Niniejsze badanie optymalizuje test izotermicznej amplifikacji zapętlonej (LAMP) z wykorzystaniem węgla aktywnego i bentonitu w celu wykrywania patogennych gatunków Vibrio w owocach morza. Ta obróbka wstępna skutecznie usuwa inhibitory reakcji, zapewniając znacznie szybszą, bardziej czułą i bardziej opłacalną diagnostykę w porównaniu z metodami konwencjonalnymi.
Artykuł badawczy
Zwiększona czułość pętlowego wzmocnienia sygnału z wykorzystaniem węgla aktywnego i bentonitu do wykrywania Vibrio spp. w produktach rybnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rodzaj Vibrio obejmuje ponad 100 gatunków, z których 12 uznaje się za patogenne dla ludzi; gatunkami najczęściej izolowanymi w żywności są V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus oraz V. alginolyticus. Głównym problemem w ich identyfikacji za pomocą konwencjonalnych metod mikrobiologicznych są wysokie koszty oraz długi czas diagnozy. Do identyfikacji V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus oraz V. alginolyticus zastosowano izotermiczną amplifikację zapętloną (LAMP). W celu usunięcia inhibitorów i poprawy czułości testu wykorzystano węgiel aktywny z bentonitem (ACB); przetestowano wartości pH 6, 7 i 9, a także różne czasy kontaktu próbki z ACB. Czułość metody LAMP uległa poprawie po zastosowaniu węgla aktywnego i bentonitu do usuwania inhibitorów reakcji w próbkach krewetek, ryb i ostryg. Czułość LAMP, ujemna wartość predykcyjna, dodatnia wartość predykcyjna oraz swoistość LAMP były równe lub przekraczały 90% dla wszystkich badanych próbek. Metoda LAMP może stanowić alternatywę dla identyfikacji V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus oraz V. alginolyticus w produktach rybnych ze względu na szybsze zastosowanie, wyższą czułość i niższe koszty w porównaniu z metodą standardową.
Wprowadzenie
Gatunki z rodzaju Vibrio są szeroko rozpowszechnione w środowiskach morskich i mogą być powiązane z rybami, mięczakami lub skorupiakami w sposób patogenny lub komensalny. Doniesiono, że 12 gatunków może być patogennych dla ludzi, przy czym Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus oraz V. alginolyticus wykazują wyższą częstotliwość izolacji w produktach rybnych. W Stanach Zjednoczonych organy zdrowia publicznego szacują, że Vibrio spp. powodują ponad 80 000 infekcji rocznie1,2,3,4,5. Izolację Vibrio spp. przeprowadza się za pomocą konwencjonalnych metod obejmujących wstępne namnażanie, hodowlę na pożywkach selektywnych oraz potwierdzenie za pomocą testów biochemicznych i serologicznych6,7. Metody konwencjonalne są ograniczone przez długi czas wymagany do izolacji patogenu (do 5 dni) oraz brak rozdzielczości, co często uniemożliwia dokładne rozróżnienie blisko spokrewnionych gatunków w obrębie rodzaju Vibrio ze względu na podobne profile fenotypowe i biochemiczne6,7,8.
Alternatywnie, izotermiczna amplifikacja zapętlona (LAMP) została opisana jako szybka, dokładna i niedroga technika molekularna do identyfikacji patogenów9,10. Metoda ta jest wysoce efektywna kosztowo i szybsza niż konwencjonalna PCR, ponieważ nie wymaga zaawansowanego sprzętu, takiego jak termocyklery9. Metoda LAMP pozwala w jednym kroku na detekcję genu docelowego poprzez obserwację zmętnienia w probówce reakcyjnej, wywołanego wytrąceniem pirofosforanu magnezu, który jest stabilnym produktem reakcji w 65 °C (temperaturze stosowanej w technice LAMP); wzrost zmętnienia koreluje zatem z ilością syntetyzowanego DNA, co pozwala uniknąć stosowania żeli agarozowych i transiluminatorów11,12,13,14,15.
Czułość wykrywania tych patogenów można poprawić poprzez eliminację inhibitorów reakcji, takich jak proteazy, jony wapnia, glikogen i lipidy, które mogą hamować polimerazę Bst lub wiązać się z docelowym DNA, zapobiegając amplifikacji13,16,17,18,19,20. Wykazano, że kombinacja węgla aktywnego z bentonitem (ACB) charakteryzuje się wysoką wydajnością w usuwaniu inhibitorów amplifikacji, co zwiększa czułość wykrywania Escherichia coli w próbkach ostryg i obniża koszty, ponieważ ACB jest tańszy niż stosowanie komercyjnych zestawów21.
W niniejszej pracy proponujemy optymalizację metody LAMP poprzez zastosowanie węgla aktywnego i bentonitu w celu zwiększenia czułości identyfikacji V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus oraz V. alginolyticus bezpośrednio z produktów rybnych. Ta zoptymalizowana metoda stanowi praktyczną wytyczną dla rutynowego monitorowania i kontroli jakości w przemyśle spożywczym, będąc wysoce przydatną do szybkiej diagnostyki patogenów z pominięciem czasochłonnych etapów wstępnego namnażania. W odniesieniu do oczekiwanej wydajności, metoda ta wykazuje doskonałą czułość (powyżej 98%) i swoistość (100%) w matrycach takich jak ryby i krewetki. Należy jednak wziąć pod uwagę kluczowe ograniczenie: w przypadku silnie zanieczyszczonych próbek pochodzących z niektórych źródeł, takich jak ostrygi, system ACB nie jest w stanie całkowicie wyeliminować wszystkich interferujących substancji organicznych, co może nieznacznie obniżyć czułość testu (94%–98%).
Protokół
Badanie to nie obejmowało ludzi ani zwierząt kręgowców; w związku z tym nie wymagano instytucjonalnej zgody komisji etycznej. Użyte odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli materiałów.
1. Wykorzystane szczepy bakteryjne i ekstrakcja DNA
Szczepy Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 oraz V. alginolyticus ATCC 17749 hodowano w bulionie BHI (brain heart infusion) z dodatkiem 2% NaCl w temperaturze 37 °C przez 24 h. Szczepy Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 oraz Salmonella Typhimurium ATCC 14028 hodowano w bulionie BHI bez chlorku sodu w temperaturze 37 °C przez 24 h, aby wykorzystać je jako kontrole negatywne w testach. W celu ekstrakcji DNA hodowlę nocną wirowano przy 16,000 x g przez 6 min w temperaturze 25 °C w wirówce. Nadfiltr ostrożnie odlano, aby nie zaburzyć osadu komórkowego, a następnie osad dokładnie resuspendowano poprzez pipetowanie w 500 μL roztworu buforu TAE (kwas TRIS-octowy-EDTA, pH 8). Zawiesinę gotowano przez 6 min w celu lizy komórek, a następnie natychmiast schłodzono na lodzie przez 5 min. Wykonano końcowe wirowanie w celu osadzenia szczątków komórkowych, otrzymując klarowny nadfiltr zawierający ekstrahowane DNA, który następnie wykorzystano jako matrycę do amplifikacji metodą LAMP22,23.
2. Procedura LAMP
Startery użyte w metodzie LAMP (Tabela 1) zostały przetestowane w celu potwierdzenia specyficzności identyfikacji V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus oraz V. alginolyticus. Identyfikację każdego gatunku Vibrio za pomocą metody LAMP przeprowadzono w probówkach reakcyjnych, przygotowując końcową objętość 25 μL mieszaniny zawierającej: 1,6 μM każdego z starterów, 1,4 mM mieszaniny dNTP, 6 mM MgSO4, 800 mM betainy, 8 U polimerazy DNA Bst oraz 5 μL matrycowego DNA. Mieszaninę reakcyjną delikatnie wymieszano i inkubowano w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez 60 min. Po czasie inkubacji produkty amplifikacji rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym. Produkty amplifikacji zabarwiono następnie za pomocą 1 μL fluorescencyjnego barwnika DNA rozcieńczonego 1:100 i wykazano przy użyciu transiluminatora światła niebieskiego. Inna technika ustalania, czy test identyfikacji patogenu był pozytywny, polegała na dodaniu do probówek reakcyjnych 4 μL błękitu hydroksynaftolowego (HNB, 125 μM) i obserwacji zmiany barwy gołym okiem. Pozytywny wynik testu wskazywała zmiana barwy na niebieską, a wynik negatywny na fioletową24. Jako kontrole negatywne dla metody LAMP wykorzystano Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 oraz Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Produkty amplifikacji uzyskane w metodzie LAMP rozdzielono w żelu agarozowym i obserwowano za pomocą transiluminatora. Uzyskane obrazy zarejestrowano i zdigitalizowano przy użyciu oprogramowania MS 1D Analysis Software.
3. Obróbka próbek ostryg, krewetek i ryb w celu eliminacji naturalnie występujących w próbkach gatunków Vibrio spp.
Pobrano dziesięć próbek ostryg, dziesięć próbek krewetek oraz dziesięć próbek ryb o przybliżonej wadze 200 g każda. W celu usunięcia naturalnie występujących komórek Vibrio zastosowano wcześniej opisaną metodologię21. Odważono pięćdziesiąt gramów (50 g) każdej próbki i poddano mechanicznej homogenizacji w blenderze łopatkowym przy 260 rpm przez 1 min, uzyskując jednorodną zawiesinę tkankową, którą następnie przechowywano w temperaturze -70 °C przez 72 h. Następnie próbki całkowicie rozmrożono w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C i przemyto 300 mL soli fosforanowego buforu fizjologicznego (0,85% NaCl, pH 9). Aby upewnić się, że poprzednia procedura skutecznie wyeliminowała Vibrio z próbek, przeprowadzono metodologię wstępnego namnażania wskazaną w rozdziale 9 podręcznika Bacteriological Analytical Manual Agencji Żywności i Leków (FDA)7. Roztwór soli zawierający próbkę zastąpiono 450 mL alkalicznej wody peptonowej (APW, pH 9). Następnie w APW starannie przygotowano rozcieńczenia seryjne do stężenia 10⁻3 i inkubowano przez 24 h. Na koniec alikwot z każdej probówki wysiało się na selektywne podłoże agar TCBS (thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose) i inkubowano przez 24 h w temperaturze 37 °C, aby wizualnie potwierdzić brak charakterystycznych kolonii Vibrio. Wszystkie testy wykonano w trzech powtórzeniach.
4. Przygotowanie węgla aktywnego z bentonitem (ACB) i ocena odzyskiwania komórek
Aby określić warunki, w których ACB najskuteczniej absorbuje inhibitory obecne w próbkach produktów rybnych, przy jednoczesnym minimalnym pochłanianiu komórek docelowych, zastosowano opublikowaną metodologię21 w celu ustalenia optymalnego pH oraz czasu kontaktu ACB z próbkami żywności. Węgiel aktywny dokładnie przepłukano wodą destylowaną i wysuszono w temperaturze 55 °C. Następnie 32,6 g węgla aktywnego zmieszano z 3,04 g bentonitu, mieszając w sposób ciągły przy 150 rpm przez 24 h w celu zapewnienia jednorodnego rozkładu, po czym wysuszono w 55 °C i wysterylizowano, otrzymując drobny, jednorodny suchy proszek ACB. Aby ocenić odzysk komórek po zmieszaniu komórek Vibrio z mieszaniną węgla aktywnego i bentonitu (ACB), szczepy hodowano oddzielnie w bulionie BHI z dodatkiem 2% NaCl do momentu osiągnięcia gęstości komórek 1,5 x 104 CFU/mL. Następnie 1 mL każdego szczepu Vibrio zaszczepiono oddzielnie do 100 mL buforu fosforanowego (PBS, 0,85% NaCl, skorygowanego do pH 4, 6 i 9). Zawiesinę bakteryjną połączono z 4,6 g wcześniej przygotowanego ACB i mieszano przy 150 rpm przez 15, 30 i 60 min, aby umożliwić kontakt. Po każdym wyznaczonym czasie kontaktu ostrożnie oddzielono aliquot o objętości 0,1 mL, naniesiono metodą wylewania na agar TCBS i inkubowano w 37 °C przez 24 h przed przystąpieniem do liczenia kolonii.
5. Ocena granicy wykrywalności V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus oraz V. alginolyticus w próbkach ostryg, krewetek i ryb poddanych działaniu węgla aktywnego i bentonitu
Każdy z gatunków Vibrio wykorzystanych w niniejszym badaniu był hodowany w bulionie BHI, a gęstość ich komórek została precyzyjnie dostosowana do 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 oraz 76 CFU/mL (A600 nm ~0,25), co zmierzono przy użyciu spektrofotometru. Następnie 1 mL każdej kultury Vibrio wykorzystano do inokulacji 50 g każdej próbki (ostrygi, ryby, krewetki), które zostały wcześniej poddane obróbce w celu wyeliminowania obecności Vibrio. Zainokulowane próbki homogenizowano w blenderze łopatkowym przy 360 rpm przez 30 s i rozcieńczono 450 mL APW (pH 6). Mieszaninę odwirowano następnie w wirówce przy 260 x g przez 5 min w 4 °C w celu oddzielenia dużych zanieczyszczeń. Otrzymany supernatant przelano do kolb zawierających 23 g ACB, mieszano przy 150 rpm przez 15 min w celu absorpcji inhibitorów, a następnie przefiltrowano za pomocą papieru filtracyjnego, uzyskując przejrzysty eluat pozbawiony dużych cząstek. Eluat ten odwirowano przy 16 000 x g przez 10 min w 4 °C, w wyniku czego na dnie probówki powstał widoczny osad komórkowy, który następnie wykorzystano do ekstrakcji DNA. Każdy gatunek Vibrio zidentyfikowano metodą LAMP. Kontrole negatywne stanowiły próbki zainokulowane szczepami Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 oraz Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez 60 min. Po czasie inkubacji produkty amplifikacji rozdzielono w 1,5% żelu agarozowym i zabarwiono fluorescencyjnym barwnikiem do DNA. Żele wizualizowano w transiluminatorze światła niebieskiego. Na koniec do każdej probówki dodano 4 μL błękitu hydroksynaftolowego (125 μM) w celu detekcji gołym okiem24.
6. Wyznaczenie wartości predykcyjnej dodatniej, wartości predykcyjnej ujemnej, swoistości i czułości metody LAMP
Czułość, swoistość oraz wartości predykcyjne metody LAMP określono przy użyciu 30 próbek (10 próbek krewetek, 10 ostryg i 10 ryb). Każdą próbkę zaszczepiono minimalną wykrywalną koncentracją ustaloną dla każdego gatunku Vibrio. Aby wyznaczyć procentową czułość i swoistość, a także ujemną wartość predykcyjną (NPV) i dodatnią wartość predykcyjną25, zastosowano tabelę kontyngencji do podsumowania wyników prawdziwie dodatnich (TP), prawdziwie ujemnych (TN), fałszywie dodatnich (FP) oraz fałszywie ujemnych (FN) uzyskanych podczas eksperymentów (Tabela 2). Na podstawie tych danych zastosowano następujące wzory:
Wyniki
Wykorzystane szczepy bakteryjne i ekstrakcja DNA
DNA zostało pomyślnie wyekstrahowane ze wszystkich szczepów patogennych oraz szczepów kontroli negatywnej, aby posłużyć jako matryce w dalszych analizach LAMP.
Procedura LAMP
Startery wykorzystane w tej pracy były specyficzne dla amplifikacji celu molekularnego w każdym gatunku Vibrio. Produkty amplifikacji otrzymane metodą LAMP przy użyciu szczepów Vibrio wykazały, że każdy starter był specyficzny dla amplifikacji genu docelowego każdego gatunku Vibrio (Rycina 1).
Obróbka próbek ostryg, krewetek i ryb w celu eliminacji gatunków Vibrio naturalnie występujących w próbkach
Obróbka mająca na celu eliminację gatunków Vibrio naturalnie występujących w próbkach była skuteczna, pozwalając na 100% redukcję gatunków Vibrio. Nie stwierdzono wzrostu gatunków Vibrio przy zastosowaniu metody BAM7.
Przygotowanie węgla aktywnego z bentonitem (ACB) i ocena odzysku komórek
Eliminacja inhibitorów reakcji przy użyciu węgla aktywnego i bentonitu pozwoliła na zwiększenie czułości wykrywania patogenu metodą LAMP. Wynika to ze zdolności węgla aktywnego z bentonitem do absorbowania substancji hamujących, które mogą wpływać na polimerazę podczas procedury amplifikacji, przy jednoczesnym ograniczonym zatrzymywaniu komórek bakteryjnych (Rysunek 2). Procent odzysku Vibrio przy różnych wartościach pH i czasach kontaktu wykazał wyższy odzysk komórkowy (93,4% ± 2,9%) przy pH 6 i czasie kontaktu wynoszącym 15 min. Przy zastosowaniu pH 4 nie stwierdzono wzrostu żadnych szczepów Vibrio, natomiast dla pH 7 i 9 wyniosły one odpowiednio 33,4% ± 7,6% oraz 67,2% ± 5,8%. Niniejsza praca sugeruje zastosowanie pH 6 w celu poprawy czułości wykrywania tą metodą.
Ocena granicy wykrywalności V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus oraz V. alginolyticus w próbkach ostryg, krewetek i ryb poddanych działaniu węgla aktywnego i bentonitu
W próbkach ostryg granica wykrywalności dla V. cholerae wynosiła 150 CFU/g, a dla V. alginolyticus, V. vulnificus i V. parahaemolyticus wynosiła 3 x 102 CFU/g; w próbkach krewetek i ryb V. cholerae wykryto przy minimalnym stężeniu 150 CFU/g, natomiast dla V. alginolyticus, V. vulnificus i V. parahaemolyticus wyniosło ono 76 CFU/g. Wyniki uzyskane metodą LAMP wykazały, że zastosowanie hydroksynaftolu niebieskiego w porównaniu z czułością LAMP pozwoliło na wyeliminowanie inhibitorów reakcji w przypadku próbek, które nie były traktowane ACB (Rycina 3). Zaobserwowano, że czułość metody LAMP była wyższa po potraktowaniu próbek ACB.
Wyznaczenie dodatniej wartości predykcyjnej, ujemnej wartości predykcyjnej, swoistości i czułości metody LAMP
W celu oceny powtarzalności systematycznie zbadano wydajność diagnostyczną zoptymalizowanej metody izotermicznej amplifikacji w pętli (LAMP), z zastosowaniem i bez zastosowania wstępnego oczyszczania za pomocą węgla aktywnego i bentonitu (ACB), przeprowadzając 150 prób (Tabela 3). Eliminacja naturalnych inhibitorów żywności przy użyciu systemu ACB znacząco poprawiła wszystkie parametry diagnostyczne (czułość, swoistość, dodatnią wartość predykcyjną (PPV) i ujemną wartość predykcyjną (NPV) do wartości równych lub przekraczających 90% we wszystkich macierzach w porównaniu z próbkami nieoczyszczonymi).
W próbkach ryb i krewetek poddanych działaniu ACB test wykazał maksymalną skuteczność diagnostyczną, osiągając czułość, swoistość, PPV i NPV na poziomie 100% (Rysunek 4). Natomiast w niepoddanych działaniu ACB próbkach ryb i krewetek obecność inhibitorów pochodzących z macierzy znacząco upośledziła test, obniżając czułość wykrywania odpowiednio do 62,5% i 52,5%. W przypadku wysoce złożonej macierzy ostryg zastosowanie ACB skutecznie zredukowało główne interferencje, co pozwoliło uzyskać wysoką ogólną czułość wynoszącą 95,0% oraz NPV na poziomie 71,4% (Rysunek 5). W przeciwieństwie do nich, w niepoddanych działaniu ACB próbkach ostryg odnotowano krytyczny spadek czułości wykrywania do 32,5% oraz NPV do 15,6% ze względu na masową obecność związków organicznych, takich jak glikogen i lipidy, które hamują działanie polimerazy.
Specyficzność diagnostyczna metody LAMP pozostała na poziomie 100% we wszystkich 150 próbach, niezależnie od rodzaju matrycy lub obróbki wstępnej, przy zerowej liczbie odnotowanych wyników fałszywie dodatnich. Taka bezwzględna specyficzność wynika z wysoce selektywnego projektu zestawów starterów skierowanych przeciwko genom specyficznym dla danego gatunku (gyrB dla V. alginolyticus, ompW dla V. cholerae, tlh dla V. parahaemolyticus oraz vvhA dla V. vulnificus). Wyniki statystyczne dowodzą, że zoptymalizowana metoda ACB-LAMP jest wysoce niezawodnym i odpornym narzędziem do szybkiego, bezkulturowego wykrywania patogennych gatunków Vibrio w różnorodnych produktach rybnych.
Wreszcie uważamy, że zastosowanie metody LAMP w połączeniu z obróbką wstępną w celu wyeliminowania inhibitorów reakcji może zwiększyć czułość wykrywania patogenów w żywności przy użyciu metody LAMP. Zatem technika ta zastosowana do poszukiwania V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus oraz V. vulnificus powinna być użyteczna w monitorowaniu zapobiegającym infekcjom wywołanym przez te mikroorganizmy.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Wszystkie surowe dane potwierdzające wyniki niniejszego badania, w tym numeryczne obliczenia liczby kolonii odzyskanych bakterii (CFU/g) przy różnych wartościach pH i czasach kontaktu, a także pełne wyniki skuteczności diagnostycznej dla wszystkich 150 prób walidacyjnych, są publicznie dostępne w repozytorium Zenodo pod adresem https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272. Powiązany zestaw danych zawiera kompletny plik arkusza kalkulacyjnego (Plik uzupełniający 1).
Rysunek 1: Analiza specyficzności produktów amplifikowanych metodą LAMP na żelu agarozy 1,5%. Ścieżka M, marker wielkości molekularnej 100 bp; ścieżka 1, kontrola negatywna (Escherichia coli ATCC 25922); ścieżka 2, kontrola negatywna (Listeria monocytogenes ATCC 49594); ścieżka 3, V. alginolyticus ATCC 17749; ścieżka 4, V. cholerae no O1 CECT 557; ścieżka 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802; ścieżka 6, V. vulnificus ATCC 29037. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Procent odzysku szczepów Vibrio przy różnych wartościach pH i czasach kontaktu z mieszaniną węgla aktywnego i bentonitu (ACB). Odzysk komórkowy (%) określono po inokulacji szczepów Vibrio w stężeniu 1.5 × 104 CFU/mL w PBS o pH 4.0, 6.0, 7.0 i 9.0, a następnie poddaniu działaniu 4.6 g ACB przez 15 min, 30 min i 60 min. Punkt danych dla pH 6.0 i 15 min kontaktu wykazuje optymalny odzysk komórek (93.4% ± 2.9%), co wskazuje, że krótki czas kontaktu jest wystarczający do odzyskania komórek docelowych przy zachowaniu wysokiej wydajności usuwania inhibitorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Granica wykrywalności produktów amplifikacji LAMP w sztucznie wzbogaconych próbkach owoców morza. Wyniki amplifikacji w próbkach (A) ostryg, (B) krewetek i (C) ryb wzbogaconych seryjnymi rozcieńczeniami gatunków Vibrio i poddanych wstępnej obróbce ACB. Probówki: (1) kontrola negatywna; (2) V. alginolyticus; (3) V. parahaemolyticus; (4) V. vulnificus; (5) V. cholerae non-O1; oraz (6) V. mimicus (użyty jako kontrola celu). Górny panel: wizualna detekcja kolorymetryczna z użyciem 4 μL błękitu hydroksynaftolowego (HNB, 125 μM) podczas oceny wzrokowej, gdzie reakcje dodatnie wykazują kolor niebieski, a reakcje ujemne pozostają fioletowe. Dolny panel: detekcja oparta na fluorescencji z użyciem barwnika Midori Green Advanced (MGA) wizualizowana pod transiluminatorem światła niebieskiego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Porównawcze parametry wydajności diagnostycznej metody LAMP z i bez usuwania inhibitorów. Porównanie całkowitej czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej (PPV) i ujemnej wartości predykcyjnej (NPV) w próbkach ryb, krewetek i ostryg wzbogaconych do minimalnych granic wykrywalności (n = 10 prób na kombinację gatunek/macierz, łącznie 150 prób). Słupki porównują próbki poddane obróbce wstępnej zoptymalizowaną mieszaniną węgla aktywnego i bentonitu (ACB) z nieobrobionymi kontrolami (brak usuwania inhibitorów). Poziomy wzbogacenia ustalono na 150 CFU/g dla V. cholerae we wszystkich macierzach; 300 CFU/g dla V. parahaemolyticus, V. alginolyticus i V. vulnificus w ostrygach oraz 76 CFU/g w rybach i krewetkach. Obróbka wstępna ACB skutecznie przywróciła wszystkie parametry diagnostyczne do poziomu ≥90% we wszystkich macierzach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Celowa czułość i swoistość zoptymalizowanej metody ACB-LAMP w różnych matrycach produktów morza. Indywidualna wydajność diagnostyczna dla V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus oraz V. vulnificus w próbkach ryb, krewetek i ostryg (n = 10 testów na każdą kombinację celu/produktem spożywczym) poddanych wstępnej obróbce ACB. Swoistość wyniosła 100% dla wszystkich celów dzięki zastosowaniu gatunkowo specyficznych starterów nakierowanych na geny gyrB, ompW, tlh i vvhA. Czułość osiągnęła 100% w matrycach ryb i krewetek, przy czym w ostrygach zaobserwowano niewielki spadek do 90% ze względu na wysoką bazową złożoność matrycy organicznej zakłócającą reakcję. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Tabela 1: Primery użyte w testach izotermicznej amplifikacji zapętlonej (LAMP). Opis przednich i tylnych primerów wewnętrznych (FIP, BIP), primerów zewnętrznych (F3, B3) oraz primerów pętli (LF, LB) zaprojektowanych do specyficznego dla gatunku targetowania V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA) i V. cholerae (ompW). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 2: Tabela kontyngencyjna do oceny parametrów wydajności diagnostycznej metody LAMP. Standardowy układ macierzy 2x2 stosowany do klasyfikacji i podsumowania wyników prawdziwie dodatnich (TP), prawdziwie ujemnych (TN), fałszywie dodatnich (FP) i fałszywie ujemnych (FN) w celu obliczenia czułości, swoistości, dodatniej wartości predykcyjnej (PPV) i ujemnej wartości predykcyjnej (NPV) w próbkach owoców morza z dodatkiem wzorca i bez niego. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Plik uzupełniający 1: Surowe zbiory danych wspierające wyniki niniejszego badania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Niniejsze badanie określa zoptymalizowane warunki w celu zwiększenia czułości izotermicznej amplifikacji zapętlonej (LAMP) w detekcji V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus oraz V. vulnificus w skażonych próbkach owoców morza. Dzięki pominięciu tradycyjnego etapu wstępnego namnażania znacznie skrócono czas diagnostyki, co zapewnia wysoce wydajne i szybkie podejście do bezpośredniej identyfikacji patogenów w produktach rybnych.
Kluczową udoskonaleniem metodologicznym w niniejszym badaniu jest optymalizacja etapu usuwania inhibitorów. Wcześniejsze metodologie wykorzystywały pH 4 przed amplifikacją21; prowadziło to jednak do zerowego odzysku szczepów Vibrio, głównie dlatego, że gatunki Vibrio są wysoce wrażliwe na środowisko kwasowe26. Aby temu zaradzić, systematycznie modyfikowano warunki w celu jednoczesnej poprawy odzysku komórkowego i wyeliminowania naturalnie występujących inhibitorów reakcji. Optymalnym warunkiem okazało się resuspension węgla aktywnego z bentonitem (ACB) w roztworze buforowym o pH 6, a następnie 15-minutowe mieszanie z próbką. Modyfikacja ta maksymalizuje odpychanie elektrostatyczne między bakteriami a ACB poprzez zbliżenie się do punktu izoelektrycznego błony bakteryjnej21,27,28, co minimalizuje utratę komórek docelowych. W konsekwencji to ulepszenie metodologiczne pozwoliło uzyskać czułość detekcji od 2 do 50 razy większą niż w przypadku próbek przetwarzanych bez zastosowania ACB.
Odrębnie od tych ulepszeń metodologicznych, pomyślna implementacja niniejszego protokołu może wymagać wyraźnego rozwiązywania problemów w przypadku wystąpienia typowych trudności. Częstym problemem napotykanym podczas wdrażania jest niepełne usunięcie materii organicznej, co może zakłócać działanie polimerazy i obniżać czułość LAMP, szczególnie w silnie zanieczyszczonych matrycach. Jeśli amplifikacja nie powiedzie się lub czułość spadnie, w pierwszej kolejności należy zweryfikować pH mieszaniny ACB i próbki; odchylenia od pH 6 mogą prowadzić do śmierci komórek (jeśli środowisko jest zbyt kwasowe) lub niewystarczającej absorpcji inhibitorów. Ponadto, jeśli mimo prawidłowej obróbki ACB występują wyniki fałszywie ujemne, badacze muszą upewnić się, że czas kontaktu nie przekracza 15 min, ponieważ przedłużona ekspozycja może prowadzić do niezamierzonego zatrzymania komórek docelowych przez matrycę. W przypadku detekcji gołym okiem, niejednoznaczne zmiany koloru można wyeliminować poprzez zapewnienie całkowitego usunięcia jonów wapnia z matrycy, które w przeciwnym razie mogą zakłócać wytrącanie pirofosforanu magnezu w analizie LAMP.
Niniejsza praca przedstawia po raz pierwszy identyfikację gatunków Vibrio w próbkach ryb z wykorzystaniem metody LAMP w połączeniu z wstępnym przygotowaniem próbki metodą ACB. Badanie to posuwa dziedzinę naukową naprzód, ustanawiając szybką, niezawodną i kostoeffektywną metodę identyfikacji produktów rybnych13,19,23,29. Chociaż konwencjonalna PCR stanowi alternatywne podejście do weryfikacji tej hipotezy, wysoka swoistość i wartości prognostyczne uzyskane w pracy wykazują, że test ACB-LAMP jest lepszą opcją. Kluczową zaletą metodologiczną tej techniki jest niezależność od zaawansowanego i drogiego sprzętu, takiego jak termocyklery, komory elektroforetyczne i transiluminatory9,30. Ponadto wizualna detekcja wyników via błękit hydroksynaftolowy znacznie upraszcza interpretację danych.
Mimo osiągniętej wysokiej czułości i swoistości, zauważalnym ograniczeniem badania jest analiza matryc o wysokim poziomie zanieczyszczenia tła, takich jak próbki ostryg. W tych przypadkach system ACB nie jest w stanie całkowicie wyeliminować całej interferującej materii organicznej, co nieznacznie obniża czułość testu w porównaniu z próbkami ryb lub krewetek. Wreszcie, potencjalne zastosowania tej metody podkreślają jej użyteczność w rutynowym, wysokoprzepustowym monitorowaniu w przemyśle spożywczym w celu zapobiegania infekcjom wywoływanym przez Vibrio. Przyszłe kierunki badań powinny priorytetowo traktować automatyzację etapów ekstrakcji DNA oraz usuwania inhibitorów za pomocą ACB. Automatyzacja tych kluczowych elementów metodologicznych stanowi istotną zaletę, która znacząco skróci czas pracy manualnej, zminimalizuje błędy ludzkie i ustandaryzuje zmienne w rozwiązywaniu problemów, ułatwiając tym samym szerokie zastosowanie tej techniki w przemysłowych laboratoriach kontroli jakości.
Oświadczenia
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Węgiel aktywny | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonit | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaina | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transiluminator systemu Bio-Image systems | Systemy obrazowania biologicznego | MBE-CP-01 | |
| polimeraza DNA Bst | New England Biolabs | M0374 | |
| Wirówka (model J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| mieszanina dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Błękit hydroksynaftolowy | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Oprogramowanie do analizy MS 1D | Kluczowe nauki | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spektrofotometr (model 6300) | Jenway | 630531 | |
| Homogenizator mechaniczny Stomacher Circulator (model 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae nie-O1 | CECT (tomografia komputerowa z kontrastem) | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| papier Whatmana | Whatman | 1001-055 |
Bibliografia
- Baker GL. Food safety impacts from post-harvest processing procedures of molluscan shellfish. Foods. 2016;5(2):29.
- Kim HJ et al. Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics. BMC Microbiol. 2015;15(1):239.
- CDC. Cholera and Other Vibrio Illness Surveillance (COVIS). Cdc.gov; 2022. Available from: http://www.cdc.gov/vibrio/surveillance.html
- Robert-Pillot A et al. Occurrence of the three major Vibrio species pathogenic for human in seafood products consumed in France using real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2014;189:75-81.
- Brands DA et al. Prevalence of Salmonella spp. in oysters in the United States. Appl Environ Microbiol. 2005;71(2):893-897.
- Gxalo O et al. Virulence and antibiotic resistance characteristics of Vibrio isolates from rustic environmental freshwaters. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:732001.
- De Paola A, Kaysner CA. Bacteriological Analytical Manual, Vibrio. Food and Drug ENTER
- Chahorm K, Prakitchaiwattana C. Application of Reverse Transcriptase-PCR-DGGE as a rapid method for routine determination of Vibrio spp. in foods. Int J Food Microbiol. 2018;264:46-52.
- Anupama KP et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay along with conventional and real-time PCR assay for sensitive detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood sample without enrichment. Mol Biol Rep. 2021;48(1):1009-1016.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Sridapan T et al. Rapid detection of Clostridium perfringens in food by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow biosensor. PLoS One. 2021;16(1):e0245144.
- Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
- Yamazaki W, Ishibashi M, Kawahara R, Inoue K. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol. 2008;8:163.
- Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002;16(3):223-229.
- Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(1):150-154.
- Yamazaki W et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of the tdh and trh genes of Vibrio parahaemolyticus and related Vibrio species. Appl Environ Microbiol. 2010;76(3):820-828.
- Di H et al. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay combined with enrichment culture for rapid detection of very low numbers of Vibrio parahaemolyticus in seafood samples. Biol Pharm Bull. 2015;38(1):82-87.
- Cai SH et al. Loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of Vibrio alginolyticus, the causative agent of vibriosis in mariculture fish. Lett Appl Microbiol. 2010;50(5):480-485.
- Han F, Ge B. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for detecting Vibrio vulnificus in raw oysters. Foodborne Pathog Dis. 2008;5(3):311-320.
- Zhang L et al. Rapid, specific and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification targeted to vvhA gene. Hai Yang Xue Bao. 2018;37(4):83-88.
- Luan C, Levin RE. Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of PCR detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue. J Microbiol Methods. 2008;72(1):67-72.
- Ren C-H, Hu C-Q, Luo P, Wang Q-B. Sensitive and rapid identification of Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Res. 2009;164(5):514–21.
- Srisuk C et al. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW: Detection of Vibrio cholerae by LAMP. Lett Appl Microbiol. 2010;50(1):36-42.
- Goto M et al. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 2009;46(3):167-172.
- Parikh R et al. Understanding and using sensitivity, specificity and predictive values. Indian J Ophthalmol. 2008;56(1):45-50.
- Yung CM et al. Insensitivity of diverse and temporally variable particle-associated microbial communities to bulk seawater environmental parameters. Appl Environ Microbiol. 2016;82(11):3431-3437.
- Abolmaaty A, Gu W, Witkowsky R, Levin RE. The use of activated charcoal for the removal of PCR inhibitors from oyster samples. J Microbiol Methods. 2007;68(2):349-352.
- Lee JL, Levin RE. Detection of 5 CFU/g of Escherichia coli O157:H7 on lettuce using activated charcoal and real-time PCR without enrichment. Food Microbiol. 2011;28(3):562-567.
- Tian CD et al. Study on detection of Vibrio parahaemolyticus in shellfish by use of loop-mediated isothermal amplification method: V. Parahaemolyticus in shellfish. J Food Saf. 2011;31(3):371-378.
- Niessen L, Luo J, Denschlag C, Vogel RF. The application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in food testing for bacterial pathogens and fungal contaminants. Food Microbiol. 2013;36(2):191-206.