Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Niniejsze badanie integruje farmakologię sieciową, zwalidowane dokowanie molekularne oraz eksperymenty in vitro w celu oceny relacji między potencjalnymi związkami a celami w obrębie składników Cordyceps sinensis a procesów związanych z przewlekłym kłębowkowym zapaleniem nerek. Do walidacji na poziomie związku wybrano β-sitosterol, który wykazał zdolność do osłabiania aktywacji zapalnej i profibrotycznej w modelach komórek mezanialnych.
Przewlekłe zapalenie kłębuszków nerkowych (CGN) charakteryzuje się uporczywym uszkodzeniem zapalnym i postępującym przebudowaniem włóknistym, jednak relacje związek-cel leżące u podstaw interwencji opartych na produktach naturalnych pozostają niepełnie zdefiniowane. W niniejszym badaniu zintegrowano farmakologię sieciową, zwalidowane dokowanie molekularne oraz eksperymenty in vitro w celu oceny potencjalnych składników Cordyceps sinensis (C. sinensis) w procesach patologicznych związanych z CGN. Przesiewowo wyłoniono potencjalne składniki C. sinensis, a cele powiązane ze związkami, pochodzące z Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, zestawiono z genami powiązanymi z CGN. Analizy wzbogacenia funkcjonalnego i oddziaływań białko-białko wykorzystano do priorytetyzacji procesów biologicznych i kluczowych celów (hub targets). PTGS2 zidentyfikowano jako kluczowy wspólny cel. Dokowanie molekularne przeprowadzono przy użyciu struktury COX-2 związanej z celekoksybem. Ponowne dokowanie kokrystalizowanego ligandu celekoksybu odtworzyło pozę krystalograficzną z wartością RMSD 0,876 Å, co potwierdziło protokół dokowania. β-sitosterol oraz octan linoleylu wykazały przewidywaną kompatybilność z regionem dokowania COX-2, z powinowactwami wiązania wynoszącymi odpowiednio −7,2 i −7,5 kcal/mol. β-sitosterol wybrano do walidacji na poziomie związku w szczurzych komórkach mezan gialnych kłębuszków nerkowych HBZY-1. W stężeniach 0,5–10 µM β-sitosterol nie spowodował znaczącego zmniejszenia żywotności komórek. W komórkach stymulowanych lipopolisacharydem (LPS) β-sitosterol obniżył ekspresję Tnf, Il6 i Ptgs2, zmniejszył produkcję prostaglandyny E2 (PGE2) oraz obniżył zawartość białka cyklooksygenazy-2 (COX-2). W komórkach traktowanych czynnikiem wzrostu TGF-β1 β-sitosterol obniżył ekspresję Col1a1 i Acta2 oraz zmniejszył zawartość białka alfa-aktyny mięśni gładkich (α-SMA). Wyniki te dostarczają dowodów pozwalających sformułować hipotezę, że β-sitosterol moduluje aktywację zapalną i profibrotyczną w modelach komórek mezangialnych, jednak nie potwierdzają one bezpośredniego hamowania enzymatycznego COX-2 ani skuteczności terapeutycznej w CGN.
Przewlekłe kłębuszkowe zapalenie nerek (CGN) obejmuje heterogenną grupę schorzeń kłębuszków, które mogą prowadzić do przewlekłej choroby nerek oraz schyłkowej niewydolności nerek1. Charakteryzuje się ono uporczywym uszkodzeniem kłębuszków, aktywacją stanu zapalnego oraz postępującą przebudową włóknistą2,3. Chociaż kortykosteroidy i leki immunosupresyjne są stosowane u wybranych pacjentów, długoterminowa kontrola choroby w wielu przypadkach pozostaje trudna, a działania niepożądane związane z leczeniem są częste1,4,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Analizy farmakologii sieciowej i bioinformatyczne oparto na publicznie dostępnych bazach danych i nie angażowały one uczestników będących ludźmi ani zwierząt. Eksperymenty in vitro przeprowadzono z wykorzystaniem uznanej linii komórkowej i nie wymagały one zgody komisji etycznej zgodnie z wymogami instytucjonalnymi.
Przesiewowe badanie potencjalnych składników i identyfikacja celu
Kandydackie składniki oraz ich odpowiednie cele pobrano z Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) 13 lipca 2025 roku, używając terminu wyszukiwania „dongchongxiaca....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przesiewanie potencjalnych składników, odzyskiwanie celów i wyznaczanie wspólnych celów
Przebieg procesu identyfikacji potencjalnych wspólnych celów dla związku i choroby przedstawiono w Rysunek 1ASiedem związków kandydackich z C. sinensis spełniały zdefiniowane kryteria przesiewowe OB ≥30% oraz DL ≥0,18, w tym kwas arachidonowy, octan linoleilu, β-sitosterol, peroksyergosterol, cerewisterol, palmitynian cholesterylu oraz CLR (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu zintegrowano farmakologię sieciową, dokowanie molekularne zweryfikowane za pomocą ligandu referencyjnego oraz eksperymenty na poziomie związków, aby zbadać hipotezę związaną z PTGS2, sformułowaną na podstawie kandydackich składników C. sinensis. Siedem składników spełniło zdefiniowane kryteria przesiewowe TCMSP, a 23 cele pokrywało się ze zbiorem genów związanych z kłębuszkowym zapaleniem nerek. Analiza oddziaływań białkowych pozwoliła wyłonić dziewięć kluczowych celów, spośród któr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak konfliktów interesów. Narzędzia oparte na sztucznej inteligencji (ChatGPT, OpenAI) zostały wykorzystane w celu pomocy w redakcji językowej oraz wstępnego projektowania schematów. Generatywna sztuczna inteligencja została użyta do przygotowania wstępnych projektów graficznych do Ryciny 1A i 7, które zostały następnie zweryfikowane i poprawione przez autorów w celu zapewnienia spójności z opisanymi metodami i wynikami. Wszystkie produkty opracowane przy wsparciu AI zostały krytycznie ocenione i zatwierdzone przez autorów. Autorzy zweryfikowali ostateczną treść rycin i wzięli pełną odpowiedzialność za rzetelność oraz dokładność manuskryptu.
Niniejsze badanie było wspierane przez Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Nephropathy Characteristic Specialty (ZYTSZK2-3) oraz Study on TCM Intervention Strategy of Chronic Kidney Disease from the Perspective of Chronic Disease Management (202240169).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Etanol absolutny | Sigma-Aldrich/Merck | E7023 | Etanol klasy biologii molekularnej, 200 proof, niedenaturowany; rozpuszczalnik dla roztworu zapasowego β-sitosterolu. |
| AutoDock Vina | Scripps Research | Version 1.1.2 | Symulacja dokowania molekularnego |
| Komora z laminarem | Thermo Fisher Scientific | 1300 Series A2 | Sterylne operacje na kulturach komórkowych |
| Celekoksyb | MedChemExpress | HY-14398 | Selektywny inhibitor COX-2 stosowany jako kontrola pozytywna; roztwór zapasowy 10 mM w DMSO. |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies, Inc. | CK04 | Kolorymetryczny test WST-8 do oceny żywotności komórek; absorbancja mierzona przy 450 nm. |
| System obrazowania chemiluminescencyjnego | Bio-Rad Laboratories | ChemiDoc MP | Akwizycja obrazów Western blot |
| Pakiet R clusterProfiler | Bioconductor | Version 4.10.0 | Analiza wzbogacenia GO i KEGG |
| Inkubator do kultur komórkowych CO2 | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3111 | Inkubacja kultur komórkowych w 37 °C i 5% CO2 |
| Królicze przeciwciało monoklonalne COX-2 (D5H5) | Cell Signaling Technology | 12282 | Zwalidowane do Western blot dla COX-2 ludzkiej, mysiej i szczurej; stosowane w rozcieńczeniu 1:1 000. |
| Wtyczka CytoNCA | Cytoscape App Store | Version 2.1.6 | Topologiczna analiza celów typu hub |
| Oprogramowanie Cytoscape | Cytoscape Consortium | Version 3.8.0 | Wizualizacja i analiza sieci |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma-Aldrich/Merck | D2650 | BioReagent filtrowany sterylnie, ≥99,7%; rozpuszczalnik dla roztworu zapasowego celekoksybu. |
| Baza danych DisGeNET | Integrative Biomedical Informatics Group | Not applicable | Wyszukiwanie genów związanych z kłębuszkowym zapaleniem nerek |
| Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | C11995500BT | Podłoże podstawowe do hodowli komórek HBZY-1 |
| Substrat do wzmocnionej chemiluminescencji | Beyotime Biotechnology | P0018S | Wizualizacja prążków w Western blot |
| Płodowa surowica bydlęca | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10099-141C | Surowica jako dodatek do kultur komórkowych |
| Królicze przeciwciało monoklonalne GAPDH (D16H11) | Cell Signaling Technology | 5174 | Kontrola załadunku w Western blot; reaktywne z GAPDH ludzkim, mysim i szczurzym; stosowane w rozcieńczeniu 1:5 000 po optymalizacji wewnętrznej. |
| Baza danych GeneCards | Weizmann Institute of Science | NA | Wyszukiwanie genów związanych z kłębuszkowym zapaleniem nerek |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.0.0.121 | Analiza statystyczna danych eksperymentalnych in vitro |
| Kozie przeciwciało anty-rabbit IgG sprzężone z HRP | Proteintech Group | SA00001-2 | Przeciwciało wtórne dla króliczych przeciwciał pierwotnych |
| Oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.54 | Analiza densytometryczna Western blot |
| Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy | Olympus | CKX53 | Obserwacja morfologii komórek |
| Pakiet R org.Hs.eg.db | Bioconductor | Version 3.18.0 | Adnotacje genów ludzkich do analizy wzbogacenia |
| Roztwór penicyliny i streptomycyny | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Dodatek antybiotykowy do kultur komórkowych |
| Zestaw do oznaczania parametrów PGE2 | R&D Systems, a Bio-Techne brand | KGE004B | Wielogatunkowy konkurencyjny test ELISA do nadnadpływów z kultur komórkowych; zakres pomiarowy 39–2 500 pg/mL; detekcja kolorymetryczna przy 450 nm. |
| Baza danych PharmGKB | Pharmacogenomics Knowledgebase | NA | Wyszukiwanie celów związanych z chorobą |
| Baza danych PubChem | National Center for Biotechnology Information | NA | Wyszukiwanie struktur ligandów |
| Membrana PVDF | Millipore/Merck | IPVH00010 | Membrana do transferu białek w Western blot |
| System grafiki molekularnej PyMOL | Schrödinger, LLC | Version 2.6.2 | Wizualizacja poz dokowania |
| Oprogramowanie R | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.2 | Analiza przecięcia celów i analiza wzbogacenia |
| Linia komórek mezanialnych kłębuszków szczura (HBZY-1) | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0117 | In vitro model walidacyjny komórek mezanialnych |
| RCSB Protein Data Bank | Research Collaboratory for Structural Bioinformatics | PDB ID: 3LN1 | Wyszukiwanie struktury krystalicznej PTGS2/COX2 |
| Rekombinowane ludzkie białko TGF-β1 | PeproTech, a Thermo Fisher Scientific brand | 100-21-10UG | Rekombinowane ludzkie TGF-β1 pochodzące z HEK293; stymulacja profibrotyczna w stężeniu 10 ng/mL. |
| System elektroforezy SDS-PAGE | Bio-Rad Laboratories | Mini-PROTEAN Tetra | Rozdział białek metodą SDS-PAGE |
| Baza danych STRING | ELIXIR/STRING Consortium | Version 12.0 | Konstrukcja sieci oddziaływań białko-białko |
| Baza danych TCMSP | Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database | NA | Przesiewanie związków kandydackich z Cordyceps sinensis |
| Therapeutic Target Database | Innovative Drug Research and Bioinformatics Group | NA | Wyszukiwanie celów terapeutycznych |
| Przeciwciało pierwotne α-SMA | Proteintech Group | 14395-1-AP | Detekcja ekspresji białka α-SMA |
| β-Sitosterol (czystość >98%) | MedChemExpress | HY-N0171A | CAS 83-46-5; określony związek stosowany do traktowania komórek; roztwór zapasowy 10 mM w etanolu absolutnym. |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.