Wpływ transplantacji mikrobioty fekalnej na charakterystykę mikrobiologiczną jelit i fenotypy kliniczne u pacjentów z chorobą Parkinsona

Podsumowanie

W tym badaniu eksploracyjnym z udziałem sześciu pacjentów z chorobą Parkinsona, którzy zostali poddani przeszczepowi mikrobioty jelitowej, zaobserwowano zmiany w czasie w zakresie różnorodności mikrobiologicznej jelit, składu taksonomicznego oraz przewidywanych profilów funkcjonalnych, a także poprawę objawów motorycznych i niemotorycznych. Wyniki te stanowią wstępne dowody wspierające dalsze badania nad interwencjami opartymi na mikrobiocie.

Streszczenie

Zmiany w mikrobiocie jelitowej są powiązane z chorobą Parkinsona (PD), jednak podłużne zmiany mikrobiologiczne po przeszczepie mikrobioty kałowej (FMT) oraz ich korelacje kliniczne pozostają słabo rozpoznane. To retrospektywne obserwacyjne badanie jednocentryczne objęło 6 pacjentów z PD, podzielonych na podgrupy o wysokim i niskim stopniu zaawansowania choroby na podstawie czasu trwania choroby (>6 lat vs ≤6 lat). Trzydzieści sześć próbek kału pobrano przed FMT oraz co miesiąc przez pięć miesięcy po zabiegu. Różnorodność mikrobiologiczną, strukturę zbiorowisk, skład taksonomiczny oraz przewidywane profile funkcjonalne oceniono za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA. Analizy obejmowały różnorodność alfa i beta, obfitość taksonomiczną, analizę wielkości efektu dyskryminanta liniowego (LEDA), przewidywanie funkcjonalne w oparciu o Tax4Fun2 oraz korelacje rang Spearmana między cechami mikrobiologicznymi a wskaźnikami klinicznymi. Analizy opisowe wykazały różnice w bogactwie mikrobiologicznym, różnorodności, strukturze zbiorowisk i przewidywanych funkcjach pomiędzy podgrupami o różnym stopniu zaawansowania choroby oraz w różnych punktach czasowych po FMT. W punkcie wyjściowym podgrupa o niskim stopniu zaawansowania wykazywała większe bogactwo i różnorodność mikrobiologiczną niż podgrupa o wysokim stopniu zaawansowania, z relatywnie wyższą obfitością taksonów, w tym Bifidobacterium i Lactobacillus. Miesiąc po FMT w podgrupie o wysokim stopniu zaawansowania odnotowano wzrost bogactwa i różnorodności względem wartości wyjściowych, czemu towarzyszyły zmiany w składzie taksonomicznym. W obu podgrupach zaobserwowano zależne od czasu zmienności różnorodności mikrobiologicznej oraz przewidywanego wzbogacenia szlaków Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes po FMT. Przewidywane funkcje obejmowały metabolizm węglowodanów i aminokwasów, biosyntezę metabolitów wtórnych, transport błonowy oraz transdukcję sygnału. Kilka jednostek operacyjnych taksonomicznych (OTU) korelowało ze wskaźnikami zaburzeń ruchowych, zaparć, jakości snu, statusu funkcjonalnego oraz objawów neuropsychiatrycznych. FMT był zatem powiązany z podłużnymi zmianami w różnorodności, składzie i przewidywanych funkcjach mikrobioty jelitowej, a określone cechy mikrobiologiczne korelowały ze wskaźnikami motorowymi i niemotorowymi. Ze względu na małą retrospektywną kohortę, wyniki te mają charakter wstępny i wymagają potwierdzenia w większych badaniach kontrolowanych. Przyszłe badania powinny ustalić, czy zmiany te są powtarzalne, utrzymują się powyżej pięciu miesięcy, odzwierciedlają przyjęcie się mikrobioty od dawcy oraz odpowiadają mierzalnej poprawie klinicznej po transplantacji w chorobie PD.

Wprowadzenie

Choroba Parkinsona (PD) jest powszechnym, postępującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym charakteryzującym się bradykinezją, sztywnością, drżeniem spoczynkowym oraz niestabilnością posturalną¹. Choć jej patogeneza nie została w pełni wyjaśniona, w zapoczątkowaniu i progresji choroby zaangażowanych jest wiele czynników, w tym neurostan zapalny, ekspozycje środowiskowe oraz predyspozycje genetyczne². Dowody epidemiologiczne wskazują, że PD należy do najczęstszych zaburzeń neurologicznych u osób starszych i wiąże się ze znacznym obciążeniem niepełnosprawnością, a jej rozpowszechnienie wzrasta wraz z wiekiem³. Obecne metody leczenia, w szczególności terapia substytucyjna dopaminą, mogą w pewnym stopniu łagodzić objawy ruchowe, jednak ich wpływ na progresję choroby oraz wiele objawów pozaruchowych pozostaje ograniczony, a reakcje na leczenie różnią się w zależności od pacjenta⁴. Dlatego dalsze badanie zmian biologicznych związanych z PD oraz potencjalnych celów terapeutycznych pozostaje istotne z punktu widzenia klinicznego.

Społeczność mikrobiologiczna jelit odgrywa istotną rolę w utrzymaniu integralności bariery jelitowej, regulowaniu odpowiedzi immunologicznych i wspieraniu homeostazy metabolicznej⁵. Przeszczep mikrobioty kałowej (FMT) polega na przeniesieniu mikrobioty kałowej od zdrowego dawcy do biorcy w celu przywrócenia równowagi mikrobiologicznej jelit^6,7. Wiele badań na zwierzętach sugeruje, że przeszczep mikrobioty jelitowej może wpływać na fenotypy neurobehawioralne^8,9. Biorąc pod uwagę, że mikrobiota od pacjentów z depresją lub lękiem może wywołać odpowiadające im zmiany behawioralne u myszy, mikrobiota od zdrowych dawców mogłaby poprawić wyniki behawioralne¹⁰. Ponadto wstępne obserwacje kliniczne wykazały poprawę objawów po FMT u niektórych pacjentów z PD i autyzmem, co sugeruje, że interwencje oparte na mikrobiocie mogą mieć potencjalne znaczenie w zaburzeniach neurologicznych i neuropsychiatrycznych^11,12. Niemniej jednak mechanizmy leżące u podłoża tych efektów pozostają niejasne, a niezbędne są badania kliniczne w celu ustalenia bezpieczeństwa i skuteczności FMT w PD.

Choć poprzednie badania sugerowały istnienie związku między mikrobiotą jelitową a PD, podłużne zmiany w składzie mikrobiomu jelitowego po FMT oraz ich powiązania z cechami klinicznymi pozostają słabo poznane. Nie jest jasne, czy pacjenci o różnym stopniu nasilenia objawów klinicznych wykazują odmienne odpowiedzi mikrobiologiczne po FMT.

W niniejszym jednorodniowym retrospektywnym badaniu obserwacyjnym przeanalizowano pacjentów z PD, u których przeprowadzono FMT w rutynowej praktyce klinicznej. Przeanalizowano wskaźniki kliniczne przed i po FMT, a dostępne próbki kału poddano dalszej analizie za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA w celu zbadania różnorodności mikrobioty jelitowej, składu taksonomicznego, przewidywanych profili funkcjonalnych oraz korelacji ze wskaźnikami klinicznymi. Celem badania była charakterystyka wyników klinicznych i profili mikrobioty jelitowej po FMT w PD oraz dostarczenie wstępnych dowodów dla przyszłych prospektywnych badań kontrolowanych.

Protokół

Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską, a protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyki Drugiego Szpitala Powiązanego z Uniwersytetem Medycznym w Nankinie (numer zatwierdzenia: 2021-KY-100-01). Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę.

To retrospektywne obserwacyjne badanie jednomiestresowe zostało przeprowadzone w Katedrze Neurologii w Drugim Szpitalu Afiliacyjnym Uniwersytetu Medycznego w Nanjing. W okresie od stycznia 2022 do grudnia 2023 roku do badania włączono łącznie 32 pacjentów z pierwotną chorobą Parkinsona (PD), którzy spełniali kryteria diagnostyczne choroby Parkinsona (wydanie z 2020 r.). Ostatecznie do dalszej analizy zakwalifikowano sześciu pacjentów, którzy spełnili rygorystyczne kryteria wyboru i przeszli wszystkie procedury badawcze. Szczegóły dotyczące przesiewu, wykluczeń oraz obserwacji przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1.

Pobieranie próbek kału i analiza społeczności mikrobiologicznej

Mikrobiota kałowa została pozyskana od zdrowych ochotników. Proces przesiewowy dawców przeprowadzono ściśle zgodnie z chińskim konsensusem eksperckim dotyczącym klinicznego zastosowania transplantacji mikrobioty kałowej. Kryteria włączenia dawców: wiek 18–40 lat, brak historii chorób przewlekłych; brak historii chorób przewodu pokarmowego, zaburzeń metabolicznych, chorób autoimmunologicznych lub zaburzeń psychiatrycznych; brak stosowania antybiotyków, probiotyków, immunosupresantów lub inhibitorów pompy protonowej w ciągu ostatnich 3 miesięcy; brak podróży do obszarów epidemicznych, przetoczeń krwi lub historii operacji chirurgicznych w ciągu ostatnich 6 miesięcy. Badania przesiewowe krwi i kału w celu wykluczenia chorób zakaźnych i patogenów obejmowały: wirus niedoboru odporności u ludzi (HIV), wirus zapalenia wątroby B (HBV), wirus zapalenia wątroby C (HCV), Treponema pallidum, Clostridium difficile, Salmonella, Shigella, Campylobacter, patogenne Escherichia coli, wirusy jelitowe oraz pasożyty. Objętość pojedynczej prawidłowej próbki kału powinna wynosić co najmniej 50 g. Przy użyciu zautomatyzowanego systemu oczyszczania mikrobioty kałowej (patrz Tabela materiałów), do każdych 100 g świeżego kału dodano 500 mL jałowej soli fizjologicznej, przeprowadzono trzy serie standardowego wirowania i przemywania (700 × g, 3 min), a następnie niezwłocznie wykonano inokulację po przygotowaniu zawiesiny z jałową solą fizjologiczną w stosunku objętości 1:2. Obiekty otrzymały pojedynczą iniekcję 150 mL zawiesiny zawierającej około 5 × 10^13 żywych bakterii¹³.

Wszyscy biorcy otrzymali FMT drogą kolonoskopową, z wprowadzeniem endoskopu do kątnicy i okrężnicy wstępującej; zawiesinę wprowadzano powoli i równomiernie przez kanał biopsyjny, aby wspomóc preferencyjną kolonizację prawej części okrężnicy. Po infuzji pacjenci pozostawali w bocznej pozycji prawej przez co najmniej 2 h. Przed zabiegiem przez 3 dni stosowano dietę niskoresztkową, a następnie przez 24 h przed procedurą dietę płynną, z zachowaniem postu od pokarmów stałych przez 6 h i od płynów przez 2 h przed infuzją. Wieczorem w dniu poprzedzającym transplantację przeprowadzono standardowe oczyszczanie całego jelita za pomocą elektrolitowego roztworu glikolu polietylenowego do momentu uzyskania przejrzystego, wolnego od treści kałowej wydzieliny. Ograniczenia w stosowaniu leków obejmowały odstawienie antybiotyków systemowych na co najmniej 72 h przed FMT oraz unikanie ich stosowania przez 1 tydzień po zabiegu. Inhibitory pompy protonowej (PPI) odstawiano na 24–48 h przed procedurą, a środki przeczyszczające i probiotyki zawieszano w dniu transplantacji.

W trakcie procedury stale monitorowano tętno, ciśnienie tętnicze oraz saturację tlenem, a także obserwowano wszelkie objawy, takie jak wzdęcia brzucha, ból lub nudności; w przypadku wystąpienia silnego bólu brzucha lub hipotonii natychmiast przerywano infuzję. Przez pierwsze 7 dni po transplantacji przeprowadzano codzienną obserwację w celu zarejestrowania częstotliwości wypróżnień, konsystencji stolca oraz wszystkich zdarzeń niepożądanych, w tym bólu brzucha, biegunki, gorączki i hematochezji. Długoterminowa obserwacja trwała do 5 miesięcy i obejmowała planowe pobieranie próbek stolca do analizy mikrobioty jelitowej oraz oceny kliniczne z wykorzystaniem skali UPDRS (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale) i skali Wexner Constipation Score, wraz z dokumentacją zmian objawów i stosowania leków towarzyszących, aby kompleksowo ocenić zarówno skuteczność, jak i bezpieczeństwo.

Próbki kału pobierano w sześciu punktach czasowych: przed FMT oraz w 1., 2., 3., 4. i 5. miesiącu po FMT. Wszyscy uczestnicy otrzymali ustandaryzowane instrukcje dotyczące pobierania próbek kału. Przy użyciu sterylnej pęsety pobrano około 10–20 g środkowej części stolca i umieszczono ją w sterylnych pojemnikach do próbek. Próbki transportowano do laboratorium w ciągu 2–3 h od pobrania, a następnie przeszkoleni badacze w warunkach aseptycznych podzielili je na aliquoty do sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL (patrz Tabela materiałów). Wszystkie aliquoty natychmiast przechowywano w temperaturze −80 °C do czasu dalszej analizy.

Po pobraniu próbek kału wszystkie materiały zostały przetransportowane w suchem lodzie do komercyjnego dostawcy usług sekwencjonowania (patrz Tabela materiałów) w celu przeprowadzenia sekwencjonowania genu 16S rRNA. Przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie oraz wstępna kontrola jakości zostały wykonane zgodnie ze standardowym protokołem dostawcy. Z każdej próbki kału wyekstrahowano genomowe DNA, a następnie za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z użyciem starterów 341F i 805R przeprowadzono amplifikację hiperzmiennych regionów V3–V4 bakteryjnego genu 16S rRNA. Sekwencjonowanie wykonano na laboratoryjnej platformie do sekwencjonowania krótkich odczytów (patrz Tabela materiałów), stosując chemię dla odczytów parzystych 2 × 300 bp, aby scharakteryzować profile mikrobioty jelitowej pacjentów przed FMT oraz w różnych punktach czasowych kontroli po FMT. Po sekwencjonowaniu surowe odczyty zostały przetworzone w celu uzyskania wysokiej jakości sekwencji do dalszej analizy mikrobiologicznej. Klasyfikację taksonomiczną przeprowadzono przy użyciu komercyjnego pakietu do przypisywania taksonomii 16S oraz powiązanej z nim bazy danych identyfikacji mikrobiologicznej (patrz Tabela materiałów). Uzyskane profile taksonomiczne wykorzystano w późniejszych analizach różnorodności mikrobiologicznej, składu społeczności, różnicowej obfitości oraz przewidywanej funkcji mikrobiologicznej.

Oceny kliniczne i etykiety analityczne

Pacjentów z PD podzielono na dwie grupy w zależności od stopnia zaawansowania choroby, określonego przez czas trwania schorzenia: grupę o wysokim stopniu zaawansowania (>6 lat, oznaczona jako „_H”) oraz grupę o niskim stopniu zaawansowania (≤6 lat, oznaczona jako „_L”). Próbki kału pobrane przed FMT zdefiniowano jako próbki wyjściowe i oznaczono jako FB_H lub FB_L zgodnie z odpowiednią grupą zaawansowania. Próbki pobrane w 1., 2., 3., 4. i 5. miesiącu po FMT oznaczono jako FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H i FP5M_H dla grupy o wysokim stopniu zaawansowania oraz FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L i FP5M_L dla grupy o niskim stopniu zaawansowania. Oceniane parametry kliniczne obejmowały skalę zaparć Wexnera, skalę objawów pozaruchowych (NMSS), kwestionariusz objawów pozaruchowych (NMSQ), inwentarz neuropsychiatryczny (NPI), stopień w skali Hoehn–Yahr, skalę czynności życia codziennego (ADL), indeks jakości snu w Pittsburghu (PSQI), oryginalną skalę (UPDRS I–VI) oraz całkowity wynik UPDRS. Do analizy zmian wskaźników klinicznych pacjentów z PD w grupie o wysokim stopniu zaawansowania (grupa _H) i grupie o niskim stopniu zaawansowania (grupa _L) w sześciu punktach czasowych zastosowano kombinację metod statystyki opisowej i indukcyjnej. Aby wstępnie zbadać różnice między grupami we wszystkich punktach czasowych, rozkłady wskaźników między grupami _H i _L porównywano w każdym punkcie czasowym za pomocą testu suma rang Wilcoxona, a następnie zastosowano bardziej rygorystyczny liniowy model mieszany (LMM) z losowymi punktami przecięcia dla poszczególnych pacjentów. Ze względu na ograniczoną liczebność próby, wyniki modelu efektów mieszanych przedstawiono jedynie jako referencje eksploracyjne. Głównym punktem końcowym tego badania eksploracyjnego była zmiana różnorodności i składu mikrobioty jelitowej od stanu wyjściowego do punktów czasowych po przeszczepie mikrobioty kałowej, natomiast zmiany kliniczne oceniano jako wtórne punkty końcowe.

Klastrowanie OTU, analiza różnorodności oraz obfitość taksonomiczna

Do podsumowania składu społeczności mikrobiologicznej wykorzystano jednostki taksonomiczne operacyjne (OTU), a sekwencje o podobieństwie ≥97% pogrupowano w ramach tego samego OTU. Głębokość sekwencjonowania oceniono za pomocą krzywych rarefakcji opartych na indeksie Shannona, przy czym plateau krzywych wskazywało na ogólnie wystarczający stopień pokrycia dla dalszych analiz różnorodności.

Różnorodność alfa oceniano za pomocą indeksów Chao1 oraz ACE (abundance-based coverage estimator) w celu określenia bogactwa mikrobiologicznego, a także indeksów Shannona i Simpsona w celu oceny ogólnej różnorodności i wyrównania. Różnorodność beta ewaluowano przy użyciu ważonych i nieważonych odległości UniFrac, a następnie przeprowadzono analizę głównych współrzędnych (PCoA), aby zwizualizować różnice w składzie społeczności mikrobiologicznej pomiędzy grupami. Różnice między grupami w zakresie różnorodności alfa i beta oceniano odpowiednio za pomocą testów nieparametrycznych oraz permutacyjnej wielowymiarowej analizy wariancji (PERMANOVA), zgodnie z opisem w sekcji analizy statystycznej.

Skład taksonomiczny podsumowano na poziomach typu, klasy, rzędu, rodziny i rodzaju w oparciu o dane z sekwencjonowania genu 16S rRNA. Używając pakietu do analizy ekologii społeczności w programie R (patrz Tabela materiałów), zidentyfikowano i zwizualizowano 10 najliczniejszych taksonów na każdym poziomie taksonomicznym. Profile taksonomiczne przedstawiono za pomocą wykresów słupkowych, a wybrane taksony porównano dodatkowo między grupami przy użyciu wykresów pudełkowych.

Analiza różnic w obfitości taksonów mikrobiologicznych

Taksony o różnej liczności w obrębie zdefiniowanych grup zidentyfikowano za pomocą analizy wielkości efektu dyskryminanta liniowej (LEfSe). LEfSe integruje test Kruskala–Wallisa, test Wilcoxona oraz analizę dyskryminantową liniową (LDA), aby zidentyfikować taksony wykazujące zarówno istotność statystyczną, jak i wartość dyskryminacyjną. Za taksony o różnej liczności uznano te, dla których P < 0,05 oraz wynik LDA (log₁₀) > 3. Względną liczność taksonów dyskryminacyjnych zwizualizowano za pomocą wykresów słupkowych taksonomicznych.

Przewidywanie funkcjonalne i analiza korelacji klinicznej

Przewidywane profile funkcjonalne mikrobioty jelitowej wywnioskowano z danych sekwencjonowania genu 16S rRNA przy użyciu Tax4Fun2 i zanoatowano zgodnie z bazą danych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Różnicowo wzbogacone przewidywane szlaki zidentyfikowano za pomocą LEfSe, przyjmując progi P < 0,05 oraz wynik LDA (log₁₀) > 3. Ponieważ profile funkcjonalne te zostały wywnioskowane, a nie zmierzone bezpośrednio metodami metagenomicznymi lub metabolomicznymi, interpretowano je jako przewidywane różnice funkcjonalne. Przeprowadzono analizę korelacji rang Spearmana w celu zbadania powiązań między cechami mikrobiologicznymi a wskaźnikami klinicznymi.

Analiza statystyczna

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania R (patrz Tabela Materiałów). Zmienne kliniczne przedstawiono jako mediany i zakresy (minimum–maksimum). Wskaźniki alfa-różnorodności porównano pomiędzy grupami za pomocą testu sum rang Wilcoxona, natomiast beta-różnorodność oceniono za pomocą analizy PERMANOVA z 999 permutacjami. Taksony o różnej obfitości oraz przewidywane ścieżki funkcjonalne zidentyfikowano za pomocą analizy LEfSe, przyjmując progi istotności P < 0,05 oraz wynik LDA (log₁₀) > 3. Do podłużnej analizy różnic w obfitości zastosowano model mieszany z losowymi punktami przecięcia specyficznymi dla pacjenta, a następnie przeprowadzono post-hoc porównania parzyste z korektą stopy odkryć fałszywych Benjamini-Hochberg. Analizę korelacji rang Spearmana wykorzystano do oceny powiązań między cechami mikrobioty jelitowej a wskaźnikami klinicznymi, stosując korektę stopy odkryć fałszywych Benjamini–Hochberg dla wartości P korelacji. Za statystycznie istotne uznano dwustronne P < 0,05. Korektę porównań wielokrotnych zastosowano do analiz korelacji oraz obfitości taksonomicznej. Ze względu na niewielką wielkość próby i projekt powtarzalnego pobierania próbek wzdłużnych, analizy statystyczne uznano za eksploracyjne, a wyniki interpretowano z ostrożnością.

Wyniki

Wybór pacjentów i charakterystyka wyjściowa

Do końcowej analizy włączono sześciu pacjentów z PD, w tym trzech mężczyzn i trzy kobiety. Mediana wieku wynosiła 69,0 lat (zakres 61–75), a mediana indeksu masy ciała wynosiła 22,6 kg/m². Kohorta obejmowała dwa fenotypy kliniczne z dominującą sztywnością, dwa z dominującym drżeniem oraz dwa o charakterze mieszanym. Wyjściowa charakterystyka kliniczna przedstawiona jest w Tabeli 1.

Dyskusja

FMT to interwencja oparta na mikrobiocie, polegająca na przeniesieniu mikrobioty kałowej od zdrowego dawcy do jelit biorcy w celu przywrócenia równowagi mikrobiologicznej jelit¹⁴. Rosnąca liczba dowodów sugeruje, że mikrobiota jelitowa odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy układu nerwowego¹⁵. Dowody dotyczące dwukierunkowej osi jelito-mózg wskazują, że mikrobiota jelitowa może wpływać na stan zapalny ośrodkowego układu nerwowego, metabolizm neuroprzekaźników oraz reakc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System MiSeq	Illumina, Inc.	SY-410-1003	Platforma do sekwencjonowania krótkich odczytów w wersji stacjonarnej, wykorzystywana do analizy V3 16S rRNA–Sekwencjonowanie amplikonów V4 za pomocą 2 × chemia sekwencjonowania par końcowych (paired-end) o długości 300 bp.
Metagenom@KIN	World Fusion Co., Ltd.	v2.2.1; https://www.w-fusion.com/metagenome	Komercyjne oprogramowanie wykorzystywane do przypisywania taksonomicznego 16S rRNA oraz analizy społeczności mikrobowych.
Baza danych identyfikacji mikrobiologicznej (bakteryjnej)	TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd.	DB-BA, baza danych v10.0; https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/	Baza referencyjna bakteryjnego 16S rDNA wykorzystywana do identyfikacji mikrobiologicznej.
starter 341F	BGI Genomics Co., Ltd.	Oligonukleotyd na zamówienie; brak numeru katalogowego	Sekwencja primera forward: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′.
starter 805R	BGI Genomics Co., Ltd.	Niestandardowy oligonukleotyd; brak numeru katalogowego	Sekwencja prawego primera: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′.
Usługa sekwencjonowania genu 16S rRNA	BGI Genomics Co., Ltd. (Wuhan, Chiny)	Usługi sekwencjonowania 16S/18S i ITS Sekwencjonowanie amplikonów 16S, 18S i ITS jest jedną z najpopularniejszych metod badania składu mikrobiomu, która pozwala na identyfikację i analizę różnorodności mikroorganizmów w próbkach środowiskowych, klinicznych i biologicznych. Dzięki wykorzystaniu konserwatywnych i zmiennych regionów genów rRna, metoda ta umożliwia precyzyjną klasyfikację taksonomiczną od poziomu królestwa do rodzaju, a w niektórych przypadkach nawet gatunku. Sekwencjonowanie 16S rRNA (bakterie i archeony) Gen 16S rRNA jest złotym standardem w identyfikacji bakterii i archeonów. Zawiera on dziewięć konserwatywnych regionów (V1–V9), które są oddzielone obszarami o wysokiej zmienności, co pozwala na rozróżnianie poszczególnych taksonów. * Zastosowania: Analiza mikrobiomu jelitowego, badania gleb i wód, diagnostyka patogenów bakteryjnych, badania ekologii mikroorganizmów. Sekwencjonowanie 18S rRNA (eukarioty) Gen 18S rRNA jest odpowiednikiem genu 16S u organizmów eukariotycznych. Jest on szeroko stosowany do analizy składu protistów, grzybów oraz innych mikroorganizmów eukariotycznych. * Zastosowania: Badania planktonu, analiza mikroflory eukariotycznej w tkankach roślinnych i zwierzęcych, badania różnorodności jednokomórkowców. Sekwencjonowanie ITS (grzyby) Regiony Internal Transcribed Spacer (ITS) są najczęściej stosowanymi markerami w identyfikacji grzybów (mykobiomie), ponieważ wykazują większą zmienność niż geny rRna, co pozwala na lepsze rozróżnienie blisko spokrewnionych gatunków. * Zastosowania: Analiza grzybów patogennych i saprotroficznych, badanie symbiozy grzybowej w glebie, ocena czystości mikrobiologicznej produktów. Nasze rozwiązania w zakresie sekwencjonowania amplikonów BGI oferuje kompleksowe usługi sekwencjonowania 16S, 18S i ITS, łącząc zaawansowaną technologię z rygorystyczną kontrolą jakości. * Wysoka dokładność i głębokość sekwencjonowania: Zapewniamy wykrycie rzadkich taksonów i precyzyjne określenie składu społeczności. * Zoptymalizowane zestawy starterów: Wykorzystujemy standardowe i sprawdzone startery, aby zapewnić szerokie spektrum detekcji i minimalizować błędy w amplifikacji. * Kompletna analiza bioinformatyczna: Dostarczamy pełne raporty zawierające analizę taksonomiczną, wykresy różnorodności (alfa i beta), analizy PCA oraz mapy ciepła (heatmaps). * Obsługa różnorodnych typów próbek: Doświadczenie w pracy z próbkami trudnymi, takimi jak próbki fekalne, tkanki, osady środowiskowe i wymazy kliniczne. Przebieg procesu 1. Ekstrakcja DNA: Izolacja wysokiej jakości genomowego DNA z dostarczonych próbek. 2. Amplifikacja PCR: Celowana amplifikacja wybranych regionów (np. V3-V4 dla 16S) przy użyciu specyficznych starterów. 3. Budowa bibliotek i sekwencjonowanie: Przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie na platformach wysokoprzepustowych. 4. Przetwarzanie danych: Filtrowanie jakościowe, usuwanie chimery oraz grupowanie sekwencji w OTU (Operational Taxonomic Units) lub ASV (Amplicon Sequence Variants). 5. Analiza taksonomiczna: Przypisanie taksonów w oparciu o najnowsze bazy danych (np. SILVA, Greengenes, UNITE). 6. Raport końcowy: Dostarczenie szczegółowych wyników i analiz statystycznych.	Komercyjny dostawca usług sekwencjonowania; przeprowadził przygotowanie bibliotek, sekwencjonowanie oraz wstępną kontrolę jakości.
probówki do mikrowirówek Eppendorf Safe-Lock, Biopur, 1,5 mL	Eppendorf SE	'0030121589	Sterylne probówki polipropylenowe używane do alikwotowania próbek kału w celu ich przechowywania w −80 °C.
LEfSe	Laboratorium Segata/bioBakery	v1.1.2; https://github.com/SegataLab/lefse	Oprogramowanie do analizy liniowej dyskryminanty (LEfSe) wykorzystane do identyfikacji taksonów o różnej liczebności oraz przewidywanych szlaków metabolicznych.
Tax4Fun2	Zespół programistyczny Tax4Fun2	v1.1.5; https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2	Pakiet R używany do wnioskowania o profilach funkcjonalnych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes na podstawie danych 16S rRNA.
pakiet R microeco	Chi Liu i współautorzy	v1.15.0; https://cran.r-project.org/package=microeco	Pakiet do analizy i wizualizacji ekologii zbiorowości dla analiz obfitości i różnorodności mikroorganizmów.
oprogramowanie R	R Foundation for Statistical Computing	Wersja niepodana; https://www.r-project.org/	Środowisko obliczeń statystycznych wykorzystane do analiz klinicznych i mikrobiomu; dokładna wersja powinna zostać potwierdzona przez autorów.
Automatyczny system oczyszczania mikrobioty kałowej GenFMTer	Nanjing FMT Medical Co., Ltd.	Model: GenFMTer; https://en.fmtmed.com/	Zautomatyzowany system wykorzystywany do standaryzowanego wirowania, przemywania i przygotowania zawiesiny mikrobioty kałowej.