Niniejszy protokół opisuje zmodyfikowaną metodę Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) z zastosowaniem oczyszczania metodą dyspersyjnej ekstrakcji do fazy stałej z użyciem adsorbenta na bazie krzemianu magnezu do wieloanalitowego oznaczania pestycydów fosforoorganicznych w glebach rolniczych za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas, co pozwala na poprawę usuwania współekstraktów, zminimalizowanie interferencji analitycznych związanych z matrycą oraz umożliwia wiarygodne oznaczanie ilościowe na poziomie śladowym.
Artykuł metodologiczny
Modyfikowana metoda QuEChERS do analizy pestycydów fosforoorganicznych w glebach rolniczych za pomocą chromatografii gazowej z tandemową spektrometrią mas
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dokładne oznaczanie pozostałości pestycydów fosforoorganicznych (OPP) w glebach rolniczych za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (GC-MS/MS) jest często utrudnione przez efekty sygnału indukowane matrycą, spowodowane współwyekstrahowaną materią organiczną, substancjami huminowymi i interferentami związanymi z minerałami. Konwencjonalne strategie oczyszczania Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) mogą nie usuwać w wystarczającym stopniu składników matrycy z kompleksowych ekstraktów glebowych, co obniża sprawność analityczną. Niniejsze badanie przedstawia zmodyfikowany protokół QuEChERS, który włącza adsorbent do oczyszczania metodą dyspersyjnej ekstrakcji do fazy stałej (dSPE) z mieszanym sorbentem w celu jednoczesnego oznaczania 12 OPP w glebach rolniczych za pomocą GC-MS/MS. Ewaluowano siedem kombinacji sorbentów dSPE w sześciu glebach rolniczych o zróżnicowanych właściwościach. Usunięcie współwyekstraktów określono grawimetrycznie, a kombinacja aminy pierwiastkowej i wtórnej, oktadecylosilanu oraz adsorbentu krzemianu magnezu (po 50 mg każdego, z 150 mg bezwodnego siarczanu magnezu) pozwoliła na najwyższe średnie usunięcie współwyekstraktów (88%). W celu zminimalizowania efektów matrycy do końcowych ekstraktów wprowadzono protektory analitytów składające się z etyloglicerolu, γ-laktonu kwasu L-gulonowego, D-sorbitolu i kwasu szikimowego, natomiast w celu skompensowania zmienności sygnału zależnej od gleby zastosowano kalibrację dopasowaną do matrycy. Chlorpyrifos-methyl-d10 i trifenylofosforan wykorzystano odpowiednio jako proceduralny wewnętrzny standard oraz wewnętrzny standard wtrysku. Krzywe kalibracyjne dopasowane do matrycy (5–600 µg/kg) wykazały doskonałą liniowość, z współczynnikami determinacji ≥0,9933 dla większości kombinacji analityt-gleba. Granicę wykrywalności (5 µg/kg) wykorzystano do oceny liniowości, natomiast granicę oznaczalności metody ustalono na poziomie 50 µg/kg jako najniższy zwalidowany poziom. Dokładność i precyzja oceniane na trzech poziomach odzysku (50, 200 i 400 µg/kg, n = 5 na poziom) wykazały odzyski od 70% do 120% przy względnych odchyleniach standardowych ≤20% dla większości kombinacji analityt-gleba, co spełnia kryteria sprawności SANTE/2020/12830 (Rev.2). Niższe odzyski zaobserwowano jedynie dla fenamifosu, pirimifosu-ethylu i etionu w wybranych matrycach glebowych. Wyniki dowodzą, że adsorbent krzemianu magnezu poprawia oczyszczanie dSPE poprzez redukcję współwyekstraktów, a jego połączenie z protektorami analitytów i kalibracją dopasowaną do matrycy zapewnia niezawodne wieloanalitowe oznaczanie OPP w złożonych matrycach glebowych za pomocą GC-MS/MS.
Wprowadzenie
Insektycydy fosfororganiczne (OPPs) pozostają jedną z najszerzej stosowanych klas agrochemikaliów na świecie ze względu na szerokie spektrum działania i wszechstronność tej grupy pestycydów w ochronie upraw1. Chociaż wiele OPPs ulega degradacji środowiskowej szybciej niż pestycydy chloroorganiczne, powszechne i powtarzalne stosowanie tych związków skutkuje ich stałą obecnością w glebach rolniczych2. Gleba pełni rolę głównego komponentu środowiskowego przyjmującego pestycydy i może służyć jako tymczasowy rezerwuar, z którego pozostałości mogą przenikać do upraw, wód powierzchniowych, wód gruntowych i okolicznych ekosystemów3. Obecność pozostałości OPPs budzi niepokój, ponieważ związki te są powiązane z efektami neurotoksycznymi u ludzi poprzez hamowanie aktywności acetylocholinoesterazy, a także ze szkodliwym wpływem na organizmy niedocelowe, glebowe społeczności mikrobowe i funkcjonowanie ekosystemów2. Występowanie pozostałości OPPs w glebach rolniczych może zatem przyczyniać się do utraty różnorodności biologicznej, nierównowagi ekologicznej i narażenia środowiska poprzez łańcuch pokarmowy oraz drogi wodne3. Niezawodne oznaczenie pozostałości OPPs jest zatem niezbędne do generowania wysokiej jakości danych o ich występowaniu, wspierania ocen narażenia środowiska i lepszego zrozumienia losów środowiskowych OPPs w różnych warunkach rolniczych. Co więcej, metody analityczne opracowane i zoptymalizowane przy użyciu jednego typu gleby nie muszą koniecznie zapewniać równoważnej wydajności w przypadku zastosowania do gleb o odmiennych charakterystykach fizykochemicznych4,5, co podkreśla znaczenie oceny przydatności metody w zróżnicowanych środowiskach rolniczych. Jednak ilościowe oznaczenie śladowych poziomów pozostaje wyzwaniem, ponieważ gleby rolnicze wykazują znaczną zmienność fizykochemiczną, która wpływa na wydajność ekstrakcji, efekty matrycowe (MEs) i ogólną sprawność analityczną6.
Chromatografia gazowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas (GC-MS/MS) jest powszechnie uznawana za referencyjną technikę analityczną do wielorezyduowego oznaczania OPP na poziomach śladowych w złożonych matrycach7,8. Niemniej jednak precyzyjna kwantyfikacja zależy nie tylko od parametrów instrumentu, ale także od skuteczności przygotowania próbek. Ekstrakty glebowe często zawierają współekstrahowane składniki matrycy, które docierają do układu chromatograficznego wraz z analizowanymi substancjami i mogą modyfikować odpowiedź analityczną poprzez tłumienie lub wzmacnianie sygnału4,5,6. Zakres tych efektów różni się znacząco w zależności od rodzaju gleby i jest uwarunkowany takimi czynnikami jak zawartość materii organicznej, frakcja ilasta, skład mineralny oraz pH. W konsekwencji efekty matrycowe (MEs) pozostają jednym z głównych źródeł niepewności analitycznej w oznaczaniu pestycydów metodą GC-MS/MS i podkreślają potrzebę stosowania strategii oczyszczania zdolnych do redukcji obciążenia współekstraktami przy jednoczesnym zachowaniu odzysku analizowanych substancji5,9,10. Ponadto generowanie wiarygodnych danych o pozostałościach wymaga zgodności z międzynarodowo przyjętymi kryteriami sprawności analitycznej, aby zapewnić dokładność metody, porównywalność badań oraz przydatność do zastosowań w monitoringu środowiska11.
Metoda Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) stała się najszerzej stosowanym podejściem do przygotowywania próbek w analizie wielorezydualnej pestycydów ze względu na swoją prostotę, niskie zużycie rozpuszczalników oraz szeroką stosowalność w obrębie macierzy rolniczych4,12,13. Jej modularna i elastyczna konstrukcja umożliwiła szeroką adaptację do różnych typów próbek i zastosowań analitycznych, co przyczyniło się do powszechnego wdrożenia tej metody we współczesnej analizie wielorezydualnej oraz do jej częstego kojarzenia z zrównoważoną chemią analityczną dzięki zredukowanemu zużyciu rozpuszczalników i uproszczonemu przygotowaniu próbek. Ta adaptacyjność pozwala również na dostosowanie metody poprzez dobór warunków ekstrakcji i oczyszczania w oparciu o specyficzne charakterystyki macierzy. W analizie gleby skuteczność etapu oczyszczania za pomocą dyspersyjnej ekstrakcji do fazy stałej (dSPE) jest krytyczna, ponieważ niewystarczające usunięcie współekstrahowanych składników macierzy może negatywnie wpłynąć na wydajność analityczną późniejszego oznaczania metodą GC-MS/MS4,14. Konwencjonalne kombinacje sorbentów oparte na aminach pierwotno-wtórnych (PSA) i oktadecylosilanie (C18) często zapewniają ograniczone usuwanie polarnych składników huminowych, które należą do głównych czynników wywołujących efekty matrycowe w ekstraktach z gleb rolniczych14. Florisil, adsorbent na bazie krzemianu magnezu wykazujący powinowactwo do związków z szerokiego zakresu polarności, wykazał obiecującą skuteczność oczyszczania w macierzach żywnościowych i roślinnych15,16. Jednakże jego rola w strategiach oczyszczania dSPE z użyciem mieszanych sorbentów dla gleb rolniczych pozostaje niewystarczająco scharakteryzowana, szczególnie w odniesieniu do gleb wykazujących zróżnicowane właściwości fizykochemiczne17,18,19,20,21.
Niniejsze badanie przedstawia zmodyfikowany protokół QuEChERS, w którym oceniono siedem kombinacji sorbentów dSPE w sześciu glebach rolniczych o zróżnicowanym pH, zawartości materii organicznej i strukturze. Badanie oparto na hipotezie, że wprowadzenie adsorbentu z krzemianu magnezu do oczyszczania dSPE z użyciem mieszanych sorbentów zwiększy usuwanie współwyekstrahowanych składników matrycy z ekstraktów gleb rolniczych. Wybór sorbentu oparto na grawimetrycznej ocenie usuwania współwyekstraktów, a kombinacja zapewniająca najwyższą średnią wydajność oczyszczania została następnie poddana pełnej walidacji analitycznej. Zoptymalizowaną procedurę zwalidowano pod kątem jednoczesnego oznaczania 12 OPP przy użyciu standaryzacji wewnętrznej, kalibracji dopasowanej do matrycy oraz GC-MS/MS. Dodatkowo do końcowego protokołu włączono środki chroniące anality (etyloglicerol, γ-lakton kwasu L-gulonowego, D-sorbitol i kwas szikimowy) jako uzupełniającą strategię minimalizacji pozostałych efektów sygnałowych wywołanych przez matrycę. Poprzez zintegrowanie systematycznej optymalizacji oczyszczania z kompleksową walidacją analityczną w glebach o kontrastujących właściwościach fizykochemicznych, protokół ten zapewnia solidny i powtarzalny schemat postępowania, który może ułatwić oznaczanie pozostałości pestycydów w heterogenicznych glebach rolniczych.
Protokół
Dane źródłowe stanowiące podstawę eksperymentalnej optymalizacji procedury oczyszczania dSPE, zestaw danych dotyczących efektu matrycy oraz charakterystyka fizykochemiczna sześciu gleb rolniczych zostały zdeponowane w Zenodo i są publicznie dostępne pod adresem DOI: 10.5281/zenodo.21644870. Szczegóły dotyczące użytych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Pobieranie i przygotowanie próbek gleby
UWAGA: Aby zapewnić bezpieczeństwo osobiste, zaleca się noszenie fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych i rękawiczek nitrylowych przez cały czas trwania tego protokołu.
- Pobierz zbiorczą próbkę kompozytową gleby z górnej warstwy (0–10 cm) z każdej wybranej lokalizacji rolniczej, łącząc 8 poszczególnych podpróbek pobranych za pomocą systematycznego planu poboru prób w siatce kwadratowej22.
UWAGA: Plan siatki kwadratowej z 8 punktami jest zgodny z zaleceniami Agencji Ochrony Środowiska Nowej Południowej Walii (NSW EPA) dla obszarów o powierzchni około 1000 m2 (0,1 ha)22. - Połącz i dokładnie wymieszaj te podpróbki w terenie, aby uzyskać jedną reprezentatywną próbkę zbiorczą (≥500 g) na lokalizację, ustanawiając homogeniczną linię bazową matrycy do oceny wydajności metody.
UWAGA: Pobieranie próbek kompozytowych jest stosowane tutaj wyłącznie w celu standaryzacji efektów tła matrycy dla optymalizacji i walidacji metody. W ramach ram regulacyjnych dla oceny terenów zanieczyszczonych w warunkach rzeczywistych lub nieznanych, pobieranie próbek kompozytowych jest ściśle ograniczone przez NSW EPA ze względu na ryzyko rozcieńczenia chemikaliów22. W celu rzeczywistej charakterystyki terenu lub wykrywania punktów zapalnych (hotspots), próbki z węzłów siatki muszą pozostać oddzielne i być analizowane indywidualnie, aby zapobiec wynikom fałszywie ujemnym i zachować dane o wariancji przestrzennej. - Transportuj próbki gleby do laboratorium w szczelnych, bursztynowych pojemnikach szklanych w ciemności.
UWAGA: Pojemniki szklane są preferowane nad workami polietylenowymi, aby zminimalizować straty adsorpcyjne hydrofobowych lub półlotnych OPP na powierzchniach plastikowych oraz zmniejszyć ryzyko wymywania zanieczyszczeń lub interakcji polimer-analit. Warunki ciemności minimalizują fotodegradację związków światłoczułych podczas transportu. - Susz próbki na powietrzu w temperaturze otoczenia, bez bezpośredniego dostępu światła, aż do osiągnięcia stałej masy.
UWAGA: Suszenie na powietrzu stosuje się w celu standaryzacji zawartości wilgoci w glebie i zapewnienia, że wyniki będą raportowane w przeliczeniu na masę suchą, co poprawia porównywalność próbek o różnej naturalnej zawartości wody. Unika się wymuszonego suszenia w piecu, aby zapobiec potencjalnym stratom termolabilnych lub półlotnych OPP oraz zmianom w strukturze materii organicznej gleby i właściwościach sorpcyjnych. - Ręcznie rozbij grudki gleby i przesiej przez sito ze stali nierdzewnej o oczkach 2 mm. Przechowuj homogenizowane gleby w szczelnych, bursztynowych pojemnikach szklanych w ciemności i w warunkach chłodniczych w temperaturze 4 °C do momentu ekstrakcji.
UWAGA: Charakterystyka fizykochemiczna sześciu gleb użytych w tej badaniu była dostępna z poprzednich rutynowych analiz glebowych. Dane te posłużyły wyłącznie do wyboru gleb rolniczych obejmujących szeroki zakres pH (gleba:H2O, 1:2)23, zawartości materii organicznej (metoda Walkeya-Blacka)24 oraz tekstury (metoda Bouyoucosa)25 do oceny metody.
2. Przygotowanie odczynników, wzorców i roztworów standardów wewnętrznych
UWAGA: O ile nie określono inaczej, poszczególne roztwory zapasowe pestycydów, mieszane roztwory wzorców roboczych, roztwory wewnętrznego wzorca proceduralnego (P-IS) i wewnętrznego wzorca do wtrysku (I-IS), roztwory odzysku oraz roztwory wzorców kalibracyjnych są przygotowywane w kolbach miarowych o pojemności 10 mL, przelewane do bursztynowych fiolek szklanych i przechowywane w temperaturze −20 °C do momentu użycia. Zastosowano kalibrację dopasowaną do matrycy, protektory analitów oraz P-IS i I-IS, ponieważ każdy z tych elementów niweluje inne źródło zmienności analitycznej, poprawiając tym samym odporność analizy ilościowej w złożonych matrycach glebowych.
- Przygotować poszczególne roztwory zapasowe dla każdego z 12 komercyjnych standardów OPP (patrz Tabela materiałów) o stężeniu 1000 mg/L w toluenie.
- Połączyć odpowiednie objętości poszczególnych roztworów zapasowych, aby przygotować mieszany roztwór wzorca roboczego w acetonitrylu (ACN) o stężeniu 400 mg/L.
UWAGA: Ten mieszany roztwór wzorca roboczego jest następnie wykorzystywany do przygotowania roztworów do odzysku i kalibracji. - Przygotować chlorpyrifos-methyl-d10 jako P-IS w ACN o stężeniu 750 mg/L. Dodać podczas ekstrakcji (krok 3.2) w celu monitorowania i korygowania zmienności proceduralnej.
UWAGA: Chlorpyrifos-methyl-d10 wybrano jako P-IS, ponieważ jako izotopowo znakowany OPP wykazuje zachowanie fizykochemiczne podobne do analizowanych substancji docelowych, pozostając jednocześnie łatwo rozróżnialnym za pomocą MS/MS. - Przygotować trifenylofosforan jako I-IS w ACN o stężeniu 1050 mg/L. Dodać bezpośrednio przed analizą instrumentalną (krok 4.2.4), aby skorygować zmienność wtrysku.
- Przygotować zapasowe roztwory do odzysku w ACN zakwaszonym 0,05% (v/v) kwasem mrówkowym, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiadające w glebie 50 µg/kg, 200 µg/kg i 400 µg/kg dla OPP, gdy 300 µL zostanie dodane do 5 g czarnej ziemi przed ekstrakcją. Przygotować oddzielny roztwór P-IS odpowiadający równoważnikowi próbki 200 µg/kg.
UWAGA: Zakwaszenie kwasem mrówkowym poprawia stabilność OPP podczas przechowywania. - Przygotować roztwory kalibracyjne zawierające 12 OPP oraz chlorpyrifos-methyl-d10 w ACN z 0,05% (v/v) kwasem mrówkowym, odpowiadające końcowym stężeniom równoważnym w glebie 5, 10, 25, 75, 200, 400 i 600 µg/kg dla analizatów oraz 200 µg/kg dla P-IS.
UWAGA: Roztwory te są następnie wykorzystywane do przygotowania krzywych kalibracyjnych dopasowanych do matrycy dla każdej matrycy glebowej, które dopasowano za pomocą nieważonej regresji liniowej. Granicę wykrywalności (LOD) i granicę oznaczalności (LOQ) zdefiniowano zgodnie z dokumentem wytycznych SANTE/2020/12830 (Rev.2). Za LOD uznano najniższy poziom kalibracji w matrycy, natomiast LOQ odpowiadało najniższemu zwalidowanemu poziomowi stężenia, wykazującemu akceptowalny odzysk i precyzję. - Przygotować mieszaninę ochronną analizatów składającą się z etyloglicerolu (100 g/L), L-gulonolaktonu (10 g/L), D-sorbitolu (10 g/L) i kwasu szikimowego (5 g/L) w ACN:wodzie (1:1, v/v) zakwaszonej 0,1% kwasem mrówkowym. Przechowywać w −20 °C. Dodać bezpośrednio przed analizą instrumentalną (krok 4.2.4) w celu mitygacji efektu ME.
3. Ekstrakcja metodą QuEChERS
- Odważ 5,00 g ± 0,01 g wysuszonej na powietrzu i przesianej gleby do 50 mL polipropylenowej probówki do wirowania.
- W przypadku eksperymentów z odzyskiem dodaj roztwór P-IS (przygotowany w kroku 2.3) oraz odpowiedni roztwór do odzysku (przygotowany w kroku 2.5), aby uzyskać stężenia końcowe 200 µg/kg dla chlorpyrifos-methyl-d10 oraz 50, 200 lub 400 µg/kg dla docelowych OPP (n = 5 na każdy poziom odzysku dla każdej gleby).
UWAGA: W eksperymentach z odzyskiem zarówno roztwór P-IS, jak i roztwory odzysku pestycydów są dodawane przed ekstrakcją, zgodnie z opisem w kroku 3.2. W rutynowej analizie próbek gleby przed ekstrakcją dodaje się tylko P-IS w celu skompensowania zmienności proceduralnej podczas przygotowania i analizy próbek. Przy przygotowywaniu ekstraktów kalibracyjnych dopasowanych do matrycy, podczas ekstrakcji nie dodaje się ani P-IS, ani standardów pestycydów; przygotowuje się ekstrakty z czystej gleby, a standardy kalibracyjne zawierające zarówno anality an l P-IS (przygotowane w kroku 2.6) dodaje się po oczyszczaniu (patrz krok 4.2.4). - Mieszaj na wortexie przez 30 s i pozostaw wzbogacone próbki do wyrównania stanu równowagi przez 10 min w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Okres wyrównywania stanu równowagi sprzyja interakcji między wzbogaconymi analitami a matrycą glebową przed ekstrakcją, co poprawia reprezentatywność eksperymentów z odzyskiem. - Dodaj 10 mL wody dejonizowanej i wstrząsaj ręcznie przez 30 s, aby zapewnić całkowite zwilżenie matrycy glebowej.
UWAGA: Rehydratacja poprawia desorpcję analitów z cząsteczek gleby i ułatwia efektywny rozdział podczas ekstrakcji. - Dodaj 10 mL ACN zawierającego 1% (v/v) kwasu octowego. Natychmiast zamknij probówkę i energicznie wstrząsaj przez 2 min.
- Dodaj 6,0 g bezwodnego siarczanu magnezu (MgSO4) oraz 1,5 g octanu sodu i natychmiast energicznie wstrząsaj probówką przez 1 min.
UWAGA: Szybkie mieszanie po dodaniu soli jest niezbędne do zapewnienia efektywnego rozdziału faz i zapobiegania tworzeniu się agregatów soli. - Wiruj przy 1800 × g przez 5 min.
- Przenieś górną fazę ACN do czystej probówki w celu późniejszego oczyszczania metodą dSPE.
4. Oczyszczanie metodą dyspersyjnej ekstrakcji do fazy stałej
UWAGA: Ta sekcja składa się z dwóch podejść. Po pierwsze, oceniono siedem kombinacji sorbentów dSPE w celu zidentyfikowania składu oczyszczania zapewniającego najwyższy średni stopień usuwania współekstraktów w sześciu glebach rolniczych. Następnie wybraną kombinację sorbentów zastosowano jako zoptymalizowaną procedurę oczyszczania do walidacji metody zgodnie z dokumentem wytycznych DG SANTE/2020/12830 (Rev.2) Dyrekcji Generalnej Komisji Europejskiej ds. Zdrowia i Bezpieczeństwa Żywności (DG SANTE)11.
- Optymalizacja kombinacji sorbentów dSPE
UWAGA: Gravimetryczne usuwanie współekstraktów wybrano jako kryterium optymalizacji, ponieważ zapewnia ono niezależny od analitycznego pomiar wydajności oczyszczania. Oceńione ilości sorbentów odpowiadają konwencjonalnym proporcjom szeroko stosowanym w procedurach dSPE opartych na metodzie QuEChERS, co ułatwia wdrożenie proponowanego protokołu w rutynowych laboratoriach analitycznych.- Przygotować probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL zawierające następujące kombinacje sorbentów: (i) 150 mg bezwodnego MgSO4 + 50 mg PSA; (ii) 150 mg bezwodnego MgSO4 + 50 mg C18; (iii) 150 mg bezwodnego MgSO4 + 50 mg adsorbentu krzemianu magnezu; (iv) 150 mg bezwodnego MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18; (v) 150 mg bezwodnego MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg adsorbentu krzemianu magnezu; (vi) 150 mg bezwodnego MgSO4 + 50 mg C18 + 50 mg adsorbentu krzemianu magnezu; (vii) 150 mg bezwodnego MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18 + 50 mg adsorbentu krzemianu magnezu.
- Przenieść 1,0 mL aliquoty ekstraktu otrzymanego w kroku 3.8 do każdej probówki dSPE.
UWAGA: Wszystkie oceny sorbentów należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach dla każdej gleby. Alikwoty użyte do porównania powinny pochodzić z tego samego ekstraktu, aby mieć pewność, że różnice w usuwaniu współekstraktów wynikają wyłącznie ze składu mieszanki oczyszczającej. - Mieszać na wortexie przez 1 min i wirować przy 1800 × g przez 5 min.
- Przenieść 1,0 mL każdego oczyszczonego ekstraktu do wcześniej wysuszonej i zważonej szklanej probówki. Odparować rozpuszczalnik do suchości pod łagodnym strumieniem azotu w temperaturze 40 °C.
- Pozostawić probówkę do ostygnięcia w deskrykatorze do temperatury pokojowej i wyznaczyć masę pozostałej pozostałości. Obliczyć masę współekstraktów, odejmując początkową wagę pustej probówki od wagi końcowej po odparowaniu rozpuszczalnika.
- Wyznaczyć ilość współekstraktów obecnych w ekstraktach bez oczyszczania dSPE poprzez odparowanie równoważnych alikwotów niepoddanego oczyszczaniu ekstraktu w identycznych warunkach.
- Obliczyć procent usuwania współekstraktów zgodnie z Równaniem 126:
- Obliczyć średnie usuwanie współekstraktów z trzech powtórzeń dla każdej kombinacji sorbentów i każdej gleby. Następnie obliczyć średnie usuwanie dla sześciu gleb rolniczych dla każdej kombinacji sorbentów.
- Ocenić różnice między kombinacjami sorbentów za pomocą analizy wariancji (ANOVA) w ramach zrandomizowanego pełnego układu blokowego (RCBD), przyjmując kombinację sorbentów jako czynnik zabiegowy, a matrycę glebową jako czynnik blokujący. Przed ANOVA ocenić normalność rozkładu reszt oraz jednorodność wariancji, stosując odpowiednio testy Shapiro-Wilka i Levene'a. Przeprowadzić porównania parowe za pomocą testu HSD Tukeya przy poziomie istotności α = 0,05.
- Wybrać skład mieszanki oczyszczającej na podstawie łącznej oceny analizy statystycznej oraz ogólnej średniej wartości usuwania współekstraktów.
UWAGA: Redukcja ładunku współekstraktów minimalizuje wprowadzanie komponentów matrycy do układu chromatograficznego, co poprawia wydajność chromatograficzną, zmniejsza zanieczyszczenie systemu GC-MS/MS i obniża wymagania dotyczące konserwacji instrumentu.
UWAGA: Kombinacja zawierająca PSA, C18 i adsorbent krzemianu magnezu (po 50 mg każdego, z 150 mg bezwodnego MgSO4) osiągnęła najwyższe średnie usuwanie współekstraktów i została zatem wybrana jako zoptymalizowana procedura oczyszczania dla wszystkich kolejnych analiz.
- Zastosowanie zoptymalizowanej procedury oczyszczania dSPE
- Przenieść 1,0 mL ekstraktu otrzymanego w kroku 3.8 do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL zawierającej 150 mg bezwodnego MgSO4, 50 mg PSA, 50 mg C18 i 50 mg adsorbentu krzemianu magnezu.
- Mieszać na wortexie przez 1 min, aby zapewnić pełną interakcję między ekstraktem a sorbentami.
- Wirować przy 1800 × g przez 5 min.
- Przenieść 200 µL oczyszczonego supernatantu do fiolki do autoprobownika i dodać 20 µL mieszaniny ochronnej analitów przygotowanej w kroku 2.7 oraz 50 µL roztworu fosforanu trifenylu przygotowanego w kroku 2.4. Dokładnie wymieszać przed analizą instrumentalną.
UWAGA: W celu kalibracji dopasowanej do matrycy przygotować ślepe ekstrakty z każdej gleby zgodnie z procedurami ekstrakcji i oczyszczania opisanymi w krokach 3 i 4.2, bez dodawania pestycydów lub P-IS. Po oczyszczaniu przenieść 200 µL oczyszczonego ślepego ekstraktu do siedmiu oddzielnych fiolek do autoprobownika i dodać roztwory kalibracyjne przygotowane w kroku 2.6, aby uzyskać końcowe stężenia 5, 10, 25, 75, 200, 400 i 600 µg/kg dla analitów oraz 200 µg/kg dla P-IS. Do każdej fiolki dodać 20 µL mieszaniny ochronnej analitów i 50 µL fosforanu trifenylu, jak opisano w kroku 4.2.4, co daje końcową objętość fiolki 270 µL. Sporządzić niezależne krzywe kalibracyjne dopasowane do matrycy dla każdej matrycy glebowej. Stężenia równoważne dla gleby opierają się na 200 µL alikwocie oczyszczonego ekstraktu, który reprezentuje ekstrakt uzyskany z oryginalnej próbki 5 g gleby. Następne dodanie środków ochronnych analitów i I-IS zwiększa końcową objętość fiolki, ale nie zmienia ilości gleby reprezentowanej przez alikwot ekstraktu. W przypadku kalibracji w rozpuszczalniku zastąpić 200 µL alikwot oczyszczonego ekstraktu glebowego 200 µL ACN i przygotować fiolki kalibracyjne przy użyciu tych samych stężeń analitów, stężenia P-IS, stężenia I-IS i mieszaniny ochronnej analitów, które zastosowano w kalibracji dopasowanej do matrycy. Te krzywe kalibracyjne w rozpuszczalniku są następnie wykorzystywane do oceny ME. - Przeprowadzić analizę instrumentalną przy użyciu systemu GC-MS/MS.
5. Analiza GC-MS/MS i akwizycja danych
UWAGA: Szczegółowe opisy konfiguracji GC-MS/MS oraz procedur akwizycji danych są dostępne w pracy Varela-Martínez i wsp.27. Główne parametry chromatograficzne i spektrometry masowe zostały podsumowane poniżej.
- Należy użyć systemu GC-MS/MS wyposażonego w potrójny spektrometr mas kwadrupolowy, źródło jonizacji elektronowej (EI) pracujące przy −70 eV oraz automatyczny próbnik (autosampler).
- Zainstaluj niskopolarną kapilarną kolumnę z topionego szkła kwarcowego (30 m × 0,25 mm i.d. × 0.25 µm grubość warstwy) i użyć helu jako gazu nośnego przy stałej prędkości przepływu 1,2 ml/min.
- Przed przystąpieniem do analizy należy sprawdzić gotowość urządzenia, w tym podaż gazu nośnego, sprawność układu próżniowego, stan strzykawki oraz poziomy rozpuszczalnika płuczącego w autosamplerze. Należy przeprowadzić strojenie instrumentu zgodnie z zaleceniami producenta.
UWAGA: Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek sekwencji analitycznej należy sprawdzić, czy próżnia robocza jest zgodna ze specyfikacjami zalecanymi przez producenta instrumentu. - Ustaw program temperatury pieca GC w następujący sposób: temperatura początkowa wynosząca 50 °C przez 1 min; zwiększyć do 180 °C w 25 °C/min; a następnie do 230 °C w 5 °C/min; a na koniec do 290 °C w 25 °C/min. Utrzymać temperaturę końcową przez 6 min. Całkowity czas przebiegu wynosi 24,6 min.
- Ustaw temperaturę portu wtryskowego na 250 °C oraz przeprowadzić 1 µL wtryski w trybie bezpodziałowym (splitless). Otwórz zawór odprowadzający (split vent) 1 minutę po wtrysku.
UWAGA: Aby zminimalizować efekt przeniesienia, należy kolejno płukać strzykawkę autosamplera metanolem, octanem etylu i ACN pomiędzy wtryskami. - Ustaw temperaturę linii transferowej MS na 250 °C a temperaturę źródła jonów na 300 °C.
- Należy przeprowadzić akwizycję danych w trybie monitorowania wybranych reakcji (MRM), wykorzystując przejścia jonów prekursor-produkt wymienione w Tabela 1.
- Ilościowo wyznacz anality, wykorzystując dopasowane do matrycy krzywe kalibracyjne przygotowane dla każdej matrycy glebowej. Oblicz stężenia analitów na podstawie stosunku pola piku analitu do pola piku chlorpyrifos-methyl-d10.
- Należy zastosować trifenylofosforan jako wewnętrzny standard kontrolny (I-IS) w celu weryfikacji powtarzalności wstrzykiwań w całej sekwencji analitycznej.
- Oblicz ME zgodnie z Równanie 228:
![Wzór na efekt matrycy, ME(%)=[Nachylenie_matrycy/Nachylenie_rozpuszczalnika-1]x100, wzór z chemii analitycznej.](/files/ftp_upload/72745/72745eq2.jpg "figure-protocol-2")
gdzie wartości ujemne wskazują na tłumienie sygnału, a wartości dodatnie na wzmocnienie sygnału.
UWAGA: Schematyczny przegląd pełnego przebiegu analizy przedstawiono w Rycina 1.
Wyniki
Sześć gleb rolniczych wybranych do oceny metody reprezentowało szeroki zakres właściwości glebowych (patrz Tabela 2), w tym wartości pH (gleba:H2O, 1:2) w przedziale od 4,67 do 7,31, zawartość materii organicznej od 0,18% do 6,46% oraz frakcję gliny od 22,9% do 48,5%. Pięć gleb pochodziło z regionów rolniczych Kolumbii, a jedna z Hiszpanii. Różnorodność tę celowo uwzględniono, aby ocenić odporność proponowanej procedury oczyszczania w różnych macierzach glebowych, biorąc pod uwagę, że właściwości gleby, takie jak pH, zawartość materii organicznej i tekstura, wpływają na współekstrakcję, efekty matrycowe (MEs) oraz odzysk analitytów podczas analizy pozostałości pestycydów.
Oceniono siedem kombinacji sorbentów dSPE, wykorzystując grawimetryczne oznaczenie usuwania współwyciągów (patrz Rysunek 2). Wśród pojedynczych sorbentów najwyższą średnią skuteczność usuwania współwyciągów osiągnął Florisil (71%), a następnie PSA (58%) i C18 (41%). Adsorbent krzemianu magnezu zapewnił całkowite usunięcie współwyciągów w próbce S2 (100%) i wykazał wartości powyżej 90% w S3 (91%) i S4 (91%). Z kolei PSA wykazało większą zmienność w zależności od rodzaju gleby, z wydajnością usuwania od 21% w S4 do całkowitego usunięcia w S6. C18 wykazało najniższą i najbardziej zmienną skuteczność, od 0% w S1 i S2 do 93% w S4. Wśród kombinacji mieszanych sorbentów kombinacja PSA+Adsorbent osiągnęła średnią skuteczność usuwania współwyciągów na poziomie 80%. Kombinacje PSA+Adsorbent i C18+Adsorbent zaowocowały niższymi średnimi wartościami usuwania, wynoszącymi odpowiednio 73% i 74%. Wprowadzenie adsorbenta krzemianu magnezu do mieszaniny PSA+C18 dodatkowo zwiększyło średnią skuteczność usuwania do 88%, co stanowiło najwyższą wartość uzyskaną spośród wszystkich ocenianych konfiguracji oczyszczania. Kombinacja PSA+C18+Adsorbent osiągnęła wartości usuwania powyżej 80% w pięciu z sześciu gleb oraz zapewniła całkowite usunięcie współwyciągów w S2 i S6. Analiza statystyczna z użyciem ANOVA w układzie RCBD wykazała istotny wpływ kombinacji sorbentów na usuwanie współwyciągów (p = 0,0432). Grupowania statystyczne uzyskane za pomocą testu HSD Tukeya przedstawiono na Rysunku 2.
Selektywność metody wykazano poprzez brak interferujących pików chromatograficznych w oczekiwanych czasach retencji analizowanych substancji docelowych. Dla każdego analitu i matrycy glebowej sporządzono krzywe kalibracyjne dopasowane do matrycy w zakresie stężeń 5–600 µg/kg, przy granicy wykrywalności (LOD) wynoszącej 5 µg/kg (patrz Tabela 3). W czasach retencji odpowiadających analizowanym substancjom docelowym nie zaobserwowano pików interferujących. Dla ogromnej większości kombinacji analit-gleba uzyskano doskonałą liniowość. Tylko trzy krzywe kalibracyjne wykazały współczynniki determinacji (R2) poniżej 0,9933, wszystkie w przypadku fenamifosu: w S1 (R2 = 0,9888), S3 (R2 = 0,9606) oraz w kalibracji w rozpuszczalniku (R2 = 0,9871). Odnośnie do efektów matrycy (ME), na podstawie średnich wartości dla sześciu gleb (patrz Rycina 3), zaobserwowano tłumienie sygnału (ME < 0) dla 10 z 12 docelowych OPP, podczas gdy wzmocnienie sygnału (ME > 0) odnotowano jedynie dla malationu (+3%) i fenamifosu (+25%). Większość analitów wykazała niewielkie ME, przy średnich wartościach ME od −25% dla metydationu i −23% dla parationu-metylowego do −5% dla etionu. Fenamifos wykazał najwyższe średnie wzmocnienie (+25%), natomiast malation wykazał jedynie niewielkie wzmocnienie (+3%). Na poziomie poszczególnych gleb najsilniejsze tłumienie sygnału zaobserwowano dla pirimifosu-etylowego w S5 (−60%) i parationu-metylowego w S1 (−44%). W przeciwieństwie do nich, fenamifos wykazał wzmocnienie sygnału w pięciu z sześciu gleb, osiągając maksymalną wartość ME +58% w S2, natomiast malation wykazał wzmocnienie w czterech glebach, z maksymalną wartością +16% w S4.
Wyniki odzysku i precyzji uzyskane dla trzech poziomów wzbogacenia przedstawiono w Tabeli 4. Najniższy poziom wzbogacenia odpowiadał docelowej granicy oznaczalności (LOQ) metody wynoszącej 50 µg/kg. Większość kombinacji analityk-gleba spełniała kryteria wydajności SANTE/2020/12830 (Rev.2)11, przy średnich odzyskach w przedziale od 70% do 120% i względnych odchyleniach standardowych (RSD) ≤ 20%. W przypadku fenamifosu odzyski były niższe niż 70% w próbkach S1, S2 i S4. Pirimifos-ethyl wykazał odzyski poniżej 70% w S1 i S6, natomiast etion wykazał odzyski poniżej 70% w S1. Dla pozostałych analityków odzyski zazwyczaj mieściły się w dopuszczalnym zakresie we wszystkich glebach i poziomach wzbogacenia. W większości przypadków wartości RSD pozostały poniżej kryterium akceptacji wynoszącego 20%, co świadczy o zadowalającej precyzji metody w badanym zakresie stężeń.
Rysunek 1: Schematyczna procedura oznaczania OPP w glebach rolniczych z wykorzystaniem ekstrakcji QuEChERS, zoptymalizowanego oczyszczania dSPE oraz analizy GC-MS/MS. Złożone próbki gleby zostały poddane obróbce (homogenizacji, suszeniu powietrznemu i przesiewaniu) przed ekstrakcją QuEChERS z użyciem zakwaszonego ACN i rozdziału poprzez wysalanie. Grawimetrycznie oceniono siedem kombinacji sorbentów dSPE w celu optymalizacji oczyszczania, a wybraną mieszaninę (150 mg MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18 + 50 mg adsorbentu krzemianu magnezu) zastosowano do walidacji metody. Końcowe ekstrakty analizowano za pomocą GC-MS/MS z zastosowaniem środków chroniących anality oraz I-IS. Skuteczność metody dla 12 OPP oceniono pod kątem kalibracji dopasowanej do matrycy, ME, odzysków oraz precyzji z użyciem P-IS. Skróty: QuEChERS = Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe; ACN = acetonitryl; PSA = amina pierwszo-drugorzędowa; C18 = oktadecylosilan; dSPE = dyspersyjna ekstrakcja do fazy stałej; I-IS = wewnętrzny standard wstrzykiwany; GC-MS/MS = chromatografia gazowa z tandemową spektrometrią mas; MRM = monitorowanie wielu reakcji; OPPs = pestycydy fosforoorganiczne; P-IS = proceduralny standard wewnętrzny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Usuwanie współekstraktów osiągnięte przez siedem kombinacji sorbentów dSPE w sześciu glebach rolniczych (S1–S6). Usuwanie współekstraktów określono grawimetrycznie po ekstrakcji QuEChERS i oczyszczaniu dSPE. Oceniono siedem kombinacji sorbentów: PSA, C18, adsorbent krzemianu magnezu, PSA+C18, PSA+Adsorbent, C18+Adsorbent oraz PSA+C18+Adsorbent (po 50 mg każdego, z 150 mg bezwodnego MgSO4). Procenty usuwania obliczono w stosunku do ekstraktów nieoczyszczonych zgodnie z równaniem 1. Wartości reprezentują średnią z trzech pomiarów dla każdej matrycy glebowej, a słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. S1: Villavicencio (Meta, Kolumbia); S2: Sabana Bogotá (Cundinamarca, Kolumbia); S3: Floresta (Boyacá, Kolumbia); S4: Guasca (Cundinamarca, Kolumbia); S5: Santa Rosa de Viterbo (Boyacá, Kolumbia); S6: La Laguna (Kanary, Hiszpania). Różne małe litery nad każdą kombinacją sorbentów wskazują statystycznie istotne różnice między średnimi z zabiegów zgodnie z analizą ANOVA w układzie RCBD, a następnie testem Tukey's HSD (p < 0.05). Porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu średnich z zabiegów dla sześciu matryc glebowych. Skróty: PSA = amina pierwotno-wtórna; C18 = oktadecylosilan. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Mapa cieplna efektów matrycy (ME%) dla 12 OPPs w sześciu matrycach glebowych (S1–S6). ME obliczono jako względną różnicę między nachyleniem krzywej kalibracyjnej w matrycy a w rozpuszczalniku, zgodnie z Równaniem 2. Wartości dodatnie wskazują na wzmocnienie sygnału (kolor czerwony), natomiast wartości ujemne wskazują na tłumienie sygnału (kolor niebieski). Skróty: OPPs = pestycydy organofosforowe; IS = standard wewnętrzny; OM = materia organiczna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Analit | Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.R (min) | Kwantyfikator (m/z) | CE (V) | Kwalifikator 1 (m/z) | CE (V) | Kwalifikator 2 (m/z) | CE (V) | ||
| Chlorpyrifos-metyl | 11.720 | 288 286 | 5 | 28693 | 25 | 286125 | 25 | ||
| Paration metylowy | 11.868 | 263109 | 15 | 10979 | 10 | 263125 | 10 | ||
| Tolclofos-metyl | 11.915 | 265250 | 15 | 267265 | 5 | 265125 | 5 | ||
| Pirimifos-metyl | 12.431 | 290233 | 10 | 305290 | 10 | 290276 | 10 | ||
| Fenitrotion | 12.526 | 277260 | 5 | 277109 | 20 | 125109 | 15 | ||
| Malation | 12.727 | 12799 | 5 | 173127 | 5 | 12593 | 5 | ||
| Chlorpyryfos | 12.976 | 314258 | 15 | 199171 | 15 | 19797 | 15 | ||
| Fenthion | 13.083 | 278109 | 20 | 278169 | 20 | 278245 | 10 | ||
| Pirimifos-etyl | 13.571 | 333168 | 25 | 333318 | 10 | 318180 | 10 | ||
| Metidation | 14.856 | 14585 | 10 | 14558 | 15 | 14593 | 10 | ||
| Fenamifos | 15.519 | 303288 | 10 | 303154 | 20 | 303217 | 10 | ||
| Etion | 16.148 | 153125 | 10 | 153125 | 5 | 231153 | 5 | ||
| Chlorpyrifos-methyl-d10 (P-IS) | 12.862 | 324260 | 25 | 324195 | 25 | 324292 | 10 | ||
| Fosforan trifenylu (I-IS) | 18.187 | 326325 | 5 | 326169 | 25 | 326215 | 25 | ||
Tabela 1: Czasy retencji, przejścia kwantyfikacyjne, przejścia kwalifikacyjne i energie kolizji w analizach GC-MS/MS dla 12 docelowych OPP, chlorpyrifos-methyl-d10 (P-IS) oraz trifenylofosforanu (I-IS). Skróty: GC-MS/MS = chromatografia gazowa z tandemową spektrometrią mas; OPPs = pestycydy fosforoorganiczne; P-IS = proceduralny standard wewnętrzny; I-IS = wstrzykiwany standard wewnętrzny; tR = czas retencji; CE (V) = energia kolizji (wolty); m/z = stosunek masy do ładunku. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
| Gleba | Pochodzenie | pH gleby:H2O (1:2) | Materia organiczna (%) | Glinka (%) | Klasa teksturalna |
| S1 | Villavicencio (Meta, Kolumbia) | 5.51 | 0.18 | 48.5 | Glina |
| S2 | Sabana Bogotá (Cundinamarca, Kolumbia) | 4.67 | 1.04 | 37.4 | Gleba gliniasto-piaszczysta |
| S3 | Floresta (Boyacá, Kolumbia) | 5.53 | 1.71 | 28.2 | Gleba gliniasto-piaszczysta |
| S4 | Guasca (Cundinamarca, Kolumbia) | 4.89 | 6.46 | 22.9 | Piaszczysto-gliniasto-piaskowa gleba |
| S5 | Santa Rosa de Viterbo (Boyacá, Kolumbia) | 4.76 | 2.74 | 27.5 | Piaszczysto-gliniasto-piaszczysta gleba |
| S6 | La Laguna (Kanary, Hiszpania) | 7.31 | 1.27 | 39.6 | Gleba gliniasto-piaszczysta |
Tabela 2: Pochodzenie i właściwości fizykochemiczne sześciu gleb rolniczych (S1–S6) użytych do ewaluacji metody. Dane obejmują pH (gleba:H2O, 1:2), zawartość materii organicznej (metoda Walkleya–Blacka), frakcję ilastą (metoda Bouyoucosa) oraz klasę teksturalną. Zróżnicowane gleby wybrano w celu zapewnienia szerokiego zakresu warunków fizykochemicznych do oceny metody. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
| Analit | Próbka | Zakres (µg/kg) | b ± sb·t(0,05;7) | a ± sa·t(0,05;7) | sy/x | R² | ME (%) | ||
| Chlorpiryfos-metyl | Gleba 1 | 5–600 | 1,50·10⁻² ± 1,75·10⁻⁴ | 2,39·10⁻² ± 5,02·10⁻² | 3,61·10⁻² | 0.9999 | -22 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 1,68·10⁻² ± 3,21·10⁻⁴ | 8,31·10⁻³ ± 9,20·10⁻² | 6,62·10⁻² | 0.9997 | -13 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 1,83·10⁻² ± 5,62·10⁻⁴ | −6,60·10⁻² ± 1,61·10⁻¹ | 1,26·10⁻¹ | 0.9991 | -5 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 1,72·10⁻² ± 1,59·10⁻⁴ | −2,40·10⁻² ± 4,56·10⁻² | 3,54·10⁻² | 0.9999 | -11 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 1,66·10⁻² ± 9,51·10⁻⁴ | −6,65·10⁻² ± 2,71·10⁻¹ | 2,09·10⁻¹ | 0.9975 | -14 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 1,62·10⁻² ± 2,28·10⁻⁴ | 1,15·10⁻² ± 6,52·10⁻² | 4,99·10⁻² | 0.9998 | -16 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 1,93·10⁻² ± 1,19·10⁻³ | −1,23·10⁻¹ ± 3,41·10⁻¹ | 2,46·10⁻¹ | 0.9971 | — | |||
| Paration metylowy | Gleba 1 | 5–600 | 3,80·10⁻³ ± 1,42·10⁻⁴ | −3,10·10⁻² ± 4,05·10⁻² | 2,92·10⁻² | 0.9989 | -44 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 5,16·10⁻³ ± 1,70·10⁻⁴ | −3,24·10⁻² ± 4,86·10⁻² | 3,50·10⁻² | 0.9992 | -24 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 5,27·10⁻³ ± 1,76·10⁻⁴ | −1,93·10⁻² ± 5,02·10⁻² | 3,93·10⁻² | 0.9990 | -22 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 5,77·10⁻³ ± 1,00·10⁻⁴ | −3,06·10⁻² ± 2,87·10⁻² | 2,23·10⁻² | 0.9997 | -15 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 5,80·10⁻³ ± 3,16·10⁻⁴ | −5,68·10⁻² ± 9,00·10⁻² | 6,96·10⁻² | 0.9978 | -15 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 5,45·10⁻³ ± 1,46·10⁻⁴ | −2,40·10⁻² ± 4,18·10⁻² | 3,20·10⁻² | 0.9994 | -20 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 6,80·10⁻³ ± 4,74·10⁻⁴ | −7,73·10⁻² ± 1,36·10⁻¹ | 9,76·10⁻² | 0.9963 | — | |||
| tolclofos-metyl | Gleba 1 | 5–600 | 1,78·10⁻² ± 2,78·10⁻⁴ | −4,35·10⁻⁴ ± 7,94·10⁻² | 5,72·10⁻² | 0.9998 | -17 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 1,90·10⁻² ± 2,25·10⁻⁴ | 1,40·10⁻² ± 6,44·10⁻² | 4,64·10⁻² | 0.9999 | -12 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 2,10·10⁻² ± 2,15·10⁻⁴ | −4,10·10⁻³ ± 6,15·10⁻² | 4,81·10⁻² | 0.9999 | -3 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 1,97·10⁻² ± 3,08·10⁻⁴ | 3,68·10⁻² ± 8,82·10⁻² | 6,85·10⁻² | 0.9998 | -9 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 1,97·10⁻² ± 1,01·10⁻³ | −1,08·10⁻¹ ± 2,88·10⁻¹ | 2,23·10⁻¹ | 0.9980 | -9 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 1,95·10⁻² ± 1,68·10⁻⁴ | 7,35·10⁻³ ± 4,80·10⁻² | 3,67·10⁻² | 0.9999 | -10 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 2,16·10⁻² ± 9,90·10⁻⁴ | −9,16·10⁻² ± 2,83·10⁻¹ | 2,04·10⁻¹ | 0.9984 | — | |||
| Pirimifos-metyl | Gleba 1 | 5–600 | 6,48·10⁻³ ± 1,09·10⁻⁴ | −3,28·10⁻² ± 3,11·10⁻² | 2,24·10⁻² | 0.9998 | -19 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 7,41·10⁻³ ± 6,28·10⁻⁵ | −2,13·10⁻² ± 1,80·10⁻² | 1,30·10⁻² | 0.9999 | -7 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 8,00·10⁻³ ± 1,29·10⁻⁴ | −1,76·10⁻² ± 3,68·10⁻² | 2,88·10⁻² | 0.9998 | 1 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 7,80·10⁻³ ± 1,52·10⁻⁴ | −5,27·10⁻³ ± 4,36·10⁻² | 3,38·10⁻² | 0.9997 | -2 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 7,33·10⁻³ ± 3,71·10⁻⁴ | −6,17·10⁻² ± 1,06·10⁻¹ | 8,16·10⁻² | 0.9981 | -8 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 7,42·10⁻³ ± 8,58·10⁻⁵ | −2,18·10⁻² ± 2,46·10⁻² | 1,88·10⁻² | 0.9999 | -7 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 7,96·10⁻³ ± 4,79·10⁻⁴ | −6,77·10⁻² ± 1,37·10⁻¹ | 9,88·10⁻² | 0.9972 | — | |||
| Fenitrotion | Gleba 1 | 5–600 | 4,65·10⁻³ ± 2,84·10⁻⁴ | −4,91·10⁻² ± 8,12·10⁻² | 5,85·10⁻² | 0.9971 | -40 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 6,34·10⁻³ ± 2,12·10⁻⁴ | −5,64·10⁻² ± 6,06·10⁻² | 4,36·10⁻² | 0.9991 | -18 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 6,43·10⁻³ ± 2,20·10⁻⁴ | −2,81·10⁻² ± 6,31·10⁻² | 4,94·10⁻² | 0.9989 | -17 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 7,41·10⁻³ ± 1,83·10⁻⁴ | −5,38·10⁻² ± 5,23·10⁻² | 4,07·10⁻² | 0.9995 | -4 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 6,84·10⁻³ ± 4,22·10⁻⁴ | −8,07·10⁻² ± 1,20·10⁻¹ | 9,28·10⁻² | 0.9971 | -11 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 6,50·10⁻³ ± 1,48·10⁻⁴ | −5,02·10⁻² ± 4,24·10⁻² | 3,25·10⁻² | 0.9995 | -16 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 7,71·10⁻³ ± 7,02·10⁻⁴ | −1,06·10⁻¹ ± 2,01·10⁻¹ | 1,45·10⁻¹ | 0.9937 | — | |||
| Malation | Gleba 1 | 5–600 | 1,20·10⁻² ± 4,06·10⁻⁴ | −4,45·10⁻² ± 1,16·10⁻¹ | 8,37·10⁻² | 0.9991 | -24 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 1,78·10⁻² ± 2,03·10⁻⁴ | −4,55·10⁻² ± 5,81·10⁻² | 4,19·10⁻² | 0.9999 | 12 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 1,67·10⁻² ± 1,44·10⁻³ | 1,00·10⁻¹ ± 4,11·10⁻¹ | 3,21·10⁻¹ | 0.9933 | 5 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 1,83·10⁻² ± 1,44·10⁻⁴ | −2,48·10⁻² ± 4,12·10⁻² | 3,20·10⁻² | 0.9999 | 16 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 1,58·10⁻² ± 8,21·10⁻⁴ | −9,07·10⁻² ± 2,33·10⁻¹ | 1,81·10⁻¹ | 0.9980 | 0 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 1,69·10⁻² ± 2,54·10⁻⁴ | −2,97·10⁻² ± 7,28·10⁻² | 5,57·10⁻² | 0.9998 | 7 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 1,58·10⁻² ± 7,45·10⁻⁴ | −8,76·10⁻² ± 2,13·10⁻¹ | 1,53·10⁻¹ | 0.9983 | — | |||
| Chlorpyryfos | Gleba 1 | 5–600 | 1,03·10⁻² ± 1,59·10⁻⁴ | −1,62·10⁻² ± 4,54·10⁻² | 3,27·10⁻² | 0.9998 | -21 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 1,15·10⁻² ± 1,96·10⁻⁴ | 4,71·10⁻¹ ± 5,62·10⁻² | 4,04·10⁻² | 0.9998 | -12 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 1,26·10⁻² ± 9,94·10⁻⁵ | −1,12·10⁻² ± 2,84·10⁻² | 2,23·10⁻² | 0.9999 | -3 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 1,24·10⁻² ± 1,76·10⁻⁴ | −1,44·10⁻⁴ ± 5,04·10⁻² | 3,92·10⁻² | 0.9998 | -5 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 1,16·10⁻² ± 6,33·10⁻⁴ | −8,42·10⁻² ± 1,80·10⁻¹ | 1,39·10⁻¹ | 0.9977 | -11 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 1,14·10⁻² ± 2,29·10⁻⁴ | 7,10·10⁻⁴ ± 6,57·10⁻² | 5,02·10⁻² | 0.9996 | -12 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 1,30·10⁻² ± 5,48·10⁻⁴ | −7,41·10⁻² ± 1,57·10⁻¹ | 1,13·10⁻¹ | 0.9986 | — | |||
| Fenthion | Gleba 1 | 5–600 | 1,71·10⁻² ± 3,38·10⁻⁴ | −3,26·10⁻² ± 9,68·10⁻² | 6,97·10⁻² | 0.9997 | -16 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 1,88·10⁻² ± 1,89·10⁻⁴ | −2,84·10⁻² ± 5,40·10⁻² | 3,89·10⁻² | 0.9999 | -8 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 2,01·10⁻² ± 4,45·10⁻⁴ | −1,38·10⁻² ± 1,27·10⁻¹ | 9,95·10⁻² | 0.9996 | -2 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 1,96·10⁻² ± 2,89·10⁻⁴ | −8,63·10⁻⁴ ± 8,27·10⁻² | 6,42·10⁻² | 0.9998 | -4 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 1,89·10⁻² ± 9,10·10⁻⁴ | −1,33·10⁻¹ ± 2,59·10⁻¹ | 2,00·10⁻¹ | 0.9983 | -7 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 1,84·10⁻² ± 1,16·10⁻⁴ | −4,97·10⁻² ± 3,31·10⁻² | 2,54·10⁻² | 0.9999 | -10 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 2,05·10⁻² ± 9,70·10⁻⁴ | −1,27·10⁻¹ ± 2,78·10⁻¹ | 2,00·10⁻¹ | 0.9983 | — | |||
| Pirimifos-etyl | Gleba 1 | 5–600 | 3,30·10⁻³ ± 6,51·10⁻⁵ | −2,54·10⁻² ± 1,86·10⁻² | 1,34·10⁻² | 0.9997 | -3 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 3,30·10⁻³ ± 3,66·10⁻⁵ | −5,05·10⁻³ ± 1,05·10⁻² | 7,55·10⁻³ | 0.9999 | -3 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 2,80·10⁻³ ± 1,78·10⁻⁴ | 1,98·10⁻³ ± 5,10·10⁻² | 3,99·10⁻² | 0.9963 | -17 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 2,64·10⁻³ ± 5,18·10⁻⁵ | 2,01·10⁻³ ± 1,48·10⁻² | 1,15·10⁻² | 0.9997 | -22 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 1,36·10⁻³ ± 6,77·10⁻⁵ | 4,60·10⁻⁴ ± 1,93·10⁻² | 1,49·10⁻² | 0.9981 | -60 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 2,92·10⁻³ ± 1,23·10⁻⁴ | −9,09·10⁻³ ± 3,51·10⁻² | 2,69·10⁻² | 0.9985 | -14 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 3,39·10⁻³ ± 1,46·10⁻⁴ | −2,62·10⁻² ± 4,18·10⁻² | 3,01·10⁻² | 0.9986 | — | |||
| Metidation | Gleba 1 | 5–600 | 2,12·10⁻² ± 7,46·10⁻⁴ | −9,50·10⁻² ± 2,13·10⁻¹ | 1,54·10⁻¹ | 0.9990 | -34 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 2,59·10⁻² ± 5,46·10⁻⁴ | −1,20·10⁻¹ ± 1,56·10⁻¹ | 1,12·10⁻¹ | 0.9997 | -19 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 2,33·10⁻² ± 1,54·10⁻³ | 6,34·10⁻² ± 4,41·10⁻¹ | 3,45·10⁻¹ | 0.9961 | -27 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 2,51·10⁻² ± 3,38·10⁻⁴ | −5,47·10⁻² ± 9,66·10⁻² | 7,51·10⁻² | 0.9998 | -22 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 2,59·10⁻² ± 1,32·10⁻³ | −2,06·10⁻¹ ± 3,75·10⁻¹ | 2,90·10⁻¹ | 0.9980 | -19 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 2,27·10⁻² ± 3,71·10⁻⁴ | −6,62·10⁻² ± 1,06·10⁻¹ | 8,13·10⁻² | 0.9998 | -29 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 3,21·10⁻² ± 1,75·10⁻³ | −2,83·10⁻¹ ± 5,00·10⁻¹ | 3,60·10⁻¹ | 0.9977 | — | |||
| Fenamifos | Gleba 1 | 5–600 | 2,36·10⁻³ ± 2,87·10⁻⁴ | −4,42·10⁻² ± 8,20·10⁻² | 5,91·10⁻² | 0.9888 | 8 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 3,47·10⁻³ ± 1,21·10⁻⁴ | −2,82·10⁻² ± 3,46·10⁻² | 2,49·10⁻² | 0.9991 | 58 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 1,89·10⁻³ ± 4,02·10⁻⁴ | 9,58·10⁻³ ± 1,15·10⁻¹ | 8,99·10⁻² | 0.9606 | -14 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 2,63·10⁻³ ± 7,66·10⁻⁵ | −2,51·10⁻² ± 2,19·10⁻² | 1,70·10⁻² | 0.9992 | 20 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 2,95·10⁻³ ± 1,91·10⁻⁴ | −3,58·10⁻² ± 5,43·10⁻² | 4,20·10⁻² | 0.9969 | 35 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 3,09·10⁻³ ± 5,98·10⁻⁵ | −2,12·10⁻² ± 1,71·10⁻² | 1,31·10⁻² | 0.9997 | 41 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 2,19·10⁻³ ± 2,87·10⁻⁴ | −4,33·10⁻² ± 8,20·10⁻² | 5,91·10⁻² | 0.9871 | — | |||
| Etion | Gleba 1 | 5–600 | 5,02·10⁻³ ± 1,00·10⁻⁴ | −1,16·10⁻² ± 2,87·10⁻² | 2,07·10⁻² | 0.9997 | -3 | ||
| Gleba 2 | 5–600 | 5,07·10⁻³ ± 2,15·10⁻⁴ | −1,06·10⁻² ± 6,16·10⁻² | 4,43·10⁻² | 0.9986 | -2 | |||
| Gleba 3 | 5–600 | 4,58·10⁻³ ± 2,21·10⁻⁴ | 9,11·10⁻⁴ ± 6,32·10⁻² | 4,95·10⁻² | 0.9979 | -12 | |||
| Gleba 4 | 5–600 | 5,07·10⁻³ ± 7,18·10⁻⁵ | −1,21·10⁻² ± 2,05·10⁻² | 1,60·10⁻² | 0.9998 | -2 | |||
| Gleba 5 | 5–600 | 5,00·10⁻³ ± 2,32·10⁻⁴ | −2,72·10⁻² ± 6,61·10⁻² | 5,11·10⁻² | 0.9984 | -3 | |||
| Gleba 6 | 5–600 | 4,73·10⁻³ ± 8,29·10⁻⁵ | −6,89·10⁻³ ± 2,37·10⁻² | 1,81·10⁻² | 0.9997 | -9 | |||
| Rozpuszczalnik | 5–600 | 5,18·10⁻³ ± 2,24·10⁻⁴ | −2,80·10⁻² ± 6,40·10⁻² | 4,61·10⁻² | 0.9986 | — | |||
Tabela 3: Parametry kalibracji dopasowane do matrycy oraz ME dla 12 docelowych OPP w sześciu glebach rolniczych.Skróty: OPPs = pestycydy fosforoorganiczne; b = nachylenie; sb = odchylenie standardowe nachylenia; a = punkt przecięcia; sa = odchylenie standardowe punktu przecięcia; R2 = współczynnik determinacji; sy/x = odchylenie standardowe estymacji; ME = efekt matrycy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
| Analit | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | |||||||||||||
| 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | ||
| Chlorpyrifos-metyl | 106 (4) | 102 (2) | 103 (1) | 110 (17) | 99 (2) | 101 (2) | 105 (5) | 104 (2) | 110 (10) | 105 (4) | 98 (3) | 100 (4) | 107 (4) | 107 (3) | 100 (4) | 114 (4) | 102 (3) | 114 (4) | |
| Paration-metyl | 96 (3) | 96 (0) | 99 (1) | 97 (17) | 92 (3) | 97 (2) | 116 (4) | 104 (6) | 121 (5) | 103 (6) | 87 (4) | 95 (6) | 117 (6) | 110 (4) | 107 (6) | 107 (6) | 100 (4) | 108 (6) | |
| Tolklofos-metyl | 113 (3) | 107 (2) | 104 (1) | 110 (15) | 100 (2) | 105 (3) | 101 (6) | 97 (2) | 104 (10) | 100 (7) | 98 (3) | 102 (2) | 106 (7) | 104 (3) | 101 (2) | 110 (7) | 103 (3) | 108 (2) | |
| Pirymifos-metyl | 78 (12) | 79 (3) | 89 (2) | 106 (22) | 95 (1) | 99 (3) | 102 (7) | 97 (3) | 104 (9) | 101 (5) | 97 (2) | 100 (3) | 104 (5) | 101 (2) | 98 (3) | 113 (5) | 102 (2) | 104 (3) | |
| Fenitrotion | 91 (4) | 90 (2) | 98 (2) | 104 (25) | 90 (3) | 95 (2) | 116 (5) | 105 (4) | 118 (5) | 101 (6) | 90 (3) | 96 (7) | 111 (6) | 107 (3) | 103 (7) | 118 (6) | 101 (3) | 103 (7) | |
| Malation | 89 (3) | 81 (1) | 87 (4) | 108 (18) | 90 (2) | 92 (2) | 118 (7) | 110 (4) | 119 (5) | 106 (5) | 96 (4) | 97 (5) | 122 (5) | 110 (4) | 102 (5) | 122 (5) | 102 (4) | 103 (5) | |
| Chlorpyrifos | 97 (4) | 96 (2) | 97 (1) | 160 (13) | 117 (5) | 112 (4) | 97 (6) | 95 (3) | 103 (10) | 102 (6) | 95 (2) | 98 (4) | 105 (6) | 98 (2) | 96 (4) | 108 (6) | 97 (2) | 103 (4) | |
| Fention | 101 (2) | 99 (1) | 98 (2) | 99 (3) | 98 (2) | 103 (2) | 100 (7) | 101 (3) | 106 (8) | 102 (6) | 94 (2) | 97 (4) | 104 (6) | 100 (2) | 100 (4) | 110 (6) | 100 (2) | 104 (4) | |
| Pirymifos-etyl | 63 (14) | 66 (5) | 85 (2) | 100 (21) | 93 (3) | 101 (3) | 70 (12) | 78 (3) | 93 (8) | 105 (9) | 104 (8) | 108 (7) | 113 (9) | 103 (8) | 103 (7) | 55 (9) | 33 (8) | 34 (7) | |
| Metidation | 92 (3) | 80 (16) | 91 (3) | 103 (16) | 87 (2) | 90 (2) | 125 (8) | 113 (5) | 125 (5) | 90 (12) | 85 (5) | 92 (8) | 97 (12) | 97 (5) | 97 (8) | 113 (12) | 100 (5) | 104 (8) | |
| Fenamifos | 5 (38) | 1 (38) | 3 (52) | 58 (18) | 58 (8) | 56 (6) | 140 (16) | 117 (3) | 126 (2) | 65 (15) | 50 (19) | 40 (20) | 82 (15) | 62 (19) | 69 (20) | 88 (15) | 70 (19) | 70 (20) | |
| Etion | 59 (15) | 42 (11) | 59 (15) | 83 (12) | 82 (3) | 87 (3) | 93 (11) | 97 (4) | 103 (7) | 80 (10) | 78 (6) | 81 (4) | 83 (10) | 77 (6) | 87 (4) | 96 (10) | 87 (6) | 89 (4) | |
Tabela 4: Średnie odzyski (%) i RSD (%, w nawiasach) dla 12 docelowych OPP w sześciu glebach rolniczych (S1–S6) przy trzech poziomach wzbogacenia. Eksperymenty dotyczące odzysku przeprowadzono przy stężeniach 50, 200 i 400 µg/kg (n = 5 na poziom) z zastosowaniem chlorpyrifos-methyl-d10 jako P-IS. Zarówno roztwory wzbogacające pestycydami, jak i P-IS dodano przed ekstrakcją. Zgodnie z kryteriami wydajności SANTE/2020/12830 (Rev.2), akceptowalne odzyski mieściły się w przedziale od 70 do 120% przy RSD ≤20%. S1: Villavicencio (Meta, Kolumbia); S2: Sabana Bogotá (Cundinamarca, Kolumbia); S3: Floresta (Boyacá, Kolumbia); S4: Guasca (Cundinamarca, Kolumbia); S5: Santa Rosa de Viterbo (Boyacá, Kolumbia); S6: La Laguna (Kanary, Hiszpania). Skróty: RSD = względne odchylenie standardowe; OPPs = pestycydy organofosforowe; P-IS = proceduralny standard wewnętrzny. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Dyskusja
Oznaczanie pozostałości pestycydów w glebach pozostaje wyzwaniem analitycznym ze względu na wysoką zmienność fizykochemicznych właściwości gleby i wynikające z niej różnice w składzie współekstrahowanych składników4,5,6,14,17,18,19,20,21. Chociaż metody oparte na QuEChERS są szeroko stosowane w przypadku matryc żywnościowych i roślinnych, mniej badań systematycznie optymalizowało oczyszczanie metodą dSPE dla gleb rolniczych wykazujących zróżnicowane właściwości4. W niniejszej pracy oceniono siedem kombinacji sorbentów dSPE, wykorzystując sześć gleb rolniczych wybranych tak, aby reprezentowały one odmienny zakres warunków edaficznych. Wyniki wykazały, że skład etapu oczyszczania istotnie wpływał na usuwanie współekstrahowanych składników matrycy. Choć usuwanie współekstraktów posłużyło jako kryterium niezależne od analityczne do wyboru najwydajniejszej konfiguracji dSPE, wydajność analityczna zoptymalizowanej procedury oczyszczania została następnie oceniona poprzez wyznaczenie ME oraz walidację metody. Dzięki zidentyfikowaniu zoptymalizowanej konfiguracji dSPE i zintegrowaniu jej z substancjami chroniącymi analityty, deuterowanym P-IS, kalibracją dopasowaną do matrycy oraz walidacją zgodnie z wytycznymi SANTE/2020/12830 (Rev.2), niniejszy protokół zapewnia kompletny, praktyczny i analityczny schemat pracy dla jednoczesnego oznaczania OPPs w glebach rolniczych o kontrastujących właściwościach. Zamiast stanowić optymalizację dla pojedynczej matrycy glebowej, protokół został zaprojektowany tak, aby zapewnić solidną i łatwo przenoszalną metodologię odpowiednią dla rutynowych laboratoriów środowiskowych.
Wyższa wydajność kombinacji PSA+C18+adsorbent może być przypisana komplementarnym mechanizmom retencji zapewnianym przez trzy sorbenty. PSA przyczynia się przede wszystkim do usuwania kwasowych polarnych współwyciągów poprzez słabe oddziaływania wymiany anionowej, podczas gdy C18 zatrzymuje związki niepolarne poprzez podział hydrofobowy12,13. Florisil, sorbent na bazie krzemianu magnezu, zapewnia dodatkową retencję polarnych i umiarkowanie polarnych składników matrycy poprzez wiązania wodorowe, oddziaływania dipol-dipol oraz oddziaływania kwasowo-zasadowe Lewisa15,16. Wyniki potwierdzają to komplementarne zachowanie. Sam adsorbent wykazał wyższą średnią skuteczność usuwania współwyciągów niż PSA lub C18 stosowane pojedynczo. Ponadto dodanie adsorbentu do samego PSA lub C18 spowodowało jedynie niewielkie zmiany w średniej wydajności oczyszczania, natomiast jego włączenie do kombinacji PSA+C18 doprowadziło do najwyższego całkowitego usunięcia współwyciągów spośród wszystkich siedmiu ocenianych konfiguracji dSPE. Taki wzorzec jest bardziej spójny z tezą, że adsorbent zapewnia komplementarną retencję składników matrycy, które nie są efektywnie usuwane przez PSA lub C18, niż z założeniem, że działa on wyłącznie jako dodatkowa masa sorbentu. Taka komplementarność jest szczególnie istotna w przypadku gleb rolniczych, gdzie zmienność zawartości materii organicznej, składu mineralnego i tekstury skutkuje bardzo heterogennymi profilami współwyciągów.
Ponieważ celem niniejszego badania było opracowanie jednolitego protokołu oczyszczania, który byłby możliwy do zastosowania w glebach rolniczych o różnych charakterystykach fizykochemicznych, ostateczny wybór sorbentu oparto zarówno na statystycznym porównaniu ocenianych konfiguracji oczyszczania, jak i na uzasadnieniu analitycznym wynikającym z komplementarnych mechanizmów retencji trzech sorbentów. Kombinacja MgSO4+PSA+C18+Adsorbent pozwoliła na osiągnięcie najwyższej ogólnej średniej skuteczności usuwania współwyekstraktów, zapewniając jednocześnie najszerszy zakres oczyszczania współwyekstraktów z macierzy spośród ocenianych konfiguracji dSPE. W związku z tym kombinację tę wybrano do późniejszej walidacji metody.
Efekty macierzy (MEs) pozostają jednym z głównych źródeł niepewności w oznaczaniu pozostałości pestycydów metodą GC-MS/MS, szczególnie w macierzach heterogenicznych, takich jak gleby4,5. Chociaż w niniejszym badaniu dominującym zjawiskiem było tłumienie sygnału, większość analizatów wykazywała średnie wartości ME w zakresie zazwyczaj uznawanym za słaby do umiarkowanego (−20% do +20% oraz −20% do −50%, odpowiednio)14,28. Wynik ten jest zgodny z efektywną redukcją obciążenia współekstraktami docierającymi do układu chromatograficznego. Niemniej jednak, nadal obserwowano zmienność zależną od analizatu. Na przykład metidation, paration metylowy i pirimifos etylowy wykazywały najsilniejsze średnie tłumienie sygnału, podczas gdy fenamifos wykazywał wzmocnienie sygnału. MEs w GC-MS/MS są z natury zależne od związku i wynikają z oddziaływań między analizatami, pozostałościami składników macierzy a centrami aktywnymi w systemie wtryskowym i drodze chromatograficznej. W konsekwencji, pozostałe składniki macierzy mogą albo zmniejszać, albo zwiększać odpowiedź detektora, w zależności od właściwości fizykochemicznych każdego analizatu i jego podatności na oddziaływania powierzchniowe. Kontrastowe odpowiedzi obserwowane wśród ocenianych OPP odzwierciedlają zatem przede wszystkim zachowanie zależne od analizatu, nałożone na różnice w składzie macierzy glebowej. Oprócz oczyszczania metodą dSPE, schemat analityczny obejmował mieszaninę ochronną analizatów, o której wcześniej raportowano, że redukuje ona oddziaływania analizatów z centrami aktywnymi w systemach GC i poprawia wydajność chromatograficzną w analizie pozostałości pestycydów28,29. Utrzymywanie się specyficznych dla analizatów MEs pomimo tych środków podkreśla złożoność macierzy glebowych i uzasadnia stosowanie kalibracji dopasowanej do macierzy dla wiarygodnego oznaczania ilościowego OPP w glebach o różnym składzie macierzy.
Doświadczenia z odzyskiem wykazały, że zoptymalizowana metoda zapewnia dokładne i precyzyjne oznaczanie ilościowe dla większości docelowych OPP w szerokim zakresie warunków gleb rolniczych. Większość kombinacji analityt-gleba spełniała kryteria akceptacji SANTE/2020/12830 (Rev.2)11, z odzyskiem w granicach od 70% do 120% i RSD poniżej 20%. Niemniej jednak, w ograniczonej liczbie kombinacji analityt-gleba zaobserwowano pewne odchylenia od zalecanego zakresu odzysku. Najistotniejsze odchylenia dotyczyły fenamifosu, pirimifosu-etylu i etionu, które wykazały niski odzysk w specyficznych matrycach glebowych. Dodatkowe odosobnione odchylenia, głównie w postaci odzysku nieco przekraczającego górną granicę akceptacji przy poszczególnych poziomach wzbogacenia, zaobserwowano dla chlorpyryfosu, parationu-metylowego, malationu i metidationu. Ponieważ odchylenia te nie występowały konsekwentnie we wszystkich matrycach glebowych, zaobserwowane zjawisko jest prawdopodobnie związane z charakterystyką zależną od związku w połączeniu z ME. Większą liczbę odchyleń zaobserwowano w próbce S1, która posiadała najwyższą zawartość gliny (48,5%) spośród ocenianych matryc, co sugeruje, że fizykochemiczne właściwości gleby mogły przyczynić się do obniżenia wydajności ekstrakcji dla niektórych analitytów. Minerały ilaste zapewniają liczne miejsca adsorpcyjne, które mogą zatrzymywać cząsteczki pestycydów poprzez oddziaływania powierzchniowe, zmniejszając tym samym ich desorpcję podczas ekstrakcji. Przewiduje się również, że zakres tych oddziaływań zależy od właściwości fizykochemicznych analitytów, w tym od ich powinowactwa do powierzchni mineralnych. Jednak brak podobnego schematu we wszystkich glebach bogatych w glinę wskazuje, że żaden pojedynczy parametr glebowy nie wyjaśnia w pełni zaobserwowanych odchyleń. Ponadto, skoro ta sama procedura oczyszczania oparta na adsorbencie zapewniła satysfakcjonujące wyniki dla większości kombinacji analityt-gleba, nie zaobserwowano dowodów na systematyczne straty związane z etapem oczyszczania. Chociaż indywidualny wpływ adsorbenta na retencję analitytów nie był niezależnie oceniany podczas optymalizacji sorbentu, satysfakcjonujące wyniki odzysku uzyskane za pomocą zoptymalizowanej procedury sugerują, że zastosowanie tego sorbentu nie pogorszyło oznaczania analitytów. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te potwierdzają przydatność proponowanej metody, jednocześnie podkreślając wpływ oddziaływań analityt-matryca na wyniki dla konkretnych związków.
Choć metoda wykazała satysfakcjonującą skuteczność w sześciu ocenianych glebach rolniczych, jej przydatność w przypadku gleb o ekstremalnych właściwościach, takich jak gleby zasolone, torfowe, gleby o bardzo wysokiej zawartości materii organicznej, gleby silnie zasadowe lub matryce wzbogacone w materiały węglowe, pozostaje do ustalenia. Ponadto obecna walidacja została przeprowadzona z użyciem wzbogaconych gleb rolniczych, w związku z czym przydatność metody dla naturalnie zanieczyszczonych próbek terenowych wymaga potwierdzenia. Co więcej, ponieważ metoda została opracowana i zwalidowana wyłącznie dla OPP, nie można zakładać jej przydatności dla innych klas pestycydów. Pomimo tych ograniczeń, protokół zapewnia standaryzowane podejście do oznaczania pozostałości OPP w glebach rolniczych i może być stosowany w programach monitoringu środowiska, badaniach nad losem i transportem pestycydów, analizach oceny ryzyka oraz działaniach nadzorczych organów regulacyjnych. Przyszłe badania powinny ocenić możliwość przeniesienia zoptymalizowanej strategii oczyszczania na dodatkowe typy gleb i klasy pestycydów, a także zbadać ulepszenia mające na celu zwiększenie odzysku dla związków wykazujących obniżoną wydajność ekstrakcji w matrycach bogatych w glinę.
Podsumowując, proponowany schemat postępowania łączy zoptymalizowane oczyszczanie metodą dSPE, kalibrację dopasowaną do matrycy, standaryzację wewnętrzną oraz stosowanie substancji chroniących analityty w ramach jednego zwalidowanego protokołu do jednoczesnego oznaczania OPP w glebach rolniczych. Systematyczna ocena kombinacji sorbentów w glebach o kontrastujących właściwościach fizykochemicznych dostarcza praktycznych wytycznych w zakresie doboru warunków oczyszczania zdolnych do minimalizacji ME przy zachowaniu satysfakcjonującej sprawności analitycznej. Protokół ten oferuje zatem powtarzalne podejście, które może wspierać monitoring środowiska, badania nad losem pestycydów oraz rutynowe oznaczanie pozostałości w glebach rolniczych o zróżnicowanej charakterystyce.
Oświadczenia
Podczas przygotowywania niniejszej pracy autorzy skorzystali z bezpłatnej wersji Claude (Anthropic) w celu pomocy w zaprojektowaniu układu graficznego Rysunku 3 oraz z bezpłatnej wersji ChatGPT (GPT-5.5, OpenAI) w celu poprawy gramatyki i pisowni. Po wykorzystaniu tych narzędzi autorzy dokładnie sprawdzili i w razie potrzeby zredagowali całą treść. Wszystkie treści naukowe, dane, analizy i wnioski zostały wygenerowane, zweryfikowane i zatwierdzone przez autorów, którzy biorą pełną odpowiedzialność za rzetelność i spójność opublikowanego artykułu.
Podziękowania
Autorzy wyrażają wdzięczność Uniwersytetowi EAN oraz jego Biuru Zarządzania Badaniami i Transferem za wsparcie niniejszych badań. Autorzy dziękują również Laboratoriom Uniwersytetu EAN za udostępnienie zaplecza analitycznego i zasobów technicznych niezbędnych do przeprowadzenia tej pracy, w tym dostępu do aparatury GC-MS/MS wykorzystywanej w całym badaniu. Praca ta była wspierana przez Zarząd ds. Badań i Transferu Uniwersytetu EAN w Bogotá D.C., Kolumbia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-etoksy-1,2-propanodiol (etyloglicerol) | Sigma Aldrich | 260428-1G | |
| Kwas octowy | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Acetonitryl | Merck | 1006652500 | |
| autosampler AOAC 20i/s | Shimadzu | 221-723115-58 | |
| Waga | OHAUS | PA224 | |
| C18 | Sigma Aldrich | 52600-U | |
| Probówki do wirowania, 2 ml | Eppendorf | 4610-1815 | |
| Probówki do wirowania, 50 ml | Gniazdo | 602002 | |
| Wirówka Z206A | MERMLE | 6019500118 | |
| Kolumna SH-Rxi-5sil MS, 30 m x 0,25 mm, 0.25 µm | Shimadzu | 221-75954-30 | |
| Naczynie z nakrętką, szkło bursztynowe, 1000 ml | Sigma Aldrich | Z674176 | |
| Pikometr | Simax | 415262302 | |
| Dozownik Dispensette 5-50 mL | MARKA | 4600361 | |
| D-sorbitol | Sigma Aldrich | 240850-5G | |
| Octan etylu | Merk | 1313181212 | |
| Florisil &<200 mesh, drobny proszek | Sigma Aldrich | 288705-50G | |
| Kwas mrówkowy | Merck | 1002641000 | |
| GCMS-TQ8040 | Shimadzu | 211552 | |
| Strzykawka do iniekcji | Shimadzu | LC2213461800 | |
| Kwas L-gulonowy γ-lakton | Sigma Aldrich | 310301-5G | |
| Wkładka bezpodziałowa (splitless) | Shimadzu | 221-4887-02 | |
| Siarczan magnezu (bezwodny) | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Metanol | Panreac | 131091.12.12 | |
| ultraczysta woda Milli-Q (typ 1) | Millipore | F4H4783518 | |
| Końcówki do pipet 10 µl 100 µL | Biologix | 200010 | |
| końcówki do pipet 100 $\mu\text{l}$ 1000 µL | Marka | 541287 | |
| Końcówki do pipet 20 $\mu$l 200 µL | Marka | 732028 | |
| Pipety Pasteura | NORMAX | 5426023 | |
| Pipeta Transferpette S zmienna 10 - 100 µL | MARKA | 704774 | |
| Pipeta Transferpette S zmienna 100 - 1000 µL | MARKA | 704780 | |
| Pipeta Transferpette S zmienna 20 - 200 µL | SCILOGEX | 712111099999 | |
| Aminy pierwszo- i drugorzędowe (PSA) | Sigma Aldrich | 52738-U | |
| Lodówka/zamrażarka | Haceb | NEV ALC 404 | |
| Kwas sykimowy | Sigma Aldrich | S5375-1G | |
| Octan sodu | Sigma Aldrich | 241245-1KG | |
| Oprogramowanie GCMSsolution | Shimadzu | 223-18472-92 | |
| Sito ze stali nierdzewnej o oczkach 2 mm | Pinzuar | PS33N10 | |
| Probówka szklana, 10 ml | Sigma Aldrich | BR114508 | |
| Toluen | Merck | 1083252500 | |
| Fosforan trifenylu (I-IS) | Sigma Aldrich | 241288-50G | |
| Fiolki z wtopioną wkładką, 0,3 ml | Sigma Aldrich | 29398-U | |
| Fiolki, z nakrętką, z brązowego szkła, 15 ml | Sigma Aldrich | 27088-U | |
| Kolba miarowa, 10 ml | Sigma Aldrich | DWK28017-10 | |
| Wymieszaj w wirówce vortex | Scilogex | 82120004 | |
| Środki ochrony roślin | |||
| Chlorpyrifos | Sigma Aldrich | 45395-100MG | 2921-88-2 |
| Chlorpyrifos-metyl | Sigma Aldrich | 45396-250MG | 5598-13-0 |
| Chlorpyrifos-methyl-d10 (P-IS) | Sigma Aldrich | 90047-5MG | 285138-81-0 |
| Etion | Sigma Aldrich | 45477-250MG | 563-12-2 |
| Fenamifos | Sigma Aldrich | 45483-250MG | 22224-92-6 |
| Fenitrotion | Sigma Aldrich | 45487-250MG | 122-14-5 |
| Fenthion | Sigma Aldrich | 36552-250MG | 55-38-9 |
| Malation | Sigma Aldrich | 36143-100MG | 121-75-5 |
| Metidation | Sigma Aldrich | 36158-100MG | 950-37-8 |
| Paration metylowy | Sigma Aldrich | 36187-100MG | 298-00-0 |
| Pirimifos-etyl | Sigma Aldrich | 45628-250MG | 23505-41-1 |
| Pirimifos-metyl | Sigma Aldrich | 32058-250MG | 29232-93-7 |
| Tolclofos-metyl | Sigma Aldrich | 31209-250MG | 5701804-9 |
Bibliografia
- Saad H, Elfeky SA, El-Gamel NE, Dena ASA. Organophosphate pesticides: a review on classification, synthesis, toxicity, remediation and analysis. RSC Adv. 2025;15(48):40802-40822.
- Mali H, et al. Organophosphate pesticides an emerging environmental contaminant: Pollution, toxicity, bioremediation progress, and remaining challenges. J Environ Sci. 2023;127:234-250.
- Dhuldhaj UP, Singh R, Singh VK. Pesticide contamination in agro-ecosystems: toxicity, impacts, and bio-based management strategies. Environ Sci Pollut Res. 2023;30:9243-9270.
- González-Curbelo MÁ, Varela-Martínez DA, Riaño-Herrera DA. Pesticide-residue analysis in soils by the QuEChERS method: A review. Molecules. 2022;27(13):4323.
- Wang J, et al. Multiresidue analysis method for the determination of 477 pesticides in soil based on thorough method validation. J Agric Food Chem. 2025;73(27):17269-17286.
- Mohamed AH, et al. Sampling and sample preparation techniques for the analysis of organophosphorus pesticides in soil matrices. Crit Rev Anal Chem. 2023;53(4):906-927.
- Bhattu M, Kathuria D, Billing BK, Verma M. Chromatographic techniques for the analysis of organophosphate pesticides with their extraction approach: a review (2015–2020). Anal Methods. 2022;14(4):322-358.
- Wondimu KT, Geletu AK, Kedir WM. Recent developments in monitoring of organophosphorus pesticides in food samples. J Agric Food Res. 2025;19:101709.
- Bulaić Nevistić M, Kovač Tomas M. Matrix effect evaluation in GC/MS-MS analysis of multiple pesticide residues in selected food matrices. Foods. 2023;12(21):3991.
- Damale RD, et al. Multiresidue analysis of pesticides in four different pomegranate cultivars: Investigating matrix effect variability by GC-MS/MS and LC-MS/MS. Food Chem. 2023;407:135179.
- European Commission. Guidance document on pesticide analytical methods for risk assessment and post-approval control and monitoring purposes (SANTE/2020/12830, Rev. 2). 2023. Available from: https://food.ec.europa.eu/system/files/2021-03/pesticides_ppp_app-proc_guide_res_mrl-guidelines-2020-12830.pdf
- González-Curbelo MÁ, et al. Evolution and applications of the QuEChERS method. Trends Anal Chem. 2015;71:169-185.
- Varela-Martinez DA, Gonzalez-Salamo J, Gonzalez-Curbelo MÁ, Hernandez-Borges J. Quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) extraction. In: Liquid-phase Extraction. Elsevier; 2020. p. 399-437.
- González-Curbelo MÁ. Analysis of organochlorine pesticides in a soil sample by a modified QuEChERS approach using ammonium formate. J Vis Exp. 2023;191:e64901.
- Jin Q, et al. Simultaneous determination of six acidic herbicides and metabolites in plant origin matrices by QuEChERS-UPLC-MS/MS. Molecules. 2025;30(4):852.
- Zhu L, et al. Establishment and validation of anticoagulant rodenticides in animal samples by HPLC-MS/MS, focusing on evaluating the effect of modified QuEChERS protocol on matrix effect reduction. ACS Omega. 2022;7(21):18146-18158.
- do Amaral B, Peralta-Zamora P, Nagata N. Simultaneous multi-residue pesticide analysis in southern Brazilian soil based on chemometric tools and QuEChERS-LC-DAD/FLD method. Environ Sci Pollut Res. 2022;29:39102-39115.
- Łozowicka B, et al. The fate of spirotetramat and dissipation metabolites in Apiaceae and Brassicaceae leaf-root and soil system under greenhouse conditions estimated by modified QuEChERS/LC-MS/MS. Sci Total Environ. 2017;603:178-184.
- Dong B, Shao X, Lin H, Hu J. Dissipation, residues and risk assessment of metaldehyde and niclosamide ethanolamine in pakchoi after field application. Food Chem. 2017;229:604-609.
- Guan J, Li D, Guo Y, Shi S, Yan F. Simultaneous determination of seven pesticide residues in soil samples using ultrasound-assisted dispersive solid-phase extraction combined with UHPLC-MS/MS. Sep Sci Plus. 2018;1(4):296-305.
- Kaczyński P, Łozowicka B, Jankowska M, Hrynko I. Rapid determination of acid herbicides in soil by liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection based on dispersive solid phase extraction. Talanta. 2016;152:127-136.
- NSW Environment Protection Authority. Sampling design part 1 - application: Contaminated land guidelines (EPA 2022P3915). 2022. Available from: https://hdp-au-prod-app-nswepa-yoursay-files.s3.ap-southeast-2.amazonaws.com/9116/6027/3560/22p3915-sampling-design-guidelines-part1.pdf
- Eckert D, Sims JT. Recommended soil pH and lime requirement tests. In: Recommended Soil Test Procedures for the Northeastern United States. Cooperative Bulletin No. 493; 2009. p. 19-26.
- Schulte EE, Hoskins B. Recommended soil organic matter tests. In: Recommended Soil Test Procedures for the Northeastern United States. 2011. p. 52-60.
- Ashworth J, Keyes D, Kirk R, Lessard R. Standard procedure in the hydrometer method for particle size analysis. Commun Soil Sci Plant Anal. 2001;32(5-6):633-642.
- González-Curbelo MÁ, Hernández-Borges J, Borges-Miquel TM, Rodríguez-Delgado MÁ. Determination of pesticides and their metabolites in processed cereal samples. Food Addit Contam A. 2012;29(1):104-116.
- Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. Determination of 45 pesticides in avocado varieties by the QuEChERS method and gas chromatography-tandem mass spectrometry. J Vis Exp. 2023;202:e66082.
- Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. High-throughput analysis of pesticides in minor tropical fruits from Colombia. Food Chem. 2019;280:221-230.
- Varela-Martínez DA, González-Curbelo MÁ, González-Sálamo J, Hernández-Borges J. Analysis of pesticides in cherimoya and gulupa minor tropical fruits using AOAC 2007.1 and ammonium formate QuEChERS versions: A comparative study. Microchem J. 2020;157:104950.