Przedstawiamy protokół wykorzystania platformy mikrofluidycznej do modelowania oddziaływań między guzem a układem odpornościowym w środowisku trójwymiarowym (3D). Nasze wyniki wykazały, że komórki Natural Killer (NK) zachowały swoją aktywność przeciwnowotworową w warunkach kompresji mechanicznej.
Artykuł metodologiczny
Platforma mikrofluidyczna do badania roli kompresji mechanicznej w oddziaływaniach między komórkami nowotworowymi a komórkami odpornościowymi w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Siły mechaniczne znacząco wpływają na zdolność komórek odpornościowych do niszczenia komórek nowotworowych w kontekście immunoterapii komórkowej. Aby zabić komórki nowotworowe, komórki odpornościowe muszą wywierać siły na komórkę docelową i utworzyć synapsę immunologiczną, poprzez którą dostarczane są cząsteczki cytotoksyczne — w tym granzyme B. Pomimo ich znaczenia, sposób, w jaki sygnały mechaniczne mogą być wykorzystane do wzmocnienia zabijania zapśredniczonego przez układ odpornościowy, pozostaje słabo poznany. Luka ta wynika częściowo z braku narzędzi zdolnych do zapewnienia dobrze kontrolowanego stresu mechanicznego w hodowlach komórkowych w fizjologicznie realistycznym środowisku. W niniejszej pracy opisujemy mikrofluidyczne urządzenie do kompresji, które może wywierać statyczny lub dynamiczny nacisk na sferoidy nowotworowe osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), umożliwiając jednocześnie obrazowanie interakcji nowotwór-układ odpornościowy w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii optycznej.
Platforma mikrofluidyczna składa się z 12 komór (6 kontrolnych i 6 funkcjonalnych). Każda komora zawiera przestrzeń dla komórek umieszczoną bezpośrednio pod jednostką sterowania ciśnieniem. Sferoidy osadzone w ECM są umieszczane w przestrzeni dla komórek. Przy użyciu tej platformy zbadano efektywność zabijania przez komórki Natural Killer (NK) sferoidów guza piersi (MCF-7) w warunkach określonej kompresji mechanicznej. Wyniki wykazały, że komórki NK pozostawały głównymi czynnikami śmierci sferoidów nowotworowych niezależnie od kompresji mechanicznej w kolagenie o stężeniu 1,5 mg/mL. Sugeruje to, że komórki NK mogą zachować swoją aktywność przeciwnowotworową pod wpływem stresu kompresyjnego. Odkrycia te demonstrują użyteczność tej platformy w badaniu roli sił mechanicznych w oddziaływaniach między guzem a układem odpornościowym. Trwające badania mają na celu zidentyfikowanie mechanizmów molekularnych, które pozwalają komórkom odpornościowym adaptować się do stresu kompresyjnego. Wnioski z tych badań mogą wskazać obiecującą ścieżkę terapeutyczną.
Wprowadzenie
Immunoterapia nowotworów oparta na komórkach to podejście terapeutyczne wykorzystujące komórki odpornościowe do zwalczania komórek rakowych1. Strategia ta odniosła spektakularne sukcesy w leczeniu nowotworów krwi2,3,4. Jednak poziom sukcesu zaobserwowany w przypadku nowotworów krwi nie został jeszcze w pełni przeniesiony na leczenie guzów litych5,6,7. Jedną z głównych przyczyn tego ograniczenia jest immunosupresyjne mikrośrodowisko guza (TME), które jest charakterystyczne dla guzów litych.
TME charakteryzuje się odrębnymi sygnałami mechanicznymi, które mogą regulować zachowanie komórkowe. Skuteczne niszczenie komórek nowotworowych przez komórki odpornościowe wymaga od nich wywierania sił na komórki docelowe i tworzenia synapsy immunologicznej, poprzez którą dostarczane są cząsteczki cytotoksyczne8. Dlatego zrozumienie, w jaki sposób siły mechaniczne wpływają na funkcję komórek odpornościowych, może ujawnić nowe strategie terapeutyczne mające na celu poprawę skuteczności immunoterapii komórkowych przeciwko guzom litym.
Kluczową cechą mechaniczną litego TME jest naprężenie ściskające, jakie mikrośrodowisko guza wywiera na rosnący nowotwór9,10. Do tej pory większość badań nad kompresją koncentrowała się na wpływie tego zjawiska na zachowanie komórek nowotworowych10,11. Dopiero niedawno uwagę zaczęto kierować w stronę zrozumienia, w jaki sposób kompresja wpływa na komórki odpornościowe w obrębie TME12. W rezultacie mechanizmy, poprzez które naprężenie ściskające wpływa na migrację komórek Natural Killer (NK), tworzenie synapsy immunologicznej i aktywność cytotoksyczną, pozostają słabo poznane i niewystarczająco określone ilościowo. Ta luka stanowi krytyczne ograniczenie w naszym rozumieniu tego, jak sygnały mechaniczne w TME mogą być wykorzystane do zwiększenia celowania immunologicznego w guzy lite.
Główną barierą w rozwiązaniu tej kwestii jest brak platform eksperymentalnych, które pozwalałyby na zastosowanie kontrolowanego i mierzalnego ściskania w fizjologicznie istotnych mikrośrodowiskach 3D, umożliwiając jednocześnie obrazowanie interakcji między guzem a układem odpornościowym w czasie rzeczywistym. Wczesne podejścia eksperymentalne do badania stresu kompresyjnego polegały na zatapianiu sferoidów w żelach agarozowych13. Choć metoda ta skutecznie oddawała fizyczne ograniczenie przestrzeni, eliminowała ona naturalne interakcje między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM). Dolega i wsp. zastosowali ciśnienie osmotyczne w celu wywołania stresu kompresyjnego; jednak sferoidy były zawieszone w pożywce hodowlanej, a zatem pozostawały pozbawione interakcji z ECM9. Pandey i wsp. wykorzystali wkładkę transwell oraz obciążniki do ściskania sferoidów zatopionych w kolagenie, co pozwoliło zachować interakcje ECM-komórka, ale ograniczyło możliwość obrazowania o wysokiej rozdzielczości, niezbędnego do ilościowego określenia mobilności i aktywności cytotoksycznej komórek odpornościowych14. Wspólnie ograniczenia te podkreślają potrzebę opracowania platform eksperymentalnych umożliwiających obrazowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi morfologicznych komórek na ściskanie w obrębie TME.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół zastosowania mikrofluidycznego urządzenia do kompresji15, które umożliwia kontrolowane przyłożenie naprężenia ściskającego przy zachowaniu fizjologicznie istotnych oddziaływań między komórkami a macierzą pozakomórkową (ECM) oraz wspiera obrazowanie na żywo z wysoką rozdzielczością dynamiki oddziaływań między komórkami odpornościowymi a nowotworowymi. Protokół obejmuje przygotowanie komponentów urządzenia (Sekcja 1), montaż urządzenia (Sekcja 2) oraz obrazowanie interakcji nowotwór–układ odpornościowy (Sekcja 3). Prezentujemy ten schemat pracy na przykładzie testu cytotoksyczności komórek NK przeciwko sferoidom nowotworowym znakowanym zieloną białkiem fluorescencyjnym (GFP). Poza tym zastosowaniem platforma ta może zostać łatwo zaadaptowana do badania wpływu sił mechanicznych na szeroki zakres typów komórek oraz oddziaływań komórkowych w trójwymiarowych mikrośrodowiskach.
Protokół
1. Przygotowanie komponentów urządzenia
- Aktywacja powierzchni komory ładowania próbek
- Nałóż maskę na komorę ładowania próbek (Warstwa 1, L1) w taki sposób, aby odsłonięte pozostały jedynie dołki.
- Poddaj zamaskowaną Warstwę 1 działaniu plazmy tlenowej przez 15 s, korzystając z ustawienia wysokiej mocy (45 W).
- Umieść Warstwę 1 w szalce Petriego, a następnie kontynuuj poniższe kroki w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Potraktuj każdy dołek 10 µL 1% polietylenoiminy (PEI) przez 10 min.
- Usuń PEI z dołków poprzez aspirację próżniową z czterech narożników każdego dołka, aby zapobiec porysowaniu powierzchni szkła.
- Przemyj dołki 10 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS), a następnie usuń płuczkę poprzez aspirację próżniową z boku.
- Potraktuj dołki 10 µL 0,1% glutaraldehydu przez 30 min, a następnie usuń glutaraldehyd poprzez aspirację próżniową z narożników.
- Przemyj dołki PBS trzy razy, usuwając płuczkę z narożników po każdym przemyciu.
- Owiń szalkę Petriego zawierającą Warstwę 1 folią i pozostaw ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza na noc.
- Sterylizacja metalowej ramy
- Zanurz metalową ramę o wymiarach 38 mm × 88 mm oraz dwanaście wkrętów z łbem panowym M2.5 w 70% etanolu na noc.
- Przygotowanie jednostki kontroli ciśnienia
- Poddaj jednostkę kontroli ciśnienia działaniu plazmy tlenowej przez 30 s, korzystając z ustawienia wysokiej mocy (45 W).
- Zanurz jednostkę kontroli ciśnienia, elementami aktywnymi skierowanymi w dół, w wodzie dejonizowanej (DI) na noc, aby wypełnić kanały i komory jednostki kontroli ciśnienia.
- Następnego dnia wyjmij jednostkę kontroli ciśnienia z wody DI, w której była zanurzona.
- Napełnij zbiornik mikrofluidyczny 50 mL wody DI.
UWAGA: Zbiornik mikrofluidyczny składa się z probówki stożkowej o pojemności 50 mL z dopasowaną niestandardową pokrywką zawierającą dwa przyłącza rurek: linię rurek pneumatycznych oraz linię rurek do dostarczania cieczy. - Podłącz strzykawkę wypełnioną powietrzem do linii rurek pneumatycznych.
- Powoli naciśnij tłok strzykawki, aby zwiększyć ciśnienie w zbiorniku i przepchnąć wodę DI przez rurkę do dostarczania cieczy, aż rurka zostanie wypełniona, a woda zacznie z niej kapać.
- Podłącz uprzednio napełnioną i kapiącą rurkę do dostarczania cieczy poprzez rozdzielacz poliwęglanowy, a następnie do wlotu 1,5 mm znajdującego się z tyłu jednostki kontroli ciśnienia.
- Pozostaw zespół jednostki kontroli ciśnienia i rozdzielacza do wyschnięcia na powietrzu przez 2 h. Po całkowitym wyschnięciu zespół jednostki kontroli ciśnienia i rozdzielacza jest gotowy do kolejnego kroku.
2. Montaż urządzenia
- Przygotowanie kolagenu z zatopionymi komórkami
- Wyjąć i osuszyć metalową ramkę oraz śruby z 70% etanolu.
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieścić trzy 600 µL mikrorurki w lodzie. Opisać probówki w następujący sposób: "N" (neutralizacja), "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." (sferoidy MCF-7), oraz "sp+NK" (Sferoidy MCF-7 z komórkami NK).
- Przygotować mieszaninę neutralizującą, dodając 10× wymaganą objętość pożywki Medium 199 (M199) oraz wodorotlenku sodu (NaOH) do "N" probówka
- Przenieś odpowiednią objętość mieszaniny M199:NaOH do "sp" i "sp+NK" probówki, aby uzyskać końcowe 1× stężenie
- Zebrać sferoidy nowotworowe i odwirować przy 141 × g przez 3 min, aby sferoidy mogły osiąść na dnie probówki.
UWAGA: Sferoidy nowotworowe około 200 µm o średnicy zostały wytworzone przy użyciu wcześniej opisanej platformy z mikrodołkami agarozowymi16W skrócie, 3 × 106 Komórki MCF-7 wysiano do płytek 36-dołkowych × macierz 36 agarozy mikroprzewodów składająca się z dołków 200 µm o średnicy i 200 µm głęboko, a następnie hodowano przez 7 dni w celu otrzymania sferoidów nowotworowych wykorzystanych w eksperymentach. - Ostrożnie usunąć supernatant i resuspendować sferoidy w 200 µL z pełnej pożywki MCF-7/NK w proporcji 50:50 (Tabela 1 i Tabela 2).
- Zebrać komórki NK do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, odwirować przy 141 × g przez 4 min, a następnie policzyć komórki.
UWAGA: Żywotność komórek NK powinna wynosić >85% w dniu eksperymentu. - Resuspendować otrzymany osad w 200 µL pełnej pożywki dla komórek NK.
- Do każdej probówki do mikrocentryfugi należy dodać odpowiednią objętość roztworu zapasowego kolagenu.
- Do każdej probówki należy dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, aby uzyskać objętość końcową wynoszącą 200 µL zawierający 1,5 mg/ml kolagenu.
UWAGA: "gat." zawiesina zawiera wyłącznie sferoidy nowotworowe, podczas gdy "sp+NK" zawiesina zawiera sferoidy nowotworowe i 1,5 × 106 Komórki NK. - Mieszaj delikatnie za pomocą pipety, aby zapewnić równomierną dystrybucję komórek i kolagenu, minimalizując jednocześnie powstawanie pęcherzyków powietrza.
- Montaż urządzenia i ładowanie komórek
- Umieść warstwę 1 wewnątrz wysuszonej metalowej ramki.
- Obciążenie 9 µL mieszaniny kolagenu do każdej studzienki.
- Za pomocą mikroskopu należy wyrównać jednostkę sterowania ciśnieniem oraz zespół kolektora z komorami komórkowymi na warstwie 1.
- Wprowadź wysuszone śruby przez rozdzielacz i do metalowej ramy, zabezpieczając jednostkę sterowania ciśnieniem oraz Warstwę 1 pomiędzy rozdzielaczem a metalową ramą.
- Umieść zmontowane urządzenie w 37 °C, 5% CO2₂ inkubować przez 45 min, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.
- Dodać po równych częściach (50:50) kompletnych pożywek do hodowli komórek MCF-7 i NK przez cztery porty doprowadzające pożywkę.
3. Obrazowanie interakcji nowotworowo-immunologicznych
- Umieść zmontowane urządzenie w inkubatorze przedmiotowym zamontowanym na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym do obrazowania żywych komórek.
UWAGA: Inkubator przedmiotowy utrzymywał temperaturę 37 °C i wilgotność na poziomie około 50% przez cały czas trwania obrazowania. - Nałóż dodatkową obudowę na zmontowane urządzenie, aby utrzymać środowisko wewnętrzne w temperaturze 37 °C, przy 100% wilgotności i 5% CO₂ przez cały okres obrazowania.
- Podłącz urządzenie do kontrolera ciśnienia za pomocą przewodów pneumatycznych.
- Wykonaj obrazy w jasnym polu i GFP sferoidów nowotworowych przed zastosowaniem kompresji, aby umożliwić ocenę deformacji sferoidów po ściskaniu.
- Zastosuj stałe ciśnienie 120 mbar przez cały okres obrazowania.
UWAGA: Oprogramowanie kontrolera ciśnienia umożliwia użytkownikowi zdefiniowanie profilu i wartości ciśnienia stosowanego podczas eksperymentu. Supplementary Figure 1 zawiera schemat systemu kontroli ciśnienia. - Rozpocznij obrazowanie time-lapse, wykonując obrazy w jasnym polu i GFP co 10 min przez 18 h.
UWAGA: Obrazy pozyskiwano w centralnej płaszczyźnie Z każdego sferoidu nowotworowego, korzystając z obiektywu 20× na odwróconym mikroskopie epi-fluorescencyjnym. Obrazy w jasnym polu i fluorescencję GFP rejestrowano przy czasach ekspozycji wynoszących odpowiednio 200.1 ms i 298.9 ms.
Wyniki
W poniższych eksperymentach wykorzystano mikrofluidyczne urządzenie kompresyjne15 do modelowania oddziaływań między guzem a układem odpornościowym w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku 3D, które jednocześnie umożliwia przykładanie statycznej i dynamicznej kompresji do sferoidów nowotworowych (Rycina 1). Komponenty urządzenia (Rycina 1A1) oraz kolejność ich montażu (Rycina 1A2) przedstawiono na Rycynie 1A. Metalowa rama służy jako podstawa urządzenia, w której umieszczona jest warstwa komory komórkowej (L1). Jednostka kontroli ciśnienia, składająca się z warstw L2 i L3 połączonych w procesie bondingowania plazmowego, jest umieszczana nad L1, a następnie nakłada się kolektor (Rycina 1A2). Razem L1 i jednostka kontroli ciśnienia tworzą funkcjonalne urządzenie mikrofluidyczne i są zaciśnięte między metalową ramą a kolektorem za pomocą śrub. Kolektor zawiera porty wlotowe dla przewodów fluidycznych w celu dostarczenia ciśnienia do urządzenia, a także zbiorniki z medium, które ułatwiają długoterminowe eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek.
Rysunek 1: Mikrofluidyczne urządzenie do kompresji przeznaczone do badań interakcji między komórkami odpornościowymi a sferoidami nowotworowymi pod wpływem kompresji mechanicznej. (A1) Fotografia komponentów niezbędnych do montażu urządzenia, przedstawionych od lewej do prawej: kolektor, jednostka kontroli ciśnienia (L2 + L3), warstwa komory komórkowej (L1) oraz metalowa rama. (A2) Schemat 3D komponentów urządzenia, przedstawionych od góry do dołu: kolektor, jednostka kontroli ciśnienia (L2 + L3), warstwa komory komórkowej (L1) oraz metalowa rama. Warstwy PDMS L2 i L3 są łączone plazmowo w celu utworzenia jednostki kontroli ciśnienia, która jest umieszczona nad komorą komórkową. Kolektor i metalowa rama stabilizują zmontowane urządzenie. (B1) Schemat przekroju jednostki kompresyjnej przed i po kompresji. Sferoidy nowotworowe osadzone w ECM oraz komórki NK są umieszczone w komorze komórkowej. Początkowa odległość między dnem L1 a dnem L2 przed kompresją jest oznaczona jako h. Po przyłożeniu ciśnienia do jednostki kontroli ciśnienia, L2 ugięta zostaje w dół, co powoduje, że tłok z PDMS kompresuje sferoid nowotworowy. Przesunięcie L2 w dół po kompresji jest oznaczone jako Δh. (B2) Połączone obrazy w jasnym polu i GFP sferoidu nowotworowego MCF-7 z komórkami NK przed (lewo) i po (prawo) kompresji. Komórki MCF-7 są znakowane GFP, natomiast komórki NK nie są znakowane. Reprezentatywne komórki NK zostały obwiedzione niebieskim kolorem, a żółte obrysy zaznaczają obrzeża sferoidów nowotworowych. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Po złożeniu urządzenie do kompresji mikrofluidycznej może być wykorzystane do ściskania sferoidów nowotworowych, jak zilustrowano na Rysunku 1B. W tym układzie sferoidy nowotworowe z komórkami NK osadzone w kolagenie są wprowadzane do komory komórkowej (L1). Po przyłożeniu ciśnienia do komory ciśnieniowej (L3), odkształcalna warstwa membrany (L2) ugina się w dół, co powoduje, że tłok z polidimetylosiloksanu (PDMS) przekazuje siły kompresyjne na sferoid. Komora ciśnieniowa jest sterowana przez zewnętrzne źródło ciśnienia. Dodatkowe szczegóły dotyczące projektu, wykonania i charakterystyki urządzenia do kompresji mikrofluidycznej zostały wcześniej opublikowane w innym badaniu15.
Odległość między dnem komory komórkowej (L1) a dnem odkształcalnej membrany (L2) definiujemy jako h (Rysunek 1B1, panel lewy). Przed kompresją odległość ta wynosi 200 µm. Po przyłożeniu ciśnienia cieczy do jednostki sterowania ciśnieniem odkształcalna membrana ugina się w dół, zmniejszając odległość h o Δh (Δh; Rysunek 1B1, panel prawy), co powoduje kompresję sferoidu nowotworowego osadzonego w kolagenie. W tym układzie odkształcenie kompresyjne definiuje się jako Δh/h, gdzie h jest początkową odległością między L1 a L2 przed kompresją, a Δh jest przemieszczeniem L2 w dół po kompresji. Przemieszczenie membrany zostało wcześniej skalibrowane poprzez wizualizację kulek fluorescencyjnych przylegających do dna L2. Szczegółowy opis procedury kalibracji oraz obliczeń odkształcenia kompresyjnego znajduje się w poprzednim badaniu17. Przykładową krzywą kalibracyjną można zobaczyć na Rysunku uzupełniającym 2.
Rysunek 1B2 przedstawia reprezentatywne, nałożone na siebie obrazy w jasnym polu i GFP sferoidu MCF-7 z komórkami NK zatopionymi w 1,5 mg/mL kolagenu przed (panel lewy) i po kompresji (panel prawy). Granice sferoidu nowotworowego zaznaczono na żółto. Po kompresji sferoid wykazał zwiększenie powierzchni rzutowanej, co wskazuje na odkształcenie w odpowiedzi na pomyślne przyłożenie obciążenia mechanicznego. we wszystkich eksperymentach przedstawionych w niniejszym manuskrypcie zastosowano odkształcenie kompresyjne Δh/h = 50%. Zauważamy, że średnica sferoidu mieści się w zakresie od 140 µm do 200 µm. Oznacza to, że rzeczywiste odkształcenie kompresyjne sferoidu jest nieco mniejsze niż 50%. Wideo uzupełniające 1 oraz Wideo uzupełniające 2 przedstawiają reprezentatywne stosy z-stacki X-Y uzyskane w kanale fluorescencji GFP sferoidu MCF-7 zatopionego w 1,5 mg/mL kolagenu odpowiednio przed i po przyłożeniu 50% odkształcenia kompresyjnego.
Mikrofluidyczne urządzenie do kompresji zostało wykorzystane do zbadania wpływu komórek NK, kompresji oraz ich połączenia na obumieranie sferoidów nowotworowych (Rysunek 2). Jest to możliwe dzięki konstrukcji urządzenia, które zawiera 12 dołków hodowlanych. Sześć z tych dołków można poddać kompresji, podczas gdy pozostałe sześć służy jako niekompresowane kontrole. Taka konfiguracja umożliwia zastosowanie czterech warunków eksperymentalnych (Rysunek 2A): same sferoidy bez kompresji (sp), sferoidy z komórkami NK bez kompresji (+NK), sferoidy poddane kompresji (+comp) oraz sferoidy poddane jednocześnie kompresji i działaniu komórek NK (+comp+NK).
Rysunek 2: Kompresja mechaniczna moduluje zależną od komórek NK cytotoksyczność wobec sferoidów nowotworowych. (A) Obrazy fluorescencyjne poklatkowe sferoidów MCF-7 zatopionych w kolagenie 1,5 mg/mL w czterech warunkach: kontrola tylko sferoidy (sp), sferoidy z komórkami NK (+NK), sferoidy poddane kompresji (+comp) oraz sferoidy poddane kompresji i inkubowane z komórkami NK (+comp+NK). Fluorescencja GFP znakuje żywe komórki nowotworowe MCF-7. Żółta obwiednia wskazuje obszar zainteresowania (ROI), który został zdefiniowany na obrazie z 18. godziny i zastosowany do wszystkich punktów czasowych w celu kwantyfikacji fluorescencji. Całkowita intensywność fluorescencji GFP wewnątrz ROI została zmierzona i wykorzystana do dalszej analizy. Pasek skali = 50 µm. (B) Całkowita intensywność fluorescencji GFP jednego sferoidu w czasie w 4 warunkach. Każda kolorowa linia reprezentuje całkowitą intensywność fluorescencji pojedynczego sferoidu, znormalizowaną do jego początkowej intensywności w t = 0. Czarna linia to dopasowanie wielomianowe drugiego stopnia do danych intensywności fluorescencji zgromadzonych z 7 sferoidów hodowanych w warunkach kontrolnych, które posłużyło jako referencja do obliczenia utraty komórek nowotworowych w części (C). (C) Znormalizowana utrata GFP dla warunków +comp, +NK oraz +comp+NK została obliczona poprzez odjęcie intensywności GFP w t = 18 h każdego sferoidu od linii referencyjnej dla samych sferoidów (sp). Zatem każdy punkt danych reprezentuje znormalizowaną utratę GFP pojedynczego sferoidu. Słupki błędów reprezentują SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Wpływ komórek NK, kompresji oraz ich połączenia na sferoidy nowotworowe można zaobserwować na reprezentatywnych obrazach sferoidów MCF-7 w 1,5 mg/mL kolagenu (Rycina 2A). Ponieważ komórki MCF-7 wykorzystane do wytworzenia sferoidów nowotworowych zostały oznakowane GFP, żywotność nowotworu można było monitorować poprzez zmiany fluorescencji GFP. Obrazy GFP i w świetle przechodzącym pozyskiwano co 10 min przez 18 h przy użyciu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Co istotne, sferoidy poddane kompresji wykazywały większą powierzchnię rzutowania niż sferoidy niekompresowane, co potwierdza skuteczny przekaz obciążenia mechanicznego z odkształcalnej membrany na sferoid nowotworowy. Z czasem zaobserwowano stopniowy zanik fluorescencji GFP w warunkach +NK oraz +comp+NK (Rycina 2A), co wskazuje na indukowaną przez komórki NK śmierć komórek nowotworowych.
Utratę fluorescencji GFP wykorzystujemy jako miarę śmierci komórek nowotworowych. Komórki MCF-7 oznakowane GFP użyte w niniejszym badaniu zostały wytworzone poprzez transdukcję lentiwirusową. W skrócie, wykorzystano wektor lentiwirusowy do wprowadzenia kasety ekspresyjnej wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) sterowanej przez promotor czynnika elongacyjnego 1α (EF1α), wraz z genem oporności na puromycynę sterowanym przez promotor wirusa białaczki ptaków (RSV). Po infekcji lentiwirusowe kasety ekspresyjne zostały zintegrowane z DNA genomicznym komórek MCF-7, co doprowadziło do stabilnej ekspresji GFP. Następnie zastosowano selekcję puromycyną w celu wyeliminowania komórek nietransdukowanych. Oznakowanie komórek MCF-7 za pomocą GFP umożliwiło ilościowe określenie żywotności komórek nowotworowych poprzez monitorowanie zmian natężenia fluorescencji GFP w czasie (Ryc. 2B). Wcześniej wykazano silną korelację między utratą fluorescencji GFP a uznanymi markerami śmierci komórkowej, w tym markerem żywotności jodkiem propidium (PI) oraz markerem apoptozy anneksyną-V18, co potwierdza, że utrata fluorescencji GFP jest miarą zastępczą śmierci komórek nowotworowych.
Aby ilościowo określić wpływ czterech warunków eksperymentalnych na żywotność guza, w każdym punkcie czasowym zmierzono całkowitą intensywność fluorescencji GFP każdego sferoidu nowotworowego, odjęto tło i znormalizowano wynik do wartości początkowej (Rysunek 2B). Całkowitą fluorescencję sferoidu obliczono w zdefiniowanym obszarze zainteresowania (ROI). Obszar ROI uzyskano poprzez ręczne obrysowanie granicy sferoidu nowotworowego na obrazie z 18. godziny (żółty obrys na panelu 18 h, Rys. 2A) przy użyciu wewnętrznego skryptu MATLAB. Całkowitą intensywność fluorescencji w tym ROI obliczono następnie dla każdego punktu czasowego i skorygowano poprzez odjęcie średniej fluorescencji tła zmierzonej z oddzielnego ROI wybranego w innym miejscu obrazu. Uzyskane wartości fluorescencji skorygowane o tło zostały następnie znormalizowane do początkowej intensywności fluorescencji sferoidu.
Każda kolorowa krzywa na Rysunku 2B reprezentuje znormalizowaną intensywność GFP pojedynczego sferoidu w określonych warunkach eksperymentalnych. Krzywa została uzyskana poprzez dopasowanie wielomianu drugiego stopnia do danych eksperymentalnych. Krzywe fioletowe reprezentują sferoidy poddane wyłącznie kompresji (+comp, Rysunek 2B), krzywe czerwone reprezentują sferoidy z komórkami NK (+NK, Rysunek 2B), a krzywe niebieskie reprezentują sferoidy poddane zarówno kompresji, jak i działaniu komórek NK (+comp+NK, Rysunek 2B). W przeciwieństwie do nich, krzywa czarna stanowi dopasowanie wielomianem drugiego stopnia do danych z siedmiu sferoidów hodowanych w warunkach kontrolnych (same sferoidy; sp, Rysunek 2B). Na Rysunku 2B, dla zwiększenia przejrzystości, przedstawiono jedynie dane dopasowane wielomianem, a nie poszczególne punkty pomiarowe. Warto zauważyć, że intensywność fluorescencji GFP w warunkach kontrolnych (sp) oraz w warunkach sferoid + kompresja (+comp) wykazywała ogólną tendencję wzrostową w czasie (Rysunek 2B), co jest spójne z dalszym wzrostem guza lub utrzymaniem żywotności komórek. Z kolei w warunkach +NK oraz +comp+NK odnotowano stopniowy spadek intensywności fluorescencji GFP (Rysunek 2B), co wskazuje na śmierć komórek nowotworowych.
Skumulowaną utratę komórek nowotworowych określono poprzez odjęcie dopasowanej znormalizowanej intensywności fluorescencji GFP każdego sferoidu w danej kondycji (+comp, +NK lub +comp+NK) od wartości w warunkach kontrolnych po 18 h (Rysunek 2C). W rezultacie każdy punkt danych reprezentuje znormalizowaną utratę GFP poszczególnego sferoidu w stosunku do kontroli składającej się z samych sferoidów (Rysunek 2C). Odpowiednio, kondycja +comp odzwierciedla utratę GFP wynikającą z samej kompresji (kolor fioletowy, Rysunek 2C), kondycja +NK odzwierciedla utratę GFP wynikającą z samych komórek NK (kolor czerwony, Rysunek 2C), a kondycja +comp+NK odzwierciedla utratę GFP wynikającą z połączonego działania kompresji i komórek NK (kolor niebieski, Rysunek 2C). W kondycji +comp zaobserwowano najniższy stopień utraty GFP (Rysunek 2C), co sugeruje, że sama kompresja miała minimalny wpływ na żywotność sferoidów. W przeciwieństwie do tego, zarówno w kondycji +NK, jak i +comp+NK odnotowano znacznie większą utratę GFP niż w kondycji +comp (Rysunek 2C), co wskazuje, że komórki NK są głównym czynnikiem indukującym śmierć komórek nowotworowych. Choć w kondycji +comp+NK zaobserwowano większą średnią utratę GFP niż w kondycji +NK, różnica ta nie osiągnęła istotności statystycznej (Rysunek 2C). Wyniki te sugerują, że kompresja nie upośledza cytotoksyczności komórek NK wobec komórek nowotworowych. Podsumowując, dane te wykazują, że mikrofluidyczne urządzenie do kompresji może być skutecznie wykorzystane do ilościowego określenia niezależnych i połączonych efektów kompresji oraz komórek NK na żywotność sferoidów nowotworowych w fizjologicznie istotnym środowisku 3D.
Z kolei nieoptymalne wyniki mogą wystąpić, gdy (1) sferoidy znajdują się poza granicą tłoka, (2) sferoidy są rozmieszczone zbyt blisko granicy tłoka oraz (3) wiele sferoidów znajduje się w odległości mniejszej niż jedna średnica sferoidu od siebie (Rysunek 3). W takich przypadkach odpowiednie pola należy wykluczyć z analizy.
Rycina 3: Reprezentatywny przykład sekwencji obrazów sferoidów wykluczonych z analizy. Przedstawiono obrazy time-lapse w świetle przechodzącym (BF), fluorescencję GFP oraz obrazy scalone sferoidów MCF-7 z komórkami NK w kolagenie 1,5 mg/mL przed (lewa kolumna) i po kompresji (dwie prawe kolumny). Obrazy przed kompresją pozyskano 20 min przed przyłożeniem ciśnienia i 10 min przed rozpoczęciem obrazowania time-lapse. Następnie obrazy gromadzono co 10 min przez 18 h, gdzie 0 h odpowiada pierwszemu obrazowi uzyskanemu bezpośrednio po kompresji, a 18 h oznacza koniec eksperymentu. Niebieska strzałka wskazuje krawędź tłoka PDMS (L2). To pole obrazowania zostało wykluczone z analizy, ponieważ w obszarze kompresji znajdowały się dwa sferoidy i były one zlokalizowane zbyt blisko granicy tłoka. W konsekwencji nie można było wiarygodnie określić stopnia deformacji sferoidów ani intensywności fluorescencji GFP podczas kompresji. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
(1) Sferoidy znajdujące się poza granicą tłoka nie podlegają kompresji, ponieważ ciśnienie jest przykładane wyłącznie w obszarze tłoka. Sferoidy te powinny zatem zostać wykluczone zarówno z grupy poddanej kompresji, jak i z grupy kontrolnej. (2) Należy wykluczyć sferoidy znajdujące się na granicy tłoka lub w jej bezpośrednim sąsiedztwie (Rysunek 3, górny sferoid), ponieważ podlegają one nierównomiernemu obciążeniu mechanicznemu. (3) Należy wykluczyć sferoidy, których odległość od sąsiednich sferoidów jest mniejsza niż średnica sferoidu (Rysunek 3). Bliskie sąsiedztwo sferoidów utrudnia kwantyfikację intensywności fluorescencji GFP, ponieważ obszar zainteresowania (ROI) jest definiowany w końcowym punkcie czasowym. Z biegiem czasu granice sferoidów mogą stać się nierozróżnialne, co utrudnia wyznaczenie ROI, który precyzyjnie obejmuje tylko jeden sferoid. Problemy te można zminimalizować, zapewniając centrowanie sferoidów w obszarze kompresji podczas ładowania urządzenia. Zachowanie szczególnej uwagi przy rozmieszczeniu i pozycjonowaniu sferoidów oraz konfiguracji urządzenia jest niezbędne do osiągnięcia jednorodnej kompresji i uzyskania wiarygodnych, powtarzalnych wyników eksperymentalnych.
| Komponenty | Stężenie |
| pożywka α-MEM | |
| płodowa surowica bydlęca (FBS) | 10% |
| Penicylina/streptomycyna | 1% |
Tabela 1: Pełna pożywka dla komórek MCF-7.
| Składniki | Stężenie |
| pożywka α-MEM | |
| mio-inozytol | 0.2 mM |
| 2-merkaptoetanol | 0.1 mM |
| płodowa surowica bydlęca (FBS) | 12.50% |
| kwas foliowy | 0.02 mM |
| surowica końska (HS) | 12.50% |
| penicylina/streptomycyna | 1% |
Tabela 2: Pełna pożywka dla komórek NK.
Rycina uzupełniająca 1: Schemat systemu kontroli ciśnienia. Kompresor dostarcza sprężone powietrze (do 20 psi) do kontrolera ciśnienia. Kontroler ciśnienia reguluje ciśnienie powietrza dostarczanego do zbiornika ciśnieniowego zgodnie z ustawieniami zdefiniowanymi przez użytkownika. Kontroler posiada maksymalne ciśnienie robocze 200 mbar, stabilność ciśnienia 0,005% pełnej skali (FS), rozdzielczość ciśnienia 0,003% FS oraz czas odpowiedzi 9 ms, co umożliwia dokładną i powtarzalną kontrolę ciśnienia. Kontroler jest połączony z komputerem za pomocą uniwersalnej magistrali szeregowej (USB), co pozwala użytkownikowi na zaprogramowanie wartości i profilu przyłożonego ciśnienia przy użyciu dołączonego oprogramowania. Oprogramowanie obsługuje wiele kształtów fal kompresji, w tym kompresję stałą, sinusoidalną, trójkątną i okresową. Na tym schemacie ciśnienie jest ustawione na 120 mbar, a sprężone powietrze pod tym ciśnieniem jest dostarczane do zbiornika ciśnieniowego przez rurkę pneumatyczną. Zbiornik ciśnieniowy zawiera 50 mL wody dejonizowanej (DI) i służy do przekształcenia ciśnienia pneumatycznego w ciśnienie hydrauliczne. Po nadaniem ciśnienia, zbiornik tłoczy ciecz przez rurki doprowadzające do jednostki kontroli ciśnienia urządzenia kompresji mikrofluidalnej (szczegóły urządzenia znajdują się na Rycini 1), gdzie ciśnienie hydrauliczne jest wykorzystywane do wywarcia kompresji na sferoid nowotworowy. Należy zauważyć, że zastosowano ciśnienie cieczy, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w urządzeniu z PDMS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek uzupełniający 2: Krzywa kalibracyjna dla mikroprzepływowego urządzenia do kompresji przedstawiająca zależność między przesunięciem tłoka (, µm) a ciśnieniem przyłożonym do komory sterowania ciśnieniem (KPa). Pomiary eksperymentalne są reprezentowane przez kropki, natomiast linia ciągła odpowiada symulacji COMSOL. Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej (SEM) z ośmiu niezależnych pomiarów eksperymentalnych, lecz są zbyt małe, aby były widoczne. Rysunek ten został przedrukowany z pracy Suh i wsp.15 za zgodą Royal Society of Chemistry. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Wideo uzupełniające 1: Stos obrazów z-stack X-Y sferoidu MCF-7 znakowanego GFP przed kompresją. Sferoid został osadzony w kolagenie o stężeniu 1,5 mg/mL w mikrofluidycznym urządzeniu do kompresji, a następnie obrazowany w kanale fluorescencji GFP z krokiem z wynoszącym 1 µm. Następnie do poprawy kontrastu wykorzystano program ImageJ. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Wideo uzupełniające 2: Następnie do sferoidu MCF-7 znakowanego GFP, osadzonego w kolagenie o stężeniu 1,5 mg/mL, przyłożono odkształcenie ściskające wynoszące 50% (Δh/h = 50%). Po ściskaniu, w kanale fluorescencji GFP, wykonano obrazowanie typu z-stack w płaszczyźnie X–Y z krokiem 1 µm, a następnie przetworzono materiał w programie ImageJ w celu poprawy kontrastu. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Niniejsza metoda opisuje zastosowanie mikrofluidycznego urządzenia kompresyjnego do badania wpływu naprężeń ściskających na interakcje między guzem a układem odpornościowym. System ten umożliwia przykładanie kontrolowanej kompresji mechanicznej do sferoidów nowotworowych osadzonych w trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Podłoże szklane tworzące podstawę komory komórkowej (L1) pozwala na obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości, co sprawia, że platforma ta jest dobrze dostosowana do badań mających na celu ilościowe określenie ruchliwości, infiltracji i aktywności cytotoksycznej komórek odpornościowych. Co istotne, system ten zachowuje interakcje międzykomórkowe oraz interakcje komórka-macierz, umożliwiając jednocześnie precyzyjną kontrolę środowiska mechanicznego. W przeciwieństwie do tego, wiele istniejących podejść eksperymentalnych służących do badania naprężeń ściskających wymaga kompromisu między oddziaływaniami komórkowymi zapośredniczonymi przez ECM9,13 a obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości14.
W niniejszym badaniu jako system modelowy wykorzystano komórki NK oraz sferoidy guza piersi MCF-7. Urządzenie do kompresji mikrofluidycznej nie jest jednak ograniczone do tych typów komórek. Do tej pory platforma ta została z powodzeniem zastosowana w wielu modelach komórek piersi, w tym w sferoidach guza piersi MDA-MB-231 oraz sferoidach piersi MCF-10A15,17. Platformę można łatwo dostosować do badania interakcji nowotwór–układ odpornościowy w różnych innych modelach nowotworowych, w tym w sferoidach guzów mózgu i płuc. Podobnie, platforma jest kompatybilna z szerokim zakresem populacji komórek odpornościowych poza komórkami NK, co umożliwia badanie różnorodnych interakcji nowotwór–układ odpornościowy w warunkach kompresji mechanicznej. Ponadto urządzenie nie ogranicza się do badań opartych na sferoidach i może zostać dostosowane do eksperymentów na pojedynczych komórkach. Wspólnie cechy te sprawiają, że platforma ta jest wszechstronnym narzędziem do badania wpływu sił mechanicznych na regulację zachowania komórek w szerokim zakresie kontekstów biologicznych i chorobowych.
Kolejną zaletą tego systemu jest precyzyjna kontrola nad wartością i wzorem kompresji przyłożonej do próbek. W niniejszym badaniu przez cały czas trwania eksperymentu stosowano statyczną odkształcalność kompresyjną na poziomie 50%. Poziom odkształcenia można jednak łatwo zmodyfikować w zależności od celu eksperymentu. Ponadto, przy użyciu zewnętrznego systemu kontroli ciśnienia, do sferoidów można przyłożyć kompresję dynamiczną o różnych kształtach fal, w tym prostokątnych i sinusoidalnych. Kompresja prostokątna polega na naprzemiennych odstępach czasu kompresji i rozprężania17, natomiast kompresja sinusoidalna wiąże się z stopniowym zwiększaniem i zmniejszaniem kompresji w czasie15. Możliwości te, w połączeniu z obrazowaniem ilościowym i modelowaniem predykcyjnym, mogą być wykorzystane do badania wpływu kompresji dynamicznej na efektywność zabijania immunologicznego.
Zauważamy, że urządzenie kompresyjne to zostało pierwotnie opracowane w celu charakterystyki właściwości mechanicznych guzów.17Poprzez wprowadzenie in situ czujnik siły, warstwa żelu poliakrylamidowego (PAA) pod sferoidem nowotworowym, właściwości mechaniczne sferoidu, takie jak sztywność i lepkosprężystość, mogą zostać ilościowo scharakteryzowane15,17Modyfikacja ta rozszerza użyteczność platformy poza modelowanie naprężeń ściskających, umożliwiając bezpośredni pomiar właściwości mechanicznych guza.
Ogólnie rzecz biorąc, mikrofluidyczne urządzenie do kompresji znajduje szerokie zastosowanie – od pomiaru właściwości mechanicznych sferoidów po badanie interakcji nowotworowo-immunologicznych w środowisku poddawanym modulacji mechanicznej. Istnieje jednak kilka kluczowych kroków niezbędnych do prawidłowego działania urządzenia. Sferoidy nowotworowe powinny być umieszczone blisko centrum każdej studni, aby zapewnić jednorodną kompresję. Jednostka kontroli ciśnienia musi być odpowiednio wyrównana względem warstwy komory komórkowej (L1), aby zapewnić dokładny przekaz ciśnienia. Podczas umieszczania jednostki kontroli ciśnienia na warstwie L1 mogą pojawić się pęcherzyki powietrza, co może negatywnie wpłynąć na jakość obrazowania i wyniki eksperymentu. Aby zapobiec temu problemowi, należy zachować ostrożność, by nie wprowadzić pęcherzyków podczas nakładania mieszaniny kolagenu; do każdej studni należy dodać 8 µL mieszaniny kolagenu, aby lekko przepełnić komorę przed umieszczeniem jednostki kontroli ciśnienia. Pomaga to zapewnić pełny kontakt między warstwami i zmniejsza prawdopodobieństwo uwięzienia powietrza.
Podsumowując, urządzenie to umożliwia kontrolowane modelowanie naprężeń ściskających w obrębie fizjologicznie istotnej trójwymiarowej macierzy kolagenowej, która wspiera interakcje między guzem a układem odpornościowym. Platforma ta stanowi narzędzie do badania, w jaki sposób statyczne i dynamiczne siły mechaniczne regulują indukowaną immunologicznie śmierć komórek oraz zachowanie nowotworu w mikrośrodowisku guza. Obecnie identyfikujemy mechanizm molekularny leżący u podstaw mechanicznej modulacji procesu niszczenia komórek nowotworowych przez układ odpornościowy. Badania te mogą doprowadzić do odkrycia potencjalnych, nowych celów terapeutycznych dla leków.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Niniejsza praca jest finansowana z grantu National Cancer Institute (Grant R01CA221346), stypendium Lance R. Collins Fellowship z College of Engineering na Uniwersytecie Cornell dla FM oraz środków z Cornell Provost’s Fund for Research Resilience dla FM. Praca ta została w części wykonana w Cornell NanoScale Facility, członkowskim ośrodku National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), wspieranym przez National Science Foundation (Grant NNCI-2025233).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 N NaOH | Sigma-Aldrich | 79724 | 7 µL |
| 10× pożywka M199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 200 µL |
| 2-merkaptoetanolo | ThermoFisher | 313500100 | |
| Sprężarka powietrza | Elveflow | Kompresor Jun-Air Model 3 | |
| Zautomatyzowany stolik mikroskopowy X-Y | Zastosowana Instrumentacja Naukowa | MS-2000 | |
| kamera CCD | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Pł Tkliwa wołowa (FBS) | GeminiBio | S11150 | |
| Przewody do podawania płynów | Eleveflow | Zapasowa rolka rurek PTFE | 1/16 cala średnicy zewnętrznej |
| Źródło światła fluorescencyjnego | Excelitas Technologies | Jednostka PC serii X-Cite 120 | |
| Kwas foliowy | Sigma | F7876 | |
| Glutaraldehyd | Nauki o EM | 16019 | 0.10% |
| Oczyszczacz plazmowy Harrick | Harrick Plasma | PDC-001-HP | Wysokie ustawienie mocy (45 W) |
| surowica końska (HS) | ThermoFisher | 16050-122 | |
| Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny | Olympus | IX81 | obiektyw 20x (NA = 0,25), obsługiwany za pomocą oprogramowania Olympus CellSens |
| Maska | Artus | Arkusz podkładki aluminiowej o grubości 10 arkuszy | Grubość wynosi 0,0125" (0,75 mm) |
| Stabilna linia komórkowa MCF-7/GFP (puromycyna) | GenTarget Inc | SC050-G | |
| Metalowa rama | Wykonane na zamówienie | Wykonany na zamówienie | |
| Zbiornik mikrofluidyczny | Eleveflow | mikrofluidyczny zbiornik o pojemności 50 ml | |
| Mikroskop | Olympus | CKX41 | obiektyw 4x (NA = 0,1) |
| Mio-inozytol | Sigma | I7508 | |
| NK-92 MI | ATCC | CRL-2407 | |
| Penicylina/streptomycyna | Gibco | 15140122 | |
| Bufor fosforanowo-solny (PBS) | ThermoFisher | 10010072 | |
| Przewody pneumatyczne | Eleveflow | przezroczysta rurka doprowadzająca z polieteru PUR | 4" średnica zewnętrzna w mm |
| polietylenoimina (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 1% |
| Kontroler ciśnienia | Elveflow | OB1 NK4 | Obsługiwane przy użyciu oprogramowania Elveflow Smart Interface |
| Kolagen typu I z ogona szczura | Corning | 354249 | 31.3 µL z roztworu zapasu kolagenu o stężeniu 9,6 mg/ml |
| Śruby | Phillips | Śruba M2.5 z łbem panhead | 12 śrub |
| Inkubator obiektowy | Precyzyjny plastik | Wykonane na zamówienie | |
| Strzykawka | Becton Dickinson | 303134 | Połączone z męskim zamkiem Luer Integral o rozmiarze 3/32" OD Barb z Eleveflow |
| α-podłoże MEM | ThermoFisher | 12561056 |
Bibliografia
- Cao J-Z, Zhao W, Xia X-J. Cell-based cancer immunotherapy: milestones, mechanistic insights, and emerging therapeutic directions. Acta Pharmacol Sin. 2026:https://doi.org/10.1038/s41401-026-01811-y.
- Yang R, Yang Y, Liu R, et al. Advances in CAR-NK cell therapy for hematological malignancies. Front Immunol. 2024;15:1414264.
- Neelapu SS, et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2017;377(26):2531-44.
- Sheykhhasan M, Manoochehri H, Dama P. Use of CAR T-cell for acute lymphoblastic leukemia (ALL) treatment: a review study. Cancer Gene Ther. 2022;29(8-9):1080-96.
- Tan S, Li D, Zhu X. Cancer immunotherapy: Pros, cons and beyond. Biomed Pharmacother. 2020;124:109821.
- Chen T, Wang M, Chen Y, Liu Y. Current challenges and therapeutic advances of CAR-T cell therapy for solid tumors. Cancer Cell Int. 2024;24(1):133.
- Peng L, et al. CAR-T and CAR-NK as cellular cancer immunotherapy for solid tumors. Cell Mol Immunol. 2024;21(10):1089-108.
- Basu R, et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 2016;165(1):100-10.
- Dolega ME, et al. Cell-like pressure sensors reveal increase of mechanical stress towards the core of multicellular spheroids under compression. Nat Commun. 2017;8(1):14056.
- Linke JA, Munn LL, Jain RK. Compressive stresses in cancer: characterization and implications for tumour progression and treatment. Nat Rev Cancer. 2024;24(11):768-91.
- Luo M, Cai G, Ho KKY, et al. Compression enhances invasive phenotype and matrix degradation of breast cancer cells via Piezo1 activation. BMC Mol Cell Biol. 2022;23(1):1.
- Ren T, Sun L, Zheng Y, et al. Mechanical forces and immune cells in the tumor microenvironment: from regulation mechanisms to therapeutic strategies. Int J Surg. 2025;111(8):5420-34.
- Helmlinger G, Netti PA, Lichtenbeld HC, Melder RJ, Jain RK. Solid stress inhibits the growth of multicellular tumor spheroids. Nat Biotechnol. 1997;15(8):778-83.
- Pandey M, et al. Mechanical compression regulates tumor spheroid invasion into a 3D collagen matrix. Phys Biol. 2024;21(3):036003.
- Suh YJ, et al. A microfluidic rheometer for tumor mechanics and invasion studies. Lab Chip. 2025;25(22):6018-32.
- Song W, et al. Dynamic self-organization of microwell-aggregated cellular mixtures. Soft Matter. 2016;12(26):5739-46.
- Pandey M, et al. Viscoelastic properties of tumor spheroids revealed by a microfluidic compression device and a modified power law model. Soft Matter. 2026;22(7):1618-29.
- Steff A-M, Fortin M, Arguin C, Hugo P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001;45(4):237-43.
Przedruki i uprawnienia
