfikowanego neurologa w wywiadzie z pacjentem i rodziną. Wielkość próby obliczono w oparciu o zdolność do wykrycia istotnej różnicy w poziomach miR-486-3p między grupami. Przy założeniu wielkości efektu 0,5, dwustronnym poziomie istotności α = 0,05 i mocy (1-β) wynoszącej 0,80, wymagano minimum 64 pacjentów w każdej grupie. Końcowe liczebności grup odzwierciedlają rzeczywisty nabór oraz wyższą częstość występowania OSAS w populacji pacjentów z udarem, a nie z góry określony przydział. Rokowania pacjentów z ACI i współistniejącym OSAS monitorowano przez okres 1 roku.
Kryteria włączenia obejmowały: (1) Ostrego udaru niedokrwiennego z wystąpieniem objawów w ciągu 72 h przed przyjęciem, potwierdzonego w badaniu rezonansem magnetycznym. (2) Zdolność do zrozumienia i wypełnienia kwestionariuszy badania oraz poddania się ocenom neurologicznym. (3) Ciężkość ACI została oceniona w momencie przyjęcia za pomocą skali udarów National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS). Wynik NIHSS <5 klasyfikowano jako łagodny ACI; wynik NIHSS między 5 a 20 uznawano za umiarkowany ACI. Główne kryteria wykluczenia obejmowały: historię nowotworów złośliwych, istniejącą ciężką niepełnosprawność fizyczną lub zaburzenia psychiatryczne, ciężką niewydolność serca, płuc lub nerek, rozległą operację lub uraz w ciągu ostatnich 3 miesięcy, aktywne infekcje lub choroby autoimmunologiczne; udar w ciągu ostatnich 6 miesięcy; terapię immunosupresyjną oraz wcześniejszą diagnozę lub leczenie OSAS (w tym terapię dodatnim ciśnieniem w drogach oddechowych).
W celu potwierdzenia w badaniu MRI, wszyscy pacjenci zostali poddani standardowemu rezonansowi magnetycznemu mózgu w systemie 3.0-T, obejmującemu następujące sekwencje: T1-zależną, T2-zależną, FLAIR (fluid-attenuated inversion recovery), DWI (diffusion-weighted imaging) oraz mapowanie ADC (apparent diffusion coefficient). Ostry zawał zdefiniowano jako obecność sygnału hiperintensywnego w DWI z odpowiadającym mu sygnałem hipointensywnym w ADC. Wszystkie skany MRI zostały zinterpretowane przez dwóch doświadczonych neuroradiologów, którzy nie mieli dostępu do danych klinicznych, a rozbieżności rozstrzygano drogą konsensusu. Ocena w skali NIHSS została przeprowadzona przy przyjęciu przez certyfikowanych neurologów przed jakimkolwiek leczeniem trombolitycznym lub endowaskularnym.
Krew żylną na czczo pobrano od 24 h do 48 h po wystąpieniu udaru, po nocnym poście trwającym co najmniej 8 h. Pobrania krwi przeprowadzono między godziną 6:00 a 8:00, aby zminimalizować zmienność okołodobową. Łącznie 5 mL krwi żylnej obwodowej pobrano do probówek próżniowych z EDTA. W ciągu 2 h od pobrania próbki krwi odwirowano przy 1 500 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C przy użyciu wirówki chłodzącej. Nadosiarcz serum ostrożnie rozdzielono do 1,5 mL probówek do mikrocentryfugi wolnych od RNaz i natychmiast przechowywano w temperaturze −80 °C do czasu ekstrakcji RNA. Ściśle unikano powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania; wszystkie alikwoty poddano maksymalnie jednemu cyklowi zamrażania i rozmrażania przed analizą.
Podział pacjentów na grupy
Uczestników podzielono na grupy na podstawie wyników wskaźnika AHI uzyskanych w badaniu polisomnograficznym. Wszystkie zapisy wykonano w szpitalnym laboratorium snu między godziną 22:00 a 6:00 rano przez co najmniej 7 h. Monitorowane kanały fizjologiczne obejmowały: elektroencefalografię (EEG; sześć kanałów), elektrookulografię (EOG; dwa kanały), elektromiografię (EMG; podbródek i obustronnie mięśnie piszczelowe przednie), elektrokardiografię (EKG; pojedyncze odprowadzenie), przepływ powietrza przez nos (termistor i przetwornik ciśnienia), wysiłek oddechowy klatki piersiowej i brzucha (pletyzmografia indukcyjna oddechowa) oraz pulsoksymetrię (SpO2). Wskaźnik AHI został obliczony przez technika badania snu. Ocena faz snu i zdarzeń oddechowych była wykonywana ręcznie przez certyfikowanego technika snu zgodnie z podręcznikiem punktacji American Academy of Sleep Medicine (AASM) z 2012 roku, przy użyciu oprogramowania Somnolyzer 24×7. Zgodnie z powszechnie przyjętymi kryteriami diagnostycznymi American Academy of Sleep Medicine, wartość AHI wynosząca 5 lub więcej zdarzeń na godzinę jest standardowym progiem diagnostycznym dla OSAS. W związku z tym uczestników z AHI < 5 zaklasyfikowano do grupy ACI (n = 100), natomiast osoby z AHI ≥ 5 zaklasyfikowano do grupy ACI z OSAS (n = 170). Wśród osób z AHI ≥ 5 (grupa ACI z OSAS, n = 170) pacjentów dodatkowo podzielono na trzy podgrupy stopnia nasilenia na podstawie ustalonych kryteriów: łagodny OSAS (5 ≤ AHI < 15, n = 60), umiarkowany OSAS (15 ≤ AHI < 30, n = 75) oraz ciężki OSAS (AHI ≥ 30, n = 35). Taka stratyfikacja umożliwiła ocenę zależności zależnej od dawki pomiędzy obciążeniem hipoksycznym, ekspresją miR‑486‑3p a markerami zapalnymi. Pacjenci, którzy wcześniej byli leczeni na OSAS (np. CPAP), nie zostali włączeni do badania, aby uniknąć zakłócenia pomiaru wyjściowego AHI.
Ocena rokowań
Punkt czasowy wynoszący 1 rok pozwala na ustąpienie efektów ostrych i przejawy skumulowanego obciążenia hipoksycznego związanego z OSAS, co zapewnia wiarygodne okno do oceny jego wpływu prognostycznego. Rokowania kliniczne pacjentów z ACI w połączeniu z OSAS oceniano za pomocą zmodyfikowanej skali Rankin (mRS) po wystąpieniu choroby. Wszystkie oceny mRS zostały przeprowadzone przez certyfikowanych neurologów, którzy przed rozpoczęciem badania przeszli ustandaryzowany trening, z wykorzystaniem ustrukturyzowanego formularza wywiadu mRS. Wiarygodność międzyoceniaczy oceniono za pomocą współczynnika kappa >0,85. Ocena kontrolna została przeprowadzona podczas zaplanowanej wizyty w poradni specjalistycznej. W przypadku pacjentów niezdolnych do osobistego stawiennictwa, przeszkolona pielęgniarka badawcza przeprowadziła ustrukturyzowany wywiad telefoniczny przy użyciu ustandaryzowanego scenariusza. Wszyscy oceniający byli zaślepieni względem poziomów miR-486-3p oraz statusu OSAS u pacjentów. Aby zachować spójność między ocenami w poradni a ocenami telefonicznymi, w obu formatach stosowano ten sam ustrukturyzowany kwestionariusz, a wszyscy oceniający wykonali ćwiczenie kalibracyjne przed rozpoczęciem badania. Pacjentów z wynikiem 0–2 zakwalifikowano do grupy z dobrymi rokowaniami, a pacjentów z wynikiem 3–6 do grupy ze złymi rokowaniami. Żaden pacjent nie wypadł z obserwacji. SAQLI, ESS, TNF-α oraz HIF-1α oceniano jako zmienne prognostyczne, zamiast wykorzystywać je do definiowania grup rokowniczych. Skale NIHSS, SAQLI oraz ESS zostały przeprowadzone przez przeszkolony personel badawczy. Kwestionariusze SAQLI i ESS były przeprowadzane w formie wywiadu w cichym pomieszczeniu.
Indeks punktacji
NIHSS jest ilościową skalą oceny udaru11, w której wyższe wyniki wskazują na większy stopień nasilenia ACI. SAQLI to kwestionariusz jakości życia w OSA w skali od 1 do 7, gdzie wyższe wyniki oznaczają gorszą jakość życia, obejmujący czynności dnia codziennego, interakcje społeczne, stany emocjonalne, objawy oraz dolegliwości związane z leczeniem12. ESS jest stosowany do badania zgłaszzanej przez pacjentów senności w ciągu dnia, z zakresem wyników od 0 do 24, gdzie wynik > 10 wskazuje na występowanie senności w ciągu dnia13.
Izolacja RNA i odwrotna transkrypcja
Całkowite RNA wyizolowano z 200 µL surowicy przy użyciu odczynnika TRIzol. W skrócie, próbki surowicy zmieszano z 800 µL TRIzol, inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 min, a następnie wirowano przy 12,000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Dodano chloroform (200 µL), a mieszaninę energicznie wstrząsano przez 15 s, inkubowano przez 3 min i wirowano przy 12,000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Fazę wodną przeniesiono do nowej probówki, a RNA wytrącono za pomocą 500 µL izopropanolu, inkubowano w temperaturze −20 °C przez 1 h i wirowano przy 12,000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Osad RNA przemyto 75% etanolem, wysuszono na powietrzu i rozpuściono w 20 µL wody wolnej od RNaz. Stężenie i czystość RNA oceniono za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru, przyjmując stosunek A260/A280 w zakresie od 1,8 do 2,0 jako odpowiedni do dalszych analiz. Integralność RNA zweryfikowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
Odwrotą transkrypcję przeprowadzono przy użyciu 500 ng całkowitego RNA z zastosowaniem Reverse Transcription Kit w całkowitej objętości reakcji 20 µL, wykorzystując randomowe primery heksamerowe zgodnie z protokołem producenta. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono w temperaturach 25 °C przez 10 min, 42 °C przez 60 min oraz 70 °C przez 5 min. Uzyskane cDNA przechowywano w temperaturze −20 °C do czasu użycia.
RT-qPCR
Ekspresję miR-486-3p wykryto przy użyciu zestawu do PCR w czasie rzeczywistym opartego na SYBR Green do ilościowego oznaczania microRNA w systemie do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Mieszanina reakcyjna zawierała 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, 2 µL matrycy cDNA (rozcieńczonej 1:5), 1 µL każdego z primerów (10 µM) oraz wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 20 µL. Sekwencje primerów są następujące (od 5'-3'): miR-486-3p-forward: TCGGCAGCGGGGCAGCUCAGU, reverse: CTCAACTGGTGTCGTGGA; oraz U6-forward: CTCGCTTCGGCAGCACA, reverse: AACGCTTCACGAATTTGCGT. Warunki cykliczne qPCR były następujące: 95 °C przez 2 min, a następnie 40 cykli obejmujących 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 60 s. Każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach, a w każdym przebiegu uwzględniono kontrolę bez matrycy (NTC). Specyficzność amplifikacji potwierdzono analizą krzywej topnienia w zakresie od 60 °C do 95 °C. Próg cyklu (Ct) był automatycznie wyznaczany przez oprogramowanie QuantStudio 6 Pro (v1.5) przy użyciu domyślnych ustawień progu. Poziom miR-486-3p obliczono metodą 2-ΔΔCT i znormalizowano do U6. U6 został zwalidowany jako stabilny gen referencyjny w naszych próbkach surowicy przy użyciu algorytmu NormFinder w celu zapewnienia spójności między grupami. Współczynniki zmienności między- i wewnątrzseryjnej wynosiły <5%.
ELISA
Stężenia białka C-reaktywnego (CRP), TNF-α oraz HIF-1α w surowicy oznaczono przy użyciu zestawu ELISA. Procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, próbki surowicy rozmrożono na lodzie i rozcieńczono w stosunku 1:2 w dostarczonym buforze do rozcieńczania. Próbki oraz wzorce naniesiono na wcześniej powleczone płytki 96-dołkowe (100 µL/dołek) i inkubowano przez 2 h w temperaturze 37°C. Po czterokrotnym przemyciu 300 µL buforu piorącego, dodano 100 µL biotynylowanego przeciwciała detekcyjnego i inkubowano przez 1 h w 37°C. Po kolejnym etapie przemywania dodano 100 µL streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową i inkubowano przez 30 min w 37°C w ciemności. Następnie dodano substrat chromogenny (tetrametylobenzydyna, 100 µL) i inkubowano przez 15 min w 37°C, chroniąc przed światłem. Reakcję przerwano za pomocą 50 µL roztworu stopującego, a absorbancję zmierzono przy 450 nm przy użyciu czytnika mikropłytek. Stężenia obliczono na podstawie krzywych wzorcowych wyznaczonych dla znanych stężeń białek rekombinowanych. Każdą próbkę oznaczono w duplikacie, a do analizy przyjęto wartość średnią. Na każdej płytce umieszczono próbki kontroli jakości dostarczone przez producenta; wyniki akceptowano tylko wtedy, gdy wartości QC mieściły się w zakresie określonym przez producenta.
Kontrola jakości i powtarzalność
Wszystkie analizy laboratoryjne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) dla RT-qPCR oraz odpowiednimi standardami raportowania dla testów ELISA. Główne urządzenia były kalibrowane zgodnie z harmonogramami producentów. W każdej serii analiz RT-qPCR i ELISA uwzględniono próbki kontrolne ujemne i dodatnie w celu monitorowania zmienności między płytkami. Wszystkie dane były rejestrowane i zarządzane przy użyciu programu Microsoft Excel, a autor korespondencyjny udostępni szczegółowe protokoły eksperymentalne i surowe dane na uzasadnioną prośbę.
Analiza statystyczna
Dane analizowano przy użyciu programu SPSS 23.0 oraz oprogramowania do statystyki i tworzenia wykresów. Rozkład normalny oceniano testem Shapiro-Wilka. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnia ± SD lub mediana (IQR) i porównywano za pomocą testu t lub testu U Manna-Whitneya, w zależności od rozkładu. Zmienne kategoryczne porównywano testem χ2. Korelacje badano za pomocą analiz Pearsona lub Spearmana, w zależności od rozkładu danych. Wartość prognostyczną określono za pomocą krzywej ROC i zweryfikowano metodą 5-krotnej walidacji krzyżowej. Optymalną wartość odcięcia dla miR-486-3p wyznaczono poprzez maksymalizację indeksu Youdena. Do oceny korelacji wykorzystano analizy korelacji Pearsona i Spearmana. W analizie prognostycznej pacjentów podzielono na grupy na podstawie mediany ekspresji miR‑486‑3p; do porównania wyników przeżycia między grupami wykorzystano krzywe Kaplana-Meiera z testem log-rank. Zmienne z wartością P < 0,1 w jednowymiarowym modelu regresji Coxa wprowadzono do wielowymiarowego modelu Coxa. Wartość P < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Wyniki
Charakterystyka wyjściowa w grupie ACI i w grupie ACI z współistniejącym OSAS
Jak pokazano w Tabeli 1, grupa ACI składała się z 68 mężczyzn i 32 kobiet, o średnim wieku 62,84 ± 12,65 lat, natomiast grupa ACI z współistniejącym OSAS obejmowała 116 mężczyzn i 54 kobiety, o średnim wieku 61,31 ± 11,25 lat. W grupie ACI z współistniejącym OSAS odnotowano istotnie wyższe wartości AHI, wyniki w skali NIHSS oraz poziomy CRP. Jednakże w obu grupach stwierdzono porównywalny rozkład wieku, płci, BMI, nadciśnienia tętniczego, DM, kardiopatii, dyslipidemii, palenia tytoniu, spożycia alkoholu, trombolizy oraz klasyfikacji TOAST.
Zmiany w poziomach miR-486-3p i markerów zapalnych w zależności od stopnia nasilenia OSAS
Aby ocenić zależność dawka-odpowiedź między stopniem nasilenia OSAS a zmianami molekularnymi, podzieliliśmy 170 pacjentów z ACI i OSAS na podgrupy: łagodną (5 ≤ AHI < 15, n = 60), umiarkowaną (15 ≤ AHI < 30, n = 75) oraz ciężką (AHI ≥ 30, n = 35) na podstawie kryteriów AHI. Jak pokazano na Rysunku 1A–C, w czterech grupach (ACI, OSAS łagodny, umiarkowany i ciężki) zaobserwowano wyraźny wzorzec stopniowy. W szczególności ekspresja miR-486-3p progresywnie spadała od grupy ACI do podgrupy z ciężkim OSAS (Rysunek 1A, P < 0,001 vs. grupa ACI). Przeciwnie, poziomy TNF-α i CRP w surowicy wzrastały stopniowo wraz z nasileniem OSAS (Rysunek 1B,C, P < 0,001 vs. grupa ACI). Wyniki te wskazują, że obciążenie niedotlenieniem wywołane przez OSAS wiąże się ze stopniową supresją miR-486-3p oraz równoległym wzrostem stanu zapalnego w organizmie.
Wartość diagnostyczna miR-486-3p dla OSAS u pacjentów z ACI
miR-486-3p może mieć istotną wartość diagnostyczną w przypadku współistnienia ACI i OSAS, przy AUC wynoszącym 0,927 (optymalna wartość odcięcia wyniosła 0,845), a czułość i swoistość wynosiły odpowiednio 92,94% i 79,00% (Rycina 1D). Aby ocenić odporność modelu diagnostycznego i wykluczyć potencjalne przeuczenie, dla analizy ROC miR‑486‑3p przeprowadzono 5-krotną walidację krzyżową. Jak pokazano w Tabeli uzupełniającej 1, średnia wartość AUC dla pięciu serii wyniosła 0,928 (w zakresie od 0,847 do 0,969), co było wysoce spójne z pozornym AUC wynoszącym 0,927 z analizy pierwotnej. Średnia czułość i swoistość wyniosły odpowiednio 88,83% i 87,00%.
Korelacje miR-486-3p z ciężkością udaru i markerami zapalnymi w ACI współistniejącym z OSAS
W grupie ACI z OSAS analizy korelacji Spearmana wykazały, że ekspresja miR-486-3p była istotnie ujemnie skorelowana z wynikiem w skali NIHSS (Rycina 2A), TNF-α (Rycina 2B) oraz CRP (Rycina 2C).
Wskaźniki prognostyczne w grupach z dobrą i złą rokowaniem
Pacjenci z ACI i współistniejącym OSAS zostały podzielone na grupę z dobrą rokowaniem i grupę ze złą rokowaniem na podstawie wyników w skali mRS. Jak wykazano w tabeli 2, w grupie ze złą rokowaniem odnotowano wzrost wyników mRS, SAQLI i ESS oraz poziomów HIF-1α i TNF-α.
Wartość prognostyczna miR-486-3p dla rocznych wyników u pacjentów z ACI i współistniejącym OSAS
Wyniki krzywej Kaplana-Meiera wskazały, że wysokie poziomy miR-486-3p wiązały się z dobrą prognozą, natomiast niskie poziomy wiązały się z rokowaniem niekorzystnym (Rycina 2D). W analizie jednowymiarowej ekspresja miR-486-3p oraz wynik w skali NIHSS były powiązane z wynikami klinicznymi. Inne zmienne, w tym wynik SAQLI (P = 0.078), HIF-1α (P = 0.086), TNF-α (P = 0.072), wiek (P = 0.082), DM (P = 0.067), kardiopatia (P = 0.065) oraz AHI (P = 0.069), wykazały marginalnie istotne powiązania z rokowaniem, co sprawiło, że zostały one również uwzględnione w wielowymiarowej analizie Coxa. W analizie wielowymiarowej miR-486-3p pozostał niezależnym czynnikiem ochronnym (HR = 0.437, 95% CI: 0.278–0.684, P < 0.001), podczas gdy kardiopatia (HR = 1.822, 95% CI: 1.070–3.104, P = 0.027) oraz wynik w skali NIHSS (HR = 1.597, 95% CI: 1.008–2.529, P = 0.046) okazały się niezależnymi czynnikami ryzyka niekorzystnych wyników klinicznych (Tabela 3).
Podsumowanie wyników
Podsumowując, niniejsze badanie wykazało, że poziom miR‑486‑3p jest znacznie obniżony u pacjentów z ACI z chorobą współistniejącą w postaci OSAS i charakteryzuje się wysoką dokładnością diagnostyczną w identyfikacji OSAS w tej populacji. Zaobserwowano wyraźną zależność od dawki w podgrupach o różnym stopniu nasilenia OSAS, gdzie poziom miR‑486‑3p progresywnie spadał, a markery zapalne (TNF‑α i CRP) stopniowo rosły od łagodnej do ciężkiej postaci OSAS. Analizy korelacyjne dodatkowo potwierdziły, że miR‑486‑3p był ujemnie skorelowany zarówno z nasileniem udaru (NIHSS), jak i z zapaleniem systemowym. Co istotne, niska ekspresja miR‑486‑3p pozwalała przewidzieć niekorzystne rokowania funkcjonalne w okresie 1 roku, a wielowymiarowa regresja Coxa zidentyfikowała miR‑486‑3p jako niezależny czynnik ochronny po skorygowaniu o potencjalne zmienne zakłócające, w tym NIHSS i AHI. Wspólnie wyniki te wspierają hipotezę, że miR‑486‑3p może służyć jako nowy biomarker diagnostyczny i prognostyczny dla współistnienia ACI i OSAS, potencjalnie poprzez jego rolę regulacyjną w zapaleniu systemowym.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Surowe dane stanowiące podstawę wyników niniejszego badania są dostępne w Pliku uzupełniającym 1, który obejmuje charakterystykę wyjściową, poziomy ekspresji miR‑486‑3p, pomiary ELISA oraz dane z 1-rocznego okresu obserwacji w skali mRS dla wszystkich włączonych pacjentów.
Rysunek 1: Zmiany w miR-486-3p i markerach zapalnych w podgrupach ACI z różnym stopniem nasilenia OSAS oraz wydajność diagnostyczna miR-486-3p dla OSAS. (A) Względna ekspresja miR-486-3p w grupie ACI oraz podgrupach ACI z OSAS. (B) Stężenie TNF-α w surowicy. (C) Stężenie CRP w surowicy w grupie ACI (AHI < 5, n=100) oraz w podgrupach z OSAS stopnia łagodnego (5 ≤ AHI < 15, n=60), umiarkowanego (15 ≤ AHI < 30, n=75) i ciężkiego (AHI ≥ 30, n=35). (D) Krzywa ROC miR-486-3p w różnicowaniu pacjentów z ACI z OSAS od pacjentów bez OSAS. ***P < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Korelacje miR-486-3p z ciężkością udaru i markerami stanu zapalnego oraz wartość prognostyczna dla wyników po 1 roku. (A–C) Analizy korelacji Spearmana ekspresji miR-486-3p z wynikiem NIHSS, TNF-α oraz CRP. (D) Krzywe przeżywalności Kaplana-Meiera dla prawdopodobieństwa dobrego rokowania w 1-rocznej obserwacji, z podziałem według mediany ekspresji miR-486-3p. ***P < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Zmienna | ACI (n=100) | ACI i OSAS (n=170) | wartość p | |
| Wiek (lata) | 62.84 ± 12.65 | 61.31 ± 11.25 | 0.303 | |
| Płeć (mężczyzna/kobieta) | 68/32 | 116/54 | 0.968 | |
| BMI (kg/m²)2) | 24.74 ± 3.57 | 25.02 ± 3.47 | 0.531 | |
| Nadciśnienie tętnicze, n (%) | 74 (74%) | 134 (78.82%) | 0.365 | |
| DM, n (%) | 22 (22%) | 43 (25.29%) | 0.543 | |
| Kardiopatia, n (%) | 13 (13%) | 25 (14.71%) | 0.698 | |
| AHI (razy/h) | 2.07 ± 1.42 | 19.95 ± 9.19 | < 0.001*** | |
| wynik w skali NIHSS | 1.70 ± 1.18 | 4.05 ± 1.73 | < 0.001*** | |
| CRP (ng/mL) | 2.03 ± 0.17 | 3.01 ± 0.27 | < 0.001*** | |
| stopień ACI (lekki/umiarkowany) | 99/1 | 69/101 | < 0.001*** | |
| Dyslipidemia (tak/nie) | 52/48 | 96/74 | 0.478 | |
| Palenie tytoniu (tak/nie) | 48/52 | 91/79 | 0.382 | |
| Spożywanie alkoholu (tak/nie) | 40/60 | 87/83 | 0.076 | |
| Tromboliza (tak/nie) | 38/62 | 81/89 | 0.124 | |
| TOAST | 0.487 | |||
| Zatorowość sercowa (n) | 22 | 36 | ||
| Zator małych naczyń (n) | 18 | 28 | ||
| Miażdżyca dużych tętnic (n) | 13 | 25 | ||
| Udar o nieustalonej etiologii (n) | 5 | 19 | ||
| Udar o innej określonej etiologii (n) | 42 | 62 | ||
Tabela 1: Charakterystyka wyjściowa pacjentów z ACI z i bez OSAS. Dane przedstawiono jako średnia ± SD dla zmiennych ciągłych lub n (%) dla zmiennych kategorycznych. Wartości P obliczono przy użyciu niezależnego testu t dla zmiennych ciągłych oraz testu chi-kwadrat dla zmiennych kategorycznych. ACI, ostry zawał mózgu; OSAS, obturacyjny zespół bezdechu sennego; BMI, wskaźnik masy ciała; DM, cukrzyca; AHI, wskaźnik bezdechów i hipopnoe; NIHSS, skala udaru National Institutes of Health Stroke Scale; CRP, białko C-reaktywne; TOAST, Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment.
| Zmienna | Rokowanie dobre (n=97) | Złe rokowania (n=73) | wartość p |
| skala mRS | 0.88 ± 0.84 | 4.55 ± 1.08 | < 0.001*** |
| wynik SAQIL | 2.59 ± 1.17 | 3.12 ± 1.48 | 0.009** |
| wynik ESS | 8.69 ± 2.76 | 10.05 ± 2.79 | 0.002** |
| HIF-1α (pg/mL) | 1159.94 ± 277.86 | 1283.88 ± 445.15 | 0.027* |
| TNF-α (pg/ml) | 121.4 ± 12.87 | 128.4 ± 11.67 | < 0.001*** |
Tabela 2: Wskaźniki prognostyczne w grupach z dobrą i złą rokowaniem u pacjentów z ACI i OSAS. Pacjentów podzielono na grupę z dobrym rokowaniem (mRS 0–2, n = 97) oraz grupę ze złym rokowaniem (mRS 3–6, n = 73) na podstawie wyników mRS po 1 roku. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Wartości P obliczono za pomocą niezależnego testu t. mRS, zmodyfikowana skala Rankina; SAQLI, Calgary Sleep Apnea Quality of Life Index; ESS, skala senności Epwortha; HIF‑1α, czynnik indukowany hipoksją‑1α; TNF‑α, czynnik martwicy nowotworu-α.
| Zmienna | HR | Jednozmienne 95% przedziały ufności (95% CI) | P | HR | Wielowymiarowy 95% przedział ufności | P | ||
| Niższy | Górny | Niższy | Górny | |||||
| miR-486-3p | 0.442 | 0.228 | 0.679 | <0.001 | 0.437 | 0.278 | 0.684 | <0.001 |
| wynik SAQLI | 0.628 | 0.375 | 1.053 | 0.078 | 0.713 | 0.416 | 1.22 | 0.217 |
| wynik ESS | 0.922 | 0.595 | 1.429 | 0.718 | ||||
| HIF-1α | 0.694 | 0.457 | 1.053 | 0.086 | 0.802 | 0.523 | 1.229 | 0.311 |
| TNF-α | 1.469 | 0.966 | 2.233 | 0.072 | 1.494 | 0.978 | 2.284 | 0.063 |
| Wiek | 1.445 | 0.955 | 2.188 | 0.082 | 1.29 | 0.845 | 1.97 | 0.238 |
| Płeć | 0.829 | 0.534 | 1.285 | 0.401 | ||||
| BMI | 1.196 | 0.786 | 1.821 | 0.402 | ||||
| Nadciśnienie tętnicze | 0.754 | 0.465 | 1.222 | 0.252 | ||||
| DM | 1.512 | 0.972 | 2.351 | 0.067 | 1.246 | 0.79 | 1.965 | 0.343 |
| Kardiopatia | 1.611 | 0.971 | 2.673 | 0.065 | 1.822 | 1.07 | 3.104 | 0.027 |
| AHI | 1.468 | 0.97 | 2.222 | 0.069 | 1.125 | 0.734 | 1.725 | 0.588 |
| wynik NIHSS | 1.588 | 1.027 | 2.455 | 0.037 | 1.597 | 1.008 | 2.529 | 0.046 |
| Dyslipidemia | 1.178 | 0.776 | 1.788 | 0.442 | ||||
| Palenie tytoniu | 0.895 | 0.593 | 1.35 | 0.596 | ||||
| Picie | 1.116 | 0.738 | 1.689 | 0.603 | ||||
| Tromboliza | 1.259 | 0.834 | 1.902 | 0.272 | ||||
Tabela 3: Jednowymiarowe i wielowymiarowe analizy regresji Coxa dla rokowania niepomyślnego w okresie 1 roku u pacjentów z ACI i OSAS. HR, hazard ratio (iloraz ryzyka); CI, przedział ufności; SAQLI, Calgary Sleep Apnea Quality of Life Index; ESS, skala senności Epwortha; HIF‑1α, czynnik indukowany hipoksją‑1α; TNF‑α, czynnik martwicy nowotworu‑α; BMI, wskaźnik masy ciała; DM, cukrzyca; AHI, indeks bezdechów i spłyceń oddechowych; NIHSS, National Institutes of Health Stroke Scale (skala NIH dla udarów). Zmienne z wartością P < 0,1 w analizie jednowymiarowej zostały wprowadzone do wielowymiarowego modelu Coxa.
Rycina uzupełniająca 1: Schemat blokowy wyboru pacjentów i stratyfikacji podgrup.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 1: Pięciokrotna walidacja krzyżowa dla wewnętrznej walidacji wartości diagnostycznej miR‑486‑3p. AUC, pole pod krzywą; CI, przedział ufności. Średnia AUC, czułość i swoistość zostały obliczone jako średnia arytmetyczna z pięciu podzbiorów.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 1: Surowe dane stanowiące podstawę wyników niniejszego badania.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Pacjenci z OSAS doświadczają nawracających zapadań i niedrożności dróg oddechowych, co prowadzi do przerywanej hipoksji (IH) i nadmiernej senności w ciągu dnia (EDS), które mogą powodować uszkodzenia neuronalne14OSA występuje z wysoką częstotliwością po ACI, dotykając około 72% pacjentów, i znacząco zwiększa ryzyko sercowo-naczyniowe15ACI stanowi spektrum deficytów neurologicznych wynikających z ogniskowego niedokrwienia i niedotlenienia mózgu wtórnych do niewystarczającej perfuzji16Przerywana hipoksja, stanowiąca centralny element patologii OSAS, prawdopodobnie wykazuje efekt synergistyczny z niedokrwiennym uszkodzeniem w przebiegu ACI, nasilając uszkodzenia mózgu. Niemniej jednak badania koncentrujące się konkretnie na tym wysokiego ryzyka stanie współistniejącym są nieliczne. Narastające dowody wskazują, że miRNA odgrywają kluczową rolę w patogenezie zarówno OSAS, jak i ACI.17,18Wcześniej zauważono, że miR-486-3p może być powiązany z OSAS oraz ACI. W związku z tym zbadaliśmy miR-486-3p jako potencjalny łącznik molekularny między OSAS a ACI. Należy zaznaczyć, że kohorta ta została zrekrutowana od listopada 2020 do grudnia 2023 roku, czyli w okresie obejmującym pandemię COVID-19. Nagromadzone dowody sugerują, że utrzymujący się stan zapalny w organizmie wywołany zakażeniem SARS-CoV-2 może zaostrzać uszkodzenia neuronów i sprzyjać progresji zmian neurodegeneracyjnych.19,20Niniejsze badanie nie koncentruje się jednak na zakażeniu SARS-CoV-2/COVID-19, a cele i projekt naszej pracy nie są powiązane z COVID-19. Stwierdzono znacznie niższy poziom miR-486-3p w surowicy u pacjentów z ACI w połączeniu z OSAS, co stanowi wstępny dowód kliniczny na jego rolę w tej chorobie współistniejącej i podkreśla potrzebę dalszych badań.
Skala NIHSS pozwala ocenić ciężkość udaru11. Wskaźnik AHI w badaniu polisomnograficznym jest powszechnie stosowany do diagnozowania OSAS, a wyższy wynik AHI wskazuje na cięższy przebieg OSAS21. Biorąc pod uwagę kliniczne i logistyczne trudności związane z polisomnografią, kluczowe jest zidentyfikowanie dostępnych biomarkerów obturacyjnego bezdechu sennego u pacjentów po udarze22. Obecne wyniki wskazują, że miR-486-3p wykazuje istotny potencjał diagnostyczny w przypadku współwystępowania ACI i OSAS, ponieważ jego poziomy korelują odwrotnie zarówno ze wskaźnikiem AHI, jak i wynikiem w skali NIHSS, odzwierciedlając tym samym ciężkość choroby.
Pod względem metodologicznym badanie to wykazuje możliwość zintegrowania profilowania molekularnego z ilościowym fenotypowaniem klinicznym w jednej kohorcie w celu jednoczesnej oceny dokładności diagnostycznej, zależności dawka-odpowiedź oraz wartości prognostycznej. Ta zintegrowana struktura może służyć jako punkt odniesienia dla przyszłych badań nad odkrywaniem biomarkerów w chorobach współistniejących związanych z udarem, w których złożone interakcje między wieloma ścieżkami patofizjologicznymi często komplikują tradycyjne analizy o pojedynczym punkcie końcowym.
IH jest cechą charakterystyczną OSAS i indukuje stan zapalny oraz uszkodzenia tkanek poprzez aktywację prozapalnych szlaków sygnałowych23. Co istotne, ten stan zapalny przenika się z patogenezą ACI i ją zaostrza, przy czym zapalenie po niedokrwieniu pośredniczy w wtórnym uszkodzeniu mózgu24,25. Kluczowe mediatory stanu zapalnego, takie jak TNF-α i CRP, są podwyższone w obu schorzeniach, znajdując się w punkcie przecięcia kaskad zapalnych indukowanych przez hipoksję i wywołanych niedokrwieniem, co czyni je kluczowymi cząsteczkami w patologii współistniejącego ACI i OSA26,27,28. W związku z tym oznaczono stężenia TNF-α i CRP w surowicy pacjentów z ACI i współistniejącym OSAS. W niniejszym badaniu zaobserwowane ujemne korelacje między poziomami surowiczego miR-486-3p a poziomami TNF-α i CRP w przypadku ACI z współistniejącym OSAS sugerują potencjalny związek między tym miRNA a ogólnoustrojowym stanem zapalnym charakterystycznym dla tego współistniejącego stanu chorobowego.
OSAS ma bardzo niekorzystny wpływ na jakość życia, a SAQLI jest kwestionariuszem jakości życia specyficznym dla OSA29. EDS jest częstym objawem OSAS, a OSAS współwystępujący z EDS prowadzi do większej liczby zdarzeń niepożądanych i gorszych rokowań30. ESS jest powszechnie stosowane do określania nasilenia senności w ciągu dnia31. W OSAS nawracające epizody IH są uważane za niezależny czynnik ryzyka chorób naczyniowych32. Ponadto stres oksydacyjny wynikający z IH może prowadzić do powikłań, takich jak osteoporoza, zwiększone ryzyko sercowo-naczyniowe i zmiany neurologiczne33. Dlatego w niniejszym badaniu zbadano również ekspresję HIF-1α. Stwierdzenie podwyższonego poziomu HIF-1α w grupie z gorszymi rokowaniami w przypadku ACI połączonego z OSAS jest zgodne z patofizjologią przewlekłej przerywanej hipoksji w OSAS. Co więcej, wyniki wykazały, że miR-486-3p i TNF-α korelowały z rokowaniami w ACI połączonym z OSAS, a niskie poziomy miR-486-3p wiązały się z gorszymi rokowaniami. Sugeruje to potencjalną kaskadę, w której indukowany przez IH HIF-1α hamuje miR-486-3p, co przyczynia się do upregulacji mediatorów stanu zapalnego, takich jak TNF-α, nasilając tym samym uszkodzenie mózgu w ACI.
Niniejsze badanie nadal posiada pewne ograniczenia. Badanie to jest ograniczone brakiem grup kontrolnych (osób zdrowych, osób wyłącznie z OSAS), co uniemożliwia zdefiniowanie prawidłowego zakresu dla miR-486-3p oraz odróżnienie zmian specyficznych dla współistnienia chorób od tych występujących wyłącznie w OSAS. Dlatego też przyszłe prace muszą uwzględniać te grupy, aby w pełni opisać profil ekspresji miR-486-3p. Ponadto samo wnioskowanie o specyficznym mechanizmie regulacyjnym miR-486-3p wyłącznie na podstawie korelacji jest niewystarczające. Dalszą weryfikację jego mechanizmu molekularnego przeprowadzimy w przyszłych eksperymentach.
Z perspektywy translacyjnej, wysoka dokładność diagnostyczna i niezależna wartość prognostyczna miR‑486‑3p sugerują kilka potencjalnych zastosowań klinicznych. Jako biomarker z krwi mógłby on zostać włączony do rutynowej diagnostyki udaru w celu zidentyfikowania pacjentów z ACI z współistniejącym OSAS, co ułatwiłoby wczesne skierowanie na polisomnografię i szybką interwencję. Monitorowanie poziomów miR‑486‑3p w fazach ostrej i podostrej może pomóc w śledzeniu dynamiki stanu zapalnego i stratyfikacji pacjentów pod kątem ryzyka prognostycznego, co umożliwi zastosowanie spersonalizowanych strategii rehabilitacyjnych. Te kierunki translacyjne wymagają dalszych badań w prospektywnych badaniach wieloośrodkowych. Podsumowując, miR-486-3p może uczestniczyć w patomechanizmie ACI połączonego z OSAS poprzez regulację czynników zapalnych oraz posiada wartość diagnostyczną i prognostyczną w przypadku ACI połączonego z OSAS.
Oświadczenia
Niniejsze badanie zostało sfinansowane w ramach projektu „Research on Stroke Prevention and Treatment Technologies” (nr WKZX2023CZ0143).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Skaner MRI 3,0 T | Siemens Healthineers, Niemcy | MAGNETOM Skyra | Obrazowanie mózgu w celu potwierdzenia ostrego zawału mózgu |
| Mikropłytki ELISA 96-dołkowe | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Chiny | płytka XBS | Reakcja antygen-przeciwciało w detekcji metodą ELISA |
| Wytyczne praktyki klinicznej AASM dotyczące zaburzeń oddychania podczas snu | American Academy of Sleep Medicine | pełny wytyczne z 2020 r. | Zstandaryzowane kryteria diagnostyczne AHI oraz kryteria stratyfikacji ciężkości OSAS |
| Chińska zwalidowana wersja Indeksu Jakości Życia w Bezdechu Sennym w Calgary (SAQLI) | University of Calgary | wydanie tłumaczone z 2021 r. | Ocena jakości życia u pacjentów z ACI powikłanym przez OSAS |
| Próżniowe probówki do pobierania krwi z EDTA-K2 5 ml | BD Biosciences, USA | 367863 | Pobieranie krwi żylnej obwodowej w celu wyizolowania surowicy |
| Chińska zwalidowana wersja Skali Senności Epworth (ESS) | Johns Hopkins University | wydanie zaktualizowane 2018 | Ocena senności w ciągu dnia u pacjentów po udarze mózgu |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Software, USA | Wersja 9.4.1 | Wykresy rozrzutu, wykresy pudełkowe, wizualizacja krzywej ROC |
| Zestaw ELISA do oznaczania ludzkiego białka CRP | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, Chiny | XBS-H001 | Ilościowe oznaczanie białka C-reaktywnego w surowicy |
| Ludzki HIF-1α Zestaw ELISA | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, Chiny | XBS-H007 | Ilościowe oznaczanie czynnika indukowanego hipoksją 1 w surowicyα |
| Ludzki TNF-α Zestaw ELISA | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, Chiny | XBS-H003 | Ilościowe oznaczanie TNF-α w surowicyα czynnik zapalny |
| IBM SPSS Statistics 23.0 | IBM, Armonk, NY, USA | Wersja 23.0 | Wszystkie analizy statystyczne (test t, korelacja, ROC, Kaplan–(model Kaplana-Meiera, regresja Coxa) |
| Spektrofotometr do mikropłytek | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | Multiskan FC | Pomiar absorbancji dla płytek ELISA przy 450 nm |
| miR-486-3p & Startery qPCR dla U6 | Sangon Biotech, Szanghaj, Chiny | Synteza na zamówienie | Amplifikacja genu docelowego i genu referencyjnego do qPCR |
| Zestaw miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy | 218073 | Ilościowa amplifikacja miR-486-3p i U6 metodą real-time PCR |
| Chińska zwalidowana wersja skali udaru NIH (NIHSS) | National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), USA | Standardowe wydanie kliniczne | Wstępna ocena stopnia nasilenia deficytów neurologicznych u pacjentów z ACI |
| Oprogramowanie do scoringu snu w PSG | BMC Medical Co., Ltd., Chiny | v3.2 | Zautomatyzowana wstępna ocena zdarzeń oddechowych podczas snu |
| System do analizy PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 6 Pro | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | QuantStudio 6 Pro | Amplifikacja RT-qPCR, pozyskiwanie krzywej topnienia, rejestracja wartości Ct |
| Oprogramowanie QuantStudio Real-Time PCR | Applied Biosystems, USA | v1.7 | Eksport surowych danych qPCR, analiza wartości Ct |
| Chłodząca wirówka laboratoryjna | Xiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., Hunan, Chiny | TDZ5-WS | Oddzielanie surowicy z krwi pełnej (2700 × g, 4 °C) |
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1691 | Odwrotna transkrypcja miRNA z surowicy do cDNA |
| Probiówki do mikrocentryfugi 1,5 ml wolne od RNaz | Axygen, USA | MCT-150-C | Aliquotowanie i przechowywanie odseparowanej surowicy |
| Odczynnik do izolacji RNA TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15596026 | Ekstrakcja całkowitego RNA z próbek ludzkiej surowicy |
| Zamrażarka ultra niskotemperaturowa | Haier Biomedical, Shandong, Chiny | DW-86L388 | Długoterminowe przechowywanie próbek surowicy w temperaturze −80 °C |
| Monitor polisomnograficzny YH-600B | BMC Medical Co., Ltd., Pekin, Chiny | YH-600B | Nocny monitoring snu i obliczanie wskaźnika AHI w diagnostyce OSAS |
Bibliografia
- Lv R, et al. Pathophysiological mechanisms and therapeutic approaches in obstructive sleep apnea syndrome. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):218.
- Gleeson M, McNicholas WT. Bidirectional relationships of comorbidity with obstructive sleep apnoea. Eur Respir Rev. 2022;31(164):210256.
- Seiler A, et al. Prevalence of sleep-disordered breathing after stroke and TIA: a meta-analysis. Neurology. 2019;92(7):e648-e654.
- Zhou Y, et al. Correlation between obstructive sleep apnea and hypoperfusion in patients with acute cerebral infarction. Front Neurol. 2024;15:1363053.
- Du W, Fan L, Du J. Neuroinflammation-associated miR-106a-5p serves as a biomarker for the diagnosis and prognosis of acute cerebral infarction. BMC Neurol. 2023;23(1):248.
- Tang Y, et al. Analysis of carotid vulnerable plaque MRI high-risk features and clinical risk factors associated with concomitant acute cerebral infarction. BMC Cardiovasc Disord. 2023;23(1):173.
- Santamaria-Martos F, et al. Circulating microRNA profile as a potential biomarker for obstructive sleep apnea diagnosis. Sci Rep. 2019;9(1):13456.
- Sheng B, et al. Exosome-mediated delivery of miR-486-3p alleviates neuroinflammation via. SIRT2-mediated inhibition of mitophagy after subarachnoid hemorrhage. Stroke Vasc Neurol. 2025;10(3):335-346.
- May AM, Mehra R. Obstructive sleep apnea: role of intermittent hypoxia and inflammation. Semin Respir Crit Care Med. 2014;35(5):531-544.
- Verjans R, et al. Functional screening identifies microRNAs as multicellular regulators of heart failure. Sci Rep. 2019;9(1):6055.
- Kwah LK, Diong J. National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS). J Physiother. 2014;60(1):61.
- Tanellari O, et al. Study on quality of life of patients with obstructive sleep apnea: pilot study. Medicina (Kaunas). 2025;61(7):1234.
- Hajikarim-Hamedani A, Rassa S, Tarjoman T, Shafiei M. Assessment of sleep patterns in migraine sufferers using the Epworth Sleepiness Scale. J Headache Pain. 2025;26(1):58.
- Liu X, et al. The relationship between inflammation and neurocognitive dysfunction in obstructive sleep apnea syndrome. J Neuroinflammation. 2020;17(1):229.
- Dharmakulaseelan L, Boulos MI. Sleep apnea and stroke: a narrative review. Chest. 2024;166(4):857-866.
- Song XD, Li SX, Zhu M. Plasma miR-409-3p promotes acute cerebral infarction via. suppressing CTRP3. Kaohsiung J Med Sci. 2021;37(4):324-333.
- Wu Z, et al. Integrated analysis of competitive endogenous RNA networks in acute ischemic stroke. Front Genet. 2022;13:833545.
- Li K, Wei P, Qin Y, Wei Y. MicroRNA expression profiling and bioinformatics analysis of dysregulated microRNAs in obstructive sleep apnea patients. Medicine (Baltimore). 2017;96(34):e7917.
- Sriram S, Mehkri Y, Quintin S, Lucke-Wold B. Shared pathophysiology: understanding stroke and Alzheimer's disease. Clin Neurol Neurosurg. 2022;218:107306.
- Small C, Mehkri Y, Panther E, Felisma P, Lucke-Wold B. Coronavirus disease 2019 and stroke: pathophysiology and management. Can J Neurol Sci. 2023;50(4):495-502.
- Tamin S, et al. Association between laryngopharyngeal reflux and obstructive sleep apnea in adults. PeerJ. 2022;10:e13303.
- Fabbri M, et al. Measuring subjective sleep quality: a review. Int J Environ Res Public Health. 2021;18(3):1082.
- Song R, Baker TL, Watters JJ, Kumar S. Obstructive sleep apnea-associated intermittent hypoxia-induced immune responses in males, pregnancies, and offspring. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1852.
- Liu X, et al. Effects of Kudiezi injection on serum inflammatory biomarkers in patients with acute cerebral infarction. Dis Markers. 2018;2018:7936736.
- Liang Z, et al. Effects of remote ischemic postconditioning on the proinflammatory neutrophils of peripheral blood in acute cerebral infarction. Aging (Albany NY). 2023;15(10):4481-4497.
- Imani MM, et al. Serum and plasma tumor necrosis factor alpha levels in individuals with obstructive sleep apnea syndrome: a meta-analysis and meta-regression. Life (Basel). 2020;10(6):87.
- Bian F, Kang S, Cui H, Wang F, Luan T. The clinical efficacy of compound Danshen injection on acute cerebral infarction and on the changes in the CRP, D-dimer, and IL-6 levels. Am J Transl Res. 2021;13(7):8126-8133.
- Tie YX, Fu YY, Xu Z, Peng Y. Relationship between C-reactive protein levels and obstructive sleep apnea syndrome. Genet Mol Res. 2016;15(2): DOI:10.4238/gmr.15027808.
- Dutt N, Janmeja AK, Mohapatra PR, Singh AK. Quality of life impairment in patients of obstructive sleep apnea and its relation with the severity of disease. Lung India. 2013;30(4):289-294.
- Feng X, et al. Test-retest reliability of Epworth Sleepiness Scale score in patients with untreated obstructive sleep apnea. Nat Sci Sleep. 2024;16:2299-2309.
- Lapin BR, Bena JF, Walia HK, Moul DE. The Epworth Sleepiness Scale: validation of one-dimensional factor structure in a large clinical sample. J Clin Sleep Med. 2018;14(8):1293-1301.
- Zolotoff C, et al. Obstructive sleep apnea, hypercoagulability, and the blood-brain barrier. J Clin Med. 2021;10(14):3099.
- Meliante PG, et al. Molecular pathology, oxidative stress, and biomarkers in obstructive sleep apnea. Int J Mol Sci. 2023;24(6):5478.