Uczenie instrumentalne muszek *Drosophila* przy użyciu torquemetru

Podsumowanie

Pomiar momentu obrotowego odchylenia (yaw torque) przywiązanej muchy Drosophila za pomocą miernika momentu obrotowego pozwala neurobiologowi na precyzyjną kontrolę warunków stymulacji zwierzęcia doświadczalnego. W połączeniu z unikalnymi narzędziami genetycznymi dostępnymi u muszki owocówki, paradygmat ten jest wykorzystywany w szerokim zakresie badań neurobiologicznych.

Streszczenie

Do eksperymentów z użyciem miernika momentu obrotowego wykorzystuje się muchy utrzymywane na standardowej pożywce dla muszek w temperaturze 25°C i wilgotności 60%, przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności. Znormalizowany system hodowli zapewnia odpowiednią gęstość larw oraz kohorty o wyrównanym wieku. Muchy, uprzednio znieczulone zimnem, są przyklejane głową i tułowiem do trójkątnego haczyka w dniu poprzedzającym eksperyment. Po zamocowaniu miernika momentu obrotowego za pomocą zacisku, zamierzone manewry lotne muchy są mierzone jako moment pędu wokół pionowej osi ciała. Mucha jest umieszczana w centrum cylindrycznej panoramy, aby umożliwić lot stacjonarny. Karta przetwornika analogowo-cyfrowego przekazuje sygnał momentu odchylenia (yaw torque) do komputera, który zapisuje przebieg sygnału do późniejszej analizy. Komputer steruje również różnymi bodźcami, które mogą zostać poddane kontroli muchy poprzez zamknięcie pętli sprzężenia zwrotnego między bodźcami a zapisem momentu odchylenia. Karę realizuje się poprzez aplikację ciepła za pomocą regulowanego lasera podczerwonego.

Protokół

Pożywka dla muszek

Skład pożywki dla muszek ma kluczowe znaczenie dla procesu uczenia się (Guo et al., 1996):

• Woda 1000 ml
• Mąka kukurydziana 180 g
• Soja 10 g
• Drożdże 18,5 g
• Agar 7,5 g
• Melasa 40 g
• Syrop (buraczany) 40 g
• Nipagin 2,5 g

Każda fiolka zawiera niewielką ilość świeżej, żywej pasty drożdżowej oraz kawałek papieru filtracyjnego, aby zapewnić dodatkową powierzchnię dla much i poczwarek.

Hodowla i wyznaczanie stadiów rozwojowych much

Poniższą procedurę wykonuje się codziennie, co pozwala na uzyskanie zwierząt o precyzyjnie określonym wieku, hodowanych przy odpowiedniej gęstości. Wszystkie muchy, które wykluły się od czasu ostatniej procedury w dniu poprzednim, są zbierane do hodowli i eksperymentów. Najstarsze fiolki, w których nie pozostały żywe poczwarki, są utylizowane. Muchy w wieku czterech dni przenosi się do nowej fiolki w celu nocnego składania jaj. Gęstość samic powinna wynosić około 20 osobników na każdą fiolkę, z dostosowaniem do wielkości fiolki oraz użytego szczepu. Idealna gęstość jest taka, która jest wystarczająco wysoka, aby pożywka dla much uległa upłynnieniu podczas stadiów larwalnych, a jednocześnie na tyle niska, aby wszystkie larwy przepoczwarły przed wykluciem się pierwszych much. Muchy składające jaja w dniu poprzednim są usuwane i utylizowane.

Przygotowanie much

Muchy są utrzymywane na standardowej pożywce kukurydzianej z melasą, opisanej powyżej, w temperaturze 25°C i wilgotności 60% przy 12-godzinnym cyklu światła i ciemności. Po krótkim unieruchomieniu much w wieku 24-48h za pomocą anestezji zimnem, następnego dnia przed eksperymentem muchy są przyklejane (klej do szkła SuperGlue UV, 505127A, Pacer Technology, Cucamonga, Ca., USA) w obrębie głowy i klatki piersiowej do trójkątnego miedzianego haczyka (średnica 0,05mm). Następnie zwierzęta są utrzymywane indywidualnie przez noc w małych, wilgotnych komorach zawierających kilka ziaren sacharozy.

Aparatura

Kluczowym elementem układu jest kompensator momentu obrotowego (miernik momentu obrotowego) (Götz, 1964). Mierzy on moment pędu muchy wokół jej pionowej osi ciała, wywołany zamierzonymi manewrami lotniczymi. Mucha, przyklejona do haczyka zgodnie z powyższym opisem, jest przymocowana do miernika momentu obrotowego za pomocą zacisku, aby umożliwić lot stacjonarny w centrum cylindrycznej panoramy (arena, średnica 58mm), która jest homogenicznie oświetlona od tyłu. Źródłem światła jest żarówka wolframowo-halogenowa 100W, 12V. W celu uzyskania zielonego i niebieskiego oświetlenia areny, światło przechodzi przez monochromatyczne szerokopasmowe żelatynowe filtry Kodak Wratten (odpowiednio nr 47 i nr 99). Filtry mogą być wymieniane przez szybki solenoid w czasie 0,1s. Alternatywnie, arena jest oświetlana światłem „dziennym” poprzez przepuszczenie go przez filtr niebiesko-zielony (Rosco „surfblue” nr 5433) lub bez użycia żadnego filtra. Widmo transmisji filtra niebiesko-zielonego Rosco użytego w tym badaniu jest równoważne widmu filtra BG18 (Schott, Mainz) i stanowi formę pośrednią między filtrami niebieskim a zielonym Kodak (Brembs and Hempel de Ibarra, 2006; Liu et al., 1999). Arena może być obracana wokół muchy za pomocą sterowanego komputerowo silnika elektrycznego. W takiej sytuacji „symulatora lotu” prędkość kątowa areny jest proporcjonalna do momentu obrotu muchy w osi yaw, lecz skierowana przeciwnie (czynnik sprzężenia K=-11°/s•10-10Nm). Umożliwia to musze stabilizację panoramy i kontrolowanie jej orientacji kątowej. Ten wirtualny „kierunek lotu” (tj. pozycja areny) jest rejestrowany w sposób ciągły za pomocą potencjometru obrotowego (Novotechnik, A4102a306). Karta przetwornika analogowo-cyfrowego (PCL812; Advantech Co.) przekazuje sygnał pozycji areny oraz momentu obrotu yaw do komputera, który zapisuje przebiegi (częstotliwość próbkowania 20Hz) do późniejszej analizy. Karę realizuje się poprzez przykładanie ciepła z regulowanego lasera podczerwonego (825 nm, 150 mW), skierowanego z tyłu i z góry na głowę i tułów muchy. Wiązka lasera jest impulsowana (szerokość impulsu ok. 200ms przy ~4Hz), a jej intensywność jest zredukowana, aby zapewnić przeżycie muchy.

Eksperymenty

Uczenie wzorców

W tradycyjnym eksperymencie uczenia się wzorców (Dill and Heisenberg, 1995; Dill et al., 1993, 1995; Liu et al., 2006; Liu et al., 1998; Liu et al., 1999; Wolf and Heisenberg, 1991) na ścianie areny rozmieszczono w równych odstępach cztery czarne, T-kształtne wzorce o naprzemiennej orientacji (tj. dwa pionowe i dwa odwrócone); szerokość wzorca ψ=40°, wysokość θ=40°, szerokość belek=14°, widziane z pozycji muchy). Program komputerowy dzieli 360° areny na 4 wirtualne ćwiartki po 90°, których środki są wyznaczone przez wzorce. Muchy kontrolują kątową pozycję wzorców za pomocą momentu obrotowego yaw (warunki symulatora lotu). Podczas treningu kara cieplna jest powiązana z pojawieniem się jednej z orientacji wzorca w przednim polu widzenia. Wzmocnienie dla każdego wzorca jest zawsze ujednolicone w obrębie grup. Podczas testu ogrzewanie jest trwale wyłączone, a preferencje muchy względem wzorców są rejestrowane.

Nauka kolorów

Uczenie się kolorów jest przeprowadzane zgodnie z wcześniejszymi opisami (Brembs and Heisenberg, 2000; Brembs and Hempel de Ibarra, 2006; Brembs and Wiener, 2006; Wolf and Heisenberg, 1997). Arena jest podzielona na cztery wirtualne kwadranty o kącie 90°, których środki są oznaczone czterema identycznymi pionowymi pasami (szerokość ψ=14°, wysokość θ=40°). Mucha kontroluje pozycję kątową czterech identycznych pasów za pomocą momentu obrotowego odchylenia (yaw torque), jak opisano powyżej dla wzorów w kształcie litery T. Kolor oświetlenia całej areny zmienia się w momencie, gdy jedna z wirtualnych granic kwadrantu przechodzi przez punkt przed muchą. Podczas treningu kara ciepłem jest uzależniona od jednego z dwóch kolorów. Podczas testowania ogrzewanie jest trwale wyłączone, a preferencja kolorystyczna muchy jest rejestrowana. Oczywiście kolory mogą być łączone ze wzorami w celu warunkowania złożonego (Brembs and Heisenberg, 2001).

Nauka momentu obrotu w osi pionowej

Uczenie momentu obrotowego odchylenia (yaw torque) jest przeprowadzane zgodnie z wcześniejszym opisem (Brembs and Heisenberg, 2000; Heisenberg and Wolf, 1993). Zakres spontanicznego momentu obrotowego odchylenia muchy zostaje podzielony na domenę „lewą” i „prawą”, odpowiadające w przybliżeniu odpowiednio skrętom w lewo lub w prawo. Ściany areny nie posiadają żadnych wzorów. Podczas treningu ciepło jest aplikowane zawsze wtedy, gdy moment obrotowy odchylenia muchy znajduje się w jednej domenie, i wyłączane, gdy moment ten przechodzi do drugiej domeny. W fazach testowych ciepło jest stale wyłączone, a wybór domen momentu obrotowego odchylenia muchy jest rejestrowany.

Uczenie kompozycyjne

Uczenie złożone jest rozszerzeniem uczenia momentu obrotu wokół osi pionowej (yaw), opisanym wcześniej (Brembs and Heisenberg, 2000). W zasadzie uczenie momentu obrotu wokół osi pionowej i uczenie kolorów są łączone w eksperymencie z równoważnymi predyktorami operantnymi (moment obrotu wokół osi pionowej) i klasycznymi (kolory). Podczas treningu mucha jest poddawana działaniu ciepła za każdym razem, gdy jej moment obrotu wokół osi pionowej wejdzie w zakres związany z karą. Ilekroć mucha zmienia zakres momentu obrotu wokół osi pionowej, zmienia się nie tylko temperatura, ale także kolor arena (z zielonego na niebieski lub odwrotnie). Zatem zakres momentu obrotu wokół osi pionowej i kolor służą jako równoważne predyktory ciepła. W fazach testowych ogrzewanie jest trwale wyłączone, a rejestrowany jest jedynie wybór zakresów momentu obrotu wokół osi pionowej/kolorów dokonywany przez muchę.

Dyskusja

Ta konfiguracja eksperymentalna łączy doskonałą kontrolę nad warunkami doświadczalnymi z zaawansowanym genetycznym organizmem modelowym. Stosując procedury opisane w niniejszej prezentacji, można badać molekularne i neurobiologiczne podstawy różnych cech behawioralnych, w tym, między innymi, mechanizmy spontanicznego generowania zachowań, warunkowania instrumentalnego i klasycznego, rozpoznawania wzorców, widzenia barw lub kontroli toru ruchu.

Dyskusja

Niniejsza konfiguracja eksperymentalna łączy doskonałą kontrolę nad warunkami doświadczalnymi z zaawansowanym genetycznym organizmem modelowym. Stosując procedury opisane w niniejszej prezentacji, można badać molekularne i neurobiologiczne podstawy różnych cech behawioralnych, w tym między innymi mechanizmy spontanicznego generowania zachowań, warunkowania instrumentalnego i klasycznego, rozpoznawania wzorców, widzenia barw oraz kontroli kursu.