Platforma mikrofluidyczna do badania roli kompresji mechanicznej w oddziaływaniach między komórkami nowotworowymi a komórkami odpornościowymi w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół wykorzystania platformy mikrofluidycznej do modelowania oddziaływań między guzem a układem odpornościowym w środowisku trójwymiarowym (3D). Nasze wyniki wykazały, że komórki Natural Killer (NK) zachowały swoją aktywność przeciwnowotworową w warunkach kompresji mechanicznej.

Streszczenie

Siły mechaniczne znacząco wpływają na zdolność komórek odpornościowych do niszczenia komórek nowotworowych w kontekście immunoterapii komórkowej. Aby zabić komórki nowotworowe, komórki odpornościowe muszą wywierać siły na komórkę docelową i utworzyć synapsę immunologiczną, poprzez którą dostarczane są cząsteczki cytotoksyczne — w tym granzyme B. Pomimo ich znaczenia, sposób, w jaki sygnały mechaniczne mogą być wykorzystane do wzmocnienia zabijania zapśredniczonego przez układ odpornościowy, pozostaje słabo poznany. Luka ta wynika częściowo z braku narzędzi zdolnych do zapewnienia dobrze kontrolowanego stresu mechanicznego w hodowlach komórkowych w fizjologicznie realistycznym środowisku. W niniejszej pracy opisujemy mikrofluidyczne urządzenie do kompresji, które może wywierać statyczny lub dynamiczny nacisk na sferoidy nowotworowe osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), umożliwiając jednocześnie obrazowanie interakcji nowotwór-układ odpornościowy w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii optycznej.

Platforma mikrofluidyczna składa się z 12 komór (6 kontrolnych i 6 funkcjonalnych). Każda komora zawiera przestrzeń dla komórek umieszczoną bezpośrednio pod jednostką sterowania ciśnieniem. Sferoidy osadzone w ECM są umieszczane w przestrzeni dla komórek. Przy użyciu tej platformy zbadano efektywność zabijania przez komórki Natural Killer (NK) sferoidów guza piersi (MCF-7) w warunkach określonej kompresji mechanicznej. Wyniki wykazały, że komórki NK pozostawały głównymi czynnikami śmierci sferoidów nowotworowych niezależnie od kompresji mechanicznej w kolagenie o stężeniu 1,5 mg/mL. Sugeruje to, że komórki NK mogą zachować swoją aktywność przeciwnowotworową pod wpływem stresu kompresyjnego. Odkrycia te demonstrują użyteczność tej platformy w badaniu roli sił mechanicznych w oddziaływaniach między guzem a układem odpornościowym. Trwające badania mają na celu zidentyfikowanie mechanizmów molekularnych, które pozwalają komórkom odpornościowym adaptować się do stresu kompresyjnego. Wnioski z tych badań mogą wskazać obiecującą ścieżkę terapeutyczną.

Wprowadzenie

Immunoterapia nowotworów oparta na komórkach to podejście terapeutyczne wykorzystujące komórki odpornościowe do zwalczania komórek rakowych¹. Strategia ta odniosła spektakularne sukcesy w leczeniu nowotworów krwi^2,3,4. Jednak poziom sukcesu zaobserwowany w przypadku nowotworów krwi nie został jeszcze w pełni przeniesiony na leczenie guzów litych^5,6,7. Jedną z głównych przyczyn tego ograniczenia jest immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME), które jest charakterystyczne dla guzów litych.

TME charakteryzuje się odrębnymi sygnałami mechanicznymi, które mogą regulować zachowanie komórkowe. Skuteczne niszczenie komórek nowotworowych przez komórki odpornościowe wymaga od nich wywierania sił na komórki docelowe i tworzenia synapsy immunologicznej, poprzez którą dostarczane są cząsteczki cytotoksyczne⁸. Dlatego zrozumienie, w jaki sposób siły mechaniczne wpływają na funkcję komórek odpornościowych, może ujawnić nowe strategie terapeutyczne mające na celu poprawę skuteczności immunoterapii komórkowych przeciwko guzom litym.

Kluczową cechą mechaniczną litego TME jest naprężenie ściskające, jakie mikrośrodowisko guza wywiera na rosnący nowotwór^9,10. Do tej pory większość badań nad kompresją koncentrowała się na wpływie tego zjawiska na zachowanie komórek nowotworowych^10,11. Dopiero niedawno uwagę zaczęto kierować w stronę zrozumienia, w jaki sposób kompresja wpływa na komórki odpornościowe w obrębie TME¹². W rezultacie mechanizmy, poprzez które naprężenie ściskające wpływa na migrację komórek Natural Killer (NK), tworzenie synapsy immunologicznej i aktywność cytotoksyczną, pozostają słabo poznane i niewystarczająco określone ilościowo. Ta luka stanowi krytyczne ograniczenie w naszym rozumieniu tego, jak sygnały mechaniczne w TME mogą być wykorzystane do zwiększenia celowania immunologicznego w guzy lite.

Główną barierą w rozwiązaniu tej kwestii jest brak platform eksperymentalnych, które pozwalałyby na zastosowanie kontrolowanego i mierzalnego ściskania w fizjologicznie istotnych mikrośrodowiskach 3D, umożliwiając jednocześnie obrazowanie interakcji między guzem a układem odpornościowym w czasie rzeczywistym. Wczesne podejścia eksperymentalne do badania stresu kompresyjnego polegały na zatapianiu sferoidów w żelach agarozowych¹³. Choć metoda ta skutecznie oddawała fizyczne ograniczenie przestrzeni, eliminowała ona naturalne interakcje między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM). Dolega i wsp. zastosowali ciśnienie osmotyczne w celu wywołania stresu kompresyjnego; jednak sferoidy były zawieszone w pożywce hodowlanej, a zatem pozostawały pozbawione interakcji z ECM⁹. Pandey i wsp. wykorzystali wkładkę transwell oraz obciążniki do ściskania sferoidów zatopionych w kolagenie, co pozwoliło zachować interakcje ECM-komórka, ale ograniczyło możliwość obrazowania o wysokiej rozdzielczości, niezbędnego do ilościowego określenia mobilności i aktywności cytotoksycznej komórek odpornościowych¹⁴. Wspólnie ograniczenia te podkreślają potrzebę opracowania platform eksperymentalnych umożliwiających obrazowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi morfologicznych komórek na ściskanie w obrębie TME.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół zastosowania mikrofluidycznego urządzenia do kompresji¹⁵, które umożliwia kontrolowane przyłożenie naprężenia ściskającego przy zachowaniu fizjologicznie istotnych oddziaływań między komórkami a macierzą pozakomórkową (ECM) oraz wspiera obrazowanie na żywo z wysoką rozdzielczością dynamiki oddziaływań między komórkami odpornościowymi a nowotworowymi. Protokół obejmuje przygotowanie komponentów urządzenia (Sekcja 1), montaż urządzenia (Sekcja 2) oraz obrazowanie interakcji nowotwór–układ odpornościowy (Sekcja 3). Prezentujemy ten schemat pracy na przykładzie testu cytotoksyczności komórek NK przeciwko sferoidom nowotworowym znakowanym zieloną białkiem fluorescencyjnym (GFP). Poza tym zastosowaniem platforma ta może zostać łatwo zaadaptowana do badania wpływu sił mechanicznych na szeroki zakres typów komórek oraz oddziaływań komórkowych w trójwymiarowych mikrośrodowiskach.

Protokół

1. Przygotowanie komponentów urządzenia

1. Aktywacja powierzchni komory ładowania próbek
   1. Nałóż maskę na komorę ładowania próbek (Warstwa 1, L1) w taki sposób, aby odsłonięte pozostały jedynie dołki.
   2. Poddaj zamaskowaną Warstwę 1 działaniu plazmy tlenowej przez 15 s, korzystając z ustawienia wysokiej mocy (45 W).
   3. Umieść Warstwę 1 w szalce Petriego, a następnie kontynuuj poniższe kroki w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
   4. Potraktuj każdy dołek 10 µL 1% polietylenoiminy (PEI) przez 10 min.
   5. Usuń PEI z dołków poprzez aspirację próżniową z czterech narożników każdego dołka, aby zapobiec porysowaniu powierzchni szkła.
   6. Przemyj dołki 10 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), a następnie usuń płuczkę poprzez aspirację próżniową z boku.
   7. Potraktuj dołki 10 µL 0,1% glutaraldehydu przez 30 min, a następnie usuń glutaraldehyd poprzez aspirację próżniową z narożników.
   8. Przemyj dołki PBS trzy razy, usuwając płuczkę z narożników po każdym przemyciu.
   9. Owiń szalkę Petriego zawierającą Warstwę 1 folią i pozostaw ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza na noc.
2. Sterylizacja metalowej ramy
   1. Zanurz metalową ramę o wymiarach 38 mm × 88 mm oraz dwanaście wkrętów z łbem panowym M2.5 w 70% etanolu na noc.
3. Przygotowanie jednostki kontroli ciśnienia
   1. Poddaj jednostkę kontroli ciśnienia działaniu plazmy tlenowej przez 30 s, korzystając z ustawienia wysokiej mocy (45 W).
   2. Zanurz jednostkę kontroli ciśnienia, elementami aktywnymi skierowanymi w dół, w wodzie dejonizowanej (DI) na noc, aby wypełnić kanały i komory jednostki kontroli ciśnienia.
   3. Następnego dnia wyjmij jednostkę kontroli ciśnienia z wody DI, w której była zanurzona.
   4. Napełnij zbiornik mikrofluidyczny 50 mL wody DI.
      UWAGA: Zbiornik mikrofluidyczny składa się z probówki stożkowej o pojemności 50 mL z dopasowaną niestandardową pokrywką zawierającą dwa przyłącza rurek: linię rurek pneumatycznych oraz linię rurek do dostarczania cieczy.
   5. Podłącz strzykawkę wypełnioną powietrzem do linii rurek pneumatycznych.
   6. Powoli naciśnij tłok strzykawki, aby zwiększyć ciśnienie w zbiorniku i przepchnąć wodę DI przez rurkę do dostarczania cieczy, aż rurka zostanie wypełniona, a woda zacznie z niej kapać.
   7. Podłącz uprzednio napełnioną i kapiącą rurkę do dostarczania cieczy poprzez rozdzielacz poliwęglanowy, a następnie do wlotu 1,5 mm znajdującego się z tyłu jednostki kontroli ciśnienia.
   8. Pozostaw zespół jednostki kontroli ciśnienia i rozdzielacza do wyschnięcia na powietrzu przez 2 h. Po całkowitym wyschnięciu zespół jednostki kontroli ciśnienia i rozdzielacza jest gotowy do kolejnego kroku.

2. Montaż urządzenia

1. Przygotowanie kolagenu z zatopionymi komórkami
   1. Wyjąć i osuszyć metalową ramkę oraz śruby z 70% etanolu.
   2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieścić trzy 600 µL mikrorurki w lodzie. Opisać probówki w następujący sposób: "N" (neutralizacja), "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." (sferoidy MCF-7), oraz "sp+NK" (Sferoidy MCF-7 z komórkami NK).
   3. Przygotować mieszaninę neutralizującą, dodając 10× wymaganą objętość pożywki Medium 199 (M199) oraz wodorotlenku sodu (NaOH) do "N" probówka
   4. Przenieś odpowiednią objętość mieszaniny M199:NaOH do "sp" i "sp+NK" probówki, aby uzyskać końcowe 1× stężenie
   5. Zebrać sferoidy nowotworowe i odwirować przy 141 × g przez 3 min, aby sferoidy mogły osiąść na dnie probówki.
      UWAGA: Sferoidy nowotworowe około 200 µm o średnicy zostały wytworzone przy użyciu wcześniej opisanej platformy z mikrodołkami agarozowymi¹⁶W skrócie, 3 × 10⁶ Komórki MCF-7 wysiano do płytek 36-dołkowych × macierz 36 agarozy mikroprzewodów składająca się z dołków 200 µm o średnicy i 200 µm głęboko, a następnie hodowano przez 7 dni w celu otrzymania sferoidów nowotworowych wykorzystanych w eksperymentach.
   6. Ostrożnie usunąć supernatant i resuspendować sferoidy w 200 µL z pełnej pożywki MCF-7/NK w proporcji 50:50 (Tabela 1 i Tabela 2).
   7. Zebrać komórki NK do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, odwirować przy 141 × g przez 4 min, a następnie policzyć komórki.
      UWAGA: Żywotność komórek NK powinna wynosić >85% w dniu eksperymentu.
   8. Resuspendować otrzymany osad w 200 µL pełnej pożywki dla komórek NK.
   9. Do każdej probówki do mikrocentryfugi należy dodać odpowiednią objętość roztworu zapasowego kolagenu.
   10. Do każdej probówki należy dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać objętość końcową wynoszącą 200 µL zawierający 1,5 mg/ml kolagenu.
       UWAGA: "gat." zawiesina zawiera wyłącznie sferoidy nowotworowe, podczas gdy "sp+NK" zawiesina zawiera sferoidy nowotworowe i 1,5 × 10⁶ Komórki NK.
   11. Mieszaj delikatnie za pomocą pipety, aby zapewnić równomierną dystrybucję komórek i kolagenu, minimalizując jednocześnie powstawanie pęcherzyków powietrza.
2. Montaż urządzenia i ładowanie komórek
   1. Umieść warstwę 1 wewnątrz wysuszonej metalowej ramki.
   2. Obciążenie 9 µL mieszaniny kolagenu do każdej studzienki.
   3. Za pomocą mikroskopu należy wyrównać jednostkę sterowania ciśnieniem oraz zespół kolektora z komorami komórkowymi na warstwie 1.
   4. Wprowadź wysuszone śruby przez rozdzielacz i do metalowej ramy, zabezpieczając jednostkę sterowania ciśnieniem oraz Warstwę 1 pomiędzy rozdzielaczem a metalową ramą.
   5. Umieść zmontowane urządzenie w 37 °C, 5% CO2₂ inkubować przez 45 min, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.
   6. Dodać po równych częściach (50:50) kompletnych pożywek do hodowli komórek MCF-7 i NK przez cztery porty doprowadzające pożywkę.

3. Obrazowanie interakcji nowotworowo-immunologicznych

1. Umieść zmontowane urządzenie w inkubatorze przedmiotowym zamontowanym na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym do obrazowania żywych komórek.
   UWAGA: Inkubator przedmiotowy utrzymywał temperaturę 37 °C i wilgotność na poziomie około 50% przez cały czas trwania obrazowania.
2. Nałóż dodatkową obudowę na zmontowane urządzenie, aby utrzymać środowisko wewnętrzne w temperaturze 37 °C, przy 100% wilgotności i 5% CO₂ przez cały okres obrazowania.
3. Podłącz urządzenie do kontrolera ciśnienia za pomocą przewodów pneumatycznych.
4. Wykonaj obrazy w jasnym polu i GFP sferoidów nowotworowych przed zastosowaniem kompresji, aby umożliwić ocenę deformacji sferoidów po ściskaniu.
5. Zastosuj stałe ciśnienie 120 mbar przez cały okres obrazowania.
   UWAGA: Oprogramowanie kontrolera ciśnienia umożliwia użytkownikowi zdefiniowanie profilu i wartości ciśnienia stosowanego podczas eksperymentu. Supplementary Figure 1 zawiera schemat systemu kontroli ciśnienia.
6. Rozpocznij obrazowanie time-lapse, wykonując obrazy w jasnym polu i GFP co 10 min przez 18 h.
   UWAGA: Obrazy pozyskiwano w centralnej płaszczyźnie Z każdego sferoidu nowotworowego, korzystając z obiektywu 20× na odwróconym mikroskopie epi-fluorescencyjnym. Obrazy w jasnym polu i fluorescencję GFP rejestrowano przy czasach ekspozycji wynoszących odpowiednio 200.1 ms i 298.9 ms.

Wyniki

W poniższych eksperymentach wykorzystano mikrofluidyczne urządzenie kompresyjne¹⁵ do modelowania oddziaływań między guzem a układem odpornościowym w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku 3D, które jednocześnie umożliwia przykładanie statycznej i dynamicznej kompresji do sferoidów nowotworowych (Rycina 1). Komponenty urządzenia (Rycina 1A1) oraz kolejność ich montażu (Rycina 1A2

Dyskusja

Niniejsza metoda opisuje zastosowanie mikrofluidycznego urządzenia kompresyjnego do badania wpływu naprężeń ściskających na interakcje między guzem a układem odpornościowym. System ten umożliwia przykładanie kontrolowanej kompresji mechanicznej do sferoidów nowotworowych osadzonych w trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Podłoże szklane tworzące podstawę komory komórkowej (L1) pozwala na obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości, co sprawia, że platforma ta jest dobrze dostosowana do badań mających na celu iloś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 N NaOH	Sigma-Aldrich	79724	7 µL
10× pożywka M199	Sigma-Aldrich	M0650	200 µL
2-merkaptoetanolo	ThermoFisher	313500100
Sprężarka powietrza	Elveflow	Kompresor Jun-Air Model 3
Zautomatyzowany stolik mikroskopowy X-Y	Zastosowana Instrumentacja Naukowa	MS-2000
kamera CCD	Hamamatsu Photonics	ORCA-R2
Pł Tkliwa wołowa (FBS)	GeminiBio	S11150
Przewody do podawania płynów	Eleveflow	Zapasowa rolka rurek PTFE	1/16 cala średnicy zewnętrznej
Źródło światła fluorescencyjnego	Excelitas Technologies	Jednostka PC serii X-Cite 120
Kwas foliowy	Sigma	F7876
Glutaraldehyd	Nauki o EM	16019	0.10%
Oczyszczacz plazmowy Harrick	Harrick Plasma	PDC-001-HP	Wysokie ustawienie mocy (45 W)
surowica końska (HS)	ThermoFisher	16050-122
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny	Olympus	IX81	obiektyw 20x (NA = 0,25), obsługiwany za pomocą oprogramowania Olympus CellSens
Maska	Artus	Arkusz podkładki aluminiowej o grubości 10 arkuszy	Grubość wynosi 0,0125" (0,75 mm)
Stabilna linia komórkowa MCF-7/GFP (puromycyna)	GenTarget Inc	SC050-G
Metalowa rama	Wykonane na zamówienie	Wykonany na zamówienie
Zbiornik mikrofluidyczny	Eleveflow	mikrofluidyczny zbiornik o pojemności 50 ml
Mikroskop	Olympus	CKX41	obiektyw 4x              (NA = 0,1)
Mio-inozytol	Sigma	I7508
NK-92 MI	ATCC	CRL-2407
Penicylina/streptomycyna	Gibco	15140122
Bufor fosforanowo-solny (PBS)	ThermoFisher	10010072
Przewody pneumatyczne	Eleveflow	przezroczysta rurka doprowadzająca z polieteru PUR	4" średnica zewnętrzna w mm
polietylenoimina (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	1%
Kontroler ciśnienia	Elveflow	OB1 NK4	Obsługiwane przy użyciu oprogramowania Elveflow Smart Interface
Kolagen typu I z ogona szczura	Corning	354249	31.3 µL z roztworu zapasu kolagenu o stężeniu 9,6 mg/ml
Śruby	Phillips	Śruba M2.5 z łbem panhead	12 śrub
Inkubator obiektowy	Precyzyjny plastik	Wykonane na zamówienie
Strzykawka	Becton Dickinson	303134	Połączone z męskim zamkiem Luer Integral o rozmiarze 3/32" OD Barb z Eleveflow
α-podłoże MEM	ThermoFisher	12561056