Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena β-sitosterolu w modelach zapalnych i profibrotycznych komórek kłęboszkowych istotnych dla przewlekłego kłębuszkowego zapalenia nerek w oparciu o analizę sieciową

107 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/73000

⸱

28 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie integruje farmakologię sieciową, zwalidowane dokowanie molekularne oraz eksperymenty in vitro w celu oceny relacji między potencjalnymi związkami a celami w obrębie składników Cordyceps sinensis a procesów związanych z przewlekłym kłębowkowym zapaleniem nerek. Do walidacji na poziomie związku wybrano β-sitosterol, który wykazał zdolność do osłabiania aktywacji zapalnej i profibrotycznej w modelach komórek mezanialnych.

Streszczenie

Przewlekłe zapalenie kłębuszków nerkowych (CGN) charakteryzuje się uporczywym uszkodzeniem zapalnym i postępującym przebudowaniem włóknistym, jednak relacje związek-cel leżące u podstaw interwencji opartych na produktach naturalnych pozostają niepełnie zdefiniowane. W niniejszym badaniu zintegrowano farmakologię sieciową, zwalidowane dokowanie molekularne oraz eksperymenty in vitro w celu oceny potencjalnych składników Cordyceps sinensis (C. sinensis) w procesach patologicznych związanych z CGN. Przesiewowo wyłoniono potencjalne składniki C. sinensis, a cele powiązane ze związkami, pochodzące z Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, zestawiono z genami powiązanymi z CGN. Analizy wzbogacenia funkcjonalnego i oddziaływań białko-białko wykorzystano do priorytetyzacji procesów biologicznych i kluczowych celów (hub targets). PTGS2 zidentyfikowano jako kluczowy wspólny cel. Dokowanie molekularne przeprowadzono przy użyciu struktury COX-2 związanej z celekoksybem. Ponowne dokowanie kokrystalizowanego ligandu celekoksybu odtworzyło pozę krystalograficzną z wartością RMSD 0,876 Å, co potwierdziło protokół dokowania. β-sitosterol oraz octan linoleylu wykazały przewidywaną kompatybilność z regionem dokowania COX-2, z powinowactwami wiązania wynoszącymi odpowiednio −7,2 i −7,5 kcal/mol. β-sitosterol wybrano do walidacji na poziomie związku w szczurzych komórkach mezan gialnych kłębuszków nerkowych HBZY-1. W stężeniach 0,5–10 µM β-sitosterol nie spowodował znaczącego zmniejszenia żywotności komórek. W komórkach stymulowanych lipopolisacharydem (LPS) β-sitosterol obniżył ekspresję Tnf, Il6 i Ptgs2, zmniejszył produkcję prostaglandyny E2 (PGE2) oraz obniżył zawartość białka cyklooksygenazy-2 (COX-2). W komórkach traktowanych czynnikiem wzrostu TGF-β1 β-sitosterol obniżył ekspresję Col1a1 i Acta2 oraz zmniejszył zawartość białka alfa-aktyny mięśni gładkich (α-SMA). Wyniki te dostarczają dowodów pozwalających sformułować hipotezę, że β-sitosterol moduluje aktywację zapalną i profibrotyczną w modelach komórek mezangialnych, jednak nie potwierdzają one bezpośredniego hamowania enzymatycznego COX-2 ani skuteczności terapeutycznej w CGN.

Wprowadzenie

Przewlekłe kłębuszkowe zapalenie nerek (CGN) obejmuje heterogenną grupę schorzeń kłębuszków, które mogą prowadzić do przewlekłej choroby nerek oraz schyłkowej niewydolności nerek1. Charakteryzuje się ono uporczywym uszkodzeniem kłębuszków, aktywacją stanu zapalnego oraz postępującą przebudową włóknistą2,3. Chociaż kortykosteroidy i leki immunosupresyjne są stosowane u wybranych pacjentów, długoterminowa kontrola choroby w wielu przypadkach pozostaje trudna, a działania niepożądane związane z leczeniem są częste1,4,5. Progresja CGN obejmuje oddziałujące na siebie procesy patologiczne, w tym aktywację odpornościową, dysfunkcję śródbłonka, stres oksydacyjny oraz gromadzenie macierzy zewnątrzkomórkowej3,6,7. W związku z tym zidentyfikowanie węzłów molekularnych łączących odpowiedzi zapalne i profibrotyczne może pomóc w sformułowaniu sprawdzalnych hipotez dotyczących strategii interwencyjnych istotnych dla przebiegu choroby.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) jest stosowany w klinicznych i eksperymentalnych kontekstach związanych z nerkami i doniesiono, że wykazuje działanie przeciwzapalne, antyapoptotyczne i cytoprotekcyjne w kilku modelach chorób8,9,10. Jednakże molekularne podstawy, dzięki którym potencjalne składniki tego grzyba mogą oddziaływać na cele istotne dla kłębuszkowego zapalenia nerek, pozostają niewystarczająco określone11. Biorąc pod uwagę wieloskładnikową naturę C. sinensis oraz heterogeniczność mechanistyczną CGN, farmakologia sieciowa dostarcza użytecznych ram dla priorytetyzacji relacji między potencjalnymi związkami, celami a szlakami sygnałowymi12,13.

W niniejszym badaniu zintegrowano przesiewowe badanie związków, identyfikację celów terapeutycznych, analizę punktów wspólnych między chorobą a genami, analizę wzbogacenia funkcjonalnego, analizę sieci oddziaływań białko-białko, dokowanie molekularne oraz walidację in vitro, aby zbadać potencjalne zależności molekularne pomiędzy kandydackimi składnikami C. sinensis a procesami patologicznymi związanymi z CGN. Syntaza prostaglandynowo-endoperoksydowa 2 (PTGS2) została uznana za priorytetowy cel centralny (hub target) w sieci związek-choroba i została poddana ocenie poprzez dokowanie molekularne z wykorzystaniem struktury cyklooksygenazy-2 (COX-2) z wiązanym celekoksybem oraz walidacją poprzez redokowanie. Na podstawie wyników analizy sieciowej, dokowania oraz wcześniejszych dowodów na działanie przeciwzapalne i przeciwzwłóknieniowe, β-sitosterol wybrano jako reprezentatywny związek kandydacki do dalszej walidacji14,15,16. Do oceny aktywacji zapalnej oraz odpowiedzi związanej z COX-2/prostaglandyną E2 (PGE2) wykorzystano komórki mezaangialne stymulowane lipopolisacharydem (LPS), natomiast w celu oceny ekspresji markerów profibrotycznych zastosowano model indukowany czynnikiem wzrostu TGF-β1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Analizy farmakologii sieciowej i bioinformatyczne oparto na publicznie dostępnych bazach danych i nie angażowały one uczestników będących ludźmi ani zwierząt. Eksperymenty in vitro przeprowadzono z wykorzystaniem uznanej linii komórkowej i nie wymagały one zgody komisji etycznej zgodnie z wymogami instytucjonalnymi.

Przesiewowe badanie potencjalnych składników i identyfikacja celu

Kandydackie składniki oraz ich odpowiednie cele pobrano z Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) 13 lipca 2025 roku, używając terminu wyszukiwania „dongchongxiacao”. Zachowano związki z przewidywaną biodostępnością doustną wynoszącą co najmniej 30% oraz lekopodobnością na poziomie co najmniej 0,18. Siedem kandydackich składników spełniło oba kryteria przesiewowe. Masę cząsteczkową, biodostępność doustną, lekopodobność oraz inne dostępne deskryptory farmakokinetyczne odnotowano z TCMSP w celu porównania opisowego.

Informacje o powiązaniach związek-cel dla zachowanych składników pobrano bezpośrednio z bazy TCMSP. Podczas tworzenia nieredundantnego zbioru celów ręcznie usunięto powtarzające się wpisy, zachowując jednocześnie oryginalne relacje związek-cel do późniejszej konstrukcji sieci. Ponieważ baza TCMSP dostarczała pełne nazwy celów zamiast standaryzowanych symboli genów, każdy cel przeszukano w bazie UniProt (dostęp z dnia 14 lipca 2025 r.). Wybrano odpowiadający im wpis dla człowieka, a nazwę celu przekształcono na oficjalny symbol genu. Standaryzowany zbiór danych związek-cel wykorzystano do analizy przecięcia choroba-cel oraz analizy sieci związek-cel.

Zbiór genów związanych z kłębuszkowym zapaleniem nerek i analiza punktów wspólnych dla celów terapeutycznych

Geny związane z chorobą pobrano z baz GeneCards, DisGeNET, PharmGKB oraz Therapeutic Target Database, stosując termin wyszukiwania „glomerulonephritis” w dniu 14 lipca 2025 r. W przypadku GeneCards zachowano wpisy z wynikiem istotności wyższym niż mediana wynosząca 10. Kwalifikujące się wpisy z pozostałych baz danych zostały uwzględnione zgodnie z ich opracowanymi adnotacjami cel-choroba. Nazwy genów ustandaryzowano do oficjalnych symboli genów ludzkich, a duplikaty usunięto. Procedura ta pozwoliła uzyskać 1 134 unikalnych genów związanych z kłębuszkowym zapaleniem nerek. Ponieważ w wyszukiwaniu zastosowano szeroki termin „glomerulonephritis”, otrzymany zestaw danych uznano za istotny dla procesów molekularnych związanych z przewlekłym kłębuszkowym zapaleniem nerek, a nie za specyficzny dla pojedynczego podtypu histopatologicznego.

Cele powiązane ze związkami pochodzącymi z TCMSP zestawiono z zestawem genów powiązanych z chorobą przy użyciu programu R. Zidentyfikowano dwadzieścia trzy wspólne cele. Diagramy Venna wygenerowano za pomocą pakietu R venn, a sieć wspólnych celów związków zbudowano i zwizualizowano przy użyciu programu Cytoscape. Relacje między kandydackimi składnikami a wspólnymi celami podsumowano w Tabeli 1.

Analizy wzbogacenia funkcjonalnego oraz oddziaływań białko-białko

Analizy wzbogacenia Gene Ontology (GO) oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) przeprowadzono w środowisku R przy użyciu pakietów clusterProfiler i org.Hs.eg.db. Terminy Gene Ontology analizowano w kategoriach procesów biologicznych, komponentów komórkowych i funkcji molekularnych. Wartości P skorygowano pod kątem wielokrotnych testów metodą Benjamini-Hochberga, a zachowano terminy lub szlaki o skorygowanych wartościach P poniżej 0,05. Wzbogacone terminy i szlaki przedstawiono za pomocą niezależnie wygenerowanych wykresów słupkowych oraz wykresów kropkowych.

Lista 23 wspólnych celów została wprowadzona do bazy STRING, z wyborem Homo sapiens jako organizmu oraz minimalnym wynikiem interakcji powyżej 0,4. Uzyskana sieć oddziaływań białko-białko została zaimportowana do programu Cytoscape. Topologię sieci oceniono za pomocą narzędzia CytoNCA w oparciu o stopień, centralność pośrednictwa, centralność bliskości, centralność wektora własnego, lokalną średnią łączność oraz centralność sieci. Cele pełniące rolę węzłów centralnych (hub targets) zdefiniowano jako węzły, dla których wartości stopnia, centralności pośrednictwa, centralności bliskości, centralności wektora własnego, lokalnej średniej łączności oraz centralności sieci były wszystkie wyższe niż odpowiadające im wartości mediany sieci. Analiza ta pozwoliła na wyłonienie dziewięciu kluczowych celów (hub targets) do dalszej interpretacji.

Dokowanie molekularne i walidacja poprzez redokowanie

Dokowanie molekularne przeprowadzono z wykorzystaniem struktury cyklooksygenazy-2 związanej z celekoksybem (PDB ID 3LN1). Łańcuch A oraz powiązana z nim grupa hemu zostały zachowane jako receptor, natomiast podczas przygotowania receptora usunięto krystalograficzne cząsteczki wody oraz współkrystalizowany ligand celekoksyb. Rodzima konformacja celekoksybu została osobno wyekstrahowana z łańcucha A w celu walidacji poprzez redokowanie. Za pomocą AutoDockTools dodano polarne atomy wodoru oraz ładunki Gasteigera, a receptor zapisano w formacie PDBQT. PDB ID 3LN1 to struktura mysiej COX-2 związanej z celekoksybem o rozdzielczości 2,40 Å. Struktury β-sitosterolu i octanu linoleylu pobrano z bazy PubChem i przygotowano za pomocą programu Open Babel. Dodano atomy wodoru i cząstkowe ładunki Gasteigera, przypisano wiązania rotowalne, a każdy ligand przekonwertowano do formatu PDBQT. Celekoksyb, β-sitosterol oraz octan linoleylu zadokowano przy użyciu AutoDock Vina z zastosowaniem tego samego receptora i parametrów przeszukiwania.

Pole dokowania (docking box) zostało wycentrowane na natywnym regionie wiązania celekoxybu przy użyciu następujących współrzędnych: center_x = 30.9886 center_y = -22.2836 center_z = -16.5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. Wartość dokładności (exhaustiveness) ustawiono na 16, liczbę trybów wyjściowych na 10, a zakres energii na 3 kcal/mol. Do wizualizacji wybrano najlepiej ocenioną pozę na podstawie najniższej przewidywanej energii wiązania. W celu walidacji protokołu przeprowadzono redokowanie natywnego celekoxybu w tych samych warunkach, a następnie za pomocą programu PyMOL obliczono odchylenie średniokwadratowe (RMSD) atomów ciężkich pomiędzy pozą krystalograficzną a pozą po redokowaniu. Odchylenie średniokwadratowe poniżej 2 Å uznano za dopuszczalne odtworzenie pozy referencyjnej. W programie PyMOL zidentyfikowano reszty znajdujące się w odległości 4 Å od każdego dokowanego ligandu. Wyniki dokowania i pozy interpretowano jako szacunki kompatybilności strukturalnej, a nie jako bezpośredni dowód wiązania z celem lub inhibicji enzymatycznej.

Hodowla komórkowa i przygotowanie związków

Komórki kłębuszkowe mezańgium szczura HBZY-1 hodowano w wysokoglukozowej pożywce Dulbecco’s modified Eagle uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C w warunkach uwilgotnienia z 5% CO₂. Do wszystkich eksperymentów wykorzystano komórki z przejść 2–7, a przed użyciem zweryfikowano brak obecności mykoplazm. Jako związki chemicznie zdefiniowane zastosowano β-sitosterol i celekoksyb. β-sitosterol rozpuszczono w etanolu absolutnym w celu przygotowania roztworu stokowego o stężeniu 10 mM (około 4,15 mg/mL). W razie potrzeby przeprowadzono krótką sonikację i podgrzano roztwór do 50–60 °C, aby uzyskać klarowny wizualnie roztwór. Celekoksyb rozpuszczono w dimetylosulfoksydzie w celu przygotowania roztworu stokowego o stężeniu 10 mM (około 3,81 mg/mL). Roztwory stokowe podzielono na alikwoty i przechowywano w temperaturze −20 °C. Przed zastosowaniem roztwory stokowe rozcieńczano bezpośrednio w uprzednio ogrzanej pożywce hodowlanej i niezwłocznie mieszano.

Stężenia rozpuszczalników zostały ujednolicone w każdym z eksperymentów. W teście żywotności komórek końcowe stężenie etanolu dostosowano do 0,2% v/v we wszystkich grupach, ponieważ najwyższe przetestowane stężenie β-sitosterolu wynosiło 20 µM. W eksperymencie dotyczącym stanu zapalnego indukowanego przez LPS końcowe stężenia etanolu i dimetylosulfotlenku dostosowano odpowiednio do 0,1% i 0,01% v/v we wszystkich grupach. W eksperymencie dotyczącym zmian profibrotycznych indukowanych przez TGF-β1 końcowe stężenie etanolu dostosowano do 0,1% v/v we wszystkich grupach. Do grup kontrolnej, LPS i TGF-β1 dodano równoważne objętości odpowiednich rozpuszczalników.

Test żywotności komórek

Komórki wysiano na płytki 96-dołkowe z gęstością 5 × 103 komórek na dołek w 100 µL pożywki kompletnej i pozostawiono na 24 h w celu adhezji. Aby ocenić zakres stężeń β-sitosterolu, komórki inkubowano z β-sitosterolem w stężeniach 0,5, 1, 5, 10 lub 20 µM przez 24 h. W teście żywotności komórek w związku z LPS, komórki poddano wstępnemu traktowaniu β-sitosterolem w stężeniach 1, 5 lub 10 µM przez 2 h, a następnie eksponowano na 1 µg/mL lipopolisacharydu przez kolejne 24 h.

Grupy badawcze obejmowały grupę kontrolną, β-sitosterol w stężeniu 0.5 µM, β-sitosterol w stężeniu 1 µM, β-sitosterol w stężeniu 5 µM, β-sitosterol w stężeniu 10 µM, β-sitosterol w stężeniu 20 µM, LPS, LPS z dodatkiem β-sitosterolu w stężeniu 1 µM, LPS z dodatkiem β-sitosterolu w stężeniu 5 µM oraz LPS z dodatkiem β-sitosterolu w stężeniu 10 µM. Odczynnik Cell Counting Kit-8 dodawano w ilości 10 µL na studzienkę, a następnie płytki inkubowano przez 2 h. Następnie zmierzono absorbancję przy 450 nm. Żywotność komórek określono po odjęciu wartości tła dla studzienek bez komórek i wyrażono ją względem grupy kontrolnej. Każdy wariant obejmował sześć studzienek technicznych w każdym z sześciu niezależnych eksperymentów biologicznych. Wartości ze studzienek technicznych z każdego eksperymentu uśredniono, aby uzyskać jedną wartość powtórzenia biologicznego do analizy statystycznej.

Aktywacja zapalna indukowana LPS

W eksperymentach nad aktywacją zapalną komórki HBZY-1 wysiano na płytki 6-dołkowe w gęstości 2 × 105 komórek na dołek i poddano działaniu substancji po osiągnięciu konfluencji na poziomie około 70%–80%. Komórki utrzymywano w pożywce uzupełnionej o 1% płodowej surowicy bydlęcej przez 12 h przed traktowaniem. β-Sitosterol lub celekoksyb podano 2 h przed stymulacją LPS. Następnie komórki eksponowano na 1 µg/mL LPS przez 24 h.

Grupy eksperymentalne obejmowały grupę kontrolną, β-sitosterol w stężeniu 10 µM, LPS, LPS plus β-sitosterol w stężeniu 1 µM, LPS plus β-sitosterol w stężeniu 5 µM, LPS plus β-sitosterol w stężeniu 10 µM oraz LPS plus celekoksyb w stężeniu 1 µM. Celekoksyb zastosowano jako funkcjonalną kontrolę pozytywną dla hamowania produkcji prostaglandyn zależnej od COX-2. Po zakończeniu inkubacji zebrano nadnadkładki hodowlane w celu oznaczenia PGE2. Komórki zebrano osobno do analizy ilościowej PCR w czasie rzeczywistym dla genów Tnf, Il6 oraz Ptgs2 a także do analizy COX-2 metodą western blot.

Profibrotyczna aktywacja indukowana przez TGF-β1

Osobny model indukowany TGF-β1 został wykorzystany do oceny aktywacji profibrotycznej. Komórki HBZY-1 wysiano do płytek 6-dołkowych w gęstości 2 × 105 komórek na dołek i utrzymywano w pożywce uzupełnionej o 1% płodowej surowicy bydlęcej przez 12 h przed traktowaniem. Komórki poddano wstępnej inkubacji z β-sitosterolem przez 2 h, a następnie stymulowano rekombinowanym TGF-β1 w stężeniu 10 ng/mL przez 48 h.

Grupy badawcze obejmowały grupę kontrolną, β-sitosterol (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-sitosterol (5 µM) oraz TGF-β1 + β-sitosterol (10 µM). Po zakończeniu okresu traktowania komórki zebrano do ilościowej analizy qPCR genów Col1a1 i Acta2 oraz do analizy western blot w celu oznaczenia poziomu alfa-aktyny mięśni gładkich (α-SMA).

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR)

Całkowity RNA wyizolowano z poddanych działaniu preparatów komórek, stosując odczynnik do ekstrakcji RNA oparty na fenolu i guanidynium zgodnie z protokołem producenta. Stężenie i czystość RNA określono za pomocą spektrofotometru. Do transkrypcji odwrotnej wykorzystano wyłącznie próbki o stosunku A260/A280 w zakresie 1,8–2,0. Dla każdej próbki 1 µg całkowitego RNA poddano transkrypcji odwrotnej do komplementarnego DNA w końcowej objętości reakcji 20 µL. Otrzymane komplementarne DNA rozcieńczono pięciokrotnie wodą wolną od nukleaz przed przeprowadzeniem ilościowej PCR. Ilościową PCR przeprowadzono w całkowitej objętości 20 µL zawierającej 10 µL 2× SYBR Green master mix, po 0,4 µL starterów prawego i lewego o stężeniu 10 µM, 2 µL rozcieńczonego komplementarnego DNA oraz 7,2 µL wody wolnej od nukleaz. Warunki amplifikacji obejmowały początkowy etap denaturacji w 95 °C przez 30 s, po którym nastąpiło 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 5 s oraz przyłączania i elongacji w 60 °C przez 30 s. Następnie przeprowadzono analizę krzywej topnienia w zakresie od 65 °C do 95 °C w celu weryfikacji swoistości amplifikacji.

Zmierzono ekspresję genów Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 oraz Gapdh. Gen Gapdh służył jako wewnętrzny gen referencyjny. Względną ekspresję genów określono metodą 2−ΔΔCt, przyjmując grupę kontrolną jako kalibrator. Sekwencje starterów podano w Tabeli uzupełniającej 1. Każda próbka była analizowana w trzech powtórzeniach technicznych, a przeprowadzono sześć niezależnych eksperymentów biologicznych. Wartości uzyskane z powtórzeń technicznych uśredniono przed analizą statystyczną.

Pomiar PGE2 za pomocą enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA)

Nadnadkliny hodowlane zebrano po 24 h stymulacji LPS i odwirowano przy 1,000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia szczątków komórkowych. Stężenia PGE2 określono przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta.

Standardy i próbki naniesiono na płytkę testową w dwóch powtórzeniach. Po zakończeniu etapów wiązania przeciwciał i rozwoju barwy zmierzono absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Stężenia PGE2 określono na podstawie czteroparametrycznej logistycznej krzywej standardowej i wyrażono w pg/mL. Przeanalizowano supernatanty z sześciu niezależnych eksperymentów komórkowych. Pomiary powtórzone dla każdej próbki biologicznej uśredniono przed przeprowadzeniem analizy statystycznej.

Western blotting

Poddane działaniu komórki poddano lizie w buforze do analizy radioimmunoprecypitacyjnej uzupełnionym o mieszaninę inhibitorów proteaz. Lizaty inkubowano na lodzie przez 30 min, a następnie wirowano przy 12,000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Stężenia białek w supernatantach określono za pomocą testu białkowego z kwasem bicinchononowym. Równe ilości białka (30 µg na ścieżkę) zmieszano z buforem do nakładania i denaturowano w temperaturze 95 °C przez 5 min. Białka z eksperymentów z LPS rozdzielano na 10% żelach poliakrylamidowych z dodecylosiarczanem sodu, natomiast białka z eksperymentów z TGF-β1 rozdzielano na żelach 12%. Rozdzielone białka przeniesiono następnie na membrany z polifluororku winylidenu.

Membrany blokowano 5% odtłuszczonym mlekiem w soli buforowanej Tris z dodatkiem 0,1% Tween 20 przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) i GAPDH (1:5000). COX-2 analizowano w próbkach z eksperymentu z LPS, natomiast α-SMA analizowano w próbkach z eksperymentu z TGF-β1. Po przemyciu membrany inkubowano z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (1:5000) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Prążki białkowe wizualizowano przy użyciu substratu do wzmocnionej chemiluminescencji i rejestrowano za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. Czasy ekspozycji wynosiły około 10 s dla COX-2, 10 s dla α-SMA i 2 s dla GAPDH.

Intensywność prążków została zmierzona przy użyciu programu ImageJ. Sygnały COX-2 i α-SMA zostały znormalizowane względem odpowiadającego im sygnału GAPDH. Western blotting przeprowadzono na próbkach białek uzyskanych z sześciu niezależnych eksperymentów z hodowlami komórkowymi i ich traktowaniem.

Analiza statystyczna

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Dla każdej analizy ilościowej wykonano sześć niezależnych eksperymentów z hodowlami komórkowymi i traktowaniem, przy czym każdy niezależny eksperyment stanowił jedną powtórkę biologiczną. Pomiary z powtórek technicznych uzyskane w ramach tego samego eksperymentu biologicznego uśredniono przed analizą statystyczną i nie uznano ich za niezależne obserwacje.

W przypadku testu żywotności komórek każdy eksperyment biologiczny obejmował sześć dołków technicznych na każdy warunek. Reakcje ilościowego PCR przeprowadzono w trzech powtórzeniach technicznych dla każdej próbki biologicznej, a pomiary PGE2 wykonano w dubletach. Ilościowa analiza Western blot opierała się na sześciu niezależnie przygotowanych próbkach białek. Zatem każdy słupek ilościowy zawiera wartości z sześciu indywidualnych powtórzeń biologicznych.

Różnice między wieloma grupami analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya. Dwustronną wartość P < 0,05 uznano za statystycznie istotną. Wartości dla poszczególnych powtórzeń biologicznych przedstawiono wraz ze średnią i odchyleniem standardowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przesiewanie potencjalnych składników, odzyskiwanie celów i wyznaczanie wspólnych celów

Przebieg procesu identyfikacji potencjalnych wspólnych celów dla związku i choroby przedstawiono w Rysunek 1ASiedem związków kandydackich z C. sinensis spełniały zdefiniowane kryteria przesiewowe OB ≥30% oraz DL ≥0,18, w tym kwas arachidonowy, octan linoleilu, β-sitosterol, peroksyergosterol, cerewisterol, palmitynian cholesterylu oraz CLR (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu zintegrowano farmakologię sieciową, dokowanie molekularne zweryfikowane za pomocą ligandu referencyjnego oraz eksperymenty na poziomie związków, aby zbadać hipotezę związaną z PTGS2, sformułowaną na podstawie kandydackich składników C. sinensis. Siedem składników spełniło zdefiniowane kryteria przesiewowe TCMSP, a 23 cele pokrywało się ze zbiorem genów związanych z kłębuszkowym zapaleniem nerek. Analiza oddziaływań białkowych pozwoliła wyłonić dziewięć kluczowych celów, spośród któr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów. Narzędzia oparte na sztucznej inteligencji (ChatGPT, OpenAI) zostały wykorzystane w celu pomocy w redakcji językowej oraz wstępnego projektowania schematów. Generatywna sztuczna inteligencja została użyta do przygotowania wstępnych projektów graficznych do Ryciny 1A i 7, które zostały następnie zweryfikowane i poprawione przez autorów w celu zapewnienia spójności z opisanymi metodami i wynikami. Wszystkie produkty opracowane przy wsparciu AI zostały krytycznie ocenione i zatwierdzone przez autorów. Autorzy zweryfikowali ostateczną treść rycin i wzięli pełną odpowiedzialność za rzetelność oraz dokładność manuskryptu.

Podziękowania

Niniejsze badanie było wspierane przez Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Nephropathy Characteristic Specialty (ZYTSZK2-3) oraz Study on TCM Intervention Strategy of Chronic Kidney Disease from the Perspective of Chronic Disease Management (202240169).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Etanol absolutnySigma-Aldrich/MerckE7023Etanol klasy biologii molekularnej, 200 proof, niedenaturowany; rozpuszczalnik dla roztworu zapasowego β-sitosterolu.
AutoDock VinaScripps ResearchVersion 1.1.2Symulacja dokowania molekularnego
Komora z laminaremThermo Fisher Scientific1300 Series A2Sterylne operacje na kulturach komórkowych
CelekoksybMedChemExpressHY-14398Selektywny inhibitor COX-2 stosowany jako kontrola pozytywna; roztwór zapasowy 10 mM w DMSO. 
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04Kolorymetryczny test WST-8 do oceny żywotności komórek; absorbancja mierzona przy 450 nm.
System obrazowania chemiluminescencyjnegoBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPAkwizycja obrazów Western blot
Pakiet R clusterProfilerBioconductorVersion 4.10.0Analiza wzbogacenia GO i KEGG
Inkubator do kultur komórkowych CO2Thermo Fisher ScientificForma Series II 3111Inkubacja kultur komórkowych w 37 °C i 5% CO2
Królicze przeciwciało monoklonalne COX-2 (D5H5)Cell Signaling Technology12282Zwalidowane do Western blot dla COX-2 ludzkiej, mysiej i szczurej; stosowane w rozcieńczeniu 1:1 000.
Wtyczka CytoNCACytoscape App StoreVersion 2.1.6Topologiczna analiza celów typu hub
Oprogramowanie CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.8.0Wizualizacja i analiza sieci
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich/MerckD2650BioReagent filtrowany sterylnie, ≥99,7%; rozpuszczalnik dla roztworu zapasowego celekoksybu.
Baza danych DisGeNETIntegrative Biomedical Informatics GroupNot applicableWyszukiwanie genów związanych z kłębuszkowym zapaleniem nerek
Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTPodłoże podstawowe do hodowli komórek HBZY-1
Substrat do wzmocnionej chemiluminescencjiBeyotime BiotechnologyP0018SWizualizacja prążków w Western blot
Płodowa surowica bydlęcaGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141CSurowica jako dodatek do kultur komórkowych
Królicze przeciwciało monoklonalne GAPDH (D16H11)Cell Signaling Technology5174Kontrola załadunku w Western blot; reaktywne z GAPDH ludzkim, mysim i szczurzym; stosowane w rozcieńczeniu 1:5 000 po optymalizacji wewnętrznej.
Baza danych GeneCardsWeizmann Institute of ScienceNAWyszukiwanie genów związanych z kłębuszkowym zapaleniem nerek
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0.0.121Analiza statystyczna danych eksperymentalnych in vitro
Kozie przeciwciało anty-rabbit IgG sprzężone z HRPProteintech GroupSA00001-2Przeciwciało wtórne dla króliczych przeciwciał pierwotnych
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.54Analiza densytometryczna Western blot
Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowyOlympusCKX53Obserwacja morfologii komórek
Pakiet R org.Hs.eg.dbBioconductorVersion 3.18.0Adnotacje genów ludzkich do analizy wzbogacenia
Roztwór penicyliny i streptomycynyGibco/Thermo Fisher Scientific15140122Dodatek antybiotykowy do kultur komórkowych
Zestaw do oznaczania parametrów PGE2R&D Systems, a Bio-Techne brandKGE004BWielogatunkowy konkurencyjny test ELISA do nadnadpływów z kultur komórkowych; zakres pomiarowy 39–2 500 pg/mL; detekcja kolorymetryczna przy 450 nm.
Baza danych PharmGKBPharmacogenomics KnowledgebaseNAWyszukiwanie celów związanych z chorobą
Baza danych PubChemNational Center for Biotechnology InformationNAWyszukiwanie struktur ligandów
Membrana PVDFMillipore/MerckIPVH00010Membrana do transferu białek w Western blot
System grafiki molekularnej PyMOLSchrödinger, LLCVersion 2.6.2Wizualizacja poz dokowania
Oprogramowanie RR Foundation for Statistical ComputingVersion 4.3.2Analiza przecięcia celów i analiza wzbogacenia
Linia komórek mezanialnych kłębuszków szczura (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117In vitro model walidacyjny komórek mezanialnych
RCSB Protein Data BankResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsPDB ID: 3LN1Wyszukiwanie struktury krystalicznej PTGS2/COX2
Rekombinowane ludzkie białko TGF-β1PeproTech, a Thermo Fisher Scientific brand100-21-10UGRekombinowane ludzkie TGF-β1 pochodzące z HEK293; stymulacja profibrotyczna w stężeniu 10 ng/mL. 
System elektroforezy SDS-PAGEBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraRozdział białek metodą SDS-PAGE
Baza danych STRINGELIXIR/STRING ConsortiumVersion 12.0Konstrukcja sieci oddziaływań białko-białko
Baza danych TCMSPTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNAPrzesiewanie związków kandydackich z Cordyceps sinensis
Therapeutic Target DatabaseInnovative Drug Research and Bioinformatics GroupNAWyszukiwanie celów terapeutycznych
Przeciwciało pierwotne α-SMAProteintech Group14395-1-APDetekcja ekspresji białka α-SMA
β-Sitosterol (czystość >98%)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; określony związek stosowany do traktowania komórek; roztwór zapasowy 10 mM w etanolu absolutnym. 

Bibliografia

  1. Kidney Disease: Improving Global Outcomes Glomerular Diseases Work G. KDIGO 2021 Clinical Practice Guideline for the Management of Glomerular Diseases. Kidney Int. 2021;100(4S):S1–S276.
  2. Roccatello D. et al. From inflammation to renal fibrosis: A one-way road in autoimmunity? Autoimmun Rev. 2024;23(4):103466.
  3. Reiss AB. et al. Fibrosis in Chronic Kidney Disease: Pathophysiology and Therapeutic Targets. J Clin Med. 2024;13(7).
  4. Kant S, Kronbichler A, Geetha D. Principles of Immunosuppression in the Management of Kidney Disease: Core Curriculum 2022. Am J Kidney Dis. 2022;80(3):393–405.
  5. El Karoui K, Fervenza FC, De Vriese AS. Treatment of IgA Nephropathy: A Rapidly Evolving Field. J Am Soc Nephrol. 2024;35(1):103–16.
  6. Stenvinkel P. et al. Chronic Inflammation in Chronic Kidney Disease Progression: Role of Nrf2. Kidney Int Rep. 2021;6(7):1775–87.
  7. Tanaka S, Portilla D, Okusa MD. Role of perivascular cells in kidney homeostasis, inflammation, repair and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2023;19(11):721–32.
  8. Liu W. et al. Mechanism of Cordyceps sinensis and its Extracts in the Treatment of Diabetic Kidney Disease: A Review. Front Pharmacol. 2022;13:881835.
  9. Yan G. et al. The effects of Ophiocordyceps sinensis combined with ACEI/ARB on diabetic kidney disease: A systematic review and meta-analysis. Phytomedicine. 2023;108:154531.
  10. Li S, Pang W, Wang Y, Zhang Y. Cordyceps sinensis extract protects against acute kidney injury by inhibiting perforin expression in NK cells via the STING/IRF3 pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(7):5887–904.
  11. Zhang Y, Li K, Zhang C, Liao H, Li R. Research Progress of Cordyceps sinensis and Its Fermented Mycelium Products on Ameliorating Renal Fibrosis by Reducing Epithelial-to-Mesenchymal Transition. J Inflamm Res. 2023;16:2817–30.
  12. Zhao L. et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  13. Ru J. et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 2014;6:13.
  14. Bi Y. et al. beta-Sitosterol Suppresses LPS-Induced Cytokine Production in Human Umbilical Vein Endothelial Cells via MAPKs and NF-kappaB Signaling Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2023;2023:9241090.
  15. Sun Y, Gao L, Hou W, Wu J. beta-Sitosterol Alleviates Inflammatory Response via Inhibiting the Activation of ERK/p38 and NF-kappaB Pathways in LPS-Exposed BV2 Cells. Biomed Res Int. 2020;2020:7532306.
  16. Park YJ. et al. Effects of beta-Sitosterol from Corn Silk on TGF-beta1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Lung Alveolar Epithelial Cells. J Agric Food Chem. 2019;67(35):9789–95.
  17. Li DD. et al. RTEC-intrinsic IL-17-driven inflammatory circuit amplifies antibody-induced glomerulonephritis and is constrained by Regnase-1. JCI Insight. 2021;6(13).
  18. Martin-Carro B. et al. Role of Klotho and AGE/RAGE-Wnt/beta-Catenin Signalling Pathway on the Development of Cardiac and Renal Fibrosis in Diabetes. Int J Mol Sci. 2023;24(6).
  19. Naas S, Schiffer M, Schodel J. Hypoxia and renal fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;325(4):C999–C1016.
  20. Harris RC, Breyer MD. Physiological regulation of cyclooxygenase-2 in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(1):F1–11.
  21. Calder PC. Eicosanoids. Essays Biochem. 2020;64(3):423–41.
  22. Waldner C, Heise G, Schror K, Heering P. COX-2 inhibition and prostaglandin receptors in experimental nephritis. Eur J Clin Invest. 2003;33(11):969–75.
  23. Pan Y. et al. Myeloid cyclooxygenase-2/prostaglandin E2/E-type prostanoid receptor 4 promotes transcription factor MafB-dependent inflammatory resolution in acute kidney injury. Kidney Int. 2022;101(1):79–91.
  24. Volzke A, Koch A, Meyer Zu Heringdorf D, Huwiler A, Pfeilschifter J. Sphingosine 1-phosphate (S1P) induces COX-2 expression and PGE2 formation via S1P receptor 2 in renal mesangial cells. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(1):11–21.
  25. Sawano H. et al. 15-Deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 inhibits IL-1beta-induced cyclooxygenase-2 expression in mesangial cells. Kidney Int. 2002;61(6):1957–67.
  26. Guo B. et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligands inhibit TGF-beta 1-induced fibronectin expression in glomerular mesangial cells. Diabetes. 2004;53(1):200–8.
  27. Zou R. et al. PPARgamma agonists inhibit TGF-beta-PKA signaling in glomerulosclerosis. Acta Pharmacol Sin. 2010;31(1):43–50.
  28. Wei J. et al. PP2 Ameliorates Renal Fibrosis by Regulating the NF-kappaB/COX-2 and PPARgamma/UCP2 Pathway in Diabetic Mice. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:7394344.
  29. Yang C, Chen EA, Zhang Y. Protein-Ligand Docking in the Machine-Learning Era. Molecules. 2022;27(14).
  30. Quiroga R, Villarreal MA. Developing Generalizable Scoring Functions for Molecular Docking: Challenges and Perspectives. Curr Med Chem. 2025;32(28):5960–72.
  31. Li J. et al. TGF-beta/Smad signaling in chronic kidney disease: Exploring post-translational regulatory perspectives (Review). Mol Med Rep. 2024;30(2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Beta-sitosterolfarmakologia sieciowadokowanie molekularnehamowanie COX-2szlaki zapalneaktywacja profibrotycznaCordyceps sinensisanaliza oddziaływań białko-białko
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.