W tym badaniu eksploracyjnym z udziałem sześciu pacjentów z chorobą Parkinsona, którzy zostali poddani przeszczepowi mikrobioty jelitowej, zaobserwowano zmiany w czasie w zakresie różnorodności mikrobiologicznej jelit, składu taksonomicznego oraz przewidywanych profilów funkcjonalnych, a także poprawę objawów motorycznych i niemotorycznych. Wyniki te stanowią wstępne dowody wspierające dalsze badania nad interwencjami opartymi na mikrobiocie.
Artykuł badawczy
Wpływ transplantacji mikrobioty fekalnej na charakterystykę mikrobiologiczną jelit i fenotypy kliniczne u pacjentów z chorobą Parkinsona
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zmiany w mikrobiocie jelitowej są powiązane z chorobą Parkinsona (PD), jednak podłużne zmiany mikrobiologiczne po przeszczepie mikrobioty kałowej (FMT) oraz ich korelacje kliniczne pozostają słabo rozpoznane. To retrospektywne obserwacyjne badanie jednocentryczne objęło 6 pacjentów z PD, podzielonych na podgrupy o wysokim i niskim stopniu zaawansowania choroby na podstawie czasu trwania choroby (>6 lat vs ≤6 lat). Trzydzieści sześć próbek kału pobrano przed FMT oraz co miesiąc przez pięć miesięcy po zabiegu. Różnorodność mikrobiologiczną, strukturę zbiorowisk, skład taksonomiczny oraz przewidywane profile funkcjonalne oceniono za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA. Analizy obejmowały różnorodność alfa i beta, obfitość taksonomiczną, analizę wielkości efektu dyskryminanta liniowego (LEDA), przewidywanie funkcjonalne w oparciu o Tax4Fun2 oraz korelacje rang Spearmana między cechami mikrobiologicznymi a wskaźnikami klinicznymi. Analizy opisowe wykazały różnice w bogactwie mikrobiologicznym, różnorodności, strukturze zbiorowisk i przewidywanych funkcjach pomiędzy podgrupami o różnym stopniu zaawansowania choroby oraz w różnych punktach czasowych po FMT. W punkcie wyjściowym podgrupa o niskim stopniu zaawansowania wykazywała większe bogactwo i różnorodność mikrobiologiczną niż podgrupa o wysokim stopniu zaawansowania, z relatywnie wyższą obfitością taksonów, w tym Bifidobacterium i Lactobacillus. Miesiąc po FMT w podgrupie o wysokim stopniu zaawansowania odnotowano wzrost bogactwa i różnorodności względem wartości wyjściowych, czemu towarzyszyły zmiany w składzie taksonomicznym. W obu podgrupach zaobserwowano zależne od czasu zmienności różnorodności mikrobiologicznej oraz przewidywanego wzbogacenia szlaków Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes po FMT. Przewidywane funkcje obejmowały metabolizm węglowodanów i aminokwasów, biosyntezę metabolitów wtórnych, transport błonowy oraz transdukcję sygnału. Kilka jednostek operacyjnych taksonomicznych (OTU) korelowało ze wskaźnikami zaburzeń ruchowych, zaparć, jakości snu, statusu funkcjonalnego oraz objawów neuropsychiatrycznych. FMT był zatem powiązany z podłużnymi zmianami w różnorodności, składzie i przewidywanych funkcjach mikrobioty jelitowej, a określone cechy mikrobiologiczne korelowały ze wskaźnikami motorowymi i niemotorowymi. Ze względu na małą retrospektywną kohortę, wyniki te mają charakter wstępny i wymagają potwierdzenia w większych badaniach kontrolowanych. Przyszłe badania powinny ustalić, czy zmiany te są powtarzalne, utrzymują się powyżej pięciu miesięcy, odzwierciedlają przyjęcie się mikrobioty od dawcy oraz odpowiadają mierzalnej poprawie klinicznej po transplantacji w chorobie PD.
Wprowadzenie
Choroba Parkinsona (PD) jest powszechnym, postępującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się bradykinezją, sztywnością, drżeniem spoczynkowym oraz niestabilnością posturalną1. Choć jej patogeneza nie została w pełni wyjaśniona, w zapoczątkowaniu i progresji choroby zaangażowanych jest wiele czynników, w tym neurostan zapalny, ekspozycje środowiskowe oraz predyspozycje genetyczne2. Dowody epidemiologiczne wskazują, że PD należy do najczęstszych zaburzeń neurologicznych u osób starszych i wiąże się ze znacznym obciążeniem niepełnosprawnością, a jej rozpowszechnienie wzrasta wraz z wiekiem3. Obecne metody leczenia, w szczególności terapia substytucyjna dopaminą, mogą w pewnym stopniu łagodzić objawy ruchowe, jednak ich wpływ na progresję choroby oraz wiele objawów pozaruchowych pozostaje ograniczony, a reakcje na leczenie różnią się w zależności od pacjenta4. Dlatego dalsze badanie zmian biologicznych związanych z PD oraz potencjalnych celów terapeutycznych pozostaje istotne z punktu widzenia klinicznego.
Społeczność mikrobiologiczna jelit odgrywa istotną rolę w utrzymaniu integralności bariery jelitowej, regulowaniu odpowiedzi immunologicznych i wspieraniu homeostazy metabolicznej5. Przeszczep mikrobioty kałowej (FMT) polega na przeniesieniu mikrobioty kałowej od zdrowego dawcy do biorcy w celu przywrócenia równowagi mikrobiologicznej jelit6,7. Wiele badań na zwierzętach sugeruje, że przeszczep mikrobioty jelitowej może wpływać na fenotypy neurobehawioralne8,9. Biorąc pod uwagę, że mikrobiota od pacjentów z depresją lub lękiem może wywołać odpowiadające im zmiany behawioralne u myszy, mikrobiota od zdrowych dawców mogłaby poprawić wyniki behawioralne10. Ponadto wstępne obserwacje kliniczne wykazały poprawę objawów po FMT u niektórych pacjentów z PD i autyzmem, co sugeruje, że interwencje oparte na mikrobiocie mogą mieć potencjalne znaczenie w zaburzeniach neurologicznych i neuropsychiatrycznych11,12. Niemniej jednak mechanizmy leżące u podłoża tych efektów pozostają niejasne, a niezbędne są badania kliniczne w celu ustalenia bezpieczeństwa i skuteczności FMT w PD.
Choć poprzednie badania sugerowały istnienie związku między mikrobiotą jelitową a PD, podłużne zmiany w składzie mikrobiomu jelitowego po FMT oraz ich powiązania z cechami klinicznymi pozostają słabo poznane. Nie jest jasne, czy pacjenci o różnym stopniu nasilenia objawów klinicznych wykazują odmienne odpowiedzi mikrobiologiczne po FMT.
W niniejszym jednorodniowym retrospektywnym badaniu obserwacyjnym przeanalizowano pacjentów z PD, u których przeprowadzono FMT w rutynowej praktyce klinicznej. Przeanalizowano wskaźniki kliniczne przed i po FMT, a dostępne próbki kału poddano dalszej analizie za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA w celu zbadania różnorodności mikrobioty jelitowej, składu taksonomicznego, przewidywanych profili funkcjonalnych oraz korelacji ze wskaźnikami klinicznymi. Celem badania była charakterystyka wyników klinicznych i profili mikrobioty jelitowej po FMT w PD oraz dostarczenie wstępnych dowodów dla przyszłych prospektywnych badań kontrolowanych.
Protokół
Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską, a protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyki Drugiego Szpitala Powiązanego z Uniwersytetem Medycznym w Nankinie (numer zatwierdzenia: 2021-KY-100-01). Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę.
To retrospektywne obserwacyjne badanie jednomiestresowe zostało przeprowadzone w Katedrze Neurologii w Drugim Szpitalu Afiliacyjnym Uniwersytetu Medycznego w Nanjing. W okresie od stycznia 2022 do grudnia 2023 roku do badania włączono łącznie 32 pacjentów z pierwotną chorobą Parkinsona (PD), którzy spełniali kryteria diagnostyczne choroby Parkinsona (wydanie z 2020 r.). Ostatecznie do dalszej analizy zakwalifikowano sześciu pacjentów, którzy spełnili rygorystyczne kryteria wyboru i przeszli wszystkie procedury badawcze. Szczegóły dotyczące przesiewu, wykluczeń oraz obserwacji przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1.
Pobieranie próbek kału i analiza społeczności mikrobiologicznej
Mikrobiota kałowa została pozyskana od zdrowych ochotników. Proces przesiewowy dawców przeprowadzono ściśle zgodnie z chińskim konsensusem eksperckim dotyczącym klinicznego zastosowania transplantacji mikrobioty kałowej. Kryteria włączenia dawców: wiek 18–40 lat, brak historii chorób przewlekłych; brak historii chorób przewodu pokarmowego, zaburzeń metabolicznych, chorób autoimmunologicznych lub zaburzeń psychiatrycznych; brak stosowania antybiotyków, probiotyków, immunosupresantów lub inhibitorów pompy protonowej w ciągu ostatnich 3 miesięcy; brak podróży do obszarów epidemicznych, przetoczeń krwi lub historii operacji chirurgicznych w ciągu ostatnich 6 miesięcy. Badania przesiewowe krwi i kału w celu wykluczenia chorób zakaźnych i patogenów obejmowały: wirus niedoboru odporności u ludzi (HIV), wirus zapalenia wątroby B (HBV), wirus zapalenia wątroby C (HCV), Treponema pallidum, Clostridium difficile, Salmonella, Shigella, Campylobacter, patogenne Escherichia coli, wirusy jelitowe oraz pasożyty. Objętość pojedynczej prawidłowej próbki kału powinna wynosić co najmniej 50 g. Przy użyciu zautomatyzowanego systemu oczyszczania mikrobioty kałowej (patrz Tabela materiałów), do każdych 100 g świeżego kału dodano 500 mL jałowej soli fizjologicznej, przeprowadzono trzy serie standardowego wirowania i przemywania (700 × g, 3 min), a następnie niezwłocznie wykonano inokulację po przygotowaniu zawiesiny z jałową solą fizjologiczną w stosunku objętości 1:2. Obiekty otrzymały pojedynczą iniekcję 150 mL zawiesiny zawierającej około 5 × 10^13 żywych bakterii13.
Wszyscy biorcy otrzymali FMT drogą kolonoskopową, z wprowadzeniem endoskopu do kątnicy i okrężnicy wstępującej; zawiesinę wprowadzano powoli i równomiernie przez kanał biopsyjny, aby wspomóc preferencyjną kolonizację prawej części okrężnicy. Po infuzji pacjenci pozostawali w bocznej pozycji prawej przez co najmniej 2 h. Przed zabiegiem przez 3 dni stosowano dietę niskoresztkową, a następnie przez 24 h przed procedurą dietę płynną, z zachowaniem postu od pokarmów stałych przez 6 h i od płynów przez 2 h przed infuzją. Wieczorem w dniu poprzedzającym transplantację przeprowadzono standardowe oczyszczanie całego jelita za pomocą elektrolitowego roztworu glikolu polietylenowego do momentu uzyskania przejrzystego, wolnego od treści kałowej wydzieliny. Ograniczenia w stosowaniu leków obejmowały odstawienie antybiotyków systemowych na co najmniej 72 h przed FMT oraz unikanie ich stosowania przez 1 tydzień po zabiegu. Inhibitory pompy protonowej (PPI) odstawiano na 24–48 h przed procedurą, a środki przeczyszczające i probiotyki zawieszano w dniu transplantacji.
W trakcie procedury stale monitorowano tętno, ciśnienie tętnicze oraz saturację tlenem, a także obserwowano wszelkie objawy, takie jak wzdęcia brzucha, ból lub nudności; w przypadku wystąpienia silnego bólu brzucha lub hipotonii natychmiast przerywano infuzję. Przez pierwsze 7 dni po transplantacji przeprowadzano codzienną obserwację w celu zarejestrowania częstotliwości wypróżnień, konsystencji stolca oraz wszystkich zdarzeń niepożądanych, w tym bólu brzucha, biegunki, gorączki i hematochezji. Długoterminowa obserwacja trwała do 5 miesięcy i obejmowała planowe pobieranie próbek stolca do analizy mikrobioty jelitowej oraz oceny kliniczne z wykorzystaniem skali UPDRS (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale) i skali Wexner Constipation Score, wraz z dokumentacją zmian objawów i stosowania leków towarzyszących, aby kompleksowo ocenić zarówno skuteczność, jak i bezpieczeństwo.
Próbki kału pobierano w sześciu punktach czasowych: przed FMT oraz w 1., 2., 3., 4. i 5. miesiącu po FMT. Wszyscy uczestnicy otrzymali ustandaryzowane instrukcje dotyczące pobierania próbek kału. Przy użyciu sterylnej pęsety pobrano około 10–20 g środkowej części stolca i umieszczono ją w sterylnych pojemnikach do próbek. Próbki transportowano do laboratorium w ciągu 2–3 h od pobrania, a następnie przeszkoleni badacze w warunkach aseptycznych podzielili je na aliquoty do sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL (patrz Tabela materiałów). Wszystkie aliquoty natychmiast przechowywano w temperaturze −80 °C do czasu dalszej analizy.
Po pobraniu próbek kału wszystkie materiały zostały przetransportowane w suchem lodzie do komercyjnego dostawcy usług sekwencjonowania (patrz Tabela materiałów) w celu przeprowadzenia sekwencjonowania genu 16S rRNA. Przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie oraz wstępna kontrola jakości zostały wykonane zgodnie ze standardowym protokołem dostawcy. Z każdej próbki kału wyekstrahowano genomowe DNA, a następnie za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z użyciem starterów 341F i 805R przeprowadzono amplifikację hiperzmiennych regionów V3–V4 bakteryjnego genu 16S rRNA. Sekwencjonowanie wykonano na laboratoryjnej platformie do sekwencjonowania krótkich odczytów (patrz Tabela materiałów), stosując chemię dla odczytów parzystych 2 × 300 bp, aby scharakteryzować profile mikrobioty jelitowej pacjentów przed FMT oraz w różnych punktach czasowych kontroli po FMT. Po sekwencjonowaniu surowe odczyty zostały przetworzone w celu uzyskania wysokiej jakości sekwencji do dalszej analizy mikrobiologicznej. Klasyfikację taksonomiczną przeprowadzono przy użyciu komercyjnego pakietu do przypisywania taksonomii 16S oraz powiązanej z nim bazy danych identyfikacji mikrobiologicznej (patrz Tabela materiałów). Uzyskane profile taksonomiczne wykorzystano w późniejszych analizach różnorodności mikrobiologicznej, składu społeczności, różnicowej obfitości oraz przewidywanej funkcji mikrobiologicznej.
Oceny kliniczne i etykiety analityczne
Pacjentów z PD podzielono na dwie grupy w zależności od stopnia zaawansowania choroby, określonego przez czas trwania schorzenia: grupę o wysokim stopniu zaawansowania (>6 lat, oznaczona jako „_H”) oraz grupę o niskim stopniu zaawansowania (≤6 lat, oznaczona jako „_L”). Próbki kału pobrane przed FMT zdefiniowano jako próbki wyjściowe i oznaczono jako FB_H lub FB_L zgodnie z odpowiednią grupą zaawansowania. Próbki pobrane w 1., 2., 3., 4. i 5. miesiącu po FMT oznaczono jako FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H i FP5M_H dla grupy o wysokim stopniu zaawansowania oraz FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L i FP5M_L dla grupy o niskim stopniu zaawansowania. Oceniane parametry kliniczne obejmowały skalę zaparć Wexnera, skalę objawów pozaruchowych (NMSS), kwestionariusz objawów pozaruchowych (NMSQ), inwentarz neuropsychiatryczny (NPI), stopień w skali Hoehn–Yahr, skalę czynności życia codziennego (ADL), indeks jakości snu w Pittsburghu (PSQI), oryginalną skalę (UPDRS I–VI) oraz całkowity wynik UPDRS. Do analizy zmian wskaźników klinicznych pacjentów z PD w grupie o wysokim stopniu zaawansowania (grupa _H) i grupie o niskim stopniu zaawansowania (grupa _L) w sześciu punktach czasowych zastosowano kombinację metod statystyki opisowej i indukcyjnej. Aby wstępnie zbadać różnice między grupami we wszystkich punktach czasowych, rozkłady wskaźników między grupami _H i _L porównywano w każdym punkcie czasowym za pomocą testu suma rang Wilcoxona, a następnie zastosowano bardziej rygorystyczny liniowy model mieszany (LMM) z losowymi punktami przecięcia dla poszczególnych pacjentów. Ze względu na ograniczoną liczebność próby, wyniki modelu efektów mieszanych przedstawiono jedynie jako referencje eksploracyjne. Głównym punktem końcowym tego badania eksploracyjnego była zmiana różnorodności i składu mikrobioty jelitowej od stanu wyjściowego do punktów czasowych po przeszczepie mikrobioty kałowej, natomiast zmiany kliniczne oceniano jako wtórne punkty końcowe.
Klastrowanie OTU, analiza różnorodności oraz obfitość taksonomiczna
Do podsumowania składu społeczności mikrobiologicznej wykorzystano jednostki taksonomiczne operacyjne (OTU), a sekwencje o podobieństwie ≥97% pogrupowano w ramach tego samego OTU. Głębokość sekwencjonowania oceniono za pomocą krzywych rarefakcji opartych na indeksie Shannona, przy czym plateau krzywych wskazywało na ogólnie wystarczający stopień pokrycia dla dalszych analiz różnorodności.
Różnorodność alfa oceniano za pomocą indeksów Chao1 oraz ACE (abundance-based coverage estimator) w celu określenia bogactwa mikrobiologicznego, a także indeksów Shannona i Simpsona w celu oceny ogólnej różnorodności i wyrównania. Różnorodność beta ewaluowano przy użyciu ważonych i nieważonych odległości UniFrac, a następnie przeprowadzono analizę głównych współrzędnych (PCoA), aby zwizualizować różnice w składzie społeczności mikrobiologicznej pomiędzy grupami. Różnice między grupami w zakresie różnorodności alfa i beta oceniano odpowiednio za pomocą testów nieparametrycznych oraz permutacyjnej wielowymiarowej analizy wariancji (PERMANOVA), zgodnie z opisem w sekcji analizy statystycznej.
Skład taksonomiczny podsumowano na poziomach typu, klasy, rzędu, rodziny i rodzaju w oparciu o dane z sekwencjonowania genu 16S rRNA. Używając pakietu do analizy ekologii społeczności w programie R (patrz Tabela materiałów), zidentyfikowano i zwizualizowano 10 najliczniejszych taksonów na każdym poziomie taksonomicznym. Profile taksonomiczne przedstawiono za pomocą wykresów słupkowych, a wybrane taksony porównano dodatkowo między grupami przy użyciu wykresów pudełkowych.
Analiza różnic w obfitości taksonów mikrobiologicznych
Taksony o różnej liczności w obrębie zdefiniowanych grup zidentyfikowano za pomocą analizy wielkości efektu dyskryminanta liniowej (LEfSe). LEfSe integruje test Kruskala–Wallisa, test Wilcoxona oraz analizę dyskryminantową liniową (LDA), aby zidentyfikować taksony wykazujące zarówno istotność statystyczną, jak i wartość dyskryminacyjną. Za taksony o różnej liczności uznano te, dla których P < 0,05 oraz wynik LDA (log10) > 3. Względną liczność taksonów dyskryminacyjnych zwizualizowano za pomocą wykresów słupkowych taksonomicznych.
Przewidywanie funkcjonalne i analiza korelacji klinicznej
Przewidywane profile funkcjonalne mikrobioty jelitowej wywnioskowano z danych sekwencjonowania genu 16S rRNA przy użyciu Tax4Fun2 i zanoatowano zgodnie z bazą danych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Różnicowo wzbogacone przewidywane szlaki zidentyfikowano za pomocą LEfSe, przyjmując progi P < 0,05 oraz wynik LDA (log10) > 3. Ponieważ profile funkcjonalne te zostały wywnioskowane, a nie zmierzone bezpośrednio metodami metagenomicznymi lub metabolomicznymi, interpretowano je jako przewidywane różnice funkcjonalne. Przeprowadzono analizę korelacji rang Spearmana w celu zbadania powiązań między cechami mikrobiologicznymi a wskaźnikami klinicznymi.
Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania R (patrz Tabela Materiałów). Zmienne kliniczne przedstawiono jako mediany i zakresy (minimum–maksimum). Wskaźniki alfa-różnorodności porównano pomiędzy grupami za pomocą testu sum rang Wilcoxona, natomiast beta-różnorodność oceniono za pomocą analizy PERMANOVA z 999 permutacjami. Taksony o różnej obfitości oraz przewidywane ścieżki funkcjonalne zidentyfikowano za pomocą analizy LEfSe, przyjmując progi istotności P < 0,05 oraz wynik LDA (log10) > 3. Do podłużnej analizy różnic w obfitości zastosowano model mieszany z losowymi punktami przecięcia specyficznymi dla pacjenta, a następnie przeprowadzono post-hoc porównania parzyste z korektą stopy odkryć fałszywych Benjamini-Hochberg. Analizę korelacji rang Spearmana wykorzystano do oceny powiązań między cechami mikrobioty jelitowej a wskaźnikami klinicznymi, stosując korektę stopy odkryć fałszywych Benjamini–Hochberg dla wartości P korelacji. Za statystycznie istotne uznano dwustronne P < 0,05. Korektę porównań wielokrotnych zastosowano do analiz korelacji oraz obfitości taksonomicznej. Ze względu na niewielką wielkość próby i projekt powtarzalnego pobierania próbek wzdłużnych, analizy statystyczne uznano za eksploracyjne, a wyniki interpretowano z ostrożnością.
Wyniki
Wybór pacjentów i charakterystyka wyjściowa
Do końcowej analizy włączono sześciu pacjentów z PD, w tym trzech mężczyzn i trzy kobiety. Mediana wieku wynosiła 69,0 lat (zakres 61–75), a mediana indeksu masy ciała wynosiła 22,6 kg/m2. Kohorta obejmowała dwa fenotypy kliniczne z dominującą sztywnością, dwa z dominującym drżeniem oraz dwa o charakterze mieszanym. Wyjściowa charakterystyka kliniczna przedstawiona jest w Tabeli 1.
Charakterystyka kliniczna różniła się między podgrupami PD o wysokim i niskim stopniu nasilenia (Tabela 1). W tej kohorcie eksploracyjnej całkowity wynik UPDRS był wyższy w grupie FB_H niż w grupie FB_L, co jest zgodne z wcześniej zdefiniowaną klasyfikacją nasilenia i wskazuje na cięższe ogólne zaburzenia motoryczne. Różnice zaobserwowano również w kilku klinicznych parametrach motorycznych i niemotorycznych, w tym w podskalach UPDRS, PSQI, skali zaparć Wexnera, skali ADL oraz NMSS. Wyniki te sugerują, że zdefiniowane podgrupy nasilenia różniły się nie tylko pod względem stadium choroby motorycznej, ale także w kilku cechach niemotorycznych i funkcjonalnych.
Indywidualne trajektorie pacjentów przedstawiono za pomocą wykresów liniowych dla kluczowych wskaźników klinicznych (Rycina 1). Jak zilustrowano, u wszystkich sześciu pacjentów po FMT zaobserwowano spójną tendencję spadkową w wynikach NMSQ, NMSS, NPI, PSQI, UPDRS Total oraz w skali Wexnera, niezależnie od początkowego stopnia zaawansowania choroby. Warto zauważyć, że pacjenci w grupie _H wykazali gwałtowniejszą poprawę kliniczną niż pacjenci w grupie _L, pomimo wyższych wyników wyjściowych. Porównania kliniczne wykazały spójne różnice między grupami o wysokim i niskim stopniu zaawansowania choroby. Większość porównań dla poszczególnych punktów czasowych była istotna, wszystkie zbiorcze wskaźniki kliniczne różniły się między grupami, a modele efektów mieszanych potwierdziły mniejsze obciążenie objawami i lepsze funkcjonowanie codzienne w grupie o niskim stopniu zaawansowania choroby.
Zdarzenia niepożądane u pacjentów z PD po FMT
Zdarzenia niepożądane odnotowane po FMT podsumowano w Tabeli 2. Najczęściej zgłaszanymi zdarzeniami były wzdęcia, biegunka, nasilenie zaparć oraz nudności/wymioty, z których każde wystąpiło u dwóch pacjentów. Ból brzucha zgłoszono u jednego pacjenta. Nie odnotowano gorączki, a żaden pacjent nie przerwał FMT z powodu zdarzeń niepożądanych. Wyniki te sugerują, że objawy żołądkowo-jelitowe były najczęściej dokumentowanymi zdarzeniami niepożądanymi w tej niewielkiej grupie; jednak wyniki dotyczące bezpieczeństwa należy interpretować z ostrożnością, biorąc pod uwagę ograniczoną wielkość próby.
Wystarczające pokrycie różnorodności i identyfikacja specyficznych dla grup OTU
Analiza krzywej rzadkości wykazała, że indeks Shannona stopniowo zbliżał się do plateau wraz ze wzrostem głębokości sekwencjonowania, co sugeruje, że głębokość sekwencjonowania była ogólnie wystarczająca do oceny różnorodności mikrobiologicznej w próbkach (Rysunek 2A). we wszystkich próbkach zidentyfikowano łącznie 80 OTU. Ta stosunkowo niewielka liczba OTU jest zgodna z głębokością sekwencjonowania i ograniczoną wielkością próby w tym badaniu eksploracyjnym. Analiza diagramu Venna pozwoliła zidentyfikować zarówno wspólne, jak i unikalne OTU spośród 12 grup (Rysunek 2B). Wykryto łącznie 80 OTU, w tym 53 OTU wspólnych dla wszystkich grup. Liczba unikalnych OTU w każdej grupie wynosiła odpowiednio: 2 w FB_H, 12 w FB_L, 4 w FP1M_H, 0 w FP1M_L, 1 w FP2M_H, 0 w FP2M_L, 4 w FP3M_H, 0 w FP3M_L, 0 w FP4M_H, 1 w FP4M_L, 1 w FP5M_H oraz 2 w FP5M_L. Wśród tych grup FB_L posiadała najwyższą liczbę unikalnych OTU, natomiast w grupach FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L i FP4M_H nie wykazano żadnych unikalnych OTU w tej analizie. Wyniki te sugerują, że podgrupy PD dzieliły rdzeniowy zestaw OTU, podczas gdy niektóre grupy wykazywały ograniczone wzorce OTU specyficzne dla danej grupy.
Różnorodność mikrobiologiczna i przewidywane profile funkcjonalne różnią się pomiędzy podgrupami o różnym stopniu nasilenia PD
Różnorodność alfa była wyższa w grupie FB_L niż w grupie FB_H, co odzwierciedlały zwiększone wskaźniki Chao1, ACE, Shannona i Simpsona (Rycina 3A). Analiza PCoA oparta na UniFrac wykazała wyraźne oddzielenie dwóch podgrup o różnym stopniu nasilenia, co sugeruje różnice w strukturze mikrobioty jelitowej (Rycina 3B). Na poziomie typu, w grupie FB_L odnotowano stosunkowo wyższą liczebność Firmicutes i Actinobacteria, podczas gdy grupa FB_H charakteryzowała się wyższą liczebnością Bacteroidetes i Proteobacteria (Rycina 3C). Na poziomie rodzaju, Bacteroides, Megasphaera oraz Escherichia były liczniejsze w grupie FB_H, natomiast Bifidobacterium i Lactobacillus były liczniejsze w grupie FB_L (Rycina 3D).
Analiza LEfSe zidentyfikowała taksony powiązane z ciężkością choroby, które wykazywały różnice w liczebności. Taksony związane z Bacteroidetes/Bacteroides oraz Proteobacteria były wzbogacone w grupie FB_H, natomiast taksony związane z Bifidobacterium, Actinobacteria, Firmicutes, Clostridia oraz Parabacteroides były wzbogacone w grupie FB_L (Rysunek 3E). Przewidywana analiza szlaków KEGG wykazała również odmienne profile funkcjonalne między grupami. FB_H była głównie wzbogacona w przewidywane szlaki związane z metabolizmem ogólnym, metabolizmem węglowodanów i energii, przekazywaniem sygnałów, systemami dwuskładnikowymi oraz biosyntezą lipopolisacharydów. W przeciwieństwie do tego, FB_L była wzbogacona w przewidywane szlaki związane z biosyntezą wtórnych metabolitów, metabolizmem aminokwasów, metabolizmem nukleotydów, replikacją i naprawą, kworum sensingiem, transportem błonowym oraz transporterami ABC (Rysunek 3F). Wyniki te wskazują, że podgrupy zależne od ciężkości PD różniły się różnorodnością mikrobiologiczną, składem taksonomicznym oraz przewidywanym potencjałem funkcjonalnym.
Miesiąc po FMT podgrupa FP1M_H wykazała wyższą różnorodność mikrobiologiczną oraz odrębne przewidywane profile funkcjonalne
W porównaniu z grupą FB_H, grupa FP1M_H wykazała wyższą różnorodność alfa, o czym świadczą zwiększone wskaźniki Chao1, ACE, Shannon i Simpson (Rysunek 4A). Analiza PCoA w oparciu o UniFrac wykazała wyraźne oddzielenie grup FB_H i FP1M_H, co sugeruje zmianę struktury mikrobioty jelitowej miesiąc po FMT (Rysunek 4B). Na poziomie typu w grupie FP1M_H odnotowano względnie wyższą liczność Firmicutes, Actinobacteria i Verrucomicrobia, podczas gdy w grupie FB_H wyższą liczność wykazały Bacteroidetes i Proteobacteria (Rysunek 4C). Na poziomie rodzaju w grupie FP1M_H liczniejsze były Bifidobacterium, Akkermansia, Enterococcus i Lactobacillus, natomiast w grupie FB_H liczniejsze były Bacteroides, Megasphaera i Escherichia (Rysunek 4D).
Analiza LEfSe zidentyfikowała taksony o różnej liczebności powiązane z grupami. Taksony związane z Bacteroidetes/Bacteroides były wzbogacone w grupie FB_H, podczas gdy taksony związane z Firmicutes, Actinobacteria, Clostridia, Bifidobacterium oraz Acidaminococcus były wzbogacone w grupie FP1M_H (Rycina 4E). Przewidywana analiza szlaków KEGG wykazała, że w grupie FB_H wzbogacone były szlaki związane z transdukcją sygnału, systemami dwuskładnikowymi, metabolizmem węglowodanów, metabolizmem lipidów, metabolizmem energetycznym oraz metabolizmem kofaktorów/witamin. W przeciwieństwie do tego, w grupie FP1M_H wzbogacone były przewidywane szlaki związane z metabolizmem aminokwasów, metabolizmem nukleotydów, metabolizmem skrobi i sacharozy, replikacją i naprawą, translacją, biosyntezą wtórnych metabolitów, quorum sensing, transporterami ABC oraz transportem błonowym (Rycina 4F). Wyniki te sugerują, że w podgrupie o wysokim stopniu nasilenia FMT wiązał się ze zwiększoną różnorodnością mikrobiologiczną oraz zmianami w składzie taksonomicznym i przewidywanym potencjale funkcjonalnym.
Bogactwo mikrobiologiczne, skład taksonomiczny oraz przewidywane profile funkcjonalne różniły się pomiędzy grupami FB_L i FP1M_L
W porównaniu z grupą FB_L, grupa FP1M_L wykazała wyższą bogactwo mikrobiologiczne, na co wskazywały zwiększone wskaźniki Chao1 i ACE, podczas gdy wskaźniki Shannon i Simpson nie różniły się istotnie między grupami (Rycina 5A). Analiza PCoA oparta na UniFrac wykazała wyraźne oddzielenie grup FB_L i FP1M_L, co sugeruje różnice w składzie społeczności mikrobiologicznej po FMT (Rycina 5B). Na poziomie typu w grupie FP1M_L odnotowano stosunkowo wyższą liczność Actinobacteria, Verrucomicrobia, Synergistetes i Euryarchaeota, natomiast Firmicutes i Bacteroidetes były liczniejsze w grupie FB_L (Rycina 5C). Na poziomie rodzaju, Bifidobacterium, Akkermansia i Parabacteroides były liczniejsze w FP1M_L, podczas gdy Bacteroides i Lactobacillus dominowały w grupie FB_L (Rycina 5D).
Analiza LEfSe wykazała wzbogacenie taksonów związanych z Firmicutes, Clostridia i Ruminococcaceae w grupie FB_L, podczas gdy taksony związane z Bacteroidetes, Bacteroidales, Parabacteroides, Porphyromonadaceae, Synergistetes, Alistipes i Rikenellaceae były wzbogacone w grupie FP1M_L (Rysunek 5E). Przewidywana analiza szlaków KEGG wskazała, że FB_L była wzbogacona w szlaki związane z transdukcją sygnału, układami dwuskładnikowymi, metabolizmem węglowodanów, metabolizmem lipidów, metabolizmem cukrów aminowych i cukrów nukleotydowych, metabolizmem skrobi i sacharozy oraz systemem fosfotransferazy. FP1M_L była wzbogacona w przewidywane szlaki związane z globalnymi szlakami metabolicznymi, metabolizmem aminokwasów, translacją, biosyntezą aminokwasów, biosyntezą metabolitów wtórnych oraz przetwarzaniem informacji genetycznej (Rysunek 5F). Wyniki te wskazują, że w podgrupie o niskim nasileniu FMT wiązała się głównie ze zwiększoną bogością mikrobiologiczną oraz zmianami w składzie taksonomicznym i przewidywanym potencjale funkcjonalnym.
Różnorodność mikrobioty jelitowej, skład taksonomiczny i przewidywane profile funkcjonalne różniły się pomiędzy podgrupami PD o wysokim stopniu ciężkości w różnych punktach czasowych po FMT
Analiza różnorodności alfa w pięciu podgrupach PD o wysokim stopniu nasilenia (FP1M_H do FP5M_H) wykazała zmienność bogactwa i różnorodności mikrobiologicznej w różnych punktach czasowych (Rycina 6A). Wśród tych podgrup FP2M_H wykazała najniższe wskaźniki Chao1, ACE, Shannona i Simpsona, podczas gdy FP1M_H, FP3M_H, FP4M_H i FP5M_H wykazały stosunkowo wyższe wartości. Analiza różnorodności beta z wykorzystaniem ważonych i nieważonych odległości UniFrac ujawniła rozdzielenie pięciu podgrup na wykresach PCoA, co wskazuje na różnice w składzie mikrobioty jelitowej w punktach czasowych po FMT (Rycina 6B). Na poziomie typu 10 najliczniejszych taksonów przedstawiono na Rycini 6C. Bacteroidetes były liczniejsze w FP3M_H, FP4M_H i FP5M_H, natomiast Firmicutes i Actinobacteria były liczniejsze w FP1M_H. Verrucomicrobia wydawały się stosunkowo wzbogacone w FP2M_H. Na poziomie rodzaju Bacteroides był stosunkowo liczniejszy w FP3M_H, FP4M_H i FP5M_H, podczas gdy Akkermansia i Escherichia były liczniejsze w FP2M_H. Bifidobacterium było stosunkowo wzbogacone w FP1M_H (Rycina 6D). Analiza LEfSe zidentyfikowała wyraźne taksony o różnej obfitości w kilku podgrupach o wysokim stopniu nasilenia (Rycina 6E), w tym taksony związane z Firmicutes, Actinobacteria, Bifidobacterium i Clostridia w FP1M_H; taksony związane z Proteobacteria i Enterobacteriaceae w FP2M_H; taksony związane z Bacteroidetes i Bacteroides w FP3M_H oraz taksony związane z Synergistetes w FP4M_H. Przewidywane profilowanie funkcjonalne w oparciu o adnotację ścieżek KEGG wykazało specyficzne dla podgrup wzorce wzbogacenia (Rycina 6F). FP1M_H wykazała przewidywane wzbogacenie w metabolizmie skrobi i sacharozy oraz biosyntezie innych metabolitów wtórnych, FP2M_H wykazała przewidywane wzbogacenie w metabolizmie kofaktorów i witamin oraz metabolizmie energetycznym, a FP5M_H wykazała przewidywane wzbogacenie w transdukcji sygnału i systemach dwuskładnikowych. Wyniki te sugerują, że podgrupy PD o wysokim stopniu nasilenia wykazywały zmienność czasową w różnorodności mikrobiologicznej, składzie taksonomicznym i przewidywanych profilach funkcjonalnych po FMT.
Różnorodność mikrobiomu jelitowego, skład taksonomiczny i przewidywane profile funkcjonalne różniły się pomiędzy podgrupami PD o niskim nasileniu w różnych punktach czasowych po FMT
Analiza różnorodności alfa w pięciu podgrupach z PD o niskim stopniu nasilenia (FP1M_L do FP5M_L) wykazała zmienność bogactwa i różnorodności mikrobiologicznej w poszczególnych punktach czasowych (Rysunek 7A). W grupie FP2M_L odnotowano relatywnie niższe wskaźniki Chao1 i ACE, natomiast w grupach FP4M_L i FP5M_L zaobserwowano relatywnie wyższe wskaźniki Shannona i Simpsona, co wskazuje na zmienność bogactwa i równomierności między podgrupami o niskim stopniu nasilenia. Analiza różnorodności beta z wykorzystaniem ważonych i nieważonych odległości UniFrac wykazała separację pięciu podgrup na wykresach PCoA, co wskazuje na różnice w składzie społeczności mikroorganizmów jelitowych w punktach czasowych po FMT (Rysunek 7B). Na poziomie typu 10 najliczniejszych taksonów przedstawiono na Rysunku 7C. Bacteroidetes i Firmicutes były dominującymi typami we wszystkich grupach, podczas gdy Actinobacteria i Verrucomicrobia wydawały się relatywnie wzbogacone w FP1M_L, a Firmicutes wydawały się relatywnie liczniejsze w FP3M_L. Na poziomie rodzaju Bifidobacterium i Akkermansia były relatywnie liczniejsze w FP1M_L, natomiast Bacteroides był relatywnie liczniejszy w FP2M_L (Rysunek 7D). Analiza LEfSe zidentyfikowała taksony o różnej liczebności powiązane z podgrupami w kilku grupach o niskim stopniu nasilenia (Rysunek 7E), w tym taksony powiązane z Ruminococcaceae w FP1M_L, taksony powiązane z Firmicutes i Clostridiales w FP2M_L, taksony powiązane z Synergistetes w FP3M_L oraz taksony powiązane z Bacteroidetes, Parabacteroides, Actinobacteria i Bifidobacterium w FP4M_L. Przewidywane profilowanie funkcjonalne na podstawie adnotacji ścieżek KEGG wykazało specyficzne dla podgrup wzorce wzbogacenia (Rysunek 7F). W grupie FP1M_L przewidywano wzbogacenie w biosyntezę metabolitów wtórnych, w grupie FP2M_L przewidywano wzbogacenie w ścieżki związane z transdukcją sygnału, systemy dwuskładnikowe, przetwarzanie informacji środowiskowych, wspólnoty komórkowe prokariontów oraz metabolizm węglowodanów, w grupie FP3M_L przewidywano wzbogacenie w transport błonowy, quorum sensing, replikację i naprawę oraz system fosfotransferazy, w grupie FP4M_L przewidywano wzbogacenie w przetwarzanie informacji genetycznej, a w grupie FP5M_L przewidywano wzbogacenie w metabolizm i ścieżki metaboliczne. Wyniki te sugerują, że podgrupy PD o niskim stopniu nasilenia wykazały zmienność czasową w różnorodności mikrobiologicznej, składzie taksonomicznym i przewidywanych profilach funkcjonalnych po FMT.
Powiązania między konkretnymi jednostkami taksonomicznymi (OTU) a wskaźnikami klinicznymi w chorobie Parkinsona
Aby zbadać powiązania między zmianami w mikrobiocie jelitowej a cechami klinicznymi w chorobie Parkinsona (PD), zwizualizowano 50 najsilniejszych korelacji między OTU a parametrami klinicznymi po zastosowaniu korekty dla wielokrotnych porównań, co odpowiadało 23 unikalnym OTU (Rycina 8). Kilka OTU wykazało podobne wzorce korelacji w odniesieniu do wielu wskaźników klinicznych. Na przykład OTU165, OTU67, OTU230, OTU154, OTU72 oraz kilka innych OTU wykazały korelacje dodatnie z wynikiem w skali Wexnera, stopniem w skali Hoehn–Yahr, wskaźnikiem PSQI oraz wieloma miarami związanymi z UPDRS, wykazując jednocześnie korelacje ujemne ze skalą ADL i NPI. Z kolei OTU10 (Parabacteroides) oraz OTU45 (Fusobacterium) wykazały przeciwny wzorzec korelacji dla kilku zmiennych klinicznych. OTU165, zaklasyfikowane na poziomie typu jako Firmicutes, wykazało korelacje dodatnie z ciężkością zaparć, stadium choroby, zaburzeniami snu i kilkoma komponentami UPDRS, natomiast korelacje ujemne ze skalą ADL i NPI. Podobnie OTU67 (Porphyromonadaceae) korelowało z kilkoma klinicznymi wskaźnikami motorycznymi i niemotorycznymi. Ogólnie wyniki te sugerują, że określone OTU wiążą się z wieloma miarami klinicznymi w PD, choć korelacje te należy interpretować ostrożnie i traktować jako generujące hipotezy, a nie jako dowody przyczynowo-skutkowe.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Materiały uzupełniające do niniejszego badania są dostępne pod adresem DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.21620775.
Rycina 1: Podłużne zmiany w wynikach klinicznych po przeszczepieniu mikrobioty kałowej u pacjentów z PD. Wykresy liniowe przedstawiają zmiany w wynikach NMSQ, NMSS, NPI, PSQI, całkowitym wyniku UPDRS oraz w skali zaparć Wexnera od poziomu wyjściowego przed FMT (FB) do 1, 2, 3, 4 i 5 miesięcy po FMT (FP1M–FP5M) w grupie o wysokim stopniu nasilenia (H) i grupie o niskim stopniu nasilenia (L). Punkty danych reprezentują wartości zbiorcze na poziomie grupy, a słupki błędów wskazują odpowiadającą im zmienność/zakres. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Krzywe rarefakcji i porównanie OTU pomiędzy grupami. (A) Krzywe rarefakcji Shannona przedstawiające zależność między głębokością sekwencjonowania a różnorodnością mikrobiologiczną. Oś X reprezentuje głębokość sekwencjonowania, a oś Y reprezentuje indeks różnorodności Shannona. Stopniowe wypłaszczanie się krzywych sugeruje, że głębokość sekwencjonowania była w ogólności wystarczająca do oceny różnorodności. (B) Diagram Venna pokazujący wspólne i unikalne OTU pomiędzy 12 grupami. Liczba w centrum reprezentuje OTU wspólne dla wszystkich grup, natomiast liczby w obszarach zewnętrznych reprezentują OTU unikalne dla każdej grupy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Różnorodność mikrobiologiczna, skład taksonomiczny i przewidywane różnice funkcjonalne między grupami FB_H i FB_L. (A) Analiza alfa-różnorodności na podstawie indeksów Chao1, ACE, Shannona i Simpsona. (B) Analiza głównych współrzędnych (PCoA) na podstawie ważonych i nieważonych dystansów UniFrac. (C,D) Względna obfitość 10 najliczniejszych taksonów mikrobioty jelitowej na poziomie typu (C) i rodzaju (D), przedstawiona za pomocą skumulowanych wykresów słupkowych i wykresów pudełkowych. (E) Analiza LEfSe wykazująca taksony o różnej obfitości między grupami FB_H i FB_L. (F) Analiza LEfSe przewidywanych ścieżek funkcjonalnych KEGG. Dodatnie i ujemne wyniki LDA wskazują na ścieżki wzbogacone w różnych grupach. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Różnorodność mikrobową, skład taksonomiczny i przewidywane różnice funkcjonalne między grupami FP1M_H i FB_H. (A) Analiza różnorodności alfa w oparciu o indeksy Chao1, ACE, Shannona i Simpsona. (B) Analiza głównych współrzędnych (PCoA) w oparciu o ważone i nieważone odległości UniFrac. (C,D) Względna obfitość 10 najliczniejszych taksonów mikrobowych jelit na poziomie typu (C) i rodzaju (D), przedstawiona za pomocą skumulowanych wykresów słupkowych i wykresów pudełkowych. (E) Analiza LEfSe pokazująca taksony o różnej obfitości między grupami FP1M_H i FB_H. (F) Analiza LEfSe przewidywanych szlaków funkcjonalnych KEGG. Dodatnie i ujemne wyniki LDA wskazują szlaki wzbogacone w różnych grupach. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Różnice mikrobiologiczne i funkcjonalne między grupami FB_L i FP1M_L. (A) Analiza różnorodności alfa grup FB_L i FP1M_L. (B) Analiza różnorodności beta grup FB_L i FP1M_L. (C,D) Względna liczebność taksonów mikrobiologicznych jelit w grupach FB_L i FP1M_L na poziomie typu (C) oraz rodzaju (D). (E) Analiza porównawcza różnic gatunkowych między grupami FB_L i FP1M_L. (F) Przewidywane funkcje mikrobiologiczne w grupach FB_L i FP1M_L. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Różnorodność mikrobiologiczna, skład taksonomiczny i przewidywane różnice funkcjonalne pomiędzy grupami FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H i FP5M_H. (A) Analiza różnorodności alfa w oparciu o indeksy Chao1, ACE, Shannona i Simpsona. (B) Analiza głównych współrzędnych (PCoA) w oparciu o ważone i nieważone odległości UniFrac. (C,D) Względna liczebność 10 najliczniejszych taksonów mikrobioty jelitowej na poziomie typu (C) i rodzaju (D), przedstawiona za pomocą skumulowanych wykresów słupkowych i wykresów pudełkowych. (E) Analiza LEfSe wykazująca taksony o różnej liczebności pomiędzy pięcioma podgrupami o wysokim stopniu ciężkości po FMT. (F) Analiza LEfSe przewidywanych ścieżek funkcjonalnych KEGG. Dodatnie wartości LDA wskazują na ścieżki wzbogacone w odpowiadających im grupach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 7: Różnorodność mikrobiologiczna, skład taksonomiczny i przewidywane różnice funkcjonalne pomiędzy grupami FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L i FP5M_L. (A) Analiza różnorodności alfa w oparciu o wskaźniki Chao1, ACE, Shannona i Simpsona. (B) Analiza głównych współrzędnych (PCoA) w oparciu o ważone i nieważone odległości UniFrac. (C,D) Względna obfitość 10 najliczniejszych taksonów mikrobiomu jelitowego na poziomie typu (C) i rodzaju (D), przedstawiona na skumulowanych wykresach słupkowych i wykresach pudełkowych. (E) Analiza LEfSe wykazująca taksony o różnej obfitości pomiędzy pięcioma podgrupami o niskim stopniu nasilenia po FMT. (F) Analiza LEfSe przewidywanych ścieżek funkcjonalnych KEGG. Dodatnie wyniki LDA wskazują na ścieżki wzbogacone w odpowiadających im grupach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Analiza korelacji Spearmana pomiędzy OTU a wskaźnikami klinicznymi. Wiersze reprezentują OTU, a kolumny cechy kliniczne. Każda komórka przedstawia współczynnik korelacji Spearmana pomiędzy konkretnym OTU a wskaźnikiem klinicznym. Kolor czerwony oznacza korelację dodatnią, a niebieski korelację ujemną, przy czym intensywność koloru odzwierciedla siłę powiązania. Wartości liczbowe w komórkach reprezentują współczynniki korelacji. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; ns, brak istotności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
| Pacjent | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Płeć (K/M) | M | F | M | F | M | F |
| Wiek (lata) | 65 | 72 | 68 | 75 | 61 | 70 |
| BMI (wskaźnik masy ciała) | 23.5 | 21.8 | 24.2 | 20.5 | 22.1 | 23 |
| podtyp PD | Sztywność | Drżenie | Hybrydowy | Sztywność | Drżenie | Hybryda |
| Przebieg choroby | 5 | 8 | 6 | 10 | 3 | 7 |
| skala Wexnera | 12 | 15 | 10 | 18 | 8 | 13 |
| całkowity wynik UPDRS | 45 | 61 | 49 | 72 | 36 | 55 |
| Suma NMSS | 45 | 62 | 50 | 70 | 38 | 55 |
| NMSQ | 10 | 14 | 11 | 16 | 8 | 12 |
| PSQI (Pittsburgh Sleep Quality Index) | 8 | 11 | 9 | 13 | 6 | 10 |
| ADL | 90 | 75 | 85 | 70 | 95 | 65 |
| NPI | 5 | 9 | 6 | 12 | 3 | 7 |
| Czas trwania zaparć | 4 | 7 | 5 | 9 | 2 | 6 |
| LEDD (mg/d) | 600 | 800 | 700 | 900 | 400 | 750 |
| Stosowanie środków przeczyszczających | Nie | Stosowanie przerywane | Nie | Długotrwałe stosowanie | Nie | Stosowanie przerywane |
| Stosowanie probiotyków | Nie | Tak | Nie | Tak | Nie | Nie |
| Stosowanie antybiotyków | Nie | Nie | Tak | Nie | Nie | Nie |
| stopień w skali Hoehn–Yahr | 2 | 3 | 2.5 | 3.5 | 1.5 | 3 |
| Grupa stopnia ciężkości | niski | wysoki | niski | wysoki | niski | wysoki |
Tabela 1: Wyjściowa charakterystyka demograficzna i kliniczna pacjentów z chorobą Parkinsona, z podziałem według czasu trwania choroby. Pacjentów zaklasyfikowano do grupy z długim czasem trwania choroby (>6 lat; FB_H) lub grupy z krótkim czasem trwania choroby (≤6 lat; FB_L). Dane przedstawiono jako mediana (zakres) dla zmiennych ciągłych oraz liczba (%) dla zmiennych kategorycznych, gdzie dotyczy. Skróty: ADL, czynności życia codziennego; BMI, wskaźnik masy ciała; NMSS, skala objawów pozaruchowych; NMSQ, kwestionariusz objawów pozaruchowych; NPI, inwentarz neuropsychiatryczny; PD, choroba Parkinsona; PSQI, indeks jakości snu w Pittsburghu; UPDRS, ujednolicona skala oceny choroby Parkinsona.
| Zdarzenia niepożądane | Pacjenci (n, %) |
| Wzdęcia | 2 (33.3%) |
| Ból brzucha | 1 (16.7%) |
| Biegunka | 2 (33.3%) |
| Nasilone zaparcie | 2 (33.3%) |
| Gorączka | 0 |
| Nudności/wymioty | 2 (33.3%) |
| Przerwanie FMT z powodu zdarzeń niepożądanych | 0 |
Tabela 2: Zdarzenia niepożądane po przeszczepieniu mikrobioty kałowej u pacjentów z chorobą Parkinsona. Tabela przedstawia liczbę i odsetek pacjentów, u których wystąpiło poszczególne zdarzenie niepożądane podczas obserwacji po przeszczepieniu mikrobioty kałowej. Nie zgłoszono przypadków gorączki ani przerwania leczenia z powodu zdarzeń niepożądanych. Skróty: FMT, przeszczepienie mikrobioty kałowej; PD, choroba Parkinsona.
Rycina uzupełniająca 1: Wybór uczestników i przepływ pacjentów. Schemat procesu przesiewowego próbek u pacjentów z chorobą Parkinsona poddawanych FMT i uczestniczących w sekwencjonowaniu 16S rRNA. n oznacza liczbę uczestników.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
FMT to interwencja oparta na mikrobiocie, polegająca na przeniesieniu mikrobioty kałowej od zdrowego dawcy do jelit biorcy w celu przywrócenia równowagi mikrobiologicznej jelit14. Rosnąca liczba dowodów sugeruje, że mikrobiota jelitowa odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy układu nerwowego15. Dowody dotyczące dwukierunkowej osi jelito-mózg wskazują, że mikrobiota jelitowa może wpływać na stan zapalny ośrodkowego układu nerwowego, metabolizm neuroprzekaźników oraz reakcje behawioralne w chorobie Parkinsona (PD)16,17. Przeszczep mikrobioty przyciągnął zatem uwagę jako potencjalna interwencja, choć jego zastosowanie kliniczne w chorobach neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych pozostaje w fazie badawczej18. W tym jednocentrowym retrospektywnym badaniu obserwacyjnym oceniono wyniki kliniczne, bezpieczeństwo oraz eksploracyjne profile mikrobioty jelitowej u pacjentów z PD, którzy poddali się przeszczepowi mikrobioty kałowej (FMT) w ramach rutynowej praktyki klinicznej. Zaobserwowano różnice w bogactwie, różnorodności, strukturze społeczności mikrobiologicznej jelit oraz w przewidywanych profilach funkcjonalnych pomiędzy podgrupami o różnym stopniu ciężkości PD oraz w punktach czasowych po FMT. Wyniki te sugerują, że profile mikrobioty jelitowej mogą różnić się w zależności od stopnia zaawansowania choroby i mogą dynamicznie zmieniać się po interwencji FMT. W związku z tym wyniki te należy traktować wyłącznie jako generujące hipotezy, które wymagają walidacji w większych badaniach o odpowiedniej mocy statystycznej.
Zaparcia są jednym z najczęstszych i najbardziej uciążliwych objawów niemotorycznych w chorobie Parkinsona (PD)19. Zaparcia mogą obniżać jakość życia, zwiększać zapotrzebowanie na środki przeczyszczające i utrudniać wchłanianie leków dopaminergicznych. W niniejszej kohorcie wyniki w skali zaparć Wexnera uległy poprawie po przeszczepie fekalinym (FMT) w obu podgrupach analitycznych, choć skala i trwałość tej poprawy różniły się w zależności od punktów czasowych obserwacji. Wzorce te sugerują istnienie związku czasowego pomiędzy FMT a poprawą objawów jelitowych.
Zaobserwowano również zmiany w kilku klinicznych parametrach ruchowych i pozaruchowych, w tym w wynikach skal NMSS, PSQI, UPDRS III oraz całkowitej punktacji UPDRS. Wyniki te są istotne, ponieważ choroba Parkinsona (PD) jest zaburzeniem wieloukładowym, w którym często współistnieją dysfunkcje przewodu pokarmowego, zaburzenia snu, objawy autonomiczne, objawy neuropsychiatryczne oraz upośledzenie funkcji motorycznych. Potencjalnym wyjaśnieniem jest fakt, że modulacja mikrobioty jelitowej może wpływać na motorykę przewodu pokarmowego, zapalenie systemowe, integralność bariery jelitowej, metabolity mikrobiologiczne oraz sygnalizację wzdłuż osi mikrobiota–jelita–mózg. Niemniej jednak na wyniki w skalach ruchowych i pozaruchowych w PD wpływa wiele czynników, w tym stadium choroby, terapia dopaminergiczna, jakość snu, nastrój, dysfunkcja autonomiczna, stan rehabilitacji oraz codzienna aktywność. W związku z tym zmiany w parametrach UPDRS, NMSS, PSQI i miarach związanych z ADL należy interpretować jako eksploracyjne obserwacje kliniczne.
Nasze wyniki są w dużym stopniu zgodne z wcześniejszymi badaniami łączącymi mikrobiotę jelitową z kliniczną heterogennością związaną z PD. Niedawne badanie wykazało, że transplantacja mikrobioty kałowej od zdrowych dawców może poprawić objawy motoryczne i niemotoryczne u pacjentów z chorobą Parkinsona, co towarzyszy zmianom w składzie mikrobioty jelitowej oraz ścieżkach funkcjonalnych13,20. Choć w jednym z poprzednich badań zaburzenia kontroli impulsów nie wpłynęły znacząco na różnorodność α i β u pacjentów z PD, u pacjentów z zaburzeniami kontroli impulsów odnotowano wzbogacenie specyficznych taksonów mikrobiologicznych, które wykazywały potencjalne różnice funkcjonalne w takich ścieżkach jak degradacja ksenobiotyków i metabolizm niacyny21. Inne badanie wskazało, że pacjenci z PD z lękiem wykazywali zmieniony skład mikrobioty jelitowej oraz różnorodność β, co dodatkowo wspiera możliwy związek między florą jelitową a niemotorycznymi objawami związanymi z PD22. W niniejszym badaniu różnorodność i skład mikrobiologiczny różniły się między podgrupami o wysokim i niskim stopniu nasilenia objawów, a kilka podgrup po FMT wykazało odmienne wzorce mikrobiologiczne. Wyniki te wspierają tezę, że mikrobiota jelitowa może być zaangażowana w wielowymiarowe manifestacje kliniczne PD, choć związki przyczynowo-skutkowe wymagają jeszcze potwierdzenia.
Kilka taksonów zidentyfikowanych w niniejszym badaniu może mieć znaczenie biologiczne w kontekście zmian w mikrobiomie jelitowym związanych z chorobą Parkinsona (PD). Niektóre bakterie mogą wpływać na patofizjologię PD poprzez szlaki immunologiczne i metaboliczne23. Firmicutes to jeden z głównych typów bakterii Gram-dodatnich w ludzkich jelitach, obejmujący gatunki zaangażowane w produkcję krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych oraz utrzymanie bariery jelitowej24. W niniejszym badaniu OTU165, przypisany na poziomie typu do Firmicutes, był jednym z OTU najczęściej powiązanych ze zmiennymi klinicznymi. Jednak szerokie grupy taksonomiczne, takie jak Firmicutes, zawierają funkcjonalnie zróżnicowane członków, a ich interpretacja biologiczna powinna być przeprowadzana z ostrożnością. Analiza metagenomiczna kału wykazała, że Lactobacillus oraz powiązane z nim epitopy mikrobiologiczne z typu Firmicutes są wzbogacone u pacjentów z PD i wiążą się z markerami stanu zapalnego oraz szlakami metabolicznymi, takimi jak fermentacja propionianu25.Bifidobacterium to rodzaj bakteryjny o potencjalnych właściwościach przeciwzapalnych, który może przyczyniać się do regulacji mikrobioty jelitowej, podczas gdy Bacteroides jest ważnym rodzajem komensalnym, którego dysbioza była wiązana z upośledzeniem funkcji bariery jelitowej i nasilonymi odpowiedziami zapalnymi26,27. W obecnym badaniu Bacteroides występował w relatywnie większej liczbie w grupie FP2M_L, natomiast Bifidobacterium występował w relatywnie większej liczbie w grupie FP1M_L. W szczurzym modelu PD suplementacja Bifidobacterium breve Bif11 poprawiła deficyty motoryczne i poznawcze, zredukowała czynniki zapalne oraz stres oksydacyjny w śródmózwiu, a także przywróciła zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i funkcję bariery jelitowej28. Wcześniejsze badania zgłaszały również zmienioną liczebność Bacteroides u pacjentów z PD, czemu towarzyszyły zmiany w metabolizmie prekursorów krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych oraz korelacje z ciężkością choroby29. Wyniki te wskazują, że taksony zaobserwowane w niniejszym badaniu mogą mieć potencjalne znaczenie biologiczne, jednak konieczna jest analiza taksonomiczna o wyższej rozdzielczości oraz walidacja funkcjonalna.
Analiza przewidywań funkcjonalnych zasugerowała, że różne podgrupy PD wykazywały odmienne przewidywane wzorce wzbogacenia szlaków KEGG. Grupa FB_H wykazała przewidywane wzbogacenie w takich szlakach jak metabolizm węglowodanów, fosforylacja oksydacyjna, metabolizm mikrobialny w różnych środowiskach oraz procesy związane z lipopolisacharydami, co może odzwierciedlać zmieniony potencjał metaboliczny mikrobów w grupie o wysokim nasileniu choroby. Fosforylacja oksydacyjna jest głównym procesem, dzięki któremu mitochondria generują energię i utrzymują prawidłową funkcję neuronów30. Zaburzenia fosforylacji oksydacyjnej mogą prowadzić do deficytów energetycznych, stresu oksydacyjnego i neurostanu zapalnego, które są powiązane z depresją i PD31. Badania sugerują, że mikrobiom jelitowy może wpływać na dysfunkcję mitochondriów poprzez regulację syntezy neuroprzekaźników, mitofagię oraz homeostazę stresu oksydacyjnego32. Geny związane z PD mogą również upośledzać funkcję kompleksu I mitochondriów, zmniejszać produkcję ATP i zaostrzać progresję choroby poprzez zaburzanie szlaku Akt33. Ponadto lipopolisacharyd (LPS), ważny składnik bakterii Gram-ujemnych, może wywoływać odpowiedzi neurozapalne, a badania na zwierzętach wykazały, że ekspozycja na LPS może aktywować mikroglej, promować uwalnianie czynników zapalnych, uszkadzać struktury neuronalne i indukować zmiany behawioralne przypominające chorobę Parkinsona34. W niniejszym badaniu niektóre podgrupy o niskim nasileniu choroby oraz podgrupy po FMT wykazały również przewidywane wzbogacenie w szlakach związanych z metabolizmem aminokwasów, biosyntezą wtórnych metabolitów, transportem błonowym, replikacją i naprawą oraz metabolizmem związanym z krótkołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi. Jednakże, ponieważ wyniki dotyczące tych szlaków zostały wywnioskowane z sekwencjonowania 16S rRNA, a nie zmierzone bezpośrednio za pomocą podejść metagenomicznych lub metabolomicznych, należy je traktować jako wstępne.
W niniejszym badaniu oceniono również powiązania między cechami mikrobioty jelitowej a wskaźnikami klinicznymi odzwierciedlającymi objawy motoryczne i niemotoryczne w PD. Skala Wexnera odzwierciedla funkcję wypróżniania; stopień według skali Hoehn–Yahr oraz UPDRS oceniają stopień nasilenia zaburzeń motorycznych; PSQI i ADL mierzą odpowiednio jakość snu i codzienną sprawność funkcjonalną, a NPI ocenia objawy neuropsychiatryczne, takie jak lęk i depresja35,36,37. Kilka OTU było powiązanych ze skalami klinicznymi dotyczącymi zaparć, zaburzeń snu, upośledzenia motorycznego, stanu funkcjonalnego i objawów neuropsychiatrycznych. Wcześniejsze randomizowane badania kontrolowane wykazały, że FMT może poprawić funkcje autonomiczne i objawy żołądkowo-jelitowe u pacjentów z PD oraz zwiększyć złożoność mikrobiomu jelitowego, co sugeruje, że FMT może być wykonalną interwencją wspomagającą38. Inne badanie wykazało również, że różnorodność mikrobioty jelitowej była zmieniona u pacjentów z PD, przy czym Firmicutes i Actinobacteria korelowały dodatnio z wynikami UPDRS III, NMSS, Wexnera oraz 39-pozycji Kwestionariusza Choroby Parkinsona PDQ-39, podczas gdy Bacteroidetes wykazywały korelacje ujemne z tymi wskaźnikami39. Niemniej jednak korelacje zaobserwowane w niniejszym badaniu nie dowodzą przyczynowości, a kierunkowość tych powiązań należy interpretować z ostrożnością.
Bezpieczeństwo jest kluczowym aspektem oceny FMT w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych. W tej kohorcie zgłaszane zdarzenia niepożądane dotyczyły głównie układu pokarmowego, w tym wzdęć, biegunki, nasilonych zaparć, nudności/wymiotów oraz bólu brzucha. Nie odnotowano gorączki, a żaden pacjent nie przerwał terapii FMT z powodu zdarzeń niepożądanych. Wyniki te sugerują, że FMT był ogólnie dobrze tolerowany w tej niewielkiej kohorcie. Jednak ocena bezpieczeństwa opierała się na retrospektywnej dokumentacji klinicznej i ograniczonej liczbie pacjentów. Nie można wykluczyć rzadkich, ale klinicznie istotnych powikłań, takich jak infekcje, aspiracja, transmisja patogenów pochodzących od dawcy, powikłania metaboliczne oraz odroczone zdarzenia niepożądane. Przyszłe badania prospektywne powinny obejmować standaryzowane definicje zdarzeń niepożądanych, aktywny nadzór nad bezpieczeństwem, dokumentację przesiewową dawców oraz długoterminową obserwację.
Należy uznać kilka ograniczeń, w tym małą wielkość próby (n = 6), brak grupy kontrolnej, projekt z powtarzanymi pomiarami z potencjalną pseudoreplikacją i regresją do średniej, a także niepełną dokumentację potencjalnych czynników zakłócających, takich jak dieta, leczenie zaparć, korekty leków oraz stosowanie antybiotyków lub probiotyków; mimo że uczestnicy zostali poinstruowani, aby unikać tych ostatnich, nie można wykluczyć niedokumentowanych ekspozycji, które mogły wpłynąć na mikrobiotę jelitową. Ponadto nie rejestrowano systematycznie wywiadu rodzinnego w kierunku choroby Parkinsona lub innych zaburzeń neurologicznych, co uniemożliwiło ocenę wkładu genetycznego lub rodzinnego. Przewidywania funkcjonalne oparto na danych 16S rRNA, a nie na bezpośrednich pomiarach metagenomicznych lub metabolomicznych, a kilka OTU zostało przypisanych jedynie do szerokich poziomów taksonomicznych, co ogranicza interpretowalność biologiczną. Ograniczenia te nakazują ostrożną interpretację uzyskanych wyników.
Niemniej jednak, to badanie eksploracyjne sugeruje, że FMT wiązało się ze zmianami w objawach związanych z zaparciami, wybranych klinicznych punktacjach motorowych i pozamotorowych, niepożądanymi zdarzeniami żołądkowo-jelitowymi oraz eksploracyjnymi profilami mikrobioty jelitowej u pacjentów z PD. Wyniki te dostarczają wstępnych dowodów z praktyki klinicznej i wspierają dalsze badanie interwencji ukierunkowanych na mikrobiotę w przypadku PD z zaparciami. Jednak ze względu na małą próbę, retrospektywny charakter badania, strukturę pomiarów powtarzanych oraz brak grupy kontrolnej, wyniki należy interpretować z ostrożnością. Konieczne są prospektywne badania kontrolowane ze zstandardyzowanymi protokołami FMT, zdefiniowanymi punktami końcowymi badania, rygorystycznym monitorowaniem bezpieczeństwa oraz zintegrowanymi analizami multiomicznymi, aby wyjaśnić wartość kliniczną, bezpieczeństwo i mechanizmy biologiczne FMT w PD.
Oświadczenia
Konflikt interesów: Autorzy deklarują brak konfliktów interesów.
Podziękowania
Składamy podziękowania wszystkim współpracownikom, którzy pomogli i wsparli te badania. Ich współpraca i wsparcie były nieocenione dla naszej pracy.
Finansowanie: Badania te zostały sfinansowane przez Jiangsu Provincial Key Program for Elderly Health (LKZ2022004).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System MiSeq | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | Platforma do sekwencjonowania krótkich odczytów w wersji stacjonarnej, wykorzystywana do analizy V3 16S rRNA–Sekwencjonowanie amplikonów V4 za pomocą 2 × chemia sekwencjonowania par końcowych (paired-end) o długości 300 bp. |
| Metagenom@KIN | World Fusion Co., Ltd. | v2.2.1; https://www.w-fusion.com/metagenome | Komercyjne oprogramowanie wykorzystywane do przypisywania taksonomicznego 16S rRNA oraz analizy społeczności mikrobowych. |
| Baza danych identyfikacji mikrobiologicznej (bakteryjnej) | TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd. | DB-BA, baza danych v10.0; https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/ | Baza referencyjna bakteryjnego 16S rDNA wykorzystywana do identyfikacji mikrobiologicznej. |
| starter 341F | BGI Genomics Co., Ltd. | Oligonukleotyd na zamówienie; brak numeru katalogowego | Sekwencja primera forward: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′. |
| starter 805R | BGI Genomics Co., Ltd. | Niestandardowy oligonukleotyd; brak numeru katalogowego | Sekwencja prawego primera: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. |
| Usługa sekwencjonowania genu 16S rRNA | BGI Genomics Co., Ltd. (Wuhan, Chiny) | Usługi sekwencjonowania 16S/18S i ITS Sekwencjonowanie amplikonów 16S, 18S i ITS jest jedną z najpopularniejszych metod badania składu mikrobiomu, która pozwala na identyfikację i analizę różnorodności mikroorganizmów w próbkach środowiskowych, klinicznych i biologicznych. Dzięki wykorzystaniu konserwatywnych i zmiennych regionów genów rRna, metoda ta umożliwia precyzyjną klasyfikację taksonomiczną od poziomu królestwa do rodzaju, a w niektórych przypadkach nawet gatunku. Sekwencjonowanie 16S rRNA (bakterie i archeony) Gen 16S rRNA jest złotym standardem w identyfikacji bakterii i archeonów. Zawiera on dziewięć konserwatywnych regionów (V1–V9), które są oddzielone obszarami o wysokiej zmienności, co pozwala na rozróżnianie poszczególnych taksonów. * Zastosowania: Analiza mikrobiomu jelitowego, badania gleb i wód, diagnostyka patogenów bakteryjnych, badania ekologii mikroorganizmów. Sekwencjonowanie 18S rRNA (eukarioty) Gen 18S rRNA jest odpowiednikiem genu 16S u organizmów eukariotycznych. Jest on szeroko stosowany do analizy składu protistów, grzybów oraz innych mikroorganizmów eukariotycznych. * Zastosowania: Badania planktonu, analiza mikroflory eukariotycznej w tkankach roślinnych i zwierzęcych, badania różnorodności jednokomórkowców. Sekwencjonowanie ITS (grzyby) Regiony Internal Transcribed Spacer (ITS) są najczęściej stosowanymi markerami w identyfikacji grzybów (mykobiomie), ponieważ wykazują większą zmienność niż geny rRna, co pozwala na lepsze rozróżnienie blisko spokrewnionych gatunków. * Zastosowania: Analiza grzybów patogennych i saprotroficznych, badanie symbiozy grzybowej w glebie, ocena czystości mikrobiologicznej produktów. Nasze rozwiązania w zakresie sekwencjonowania amplikonów BGI oferuje kompleksowe usługi sekwencjonowania 16S, 18S i ITS, łącząc zaawansowaną technologię z rygorystyczną kontrolą jakości. * Wysoka dokładność i głębokość sekwencjonowania: Zapewniamy wykrycie rzadkich taksonów i precyzyjne określenie składu społeczności. * Zoptymalizowane zestawy starterów: Wykorzystujemy standardowe i sprawdzone startery, aby zapewnić szerokie spektrum detekcji i minimalizować błędy w amplifikacji. * Kompletna analiza bioinformatyczna: Dostarczamy pełne raporty zawierające analizę taksonomiczną, wykresy różnorodności (alfa i beta), analizy PCA oraz mapy ciepła (heatmaps). * Obsługa różnorodnych typów próbek: Doświadczenie w pracy z próbkami trudnymi, takimi jak próbki fekalne, tkanki, osady środowiskowe i wymazy kliniczne. Przebieg procesu 1. Ekstrakcja DNA: Izolacja wysokiej jakości genomowego DNA z dostarczonych próbek. 2. Amplifikacja PCR: Celowana amplifikacja wybranych regionów (np. V3-V4 dla 16S) przy użyciu specyficznych starterów. 3. Budowa bibliotek i sekwencjonowanie: Przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie na platformach wysokoprzepustowych. 4. Przetwarzanie danych: Filtrowanie jakościowe, usuwanie chimery oraz grupowanie sekwencji w OTU (Operational Taxonomic Units) lub ASV (Amplicon Sequence Variants). 5. Analiza taksonomiczna: Przypisanie taksonów w oparciu o najnowsze bazy danych (np. SILVA, Greengenes, UNITE). 6. Raport końcowy: Dostarczenie szczegółowych wyników i analiz statystycznych. | Komercyjny dostawca usług sekwencjonowania; przeprowadził przygotowanie bibliotek, sekwencjonowanie oraz wstępną kontrolę jakości. |
| probówki do mikrowirówek Eppendorf Safe-Lock, Biopur, 1,5 mL | Eppendorf SE | '0030121589 | Sterylne probówki polipropylenowe używane do alikwotowania próbek kału w celu ich przechowywania w −80 °C. |
| LEfSe | Laboratorium Segata/bioBakery | v1.1.2; https://github.com/SegataLab/lefse | Oprogramowanie do analizy liniowej dyskryminanty (LEfSe) wykorzystane do identyfikacji taksonów o różnej liczebności oraz przewidywanych szlaków metabolicznych. |
| Tax4Fun2 | Zespół programistyczny Tax4Fun2 | v1.1.5; https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2 | Pakiet R używany do wnioskowania o profilach funkcjonalnych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes na podstawie danych 16S rRNA. |
| pakiet R microeco | Chi Liu i współautorzy | v1.15.0; https://cran.r-project.org/package=microeco | Pakiet do analizy i wizualizacji ekologii zbiorowości dla analiz obfitości i różnorodności mikroorganizmów. |
| oprogramowanie R | R Foundation for Statistical Computing | Wersja niepodana; https://www.r-project.org/ | Środowisko obliczeń statystycznych wykorzystane do analiz klinicznych i mikrobiomu; dokładna wersja powinna zostać potwierdzona przez autorów. |
| Automatyczny system oczyszczania mikrobioty kałowej GenFMTer | Nanjing FMT Medical Co., Ltd. | Model: GenFMTer; https://en.fmtmed.com/ | Zautomatyzowany system wykorzystywany do standaryzowanego wirowania, przemywania i przygotowania zawiesiny mikrobioty kałowej. |
Bibliografia
- Masuda T, Egawa K, Takeshita Y, Tanaka K. Parkinson's disease bradykinesia, forward posture, and drug-induced Pisa syndrome alleviated with traditional Japanese acupuncture: a case report. Cureus. 2024;16(10):e70860. doi:10.7759/cureus.70860.
- Boyd RJ, Avramopoulos D, Jantzie LL, McCallion AS. Neuroinflammation represents a common theme amongst genetic and environmental risk factors for Alzheimer and Parkinson diseases. J Neuroinflammation. 2022;19(1):223. doi:10.1186/s12974-022-02584-x.
- Zhong QQ, Zhu F. Trends in prevalence cases and disability-adjusted life-years of Parkinson's disease: findings from the Global Burden of Disease Study 2019. Neuroepidemiology. 2022;56(4):261–70.
- Albin RL, Brissenden JA, Lee TG, Leventhal DK. Striatal dopamine actions and movement: inferences from Parkinson disease. J Neurosci. 2025;45(24):e0022252025. doi:10.1523/JNEUROSCI.0022-25.2025.
- Panwar S, Sharma S, Tripathi P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Front Physiol. 2021;12:715611. doi:10.3389/fphys.2021.715611.
- Minkoff NZ, et al. Fecal microbiota transplantation for the treatment of recurrent Clostridioides difficile (Clostridium difficile.). Cochrane Database Syst Rev. 2023;4(4):CD013871. doi:10.1002/14651858.CD013871.pub2.
- Wang M, et al. Influence of the gut microbiota, metabolism and environment on neuropsychiatric disorders. Curr Rev Clin Exp Pharmacol. 2025;20(4):334–48.
- Ojeda J, Ávila A, Vidal PM. Gut microbiota interaction with the central nervous system throughout life. J Clin Med. 2021;10(6):1299. doi:10.3390/jcm10061299.
- Lobo B, et al. The stressed gut: region-specific immune and neuroplasticity changes in response to chronic psychosocial stress. J Neurogastroenterol Motil. 2023;29(1):72–84.
- Jang HM, et al. Transplantation of fecal microbiota from patients with inflammatory bowel disease and depression alters immune response and behavior in recipient mice. Sci Rep. 2021;11(1):20406. doi:10.1038/s41598-021-00088-x.
- Segal A, et al. Fecal microbiota transplant as a potential treatment for Parkinson's disease—a case series. Clin Neurol Neurosurg. 2021;207:106791. doi:10.1016/j.clineuro.2021.106791.
- Scheperjans F, et al. Fecal microbiota transplantation for treatment of Parkinson disease: a randomized clinical trial. JAMA Neurol. 2024;81(9):925–38.
- Zhang H, et al. Pilot clinical trial of fecal microbiota transplantation for constipation in Parkinson's disease. J Microbiol Biotechnol. 2025;35:e2509029. doi:10.4014/jmb.2509.09029.
- Danne C, Rolhion N, Sokol H. Recipient factors in faecal microbiota transplantation: one stool does not fit all. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2021;18(7):503–13.
- Su X, Gao Y, Yang R. Gut microbiota-derived tryptophan metabolites maintain gut and systemic homeostasis. Cells. 2022;11(15):2296. doi:10.3390/cells11152296.
- Góralczyk-Bińkowska A, Szmajda-Krygier D, Kozłowska E. The microbiota–gut–brain axis in psychiatric disorders. Int J Mol Sci. 2022;23(19):11245. doi:10.3390/ijms231911245.
- Chen M, et al. Neurotransmitter and intestinal interactions: focus on the microbiota–gut–brain axis in irritable bowel syndrome. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:817100. doi:10.3389/fendo.2022.817100.
- Zheng L, Ji YY, Wen XL, Duan SL. Fecal microbiota transplantation in metabolic diseases: current status and perspectives. World J Gastroenterol. 2022;28(23):2546–60.
- Yao L, et al. Constipation in Parkinson's disease: a systematic review and meta-analysis. Eur Neurol. 2023;86(1):34–44.
- Figura M, et al. Safety and efficacy of fecal microbiota transplantation in alleviating symptoms of Parkinson's disease: a randomized, placebo-controlled, double-blinded study. Ann Neurol. 2026;100(1):10–21.
- Lin SH, et al. Associations between gut microbiota composition and impulse control disorders in Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 2025;26(13):6146. doi:10.3390/ijms26136146.
- Lin SH, et al. Anxiety-related gut microbiota alterations in Parkinson's disease: distinct associations compared with healthy individuals. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1594152. doi:10.3389/fcimb.2025.1594152.
- Nie S, et al. Inflammatory microbes and genes as potential biomarkers of Parkinson's disease. NPJ Biofilms Microbiomes. 2022;8(1):101. doi:10.1038/s41522-022-00367-z.
- Markowiak-Kopeć P, Śliżewska K. The effect of probiotics on the production of short-chain fatty acids by the human intestinal microbiome. Nutrients. 2020;12(4):1107. doi:10.3390/nu12041107.
- Li Z, et al. Altered Actinobacteria- and Firmicutes-phylum-associated epitopes in patients with Parkinson's disease. Front Immunol. 2021;12:632482. doi:10.3389/fimmu.2021.632482.
- Aghamohammad S, et al. The potential role of Bifidobacterium. spp. as preventive and therapeutic agents in controlling inflammation by affecting inflammatory signalling pathways. Lett Appl Microbiol. 2022;75(5):1254–63.
- Chen Y, Cui W, Li X, Yang H. Interaction between commensal bacteria, immune response and the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. Front Immunol. 2021;12:761981. doi:10.3389/fimmu.2021.761981.
- Valvaikar S, et al. Supplementation with the probiotic Bifidobacterium breve. Bif11 reverses neurobehavioural deficits, inflammatory changes and oxidative stress in a Parkinson's disease model. Neurochem Int. 2024;174:105691. doi:10.1016/j.neuint.2024.105691.
- Mao L, et al. Cross-sectional study on the gut microbiome of patients with Parkinson's disease in Central China. Front Microbiol. 2021;12:728479. doi:10.3389/fmicb.2021.728479.
- Trigo D, et al. Mitochondria, energy and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Lett. 2022;596(9):1095–110.
- Masenga SK, Kabwe LS, Chakulya M, Kirabo A. Mechanisms of oxidative stress in metabolic syndrome. Int J Mol Sci. 2023;24(9):7898. doi:10.3390/ijms24097898.
- Zhao H, et al. Multiple pathways through which the gut microbiota regulates neuronal mitochondria constitute another possible direction for depression. Front Microbiol. 2025;16:1578155. doi:10.3389/fmicb.2025.1578155.
- Ali MZ, Dholaniya PS. Oxidative phosphorylation-mediated pathogenesis of Parkinson's disease and its implications via Akt signaling. Neurochem Int. 2022;157:105344. doi:10.1016/j.neuint.2022.105344.
- Zhang J, et al. LPS activates neuroinflammatory pathways to induce depression in a Parkinson's disease-like condition. Front Pharmacol. 2022;13:961817. doi:10.3389/fphar.2022.961817.
- Ota E, et al. Incidence and risk factors of bowel dysfunction after minimally invasive rectal cancer surgery and discrepancies between the Wexner score and the low anterior resection syndrome score. Surg Today. 2024;54(7):763–70.
- Kataoka H, Sugie K. Association between fatigue and Hoehn–Yahr staging in Parkinson's disease: an eight-year follow-up study. Neurol Int. 2021;13(2):224–31.
- Ren XQ, et al. Mediating roles of activities of daily living and depression in the relationship between sleep quality and health-related quality of life. Sci Rep. 2024;14(1):14057. doi:10.1038/s41598-024-65095-0.
- Cheng Y, et al. Efficacy of fecal microbiota transplantation in patients with Parkinson's disease: clinical trial results from a randomized, placebo-controlled design. Gut Microbes. 2023;15(2):2284247. doi:10.1080/19490976.2023.2284247.
- Hu Y, Wang H, Zhong Y, Sun Y. Retrospective analysis of diet, gut microbiota diversity and clinical pharmacology outcomes in patients with parkinsonism syndrome. Heliyon. 2024;10(21):e38645. doi:10.1016/j.heliyon.2024.e38645.