Lasery tulowe, erbowe i diodowe w odkażaniu kanałów korzeniowych: aktywność przeciwko Enterococcus faecalis oraz bezpieczeństwo termiczne ex vivo

Podsumowanie

Niniejszy protokół porównuje lasery diodowe, tulowe i erbowe w zakresie dezynfekcji wewnątrzkanalowej w modelu kanału korzeniowego Enterococcus faecalis ex vivo, oceniając skuteczność przeciwbakteryjną oraz temperaturę zewnętrznej powierzchni korzenia w celu zidentyfikowania bezpiecznych i skutecznych parametrów naświetlania.

Streszczenie

Irygacja wspomagana laserem stała się obiecującą metodą uzupełniającą dezynfekcję kanałów korzeniowych; jednak dowody bezpośrednio porównujące różne systemy laserowe w zstandaryzowanych warunkach doświadczalnych pozostają ograniczone. W niniejszym badaniu ex vivo porównano skuteczność przeciwbakteryjną i bezpieczeństwo termiczne lasera diodowego 808 nm, lasera tulowego 1940 nm oraz lasera erbowego 2940 nm w dekontaminacji wewnątrzkanałowej przeciwko Enterococcus faecalis. Zstandaryzowane, zainfekowane próbki ludzkich kanałów korzeniowych poddano działaniu z użyciem klinicznie istotnych parametrów napromieniowania. Skuteczność przeciwbakteryjną oceniono na podstawie redukcji jednostek tworzących kolonie (CFU) oraz analizy krzywej wzrostu bakterii, natomiast bezpieczeństwo termiczne oceniono poprzez pomiar zmian temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia podczas napromieniowania laserowego. Wszystkie trzy systemy laserowe wykazały większą aktywność przeciwbakteryjną niż grupa kontrolna traktowana solą fizjologiczną. Laser erbowy osiągnął najwyższy średni stopień inhibicji (9,0%) przy 30 mJ przez 30 s, utrzymując jednocześnie wzrost temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia poniżej przyjętego progu bezpieczeństwa termicznego wynoszącego 10°C. Laser tulowy wykazał porównywalną aktywność przeciwbakteryjną, lecz przekroczył próg bezpieczeństwa termicznego przy najwyższych ustawieniach napromieniowania. Laser diodowy wykazał niższą skuteczność przeciwbakteryjną i większe wzrosty temperatury niż lasery tulowy i erbowy w testowanych warunkach. W ramach ograniczeń tego modelu ex vivo, laser erbowy 2940 nm wykazał najkorzystniejszą równowagę między skutecznością przeciwbakteryjną a bezpieczeństwem termicznym i stanowi obiecujące podejście uzupełniające w dezynfekcji wewnątrzkanałowej.

Wprowadzenie

Główną przyczyną zapalenia miazgi i okołowierzchołkowego zapalenia tkanek jest zakażenie bakteryjne systemu kanałów korzeniowych¹. Według jednego z badań Enterococcus faecalis został zidentyfikowany jako dominujący izolat bakteryjny u pacjentów z przewlekłą lub nawracającą infekcją po leczeniu endodontycznym^2,3. Bakteria ta posiada liczne czynniki wirulencji, w tym zdolność do tworzenia biofilmu; potrafi ona przenikać do kanalików zębinowych na głębokość do 80 µm i przetrwać w warunkach ograniczonej dostępności składników odżywczych^2,3. Właściwości te przyczyniają się do jej oporności na standardowe środki dezynfekcyjne stosowane wewnątrz kanałów podczas leczenia endodontycznego, a także na naturalne mechanizmy obronne organizmu. W związku z tym niemożność całkowitego usunięcia pozostałych komórek E. faecalis z systemu kanałów korzeniowych jest istotną przyczyną niepowodzeń w leczeniu endodontycznym⁴.

Obecne leczenie kanałowe łączy mechaniczne oczyszczanie za pomocą instrumentarium z irygacją chemiczną, co pomaga w eliminacji mikroorganizmów z systemu kanałów korzeniowych⁵. Chociaż instrumentacja mechaniczna jest bardzo skuteczna w redukcji populacji bakterii, wiele obszarów w obrębie złożonej anatomii kanału korzeniowego pozostaje niedostępnych dla samego instrumentarium⁵. W związku z tym środki irygacyjne pełnią istotną rolę w dezynfekcji systemu kanałów korzeniowych. Badania wykazały jednak, że nawet najsilniejsze środki chemiczne nie są w stanie całkowicie wyeliminować biofilmów bakteryjnych⁶. Co więcej, niektóre środki chemiczne stosowane podczas leczenia endodontycznego mogą naruszać integralność strukturalną zębiny^6,7. Aby zwiększyć skuteczność dezynfekcji i osiągnąć pełniejsze usunięcie biofilmów bakteryjnych z systemu kanałów korzeniowych, zbadano kilka metod aktywacji środków irygacyjnych. Wśród nich irygacja aktywowana laserem wyłoniła się jako jedna z bardziej obiecujących alternatyw⁸. Oceniano również potencjał laserów diodowych, tulowych i erbowych w generowaniu efektów fototermalnych i fotomechanicznych zdolnych do rozrywania ścian komórkowych bakterii oraz biofilmów⁹.

Interakcja między poszczególnymi typami laserów a tkankami, z którymi oddziałują, różni się znacząco w zależności od długości fali. Lasery diodowe, które zazwyczaj emitują światło o długościach fal od 808 do 980 nm, są pochłaniane przez chromofory w tkankach biologicznych, co prowadzi do reakcji fototermicznej, w której dochodzi do denaturacji białek i eliminacji bakterii¹⁰. Lasery tulowe pracują przy 1940 nm i wykazują wysoką absorpcję w wodzie. Wykazano zatem, że lasery tulowe są dobrze dostosowane do środowisk wilgotnych, w tym do kanałów korzeniowych wypełnionych roztworem płuczącym¹. Ze względu na wysoką absorpcję wody, lasery tulowe mogą szybko podgrzewać i odparowywać ciecz podczas stosowania w irygowanych kanałach korzeniowych. Odparowanie generuje fale uderzeniowe, które mogą pomagać w rozrywaniu biofilmu bakteryjnego. Lasery erbowe, w szczególności te pracujące przy 2940 nm, posiadają najwyższy współczynnik absorpcji wody spośród laserów stomatologicznych¹². W irygowanych kanałach właściwość ta może generować eksplozywne odparowanie i fale uderzeniowe, które mechanicznie odrywają i zabijają bakterie, jednocześnie potencjalnie ograniczając przekazywanie ciepła do otaczającej zębiny¹³.

Choć zainteresowanie technologią laserową w praktyce endodontycznej stale rośnie, wiele kwestii dotyczących optymalnych parametrów klinicznych dla różnych systemów laserowych pozostaje nieznanych. Obecne metody stosowania w praktyce klinicznej opierają się zazwyczaj na doświadczeniu empirycznym lub wytycznych producenta, przy ograniczonym wsparciu opartym na dowodach¹⁴. Ponadto większość dotychczasowych badań oceniała działanie przeciwdrobnoustrojowe laserów; jednak istotny aspekt terapii laserowej otrzymał stosunkowo mniejszą uwagę: ryzyko uszkodzenia termicznego tkanek periodontu. Powszechnie przyjmuje się, że wzrost temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia o więcej niż 10°C może prowadzić do trwałego uszkodzenia więzadła ozębnego i otaczającej kości¹⁵. Wydaje się, że nie opublikowano bezpośredniego porównania różnych systemów laserowych, które w sposób systematyczny oceniałoby zarówno ich skuteczność przeciwdrobnoustrojową, jak i bezpieczeństwo termiczne w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych.

Głównym celem niniejszego badania ex vivo była analiza i porównanie skuteczności przeciwdrobnowej oraz bezpieczeństwa termicznego trzech systemów laserowych — lasera diodowego 808 nm, lasera tulowego 1940 nm oraz lasera erbowego 2940 nm — w usuwaniu biofilmu E. faecalis ze ścian kanałów korzeniowych. W celu zidentyfikowania kombinacji parametrów, które zapewniają skuteczną eliminację bakterii przy zachowaniu bezpieczeństwa termicznego, w badaniu oceniono klinicznie istotne parametry napromieniowania. Przewiduje się, że wyniki te pomogą klinicystom w wyborze bezpiecznych i skutecznych metod dezynfekcji endodontycznej wspomaganej laserem.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi Szpitala Czwartego Ludowego w Szanghaju (Shanghai Fourth People’s Hospital), Wydziału Medycznego Uniwersytetu Tongji i zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (numer zatwierdzenia 2026013-001). Wyekstrahowane ludzkie zęby wykorzystane w niniejszym badaniu zostały pobrane od pacjentów, u których dokonano ekstrakcji zębów z przyczyn ortodontycznych lub periodontalnych. Przed pobraniem próbek od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę. Na potrzeby niniejszego badania nie przeprowadzono żadnych dodatkowych interwencji klinicznych. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wymogami instytucjonalnymi dotyczącymi wykorzystania wyekstrahowanych ludzkich zębów.

Przygotowanie próbek i kryteria wyboru
Z Kliniki Stomatologii przy Szpitalu Czwartego Ludowego w Szanghaju, powiązanym z Uniwersytetem Tongji, otrzymano łącznie 141 niedawno usuniętych jednokanałowych zębów trwałych (siekaczy i przedtrzonowców dolnych). Wszystkie zęby zostały usunięte z przyczyn ortodontycznych lub periodontalnych. Od każdego pacjenta uzyskano świadomą zgodę. Do badania włączono zęby o długości korzenia co najmniej 10 mm (oznaczonej za pomocą sondy periodontalnej), zęby zdrowe, bez ubytków próchnicznych lub pęknięć, z całkowicie uformowanym korzeniem i krzywizną korzenia mniejszą niż 10 stopni według metody Schneidera. Z badania wykluczono zęby z wieloma kanałami, z wapnieniem kanału, resorpcją wewnętrzną lub przebytym leczeniem endodontycznym. Po ekstrakcji wszystkie widoczne złogi kamienia oraz pozostałości tkanek miękkich usunięto za pomocą skalera periodontalnego. Zęby przechowywano następnie w 0,9% roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 4°C do momentu użycia, aby zapobiec odwodnieniu; wszystkie eksperymenty przeprowadzono w ciągu trzech miesięcy od ekstrakcji. Próbki przydzielono do grup eksperymentalnych przy użyciu zdefiniowanej naprzemiennej sekwencji alokacji. W szczególności próbki przydzielano sekwencyjnie do każdej grupy w sposób naprzemienny, aż do osiągnięcia wymaganej liczby próbek w każdej grupie. Nie przeprowadzono formalnych obliczeń mocy a priori. Wielkość próby wybrano na podstawie wcześniejszych porównywalnych badań ex vivo, liczby ocenianych kombinacji parametrów napromieniania oraz dostępności odpowiednich zębów usuniętych.

Przygotowanie i sterylizacja kanałów korzeniowych
Koronę każdego zęba usunięto na poziomie połączenia cementowo-nasieciowego za pomocą wolnoobrotowej piły diamentowej przy ciągłym chłodzeniu wodnym, aby uzyskać znormalizowany odcinek korzenia o długości 10 mm. Długość roboczą wyznaczono jako 1 mm krótszą od otworu wierzchołkowego, używając pilnika K rozmiaru 10. Kanały korzeniowe przygotowano przy użyciu rotacyjnego systemu niklowo-tytanowego ProTaper Universal zgodnie z instrukcją producenta, stosując sekwencję S1, S2, F1, F2 i F3, aż do uzyskania rozmiaru przygotowania wierzchołkowego F3. Podczas instrumentacji kanały płukano około 2 mL 5,25% podchlorynu sodu po użyciu każdego pilnika rotacyjnego, co dało całkowitą objętość irygacji wynoszącą około 10 mL na kanał. Płukanie końcowe wykonano przy użyciu 5 mL 17% EDTA przez 1 min, a następnie 5 mL sterylnej soli fizjologicznej. Otwór wierzchołkowy uszczelniono płynnym kompozytem żywicznym, aby stworzyć zamknięty system kanałowy. Przygotowane korzenie wysterylizowano w autoklawie w temperaturze 121°C przez 20 min, przechowywano w sterylnym roztworze soli fosforanowej (PBS) w temperaturze 4°C i zaszczepiono bakteriami w ciągu 24 h po sterylizacji.

Szczep bakteryjny i warunki hodowli
Do opracowania modelu zainfekowanego kanału korzeniowego wykorzystano E. faecalis ATCC 29212. Szczep hodowano na agarze BHI (brain heart infusion) w temperaturze 37°C przez 24 h w warunkach tlenowych. Pojedynczą kolonię przeniesiono do bulionu BHI i inkubowano w temperaturze 37°C przez 18–24 h. Zawiesinę bakteryjną dostosowano do stężenia około 1,5 × 10⁸ CFU/mL, co odpowiada standardowi 0,5 wg पैमाने McFarland, wykorzystując wartość gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) na poziomie 0,08–0,10.

Ustanowienie E. faecalis Model zainfekowanego kanału korzeniowego
Aby stworzyć model biofilmu w zainfekowanym kanale korzenia, zewnętrzną powierzchnię każdego wysterylizowanego korzenia pokryto dwiema warstwami bezbarwnego lakieru do paznokci, aby zapobiec penetracji bakterii przez cement. Obszar apikalny pokryto lakierem po uprzednim uszczelnieniu otworu wierzchołkowego płynnym kompozytem żywicznym, natomiast otwór kanału pozostawiono niezakryty, aby umożliwić inokulację bakteryjną. Używając sterylnej mikropipety, 10 µL z / od / do (zależnie od kontekstu) E. faecalis zawiesinę przeniesiono do każdego z poszczególnych kanałów korzeniowych, aby wypełnić całą ich długość, unikając wycieku poza kanał. Następnie zaszczepione próbki umieszczono pojedynczo w sterylnych 24-dołkowych płytkach hodowlanych, dodając 1,5 ml bulionu BHI do każdego dołka. Próbki inkubowano w 37°C w warunkach tlenowych przez 21 dni. Pożywkę wzrostową usuwano i zastępowano świeżą sterylną pożywką BHI co 2 dni, aby zapewnić składniki odżywcze do dalszego wzrostu bakterii oraz usunąć nagromadzone szczątki komórkowe. Podczas wymiany pożywki nie przeprowadzano dodatkowego szczepienia E. faecalis. Po zakończeniu okresu inkubacji wszystkie żywe próbki przemyto raz solą fizjologiczną (PBS), aby usunąć słabo przytwierdzone bakterie planktoniczne przed przeprowadzeniem badań eksperymentalnych. Dwie losowo wybrane próbki wykorzystano do wizualizacji dojrzałego biofilmu oraz penetracji bakterii do kanalików dentynowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Próbki utrwalono w 2,5% glutaraldehydzie w 4°C przez 24 h, przepłukano trzykrotnie w PBS, odwodniono w serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu (30%, 50%, 70%, 80%, 90% i 100%), z czasem trwania każdego etapu 10 min, następnie przekrojono wzdłużnie, wysuszono na powietrzu, zamocowano na podstawkach aluminiowych, napylono złotem i poddano analizie za pomocą SEM.

Grupy eksperymentalne i protokoły naświetlania laserowego
135 zainfekowanych próbek korzeni podzielono na trzy główne grupy eksperymentalne w zależności od zastosowanego systemu laserowego: grupę lasera diodowego 808 nm, grupę lasera tulowego 1940 nm oraz grupę lasera erbowego 2940 nm. W każdej grupie laserowej znajdowało się 45 próbek, które następnie podzielono na podgrupy zgodnie z parametrami naświetlania. Laser diodowy pracował przy średniej mocy 1,0, 1,5 lub 2,0 W, a każde ustawienie mocy było stosowane przez 10, 20 lub 30 s, co dało dziewięć podgrup po trzy próbki w każdej podgrupie. Laser tulowy pracował przy średniej mocy 1,5, 2,5 lub 3,5 W, a każde ustawienie mocy było stosowane przez 10, 20 lub 30 s, co również dało dziewięć podgrup po trzy próbki w każdej podgrupie. Laser erbowy pracował w trybie ultrakrótkich impulsów przy stałej częstotliwości 15 Hz. Energie impulsów 10, 20 lub 30 mJ stosowano przez 10, 20 lub 30 s, tworząc dziewięć podgrup po trzy próbki w każdej podgrupie. Zarówno laser diodowy 808 nm, jak i laser tulowy 1940 nm pracowały w trybie ciągłym.

Łącznie włączono sześć dodatkowych próbek, z czego po trzy próbki przypisano do grup kontrolnej ujemnej i kontrolnej dodatniej. Grupę kontrolną ujemną traktowano sterylną solą fizjologiczną, natomiast grupę kontrolną dodatnią traktowano 5,25% podchlorynem sodu (NaOCl) przez 30 s.

W grupach laserowych zastosowano standaryzowany protokół naświetlania. Włókno optyczne wprowadzono do kanału korzeniowego do długości roboczej, a następnie przesuwano je powolnym, ciągłym ruchem spiralnym w kierunku od wierzchołka do korony przez cały czas trwania naświetlania. Zamiast jednego wymiennego włókna stosowano włókna dostawcze lub końcówki specyficzne dla danego lasera. Laser diodowy 808 nm był dostarczany za pomocą włókna end-firing 200 µm, laser tulowy 1940 nm za pomocą włókna end-firing 200 µm, a laser erbowy 2940 nm za pomocą końcówki radial-firing 400 µm. Włókno dostawcze lub końcówkę wycofywano z prędkością około 1 mm/s. Po dotarciu do ujścia kanału włókno było ponownie wprowadzane do długości roboczej, a ruch spiralny od wierzchołka do korony powtarzano do momentu zakończenia wyznaczonego czasu naświetlania.

W przypadku laserów tulowego i erbnego kanały pozostawiano wypełnione sterylną solą fizjologiczną podczas naświetlania, aby symulować laserową aktywację wspomaganą wodą. Przed naświetlaniem do każdego kanału wprowadzano około 10 µL sterylną soli fizjologicznej, aby wypełnić go do poziomu ujścia kanału. W razie potrzeby sól fizjologiczną uzupełniano przed każdym cyklem naświetlania, aby utrzymać wypełnienie kanału cieczą przez cały czas trwania zabiegu. W grupie z laserem diodowym kanały przed naświetlaniem osuszano sterylnymi papierowymi czopami, ponieważ laser diodowy 808 nm wykazuje stosunkowo niską absorpcję w wodzie i był stosowany w celu uzyskania bezpośredniego fototermicznego efektu przeciwbakteryjnego wewnątrz kanału. Z kolei lasery tulowy 1940 nm i erbny 2940 nm charakteryzują się znacznie większą absorpcją wody, dlatego stosowano je w kanałach wypełnionych solą fizjologiczną, aby ułatwić wystąpienie fototermicznych i fotomechanicznych efektów pośredniczonych przez wodę. Zabieg laserowy powtarzano raz dziennie przez trzy kolejne dni.

Pomiar temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia
Zmiany temperatury na zewnętrznej powierzchni korzenia w czasie rzeczywistym mierzono podczas pierwszego dnia naświetlania laserem. Każdy preparat korzenia zamocowano pionowo na statywie laboratoryjnym w temperaturze pokojowej (22°C ± 1°C). Termoparę typu K, podłączoną do cyfrowego termometru, przyłożono ściśle do środkowej jednej trzeciej zewnętrznej powierzchni korzenia, prostopadle do jego osi długiej. Sonda termopary została ustawiona za pomocą regulowanego zacisku i przymocowana do powierzchni korzenia za pomocą żaroodpornej taśmy klejącej, aby zapewnić stały i stabilny kontakt podczas pomiaru. Sonda termopary była kalibrowana przed każdą sesją pomiarową przy użyciu wrzącej wody (100°C) oraz mieszaniny lodu i wody (0°C). Odczyty temperatury rejestrowano w odstępach 50 ms przez cały okres naświetlania (10, 20 lub 30 s). Dla każdego preparatu mierzono zarówno temperaturę bazową, jak i maksymalną temperaturę odnotowaną w trakcie lub bezpośrednio po naświetlaniu laserem. Wzrost temperatury od wartości bazowej do szczytowej obliczono jako ΔT. Przyjęto, że ΔT przekraczające 10°C stanowi próg potencjalnego uszkodzenia tkanek okresu protetycznego.

Ocena mikrobiologiczna: liczenie kolonii i stopień inhibicji
W celu określenia działania antybakteryjnego zabiegów laserowych, po każdym zabiegu pobrano próbki. Kanał osuszono sterylnymi papierowymi punktami. Do każdego preparatu użyto nowej sterylnej pilnika Hedströma o rozmiarze 40, aby pobrać opiłki dentyny ze ścian kanału, zapobiegając tym samym kontaminacji krzyżowej między próbkami. Każdy opiłek dentyny przeniesiono do oddzielnej probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 mL sterylnego PBS. Probówki mieszczano intensywnie na wortexie przez 30 s, aby uwolnić bakterie z opiłków dentyny. Przygotowano seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne od 10⁻¹ do 10⁻⁶, przenosząc 100 µL zawiesiny bakteryjnej do 900 µL sterylnego PBS na każdym etapie rozcieńczania. Alikwoty (30 µL) z każdego rozcieńczenia wymazano na oddzielnych płytkach z agarem BHI (brain heart infusion), które inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 h. Kolonie przeliczono i zapisano jako jednostki tworzące kolonie (CFU). Każde rozcieńczenie wysiano w trzech powtórzeniach, a do analizy wykorzystano średnią liczbę kolonii z trzech płytek. Przed liczeniem płytki zakodowano, a badacz wykonujący liczenie kolonii nie wiedział, który preparat został poddany jakiemu zabiegowi.

W tym przypadku C to średnia liczba CFU w grupie kontrolnej ujemnej (solanka), a T to średnia liczba CFU w grupie badawczej.

Analiza krzywej wzrostu bakterii
Wpływ różnych zabiegów laserowych na kinetykę wzrostu bakterii badano poprzez wykreślenie krzywych wzrostu. W 3. dniu po ostatnim zabiegu laserowym kanały przemyto 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Treść kanałów zebrano za pomocą sterylnych papierowych adapterów, które następnie przeniesiono do probówki do wirowania zawierającej 5 ml pożywki BHI. Probówkę wymieszano na wirówce typu vortex, aby zawiesić bakterie w pożywce. Zawiesinę bakteryjną dostosowano do poziomu 1 × 10⁶ CFU/ml. Stężenie bakterii skorygowano na podstawie wartości OD₆₀₀ pomiary z wykorzystaniem wcześniej opracowanej krzywej kalibracyjnej dla *E. faecalis* ATCC 29212, co następnie zweryfikowano poprzez liczenie żywych kolonii. Alikwot 200 µL zawiesiny dodano do każdego dołka sterylnej mikropłytki 96-dołkowej. Ponadto, 20 µL do każdej studni dodano sterylny olej mineralny w celu zminimalizowania parowania. Mikropłytkę umieszczono w spektrofotometrze/inkubatorze utrzymującym temperaturę 37°Coraz OD₆₀₀ pomiar wykonywano co godzinę przez 24 h. Przed każdym pomiarem OD600 mikroplate poddawano wstrząsaniu orbitalnemu z prędkością około 300 obr./min przez 10 s w celu zapewnienia homogeniczności zawiesiny bakteryjnej. Każdą próbkę badano w pięciu powtórzeniach w osobnych dołkach.

Analiza statystyczna
Wszystkie dane liczbowe przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Analizy statystyczne wykonano przy użyciu programu SPSS w wersji 26.0. Rozkład danych oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka. Do porównania więcej niż dwóch grup wykorzystano analizę wariancji (ANOVA), a następnie test Tukey'a (HSD) dla porównań parzystych. Porównania między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą testu t dla prób niezależnych. Homogeniczność wariancji oceniono za pomocą testu Levene'a przed zastosowaniem testów parametrycznych. W przypadku naruszenia założenia o homogeniczności wariancji zastosowano, w zależności od potrzeb, poprawkę Welcha. Istotność statystyczną zdefiniowano jako P < 0,05. Wykresy wygenerowano przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 9.0.

Wyniki

Działanie przeciwbakteryjne różnych zabiegów laserowych przeciwko E. faecalis
Skuteczność przeciwbakteryjną trzech systemów laserowych przeciwko E. faecalis oceniono poprzez oznaczenie liczby CFU po trzech kolejnych zabiegach. Wyniki przedstawiono na Rysunku 1 oraz Rysunku uzupełniającym 1. W grupie kontrolnej negatywnej (sterylna sól fizjologiczna) odnotowano znaczny wzrost bakterii, przy średniej wartości szarości liczby kolonii wynoszącej 396618,7 ± 67787,5. Grupa kontrolna pozytywna (5,25% NaOCl) osiągnęła ogólną średnią stopę inhibicji na poziomie 47,2% ± 3,0%, przy indywidualnych wartościach inhibicji wynoszących 46,8%, 43,1% oraz 51,7%.

Rycina 1: Skuteczność przeciwbakteryjna zabiegów laserowych przeciwko Enterococcus faecalis. Wskaźniki hamowania bakterii po trzech kolejnych dniach leczenia za pomocą systemów laserowych: diodowego 808 nm, tulowego 1940 nm oraz erbowego 2940 nm przy zastosowaniu różnych parametrów napromieniowania. Podchloryn sodu (NaOCl), 5,25%, posłużył jako kontrola pozytywna, a sterylna sól fizjologiczna jako kontrola negatywna z 0% hamowania. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) z n = 3 niezależnych próbek na grupę zabiegową. Słupki błędów reprezentują SD. * oznacza P < 0,05, ** oznacza P < 0,01, a *** oznacza P < 0,001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wszystkie grupy poddane działaniu lasera wykazały wyższe wskaźniki inhibicji niż grupa kontrolna dodatnia z 5,25% NaOCl. Zwiększoną aktywność przeciwbakteryjną zaobserwowano wraz ze wzrostem mocy lasera lub energii impulsu oraz przy dłuższym czasie naświetlania. Na przykład w grupie z laserem diodowym 808 nm średni wskaźnik inhibicji wzrósł z 53,1% ± 6,5% przy 1,0 W przez 10 s do 80,2% ± 2,6% przy 2,0 W przez 30 s. Statystycznie istotną różnicę odnotowano pomiędzy grupami leczonymi przy 1,0 W przez 30 s a 2,0 W przez 30 s (P < 0,01).

Laser tulowy 1940 nm wykazał większą aktywność przeciwbakteryjną niż laser diodowy w większości testowanych warunków. Przy mocy 1.5 W przez 10 s średni stopień inhibicji wyniósł 78.8% ± 1.9%. Przy mocy 2.5 W przez 30 s stopień inhibicji wzrósł do 91.6% ± 0.4%. Najwyższy stopień inhibicji w grupie lasera tulowego zaobserwowano przy mocy 3.5 W przez 30 s, osiągając wartość 97.4% ± 0.8%. Wartość ta była istotnie wyższa niż w grupie kontrolnej dodatniej 5.25% NaOCl (P < 0.001) oraz w przypadku lasera diodowego 808 nm przy mocy 2.0 W przez 30 s (P < 0.001).

Laser erbowy o długości fali 2940 nm wykazał największą aktywność przeciwbakteryjną spośród trzech badanych systemów laserowych. Przy energii 10 mJ przez 10 s średni stopień inhibicji wyniósł 84,3% ± 1,5%. Przy 20 mJ przez 30 s stopień inhibicji wyniósł 96,5% ± 2,0%. Najwyższy stopień inhibicji zaobserwowano przy 30 mJ przez 30 s, osiągając wartość 99,0% ± 0,6%. Wartość ta była istotnie wyższa niż w grupie kontrolnej dodatniej z 5,25% NaOCl (P < 0,001), w grupie lasera tulowego 1940 nm przy 2,5 W przez 30 s (P < 0,01) oraz we wszystkich grupach leczonych laserem diodowym 808 nm (P < 0,001).

Wyniki wykazują, że wszystkie trzy systemy laserowe wykazały aktywność przeciwbakteryjną wobec E. faecalis, przy czym zwiększanie parametrów napromieniowania było zazwyczaj powiązane z wyższymi stopniami hamowania. Wśród badanych warunków najwyższe hamowanie przeciwbakteryjne osiągnął laser erbowy 2940 nm, a następnie laser tulowy 1940 nm i laser diodowy 808 nm, co potwierdza hipotezę badawczą, że dezynfekcja wewnątrzkanałowa wspomagana laserem może skutecznie zmniejszyć obciążenie bakteryjne w badanych warunkach eksperymentalnych.

Wpływ zabiegów laserowych na kinetykę wzrostu bakterii
Ponowny wzrost bakterii po zabiegu oceniono poprzez pomiar OD₆₀₀ w ciągu 24 h. Wyniki przedstawiono na Rysunku 2 oraz Rysunku uzupełniającym 2. Grupa kontrolna z jałową solą fizjologiczną wykazała typowy wzorzec wzrostu bakterii, składający się z około 4 h fazy adaptacyjnej, po której nastąpił szybki wzrost wykładniczy między 4 a 12 h oraz faza stacjonarna z maksymalnymi wartościami OD600 w zakresie od 1,167 do 1,245.

Rycina 2: Krzywe wzrostu Enterococcus faecalis po zabiegu laserowym. Kinetyka wzrostu Enterococcus faecalis wyizolowanego z leczonych kanałów korzeniowych w ciągu 24 h, mierzona jako gęstość optyczna przy 600 nm (OD₆₀₀). Przedstawiono reprezentatywne krzywe wzrostu dla kontroli w postaci sterylnej soli fizjologicznej, kontroli z 5,25% podchlorynu sodu (NaOCl) oraz wybranych grup leczonych laserem diodowym 808 nm, tulowym 1940 nm i erbowym 2940 nm. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) z n = 3 niezależnych próbek, przy pięciu technicznych powtórzeniach w dołkach dla każdej próbki. Słupki błędu reprezentują SD. * oznacza P < 0,05, ** oznacza P < 0,01, a *** oznacza P < 0,001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Grupy poddane działaniu lasera diodowego 808 nm wykazały zależne od parametrów hamowanie wzrostu bakterii. Przy mocy 1,0 W przez 10 s krzywa wzrostu była podobna do grupy z 5,25% NaOCl, a wzrost wykładniczy rozpoczął się w około 8 h. Przy mocy 2,0 W przez 30 s faza lag została wydłużona do około 10 h, a wartość OD₆₀₀ po 14 h była znacząco niższa niż w grupie z 5,25% NaOCl (0,559 ± 0,042 vs 0,934 ± 0,042, P < 0,001).

Grupy poddane działaniu lasera tulowego o długości fali 1940 nm wykazały silniejsze hamowanie wzrostu bakterii niż grupy poddane działaniu lasera diodowego. Przy mocy 1,5 W przez 10 s wzrost wykładniczy rozpoczął się mniej więcej po 10 h. Przy 2,5 W przez 30 s faza adaptacyjna została wydłużona do około 11 h, przy czym wartości OD600 były znacznie niższe niż w przypadku zarówno kontroli z jałową solą fizjologiczną, jak i lasera diodowego 808 nm przy 2,0 W przez 30 s w odpowiadającym punkcie czasowym (P < 0,001 dla obu). Przy 3,5 W przez 30 s wzrost bakterii pozostał wyraźnie zahamowany, a wartości OD600 utrzymywały się na poziomie około 0,15 lub poniżej, począwszy od 12 h i pozostając w zasadzie niezmienione w dalszym czasie.

Grupy poddane działaniu lasera erbowego 2940 nm wykazały największe zahamowanie ponownego wzrostu bakterii. Przy energii 10 mJ przez 10 s nie zaobserwowano wykładniczego wzrostu bakterii aż do około 10 h po zabiegu. Zwiększenie energii impulsu dodatkowo opóźniło początek wzrostu wykładniczego. Przy 30 mJ przez 30 s wzrost wykładniczy został opóźniony do około 12 h, podczas których średnia wartość OD600 pozostawała poniżej 0,20. W 12. godzinie wartość OD600 dla grupy lasera erbowego 2940 nm poddanego działaniu energii 30 mJ przez 30 s była znacząco niższa niż w grupie lasera diodowego 808 nm poddanego działaniu mocy 2,0 W przez 30 s (0,120 ± 0,001 vs 0,274 ± 0,044, P < 0,001).

Ogólnie wszystkie trzy systemy laserowe opóźniły ponowny wzrost bakterii w porównaniu z grupami kontrolnymi, przy czym obserwowano progresywnie silniejszą supresję wraz ze wzrostem parametrów napromieniowania. W badanych warunkach laser erbowy 2940 nm wywołał największe zahamowanie ponownego wzrostu bakterii, a następnie laser tulowy 1940 nm i laser diodowy 808 nm, co potwierdza hipotezę badawczą.

Ocena bezpieczeństwa termicznego różnych zabiegów laserowych na zewnętrznej powierzchni korzenia
Oprócz aktywności przeciwbakteryjnej oceniono bezpieczeństwo termiczne trzech systemów laserowych, mierząc wzrost temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia (ΔT). Wzrost temperatury przekraczający 10°C uznano za próg potencjalnego uszkodzenia tkaneky okresu). Wyniki przedstawiono na Rysunku 3.

Rycina 3: Zmiany temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia podczas naświetlania laserem. Zmiany temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia (ΔT) po naświetlaniu systemami laserowymi: diodowym 808 nm, tulowym 1940 nm i erbowym 2940 nm przy zastosowaniu różnych parametrów naświetlania. Pozioma linia przerywana oznacza próg 10°C, który jest powszechnie wiązany z potencjalnym uszkodzeniem tkanek okołowierzchołkowych. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) z n = 3 niezależnych próbek. Słupki błędu reprezentują SD. * oznacza P < 0,05, ** oznacza P < 0,01, a *** oznacza P < 0,001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Laser diodowy 808 nm spowodował największy wzrost temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia. Przy mocy 1.0 W przez 10 s średni wzrost temperatury (ΔT) wyniósł 6.0°C ± 0.7°C. Wydłużenie czasu naświetlania do 30 s przy zachowaniu tej samej mocy zwiększyło średnie ΔT do 10.4°C ± 0.9°C. Przy mocy 2.0 W przez 30 s średnie ΔT wzrosło dalej do 14.8°C ± 3.8°C, przekraczając próg bezpieczeństwa 10°C we wszystkich próbkach.

Laser tulowy o długości fali 1940 nm spowodował umiarkowany wzrost temperatury. Przy mocy 1.5 W przez 10 s średnia wartość ΔT wyniosła 2.5°C ± 0.7°C. Zwiększenie mocy do 2.5 W oraz czasu naświetlania do 30 s podniosło średnią wartość ΔT do 8.8°C ± 0.9°C, przy czym w jednej próbce osiągnięto 10.2°C. Przy mocy 3.5 W przez 30 s średnia wartość ΔT wzrosła do 12.7°C ± 1.9°C, a we wszystkich próbkach przekroczono próg bezpieczeństwa wynoszący 10°C. Wzrost temperatury przy 3.5 W przez 30 s był istotnie większy niż przy 2.5 W przez 30 s (P < 0.01).

Laser erbowy 2940 nm spowodował najmniejszy wzrost temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia spośród wszystkich badanych parametrów. Przy 10 mJ przez 10 s średnia ΔT wyniosła 0,8°C ± 0,1°C. Przy maksymalnym badanym ustawieniu 30 mJ przez 30 s średnia ΔT wyniosła 3,6°C ± 1,0°C, przy czym zmierzone temperatury wahały się od 2,1°C do 5,0°C. Wszystkie zarejestrowane wzrosty temperatury pozostały poniżej progu bezpieczeństwa wynoszącego 10°C. Wzrost temperatury zaobserwowany przy użyciu lasera tulowego 1940 nm przy 3,5 W przez 30 s był znacząco większy niż ten zaobserwowany dla lasera erbowego 2940 nm przy 30 mJ przez 30 s (P < 0,01).

Ogólnie rzecz biorąc, laser erbowy 2940 nm wykazał najniższy wzrost zewnętrznej temperatury powierzchni korzenia we wszystkich testowanych warunkach, podczas gdy laser diodowy 808 nm oraz ustawienia lasera tulowego 1940 nm o wyższej mocy powodowały większe wzrosty temperatury, przy czym w niektórych warunkach przekroczono zdefiniowany próg bezpieczeństwa.

Dostępność danych:
Wszystkie surowe dane wspierające wyniki niniejszego badania zostały udostępnione w plikach uzupełniających. Reprezentatywne obrazy jednostek tworzących kolonie (CFU) oraz pełne krzywe wzrostu bakterii są dostępne odpowiednio w Rysunkach uzupełniających 1 i 2. Pomiary temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia na poziomie poszczególnych próbek znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1, a surowe dane dotyczące aktywności przeciwbakteryjnej, w tym wartości szarości powierzchni kolonii oraz obliczone wskaźniki inhibicji dla wszystkich grup badawczych, znajdują się w Tabeli uzupełniającej 2. Pliki uzupełniające te zawierają podstawowe dane, na których opierają się wyniki przedstawione w głównym manuskrypcie.

Pliki uzupełniające
Rycina uzupełniająca 1. Reprezentatywne płytki z jednostkami tworzącymi kolonie (CFU) po zabiegu laserowym u Enterococcus faecalis. Reprezentatywne płytki z agarem BHI (brain heart infusion), pokazujące jednostki tworzące kolonie (CFU) odzyskane z próbek kanałów korzeniowych po trzech kolejnych zabiegach. Próbki poddano rozcieńczeniu seryjnem (10⁻³) przed wysianiem na płytki i inkubowano przez 24 h. Przedstawiono reprezentatywne obrazy dla grup: ujemnej kontroli z jałową solą fizjologiczną, dodatniej kontroli z 5,25% podchlorynem sodu (NaOCl), laserem diodowym 808 nm (2,0 W, 30 s), laserem tulowym 1940 nm (3,5 W, 30 s) oraz laserem erbowym 2940 nm (30 mJ, 30 s). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2. Pełne krzywe wzrostu Enterococcus faecalis w ciągu 24 h po zabiegu laserowym. Kinetyka wzrostu Enterococcus faecalis odizolowanego z leczonych kanałów korzeniowych w ciągu 24 h, mierzona jako gęstość optyczna przy 600 nm (OD₆₀₀). Zawiesiny bakteryjne dostosowano do stężenia 1 × 10⁶ jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL i inkubowano w bulionie BHI (brain heart infusion) w temperaturze 37°C. Przedstawiono krzywe wzrostu dla ujemnej kontroli w postaci sterylnej soli fizjologicznej, dodatniej kontroli z 5,25% podchlorynu sodu (NaOCl) oraz wszystkich eksperymentalnych grup zabiegów laserowych: lasera diodowego 808 nm (1,0, 1,5 i 2,0 W przez 10, 20 i 30 s), lasera tulowego 1940 nm (1,5, 2,5 i 3,5 W przez 10, 20 i 30 s) oraz lasera erbowego 2940 nm (10, 20 i 30 mJ przy 15 Hz przez 10, 20 i 30 s). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1. Pomiary zewnętrznej temperatury powierzchni korzenia podczas napromieniowania laserowego.
Zewnętrzne temperatury powierzchni korzenia przed i po napromieniowaniu podano dla każdego preparatu leczonego laserem diodowym 808 nm, tulowym 1940 nm lub erbowym 2940 nm przy wskazanych warunkach mocy lub energii impulsu oraz czasu napromieniowania. Różnicę temperatur obliczono jako ΔT = temperatura po napromieniowaniu − temperatura przed napromieniowaniem. Dla każdej kombinacji parametrów oceniono trzy niezależne preparaty. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2. Surowe dane z analizy jednostek tworzących kolonie (CFU) dla aktywności przeciwbakteryjnej po zabiegu laserowym.
Przedstawiono wartości szarości obszaru kolonii oraz obliczone wskaźniki inhibicji dla każdego preparatu po zabiegu laserem diodowym 808 nm, tulowym 1940 nm lub erbowym 2940 nm przy wskazanych parametrach naświetlania. Jako grupy kontrolne negatywną i pozytywną posłużyły odpowiednio sól fizjologiczna oraz 5,25% podchloryn sodu (NaOCl). Wskaźnik inhibicji obliczono w stosunku do grupy kontrolnej z solą fizjologiczną. Dla każdego warunku zabiegowego przeanalizowano trzy niezależne preparaty. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niniejsze badanie ex vivo porównywało skuteczność przeciwbakteryjną i bezpieczeństwo termiczne laserów diodowego 808 nm, tulowego 1940 nm oraz erbowego 2940 nm w eliminowaniu biofilmu E. faecalis z zainfekowanych kanałów korzeniowych. Wszystkie trzy systemy laserowe wykazały silniejsze hamowanie wzrostu bakterii niż 5,25% NaOCl; jednak ich skuteczność przeciwbakteryjna i profile termiczne istotnie się różniły. Laser erbowy 2940 nm osiągnął najkorzystniejszą ogólną równowagę, łącząc najwyższą aktywność przeciwbakteryjną z najmniejszym wzrostem temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia. Laser tulowy 1940 nm również wykazał wysoką skuteczność przeciwbakteryjną, choć przy najwyższych parametrach napromieniowania przekroczył próg bezpieczeństwa termicznego wynoszący 10°C. Laser diodowy 808 nm wykazał porównawczo niższą aktywność przeciwbakteryjną i mniej korzystne bezpieczeństwo termiczne. Wyniki te wskazują, że długość fali lasera oraz parametry napromieniowania są istotnymi czynnikami w zachowaniu równowagi między dezynfekcją wewnątrzkanalową a bezpieczeństwem tkanek periodontu¹⁶. Należy jednak ostrożnie interpretować bezpośrednie porównania między różnymi systemami laserowymi, ponieważ każda długość fali ma odmienne wskazania kliniczne, systemy dostarczania energii i mechanizmy działania. Niniejsze badanie porównywało skuteczność przeciwbakteryjną w zestandaryzowanych warunkach ex vivo, lecz optymalne zastosowanie każdego lasera może zależeć od konkretnego scenariusza klinicznego, celów leczenia i dostępnego instrumentarium.

Różnice w wynikach uzyskanych przy użyciu trzech systemów laserowych można w dużej mierze wyjaśnić ich zależnymi od długości fali oddziaływaniami z wodą, dentyną i biofilmem bakteryjnym. Laser diodowy o długości fali 808 nm jest słabo absorbowany przez wodę i działa przede wszystkim poprzez bezpośrednie efekty fototermiczne. Lasery diodowe mogą eliminować bakterie poprzez indukowaną ciepłem denaturację białek i rozrywanie błon bakteryjnych¹⁷. Jednak ich skuteczność zależy od tego, jak blisko włókno laserowe styka się z docelowymi bakteriami lub jak blisko nich się znajduje, co jest trudne do osiągnięcia w złożonej anatomii systemu kanałów korzeniowych. Może to wyjaśniać, dlaczego laser diodowy wywołał jedynie umiarkowany stopień inhibicji bakterii, nawet przy mocy 2.0 W przez 30 s. Analiza krzywej wzrostu wykazała, że część bakterii przetrwała zabieg laserem diodowym i zachowała zdolność do ponownego wzrostu, co sugeruje, że istniejący biofilm nie został całkowicie usunięty¹⁸. Laser tulowy o długości fali 1940 nm wykazuje większą absorpcję wody niż laser diodowy i może wywoływać zarówno efekty fototermiczne, jak i fotomechaniczne w wypełnionych płynem kanałach¹⁹. Ta większa absorpcja wody może tłumaczyć jego silniejszy efekt przeciwbakteryjny; prowadzi ona jednak również do większych wzrostów temperatury przy wyższych ustawieniach mocy. Na przykład naświetlanie mocą 3.5 W przez 30 s spowodowało wyraźne działanie przeciwbakteryjne, ale przekroczyło zalecany próg 10°C w celu uniknięcia uszkodzenia tkaneky periodontalnych^1,20. Wydaje się zatem, że istnieje kompromis między uzyskaniem wystarczającej dezynfekcji zainfekowanych kanałów korzeniowych a uniknięciem nadmiernych wzrostów temperatury, które mogłyby potencjalnie uszkodzić otaczające tkanki. Systemów laserowych tych nie należy uważać za bezpośrednio zamienne, ponieważ ich długości fal mają różne główne chromofory i mechanizmy przekazywania energii. Laser diodowy wywołuje przede wszystkim bezpośrednie efekty fototermiczne, podczas gdy lasery tulowe i erbowe silniej oddziałują z wodą wewnątrz kanału i generują dodatkowe efekty pośredniczone przez płyny. Zatem obserwowane różnice mogą odzwierciedlać zarówno parametry naświetlania, jak i odmienne mechanizmy działania trzech systemów laserowych.

Laser erbowy o długości fali 2940 nm wykazał najkorzystniejszy profil ogólny, głównie ze względu na silną absorpcję przez wodę²¹Po aktywacji w nawodnionym kanale energia lasera jest szybko pochłaniana przez cienką warstwę wody, co wywołuje kawitację, fale uderzeniowe oraz ruchy cieczy zdolne do mechanicznego rozbicia biofilmów przy jednoczesnym ograniczeniu przekazywania ciepła do zewnętrznej powierzchni korzenia.^21,22Mechanizm ten może wyjaśniać, dlaczego laser erbowy osiągnął najwyższy stopień inhibicji, utrzymując jednocześnie wszystkie wzrosty temperatury związane z napromieniowaniem w obrębie zdefiniowanego progu bezpieczeństwa. Zatem w warunkach doświadczalnych ocenianych w niniejszym badaniu ex vivo, laser erbowy wykazał najkorzystniejszą równowagę między skutecznością przeciwbakteryjną a bezpieczeństwem termicznym spośród badanych systemów laserowych. Jednakże wyniki te ograniczają się do przebadanych ex vivo warunkach i nie wykazują przewagi klinicznej lasera erbowego. Co więcej in vivo a przed przełożeniem tych wyników na zalecenia w leczeniu klinicznym niezbędne są badania kliniczne. Odnotowany niższy stopień inhibicji w przypadku zastosowania 5,25% NaOCl jest również istotny. NaOCl od dawna jest stosowany jako standardowy roztwór płuczący do eliminacji bakterii podczas leczenia endodontycznego; jednak jego działanie przeciwbakteryjne może być ograniczone w dojrzałych biofilmach i głębokich kanalikach zębinowych ze względu na ograniczoną penetrację, neutralizację chemiczną oraz ochronny charakter macierzy biofilmu^23,24Wyniki te sugerują, że efekty fizyczne wywołane przez lasery, w tym kawitacja, fale uderzeniowe i strumieniowanie akustyczne, mogą zwiększyć skuteczność eliminacji bakterii w porównaniu z samą irygacją podchlorynem sodu.^8,25W związku z tym wyniki niniejszego badania wspierają zastosowanie irygacji wspomaganej laserem jako metody uzupełniającej do dezynfekcji kanałów korzeniowych, a nie jako zamiennika dla konwencjonalnych protokołów irygacji. Roztwór soli fizjologicznej oraz NaOCl zostały włączone odpowiednio jako negatywna i konwencjonalna kontrola chemiczna, ponieważ głównym celem badania było porównanie trzech systemów laserowych w zestandaryzowanych warunkach eksperymentalnych. Badanie nie zostało zaprojektowane w celu porównania naświetlania laserowego ze współczesnymi protokołami irygacji aktywowanej sonicznie, ultradźwiękowo lub innymi metodami. W konsekwencji brak tych grup porównawczych ogranicza znaczenie kliniczne otrzymanych wyników, co powinno zostać uwzględnione w przyszłych badaniach.

Bezpieczeństwo termiczne pozostaje istotnym aspektem w zastosowaniach klinicznych. Naświetlanie laserem diodowym przez 30 s przekroczyło lub zbliżyło się do progu 10°C przy kilku parametrach naświetlania, co sugeruje potencjalne ryzyko uszkodzenia tkanek periodontu²⁶. Lasery tulowe wykazały silniejsze działanie przeciwbakteryjne niż lasery diodowe; jednak ich margines bezpieczeństwa zawężał się przy wyższych ustawieniach mocy, szczególnie przy 3,5 W przez 30 s. W przeciwieństwie do nich, laser erbowy 2940 nm utrzymywał wzrost temperatury poniżej 5°C nawet przy najwyższym testowanym ustawieniu. Wyniki te sugerują, że przy stosowaniu laserów diodowych lub tulowych konieczny jest staranny dobór parametrów, podczas gdy laser erbowy wykazał szerszy margines bezpieczeństwa termicznego w warunkach ocenianych w niniejszym badaniu.

Niniejsze badanie posiada kilka ograniczeń. Po pierwsze, wykorzystano w nim model ex vivo, który nie może w pełni odwzorować środowiska biologicznego infekcji klinicznej. W szczególności brak perfuzji krwi oraz fizjologicznego chłodzenia tkanek może wpływać na rozpraszanie ciepła i zmiany temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia. Ponadto brak odpowiedzi immunologicznej gospodarza oznacza, że wyniki dotyczące działania przeciwbakteryjnego odzwierciedlają jedynie bezpośrednie efekty napromieniowania laserem i nie uwzględniają odpornościowo zapośredniczonego usuwania bakterii. Po drugie, zbadano tylko jeden gatunek bakterii, E. faecalis, podczas gdy większość zainfekowanych kanałów korzeniowych zawiera biofilmy polimikrobowe.²⁷Model jednopatogenowy nie jest w stanie odtworzyć interakcji międzygatunkowych, heterogenicznej struktury biofilmu ani zmiennej podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe, które są charakterystyczne dla klinicznych zakażeń polimikrobowych. W związku z tym obserwowana skuteczność przeciwbakteryjna względem *E. faecalis* nie powinny być uogólniane na całą społeczność drobnoustrojów występującą w zainfekowanych kanałach korzeniowych. Po trzecie, wszystkie eksperymenty przeprowadzono w statycznych warunkach laboratoryjnych, podczas gdy na zęby in vivo wpływają otaczające je tkanki oraz perfuzja krwi, co może oddziaływać na rozpraszanie ciepła²⁸W końcu oceniono jedynie wybrane kombinacje długości fali i parametrów napromieniowania. Testowane długości fali wybrano tak, aby reprezentowały systemy laserowe o różnych charakterystykach absorpcji wody i mechanizmach działania przeciwbakteryjnego, natomiast ustawienia napromieniowania dobrano tak, aby odzwierciedlały klinicznie wykonalne poziomy mocy lub energii oraz czasy ekspozycji. Niemniej jednak ograniczona liczba kombinacji parametrów ogranicza możliwość generalizacji wyników, a w przyszłych badaniach należy ocenić dodatkowe ustawienia. Chociaż E. faecalis często stosowany jako organizm reprezentatywny w badaniach endodontycznych ze względu na swoją trwałość i oporność na działanie środków przeciwdrobnoustrojowych, nie powinien być jednak uważany za jedyny wskaźnik zakażenia endodontycznego lub niepowodzenia leczenia. Zakażenia kliniczne mają zazwyczaj charakter polimikrobowy, w związku z czym konieczne są przyszłe badania z wykorzystaniem wielogatunkowych modeli biofilmu, aby lepiej odzwierciedlić złożoność mikrobioty kanału korzeniowego.

Podsumowując, każdy z systemów laserowych wykazał większą aktywność przeciwbakteryjną wobec E. faecalis niż samo 5,25% NaOCl. W warunkach eksperymentalnych ocenianych w tym badaniu ex vivo, laser erbowy 2940 nm wykazał najkorzystniejszą równowagę między skutecznością przeciwbakteryjną a bezpieczeństwem termicznym. Laser tulowy 1940 nm również wykazał silną aktywność przeciwbakteryjną; jednakże ustawienia wyższej mocy zwiększały ryzyko termicznego uszkodzenia tkanek. Laser diodowy 808 nm wykazał niższą skuteczność przeciwbakteryjną i mniej korzystne bezpieczeństwo termiczne niż lasery tulowe i erbowe. Wyniki te wspierają dalsze badania nad dezynfekcją wspomaganą laserem erbowym 2940 nm jako obiecującą metodą uzupełniającą w leczeniu endodontycznym²⁹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.9% roztwór soli fizjologicznej	Beyotime	ST341-50ml	Przechowywanie zębów, irygacja i kontrola ujemna
Probówka do mikrocentryfugi 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C	Pobieranie próbek i rozcieńczanie seryjne
Płytka hodowlana 24-dołkowa	Corning	3524	Inkubacja biofilmu
Mikropłytka 96-dołkowa	Corning	359	Analiza krzywej wzrostu bakterii
Autoklaw	Tuttnauer	2540E	Sterylizacja przygotowanych korzeni
Agar BHI (Brain heart infusion)	BD Biosciences	21065	Hodowla bakterii i wyliczanie CFU
Pożywka BHI (Brain heart infusion)	BD Biosciences	237500	Hodowla bakterii i analiza krzywej wzrostu
Przezroczysty lakier do paznokci	Beyotime	C0187	Uszczelnianie zewnętrznej powierzchni korzenia
Piła diamentowa (niskobiegowa)	Buehler	IsoMet Low Speed Saw	Sekcjonowanie koron
Termometr cyfrowy (kompatybilny z termoparą typu K)	OMEGA Engineering	HH802U	Pomiar temperatury zewnętrznej powierzchni korzenia
Enterococcus faecalis ATCC 29212	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 29212	Szczep bakteryjny
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 17%	Sigma-Aldrich	E984	Końcowe płukanie kanału
Kompozyt żywiczny płynny	3M ESPE	6031A2	Uszczelnianie otworu wierzchołkowego
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.0 • RRID: SCR_02798	Generowanie wykresów
Pilnik Hedström, rozmiar 40	Dentsply Maillefer	8060301042	Pobieranie opiłków dentyny
Pilnik K, rozmiar 10	Dentsply Maillefer	80-0210	Wyznaczanie długości roboczej
System laserowy, włókno domieszkowane tulenem 1940 nm	Menovex Medical Technology (Shenzhen) Co., Ltd. (Arpadent)	TN20	Naświetlanie laserowe
System laserowy, Er:YAG 2940 nm	PointNix Co., Ltd.	Modular-beam	Naświetlanie laserowe
System laserowy, diodowy 808 nm	elexxion AG	Claros Nano	Naświetlanie laserowe
Mikropipeta	Eppendorf	31230063	Inokulacja próbek
Olej mineralny (sterylny)	Sigma-Aldrich	M5904	Zapobieganie parowaniu podczas analizy krzywej wzrostu bakterii
Rotacyjny system pilników niklowo-tytanowych (przygotowanie F3)	Dentsply Sirona	ProTaper Gold	Przygotowanie kanału korzeniowego
Włókno optyczne dla lasera włóknistego domieszkowanego tulenem 1940 nm	Menovex Medical Technology (Shenzhen) Co., Ltd. (Arpadent)	40 µm średnicy	Naświetlanie laserowe
Włókno optyczne dla lasera Er:YAG 2940 nm	PointNix Co., Ltd.	60 µm średnicy	Naświetlanie laserowe
Włókno optyczne dla lasera diodowego 808 nm	elexxion AG	elexxion longlife 20, 20 µm (Art. No. 1063)	Naświetlanie laserowe
Sonda periodontalna	Hu-Friedy	PCPUNC156	Pomiar długości korzenia
Skaaler periodontalny	Hu-Friedy	SJ34-35	Usuwanie kamienia i tkanek miękkich
Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna (PBS)	Gibco / Thermo Fisher Scientific	101023	Płukanie i rozcieńczanie bakterii
Końcówki do pipet (10 µL, 20 µL, 10 µL)	Axygen	T-30 / T-20-Y / T-10-B	Obsługa cieczy
Statyw laboratoryjny	Biosharp	BS-IT-01	Mocowanie próbek korzeni
Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)	Hitachi High-Technologies	TM40Plus	Obrazowanie biofilmu
Inkubator z wytrząsaniem	Thermo Fisher Scientific	MaxQ 40	Inkubacja w pożywce płynnej
Podchloryn sodu (NaOCl), 5.25%	Sigma-Aldrich	42504	Irygacja kanału i kontrola dodatnia
Spektrofotometr/inkubator (czytnik mikropłytek)	BioTek / Agilent Technologies	Epoch 2	Pomiary gęstości optycznej przy 60 nm (OD60)
SPSS	IBM	Version 26.0 • RRID: SCR_02865	Analiza statystyczna
Sterylne papierowe wkładki	Dentsply Maillefer	Absorbent Paper Points, ISO 20, 0.02 taper, 28 mm	Osuszanie kanału i pobieranie próbek bakterii
Sonda termopary (typ K)	OMEGA Engineering	80	Pomiar temperatury
Mieszadło Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie 2	Mieszanie zawiesin bakteryjnych