Artykuł badawczy

Kapsułka Yangjing łagodzi dysfunkcję spermatogenezy u myszy poprzez hamowanie szlaku QKI-5/p38 MAPK poprzez upregulację lncRNA NONMMUT031883.2

11 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/73166

⸱

28 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie ocenia działanie ochronne kapsułek Yangjing w przypadku dysfunkcji spermatogenezy indukowanej cyklofosfamidą u myszy oraz bada udział szlaku sygnałowego lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Streszczenie

Dysfunkcja spermatogenezy jest istotną przyczyną męskiej niepłodności, a cyklofosfamid (CP) może upośledzać spermatogenezę poprzez indukcję nieprawidłowej apoptozy spermatogonii. Kapsułki Yangjing (YC) są stosowane w celu poprawy funkcji rozrodczych, jednak ich podstawowy mechanizm molekularny pozostaje niejasny. W niniejszym badaniu zbadano efekty ochronne YC w modelu dysfunkcji spermatogenezy indukowanej CP u myszy oraz w komórkach spermatogonialnych GC-1. Oceńiano liczbę i ruchliwość plemników, płodność samców, poziom hormonów płciowych w surowicy oraz zmiany histopatologiczne w jądrach i najazdach. W komórkach GC-1 oceniano żywotność komórek, uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej, apoptozę oraz białka związane z apoptozą. Do analizy lncRNA NONMMUT031883.2, Quaking-5 (QKI-5) oraz szlaku sygnałowego p38 kinazy aktywowanej mitogenem (MAPK) wykorzystano ilościową reakcję polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją, testy RNA pull-down, immunofluorescencję oraz Western blotting. YC w sposób zależny od dawki poprawiły jakość plemników, poziomy hormonów płciowych w surowicy, morfologię narządów rozrodczych, histopatologię jąder oraz płodność u myszy traktowanych CP. W komórkach GC-1 YC zwiększyły żywotność komórek oraz zmniejszyły uszkodzenia komórkowe i apoptozę. LncRNA NONMMUT031883.2 wchodziły w fizyczną interakcję z QKI-5, a zastosowanie YC zwiększyło ekspresję lncRNA NONMMUT031883.2, jednocześnie redukując ekspresję QKI-5 i fosforylację p38. Leczenie YC hamowało apoptozę indukowaną przez wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 w komórkach GC-1, podczas gdy nadekspresja QKI-5 zmniejszyła antyapoptotyczne działanie YC. Wyniki te sugerują, że YC łagodzi indukowaną przez CP dysfunkcję spermatogenezy, a jej efekty ochronne są mediowane przez regulację szlaku lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Wprowadzenie

Dysfunkcja spermatogenezy odnosi się do upośledzenia funkcji rozrodczych spowodowanego nieprawidłowościami w produkcji, dojrzewaniu lub funkcji plemników w męskim układzie rozrodczym. Charakteryzuje się ona obniżoną liczbą i ruchliwością plemników oraz zwiększonym odsetkiem plemników zdeformowanych1,2. Patogeneza dysfunkcji spermatogenezy jest złożona i wiąże się z czynnikami genetycznymi, zaburzeniami autoimmunologicznymi, toksynami środowiskowymi, uszkodzeniami wywołanymi chemioterapią oraz zmianami chorobowymi w narządach rozrodczych3-5. Leki chemioterapeutyczne, takie jak cyklofosfamid (CP), mogą bezpośrednio uszkadzać kanaliki nasienne jąder i indukować apoptozę spermatogoniów, przyczyniając się tym samym do wystąpienia męskiej dysfunkcji spermatogenezy6,7. Jako interwencje kliniczne stosuje się obecnie terapię hormonalną, suplementację przeciwutleniaczami oraz techniki wspomaganego rozrodu. Podejścia te charakteryzują się jednak niespójną skutecznością i znacznymi działaniami niepożądanymi8,9,10. Dlatego zidentyfikowanie bezpiecznych i skutecznych interwencji oraz wyjaśnienie ich celów molekularnych ma istotne znaczenie kliniczne dla poprawy wyników płodności u pacjentów z dysfunkcją spermatogenezy.

Chińskie zioła lecznicze wykazują potencjał w ochronie funkcji rozrodczych mężczyzn i leczeniu zaburzeń spermatogenezy ze względu na swoje właściwości wielocelowe i stosunkowo niską toksyczność11,12. Kapsułka Yangjing (YC) jest tradycyjnym chińskim lekiem patentowym składającym się z Rehmannia glutinosa, Epimedium, łożyska, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis oraz innych chińskich ziół leczniczych. Jest ona stosowana w celu wzmocnienia nerek i esencji, odżywienia krwi i szpiku oraz regulacji funkcji rozrodczych13. Wcześniejsze badania wykazały, że YC może regulować poziom hormonów płciowych u zwierząt męskich, poprawiać jakość plemników, naprawiać uszkodzenia tkanki jawotwarowej oraz chronić przed urazami rozrodczymi wywołanymi przez czynniki chemiczne14,15. Komórki spermatogonialne stanowią podstawę spermatogenezy, a nieprawidłowa apoptoza spermatogonii jest kluczowym zdarzeniem w rozwoju zaburzeń spermatogenezy16. Doniesiono również, że YC poprawia żywotność spermatogonii, zwiększa odsetek komórek w fazie S oraz hamuje apoptozę17. Jednakże jej efekty ochronne oraz specyficzne mechanizmy molekularne w przypadku dysfunkcji spermatogenezy indukowanej przez CP pozostają niewyjaśnione.

Długie niekodujące RNA (lncRNA) to cząsteczki RNA o długości przekraczającej 200 nukleotydów, które nie posiadają zdolności do kodowania białek18. LncRNA mogą regulować ekspresję genów poprzez mechanizmy obejmujące wyciszanie chromosomalne, modyfikację chromatyny, imprinting genomiczny oraz aktywację transkrypcyjną19,20. Białko wiążące RNA Quaking-5 (QKI-5) uczestniczy w procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w proliferacji i apoptozie komórek, poprzez regulację alternatywnego splicingu genów downstream21. Szlak kinazy p38 mitogenowo aktywowanej (MAPK) jest zaangażowany w regulację apoptozy i odgrywa również istotną rolę w męskiej płodności oraz rozwoju jąder22,23. Wcześniejsze badanie wykazało, że nadekspresja QKI-5 aktywuje szlak p38 MAPK w komórkach raka wątrobowokomórkowego24. Ponadto wykazano, że lncRNA NONMMUT074098.2 wiąże QKI-5 w spermatogoniach, podczas gdy wyciszenie QKI-5 hamowało szlak p38 MAPK i redukowało apoptozę spermatogonialną25. W niniejszym badaniu wykorzystano indukowany przez CP model myszy z dysfunkcją spermatogenezy, aby sprawdzić, czy YC reguluje ekspresję lncRNA NONMMUT031883.2 oraz oś sygnałową QKI-5/p38 MAPK, redukując tym samym nieprawidłową apoptozę spermatogonialną i łagodząc indukowaną przez CP dysfunkcję spermatogenezy (Rysunek 1). Celem było wyjaśnienie mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw ochronnego działania YC na spermatogenezę oraz poszerzenie wiedzy o jego roli farmakologicznej w ochronie funkcji rozrodczych mężczyzn.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat projektu eksperymentalnego. Górny panel podsumowuje eksperymenty in vitro w komórkach spermatogonalnych GC-1. Wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 zastosowano w celu wywołania apoptozy i uszkodzeń komórkowych, po czym przeprowadzono wyciszenie QKI-5, aby ocenić jego wpływ na apoptozę i uszkodzenie komórek. Dolny panel podsumowuje eksperymenty in vivo w mysich modelach dysfunkcji spermatogenezy wywołanej cyklofosfamidem (CP). Myszy otrzymały leczenie kapsułkami Yangjing i/lub interwencję lncRNA NONMMUT031883.2 lub QKI-5. Następnie oceniono płodność, poziomy hormonów w surowicy, tkanki jąder i najduszek, zawiesinę plemników, rezerwy plemników, jakość plemników oraz histopatologiczne uszkodzenia jąder. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE oraz przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu Południowo-Wschodniego (numer zatwierdzenia 20230216022).

1. Przygotowanie surowicy zawierającej YC
Otwarto dwie kapsułki Yangjing (YC; 0,5 g/kapsułka) i odważono 0,8 g zawartości kapsułek. Dodano sól fizjologiczną do uzyskania końcowej objętości 10 mL, a mieszaninę dokładnie wymieszano za pomocą wortexa w celu przygotowania zawiesiny o stężeniu 80 mg/mL. Samce myszy BALB/c wolne od specyficznych patogenów (SPF) o masie 22–25 g i wieku 8 tygodni utrzymywano w temperaturze 22 °C i wilgotności 55%–60% przy 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, z dostępem do pokarmu i wody ad libitum. Po 1 tygodniu aklimatyzacji myszy otrzymywały YC poprzez zgłębnik żołądkowy w dawce 800 mg/kg masy ciała w objętości 10 mL/kg raz dziennie przez 5 kolejnych dni. Dwie godziny po ostatnim podaniu myszy znieczulono intraperitonealnie 1% roztworem pentobarbalsodu i pobrano próbki krwi w celu przygotowania surowicy zawierającej YC. Surowicę inaktywowano w temperaturze 56 °C przez 30 min, przefiltrowano przez membranę 0,22 µm i przechowywano w temperaturze −80 °C do czasu użycia.

2. Hodowla komórek i transfekcja
Mysie komórki spermatogonialne GC-1 hodowano w pożywce DMEM zawierającej 1% penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej. Wszystkie hodowle utrzymywano w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO₂ (v/v).

Zsyntetyzowano i skonstruowano specyficzne dla lncRNA krótkie zapinki RNA (sh-lncRNA), plazmid do nadekspresji QKI-5 (OE-QKI-5), małe interferujące RNA przeciwko QKI-5 (si-QKI-5) oraz odpowiadające im kontrole negatywne (sh-NC, OE-NC i si-NC). Komórki GC-1 poddano transfekcji sh-lncRNA lub sh-NC, si-QKI-5 lub si-NC, bądź OE-QKI-5 lub OE-NC zgodnie z instrukcją dołączoną do odczynnika transfekcyjnego. Po 48 h inkubacji oceniono wydajność transfekcji poprzez pomiar ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2 lub QKI-5.

W przypadku grupy sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposyd, komórki GC-1 poddano transfekcji sh-lncRNA oraz si-QKI-5, a następnie traktowano 100 µM etoposydu przez 12 h26. Do późniejszych testów żywotności komórek wykorzystano komórki GC-1 hodowane w pożywce uzupełnionej o 5%, 10% lub 20% surowicy zawierającej YC, które oznaczono odpowiednio jako grupy z niską dawką YC (L-YC), średnią dawką YC (M-YC) i wysoką dawką YC (H-YC). Stężenia surowicy zawierającej YC (5%, 10% i 20% YC) określono na podstawie wyników wstępnych eksperymentów z gradientem stężeń. W przypadku grup sh-lncRNA + H-YC + OE-NC oraz sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5, komórki GC-1 poddano transfekcji sh-lncRNA wraz z OE-NC lub sh-lncRNA wraz z OE-QKI-5 przez 48 h, a następnie eksponowano na 20% surowicę zawierającą YC przez 24 h.

3. Analiza z użyciem zestawu Cell Counting Kit-8
Komórki GC-1 wysiano do płytek 96-dołkowych w zagęszczeniu 5 × 103 komórek/dołek i hodowano przez 24 h. Po przytwierdzeniu komórek pierwotne medium zastąpiono 100 µL medium kompletnego uzupełnionego o surowicę zawierającą YC, a następnie komórki inkubowano przez 6, 12 lub 24 h. Po inkubacji do każdego dołka dodano 10 µL odczynnika Cell Counting Kit-8 i inkubowano komórki w temperaturze 37 °C w ciemności przez 2 h. Absorbancję przy 450 nm zmierzono za pomocą czytnika mikroplatek.

4. Analiza aktywności dehydrogenazy mleczanowej
Po 48 h od transfekcji sh-NC lub sh-lncRNA zebrano pożywkę hodowlaną komórek GC-1, a następnie w wyniku wirowania otrzymano nadsącz. Zgodnie z instrukcją zestawu do analizy dehydrogenazy mleczanowej, nadsącz delikatnie zmieszano z roboczym roztworem detekcyjnym i przeniesiono do płytki 96-dołkowej. Płytkę inkubowano w temperaturze 25 °C w ciemności przez 30 min. Absorbancję przy 490 nm zmierzono za pomocą czytnika mikro płytek, a następnie obliczono uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej w celu oceny uszkodzeń komórek.

5. Barwienie kalceiną AM i jodkiem propidium
Po 48 h od transfekcji sh-NC lub sh-lncRNA oceniono przeżywalność komórek GC-1 za pomocą barwienia kalceiną AM i jodkiem propidium (PI). Komórki wysiano do płytek 12-dołkowych w zagęszczeniu 5 × 104 komórek/dołek i hodowano do czasu osiągnięcia 60%–70% konfluencji. Komórki delikatnie przepłukano solą fizjologiczną w buforze fosforanowym, a następnie do każdego dołka dodano 500 µL roztworu barwiącego Calcein AM/PI. Komórki inkubowano w ciemności w temperaturze 37 °C przez 30 min, po czym poddano je obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Liczbę żywych i martwych komórek określono przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, a następnie obliczono odsetek komórek przeżywalnych.

6. Cytometria przepływowa
Komórki GC-1 zebrano poprzez wirowanie i delikatnie przepłukano solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Osad komórkowy resuspenderowano w 500 µL buforu wiążącego przy gęstości 5 × 105 komórek/mL. Następnie dodano po 5 µL Annexin V-APC oraz PI, a zawiesinę dokładnie wymieszano i inkubowano w temperaturze 25 °C w ciemności przez 10 min. Apoptozę analizowano za pomocą cytometrii przepływowej, stosując długości fal wzbudzenia/emisji 633/660 nm dla APC oraz 488/630 nm dla PI. Stopień apoptozy oceniono przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

7. Analiza aktywności kaspazy-3
Po wskazanych zabiegach zebrano około 1 × 106 komórek GC-1, opłukano je i zawieszono ponownie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Komórki zmieszano z 100 µL odczynnika II z zestawu do analizy aktywności kaspazy-3 i lizowano na lodzie przez 15 min. Po wirowaniu pobrano 50 µL supernatantu lizatu i zmieszano z 40 µL odczynnika I oraz 10 µL odczynnika III. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 2 h. Absorbancję przy 405 nm zmierzono za pomocą czytnika płytek mikroplate, a aktywność kaspazy-3 oceniono zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu.

8. Analiza RNA pull-down
Nici sens i antysens lncRNA NONMMUT031883.2 zostały zsyntetyzowane zgodnie z odpowiednią sekwencją i znakowane biotyną. Komórki poddano lizie w buforze do lizy komórek w immunoprecypitacji na lodzie przez 30 min, a następnie za pomocą wirówki zebrano supernatant zawierający białka. Magnetyczne kulki streptawidynowe przemyto trzykrotnie buforem do wiązania RNA i inkubowano w buforze do wiązania zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej przez 30 min.

Wstępnie potraktowane koraliki połączono z sondami znakowanymi biotyną i inkubowano w temperaturze 25 °C przez 30 min. Niezwiązane sondy usunięto za pomocą separacji magnetycznej. Następnie dodano nadsącz z lizatu komórkowego, a mieszaninę inkubowano w temperaturze 4 °C przez 4 h w celu utworzenia kompleksów koralików magnetycznych-RNA-białka. Koraliki magnetyczne przemyto trzykrotnie buforem do mycia, aby usunąć niespecyficznie związane białka. Bufor do mycia usunięto za pomocą separacji magnetycznej, a następnie dodano 2× bufor do nakładania próbek SDS. Próbki podgrzewano w temperaturze 95 °C przez 10 min, a nadsącz zebrano za pomocą separacji magnetycznej do późniejszej analizy Western blot.

9. Konstrukcja modelu dysfunkcji spermatogenezy u myszy
Po 5 dniach aklimatyzacji, samce myszy BALB/c wolne od specyficznych patogenów o masie 22–25 g i wieku 8 tygodni otrzymały cyklofosfamid (CP) drogą dosytronialną w dawce 50 mg/kg raz dziennie przez 7 dni w celu utworzenia modelu dysfunkcji spermatogenezy14,27. Myszy z pomyślnie indukowanym modelem zostały losowo przydzielone za pomocą tablicy liczb losowych do grup: CP, 200 mg/kg YC, 400 mg/kg YC, 800 mg/kg YC, 800 mg/kg YC + sh-NC oraz 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, po sześć myszy w każdej grupie.

Myszy w grupach traktowanych YC otrzymywały odpowiednią dawkę YC drogą zgłębnika raz dziennie przez 30 dni13. W przypadku grup 800 mg/kg YC + sh-NC oraz 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, po pomyślnym utworzeniu modelu, myszy zanieczulono poprzez inhalację 2% izofluranu. Po potwierdzeniu braku odruchu cofania łapy oraz stabilności częstości oddechów, miejsce operacyjne ogolono i zdezynfekowano jodopowidionem. W warunkach aseptycznych wykonano cięcie w linii środkowej brzucha przez skórę i ścianę ciała przed narządami płciowymi. Jądro odsłonięto, ostrożnie manipulując poduszką tłuszczową najądrza, dbając o to, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Za pomocą mikromanipulatora zlokalizowano kanaliki nasienne i powoli wstrzyknięto 1 µL zawiesiny adenowirusowej (1 × 1010 TU/mL) przy użyciu igły do mikroiniekcji28. Igłę pozostawiono w miejscu wstrzyknięcia przez 5 min, a następnie powoli wycofano, po czym uzyskano hemostazę za pomocą sterylnego tamponu bawełnianego. Tę samą procedurę zastosowano następnie w obrębie przeciwległego jądra. Następnie zaszyto cięcie, a myszy pozostawiono do rekonwalescencji na podgrzewającej podkładce pooperacyjnie. Myszy kontrolne otrzymywały codziennie równą objętość roztworu soli fizjologicznej drogą zgłębnika oraz iniekcji.

10. Ocena płodności
Po zakończeniu podawania leku samce myszy z każdej grupy kopulowano swobodnie z samicami myszy BALB/c w stosunku 1:2 przez 7 dni. Codziennie monitorowano i odnotowywano obecność czopów pochwowych u samic. Po potwierdzeniu udanego zapłodnienia samce usunięto, a samice kwaterowano indywidualnie aż do naturalnego porodu. Do analizy włączono dziewięć ciężarnych samic na grupę. Odnotowano średnią liczebność lęgów w celu oceny płodności samców w każdej grupie.

Pod koniec okresu eksperymentalnego myszy poddano eutanazji poprzez podanie doszpikowe pentobarbitalu sodowego w dawce 100 mg/kg. Metoda eutanazji została zatwierdzona przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Południowo-Wschodniego (numer zatwierdzenia 20230216022). Jądra i najotoczki nasion zostały starannie oddzielone, sfotografowane i zważone. Indeksy jądra i najotoczki obliczono jako stosunek masy organu do masy ciała. Z każdej myszy pobrano jedną najotoczkę, pocięto ją na fragmenty, umieszczono w 1 mL uprzednio ogrzanego soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (37 °C) i inkubowano przez 20 min, aby umożliwić wypłynięcie plemników29. Zawiesinę plemników delikatnie wymieszano, a następnie 10 µL zawiesiny nanieśli na podgrzaną płytkę do liczenia komórek krwi. Plemniki policzono ręcznie pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 200×, a wyniki wyrakowano jako 106/L. Ponadto jako ruchliwość plemników obliczono procent plemników o ruchliwości progresywnej w stosunku do całkowitej liczby plemników13.

11. Oznaczenie poziomu hormonów płciowych
Krew pobrano z żyły ocznej myszy w każdej grupie i pozostawiono w temperaturze 25 °C na 30 min. Surowicę wyizolowano poprzez wirowanie przy 3,000 × g przez 10 min30. Poziomy testosteronu w surowicy, hormonu luteotropowego (LH) oraz hormonu folikulotropowego (FSH) zmierzono przy użyciu odpowiednich zestawów do testów immunoenzymatycznych (ELISA).

12. Analiza stabilności RNA
Komórki GC-1 wysiano do 96-dołkowych płytek hodowlanych, przetransfekowano za pomocą si-QKI-5 lub si-NC i hodowano przez 48 h. Następnie dodano aktynomycynę D w stężeniu 5 µg/mL i pobrano komórki w czasie 0, 3, 6 i 9 h. Wyizolowano całkowite RNA, a względny poziom ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2 określono za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją po przeprowadzeniu odwrotnej transkrypcji. Względny poziom RNA w każdym punkcie czasowym obliczono, przyjmując poziom ekspresji w czasie 0 h jako 100%.

13. Ilościowa reakcja polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją
Komórki GC-1 oraz tkanki jąder myszy opłukano roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, a następnie poddano lizie w celu izolacji całkowitego RNA. Komplementarne DNA wygenerowano poprzez odwrotną transkrypcję z użyciem odwrotnej transkryptazy AMV. Amplifikację metodą reakcji polimerazy łańcuchowej przeprowadzono przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym oraz zestawu do ilościowego PCR, wykorzystując komplementarne DNA jako matrycę amplifikacji. U6 posłużył jako wewnętrzna referencja dla lncRNA NONMMUT031883.2, natomiast GAPDH wykorzystano jako wewnętrzną referencję dla QKI-5. Względną ekspresję genu docelowego obliczono metodą 2−ΔΔCt25. RNA izolowano również osobno z frakcji cytoplazmatycznej i jądrowej, aby określić lokalizację subkomórkową lncRNA NONMMUT031883.2. Sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1.

GenStarter prawy (5' do 3')Primer odwrotny (5' do 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
RNA U6CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tabela 1: Sekwencje starterów użytych do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Sekwencje starterów prawych i lewych podano w kierunku 5′–3′ dla lncRNA NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 oraz GAPDH.

14. Barwienie hematoksyliną i eozyną
Tkanki jąder i nadjądrzy myszy zanurzono w 4% paraformaldehydzie i utrwalono w temperaturze 4 °C przez 24 h. Po wypłukaniu buforem fosforanowym (PBS) tkanki odwodniono w szeregu stężeń etanolu, zawleczono w parafinie i pocięto na skrawki o grubości 5 µm. Skrawki podgrzewano w temperaturze 60 °C przez 60 min i odparafinowano w ksylenie przez 30 min.

Po nawodnieniu w szeregu roztworów etanolu o malejących stężeniach, skrawki barwiono hematoksyliną przez 5 min, traktowano roztworem różnicującym z kwasu solnego i etanolu przez 10 s, płukano wodą z kranu w celu przejścia w kolor niebieski, a następnie barwiono 1% eozyną przez 2 min. Następnie skrawki odwodniono w 95% etanolu oraz etanolu absolutnym i klarowano w ksylenie przez 30 min. Po wysuszeniu na powietrzu skrawki osadzono w gumie neutralnej. Zmiany morfologiczne w jądrach i najogoniach obserwowano pod mikroskopem.

15. Immunofluorescencja
Parafinowe przekroje jąder myszy poddano odparafinowaniu i rehydratacji w szeregu stężeń etanolu, po czym przeprowadzono mikrofalową odzyskiwanie antygenu w buforze cytrynowym o pH 6.0. Po naturalnym schłodzeniu do temperatury pokojowej przekroje inkubowano z 0,3% Triton X-100 przez 10 min. Próbki blokowano 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze 25 °C przez 60 min, płukano solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS) i inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko Ki67. Następnego dnia zastosowano znakowane fluorochromem przeciwciało drugorzędowe klasy immunoglobulin G i inkubowano przekroje w temperaturze 37 °C w ciemności przez 60 min. Po wypłukaniu buforem PBS przekroje barwiono kontrastowo DAPI przez 10 min i analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Intensywność fluorescencji analizowano przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.

W celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego komórek GC-1, komórki wysiano do płytek 12-dołkowych w zagęszczeniu 1 × 105 komórek/dołek i inkubowano przez 24 h. Komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 30 min, przepuszczczono za pomocą 0,3% Triton X-100 przez 10 min, zablokowano 5% albuminą surowicy bydlęcej, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem pierwotnym przeciwko QKI-5. Pozostałą część procedury wykonano zgodnie z opisem dla skrawków tkanki jąder.

16. Barwienie TUNEL
Parafinowe skrawki tkanek jąder myszy poddano dewaksacji, nawodnieniu w serii rozcieńczeń etanolu, a następnie inkubowano z 0,1% Triton X-100 przez 5 min w celu zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych. Na skrawki równomiernie nanesiono roztwór roboczy proteinazy K w stężeniu 20 µg/mL bez DNazy, po czym inkubowano je w temperaturze 37 °C przez 15 min. Dodano roztwór detekcyjny TUNEL i inkubowano skrawki w ciemności w temperaturze 37 °C przez 90 min. Po inkubacji z DAPI przez 10 min zastosowano medium montażowe zapobiegające zanikaniu fluorescencji, a następnie tkankę jąder obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Komórki GC-1 wysiano do płytek 12-dołkowych i utrwalono 4% paraformaldehydem przez 30 min. Po permeabilizacji 0,1% Triton X-100 przez 5 min, na komórki nałożono roztwór do detekcji TUNEL, a następnie inkubowano je w ciemności przez 60 min. Następnie komórki barwiono DAPI przez 10 min i analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym.

17. Western blotting
Tkanki jąder myszy oraz komórki GC-1 poddano lizie w buforze do lizy komórek stosowanym w immunoprecypitacji na lodzie przez 30 min, a następnie rozbito za pomocą sonikacji. Po wirowaniu zebrano supernatant zawierający białka, a stężenie białka określono przy użyciu zestawu do testu kwasu bicinchonininowego. Supernatant białkowy zmieszano z buforem do ładowania SDS i podgrzewano w wrzącej wodzie przez 10 min. Po rozdziale za pomocą elektroforezy żelowej białka przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu i blokowano 5% albuminą wołową przez 2 h31.

Membrany inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko rozszczepionej kaspazie-3 (1:500), Bcl-2 (1:1000), kaspazie-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), fosforylowanej p38 (1:1000) lub p38 (1:500). Następnego dnia membrany płukano buforem Tris-buffered saline z dodatkiem Tween 20, a następnie inkubowano z kozimi przeciwciałami anty-króliczymi przeciwko immunoglobulinie G w rozcieńczeniu 1:10000 przez 2 h w temperaturze 25 °C. Na powierzchnię membrany naniesiono roboczy roztwór do wzmocnionej chemiluminescencji, a prążki białkowe obrazowano za pomocą systemu do obrazowania żeli. Intensywność prążków analizowano przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, a względną ekspresję białek normalizowano względem GAPDH (1:3000).

Do zahamowania syntezy białek zastosowano cykloheksymidę w stężeniu 50 µg/mL. Aby określić okres półtrwania QKI-5, komórki zbierano w czasie 0, 3, 6 i 9 h, a następnie poziom białka QKI-5 oznaczono metodą Western blotting25.

18. Analiza statystyczna
Wszystkie dane zostały poddane analizie statystycznej oraz przedstawione na wykresach z wykorzystaniem oprogramowania do obliczeń statystycznych, tworzenia grafiki i analizy obrazów. Do oceny normalności rozkładu danych zastosowano test Shapiro-Wilka. Dane eksperymentalne przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Do oceny różnic między grupami wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji. Do porównań post hoc przeprowadzano test LSD-t w przypadku jednorodności wariancji, natomiast test Dunnetta T3 w przypadku wariancji niejednorodnych. Wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną.

Wyniki

Wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 indukuje apoptozę spermatogoniów
Komórki GC-1 poddano transfekcji sh-lncRNA w celu wyciszenia ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2. W porównaniu z komórkami transfekowanymi sh-NC, poziom transkrypcyjny lncRNA NONMMUT031883.2 był wyraźnie obniżony po transfekcji sh-lncRNA, co potwierdziło skuteczne wyciszenie (Rycina 2A). Po wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2 żywotność komórek GC-1 uległa znacznemu zmniejszeniu (Rycina 2B), natomiast uwalnianie LDH znacząco wzrosło, co wskazuje na większe uszkodzenie komórek (Rycina 2C). Barwienie Calcein-AM/PI wykazało zwiększoną liczbę komórek GC-1 dodatnich pod kątem PI oraz zmniejszony odsetek żyjących komórek w grupie sh-lncRNA (Rycina 2D, E). Stopień apoptozy komórek GC-1 wyraźnie wzrósł po wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2 (Rycina 2F, G). Odsetek komórek dodatnich w teście TUNEL był również znacznie podwyższony w grupie sh-lncRNA, co dodatkowo wskazywało na zwiększoną apoptozę (Rycina 2H, I). Ponadto wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 znacząco zwiększyło aktywność kaspazy-3 w komórkach GC-1 (Rycina 2J). W grupie sh-lncRNA ekspresja Bax była wyraźnie zwiększona, ekspresja Bcl-2 była zmniejszona, a stosunek rozszczepionej kaspazy-3 do kaspazy-3 był znacząco podwyższony (Rycina 2K, L). Wyniki te wskazują, że wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 indukuje apoptozę w komórkach GC-1. Wszystkie dane ilościowe uzyskano dla n = 6.

figure-results-1
Rysunek 2: Wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 indukuje apoptozę spermatogoniów. (A) Ilościowa analiza polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2 w komórkach GC-1. (B) Test przeżywalności komórek GC-1 przy użyciu zestawu CCK-8 (Cell Counting Kit-8) po wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2. (C) Uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) z komórek GC-1 po wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2. (D, E) Barwienie Calcein-AM/jodkiem propidyny (PI) w celu oceny przeżywalności komórek GC-1 (20×; pasek skali, 100 µm). (F, G) Analiza cytometryczna apoptozy po wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2. (H, I) Analiza TUNEL (metoda znakowania końców nacięć dUTP za pomocą terminalowej nukleotydylotransferazy) komórek GC-1 (40×; pasek skali, 50 µm). (J) Aktywność kaspazy-3 po wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2. (K, L) Analiza Western blot ekspresji Bcl-2, Bax, kaspazy-3 oraz rozszczepionej kaspazy-3 po transfekcji sh-lncRNA. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; n = 6. ***p < 0.001 w stosunku do sh-NC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

LncRNA NONMMUT031883.2 oddziałuje z QKI-5
Interakcję między lncRNA NONMMUT031883.2 a QKI-5 zbadano w celu wyjaśnienia mechanizmu molekularnego leżącego u podłoża apoptozy spermatogoniów. Po rozdzieleniu frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej analiza qRT-PCR wykazała, że lncRNA NONMMUT031883.2 lokalizuje się głównie w jądrach komórek GC-1 (Rycina 3A). Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że QKI-5 również koncentruje się w jądrze, co stanowi podstawę przestrzenną dla interakcji między lncRNA NONMMUT031883.2 a QKI-5 (Rycina 3B). Okres połowicznego rozpadu lncRNA NONMMUT031883.2 zmierzono po zastosowaniu aktynomycyny D, aby ocenić, czy QKI-5 reguluje stabilność lncRNA. Knockdown QKI-5 nie miał znaczącego wpływu na okres połowicznego rozpadu transkryptu lncRNA (Rycina 3C). Po zahamowaniu syntezy białek cykloheksymidem, knockdown lncRNA NONMMUT031883.2 nie zmienił ekspresji białka QKI-5 (Rycina 3D, E). Następnie za pomocą qRT-PCR oceniono wydajność wychwytu znakowanej biotyną sondy antysensownej celującej w lncRNA NONMMUT031883.2. Sonda antysensowna skutecznie wzbogaciła docelowy lncRNA, w związku z czym została wykorzystana w kolejnym badaniu RNA pull-down (Rycina 3F). Badanie RNA pull-down z następującym po nim Western blottingiem wykazało specyficzną interakcję fizyczną między lncRNA NONMMUT031883.2 a QKI-5 (Rycina 3G, H). Wyniki te wskazują, że lncRNA NONMMUT031883.2 i QKI-5 kolokalizują w jądrach komórek GC-1 i oddziałują specyficznie. Dane ilościowe z Ryciny 3C oraz Ryciny 3D, F uzyskano dla n = 3, a pozostałe dane ilościowe uzyskano dla n = 6.

figure-results-2
Rysunek 3: LncRNA NONMMUT031883.2 oddziałuje z QKI-5. (A) Analiza qRT-PCR dystrybucji jądrowej i cytoplazmatycznej lncRNA NONMMUT031883.2 w komórkach GC-1. (B) Analiza immunofluorescencyjna subkomórkowej lokalizacji QKI-5 w komórkach GC-1 (40×; pasek skali, 50 µm). (C) Analiza qRT-PCR okresu półtrwania lncRNA NONMMUT031883.2 po traktowaniu aktynomicyną D i wyciszeniu QKI-5 (n = 3). (D, E) Analiza Western blot ekspresji białka QKI-5 po traktowaniu cykloheksymidą i wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) Walidacja qRT-PCR wydajności wzbogacania biotynylowanej sondy antysensownej skierowanej przeciwko lncRNA NONMMUT031883.2. (G, H) Analiza RNA pull-down i Western blot oddziaływania między lncRNA NONMMUT031883.2 a QKI-5. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; n = 6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wyciszenie QKI-5 hamuje apoptozę spermatogoniów poprzez supresję szlaku p38 MAPK
Zbadano rolę QKI-5 oraz zależnego od niego szlaku p38 MAPK w apoptozie spermatogoniów. Po transfekcji si-QKI-5 poziomy białka QKI-5 uległy znacznemu obniżeniu w komórkach GC-1, co potwierdziło skuteczność wyciszenia (Ryc. 4A, B). Wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 znacząco zwiększyło stosunek p-p38/p38, podczas gdy jednoczesne wyciszenie QKI-5 zmniejszyło ten stosunek, co wskazuje na hamowanie aktywacji szlaku p38 MAPK (Ryc. 4C, D). Wyciszenie QKI-5 złagodziło uszkodzenia komórek GC-1 wywołane wyciszeniem lncRNA NONMMUT031883.2, natomiast zastosowanie etoposydu jako induktora apoptozy znacząco obniżyło żywotność komórek (Ryc. 4E). Wyciszenie QKI-5 znacząco zmniejszyło odsetek apoptozy w komórkach GC-1, podczas gdy leczenie etoposydem wyraźnie zwiększyło apoptozę (Ryc. 4F, G). Transfekcja si-QKI-5 również znacząco obniżyła aktywność kaspazy-3, podczas gdy leczenie etoposydem zwiększyło aktywność kaspazy-3 (Ryc. 4H). Wyciszenie QKI-5 obniżyło ekspresję Bax, zwiększyło ekspresję Bcl-2 i znacząco zmniejszyło stosunek rozszczepionej kaspazy-3/kaspazy-3, podczas gdy leczenie etoposydem odwróciło te wzorce ekspresji (Ryc. 4I, J). Wyniki te wskazują, że wyciszenie QKI-5 hamuje apoptozę w spermatogoniach GC-1 poprzez inhibicję szlaku p38 MAPK. Wszystkie dane ilościowe uzyskano dla n = 6.

figure-results-3
Rycina 4: Wyciszenie QKI-5 hamuje apoptozę spermatogoniów poprzez supresję szlaku p38 MAPK. (A, B) Analiza Western blot ekspresji QKI-5 w komórkach GC-1 po transfekcji si-NC lub si-QKI-5. (C, D) Analiza Western blot ekspresji fosforylowanej p38 (p-p38) oraz całkowitej p38. (E) Analiza żywotności komórek GC-1 za pomocą testu CCK-8 w różnych grupach badawczych. (F, G) Analiza cytometryczna apoptozy po zastosowaniu etoposydu. (H) Aktywność kaspazy-3 w różnych grupach badawczych. (I, J) Analiza Western blot ekspresji Bax, Bcl-2, kaspazy-3 i aktywnej kaspazy-3 w komórkach GC-1. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; n = 6. ***p < 0,001 względem si-NC lub sh-NC; ###p < 0,001 względem sh-lncRNA; &&&p < 0,001 względem sh-lncRNA + si-QKI-5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

YC hamuje apoptozę spermatogoniów poprzez szlak lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
Po traktowaniu komórek GC-1 surowicą zawierającą YC przez 6, 12 i 24 h, żywotność komórek stopniowo wzrastała wraz ze zwiększeniem stężeń YC i wydłużeniem czasu ekspozycji. W związku z tym stężenia te wybrano do kolejnych eksperymentów, przy czasie traktowania wynoszącym 24 h (Rysunek 5A). Traktowanie YC przez 24 h wyraźnie zwiększyło poziom transkrypcyjny lncRNA NONMMUT031883.2 w komórkach GC-1 (Rysunek 5B) i zwiększyło jego zdolność wiązania z QKI-5 (Rysunek 5C, D). Po traktowaniu YC ekspresja QKI-5 oraz stosunek p-p38/p38 uległy znacznemu obniżeniu w komórkach GC-1, co sugeruje hamowanie szlaku p38 MAPK (Rysunek 5E, F). Traktowanie YC wyraźnie zmniejszyło również wskaźnik apoptozy (Rysunek 5G, H), obniżyło aktywność kaspazy-3 (Rysunek 5I), zwiększyło ekspresję Bcl-2 oraz zmniejszyło ekspresję Bax i stosunek rozszczepionej kaspazy-3/kaspazy-3 (Rysunek 5J, K).

Aby dalej ocenić swoistość szlaku, komórki GC-1 przetransfekowano OE-NC lub OE-QKI-5. Ekspresja białka QKI-5 była znacznie zwiększona w komórkach przetransfekowanych OE-QKI-5, co potwierdziło skuteczną nadekspresję (Rycyna 5L, M). Wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 znacząco obniżyło żywotność komórek, natomiast zastosowanie YC odwróciło ten efekt. Nadekspresja QKI-5 osłabiła działanie cytoprotekcyjne YC (Rycyna 5N). Leczenie YC zmniejszyło również apoptozę indukowaną przez wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 (Rycyna 5O, P), obniżyło aktywność kaspazy-3 (Rycyna 5Q), zredukowało ekspresję Bax, zwiększyło ekspresję Bcl-2 oraz obniżyło stosunek rozszczepionej kaspazy-3 do kaspazy-3 (Rycyna 5R, S). W przeciwieństwie do tego, nadekspresja QKI-5 osłabiła działanie antyapoptotyczne YC. Wyniki te wskazują, że YC zwiększa poziom lncRNA NONMMUT031883.2 i promuje jego wiązanie z QKI-5, hamując tym samym szlak p38 MAPK i tłumiąc apoptozę w komórkach GC-1. Wszystkie dane ilościowe uzyskano dla n = 6.

figure-results-4
Rysunek 5YC hamuje apoptozę spermatogoniów poprzez szlak lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Analiza CCK-8 żywotności komórek GC-1 po ekspozycji na surowicę zawierającą kapsułki Yangjing (YC) przez 6, 12 i 24 h. (B) Analiza qRT-PCR ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2 w komórkach GC-1 po 24 h traktowania YC. (C, D) Analiza RNA pull-down wiązania lncRNA NONMMUT031883.2 z białkiem QKI-5 po zastosowaniu leczenia YC. (E, F) Analiza Western blot ekspresji QKI-5, p-p38 i p38 po zastosowaniu YC. (G, H) Analiza cytometryczna przepływowa apoptozy komórek GC-1 po zastosowaniu YC. (I) Aktywność kaspazy-3 po leczeniu YC. (J, K) Analiza Western blot ekspresji Bcl-2, Bax, kaspazy-3 i rozszczepionej kaspazy-3 po leczeniu YC. (L, M) Analiza Western blot ekspresji QKI-5 po transfekcji OE-NC lub OE-QKI-5. (N) Analiza żywotności komórek GC-1 metodą CCK-8. (O, P) Analiza cytometryczna przepływowo analiza apoptozy w komórkach GC-1 po nadekspresji QKI-5. (Q) Aktywność kaspazy-3 po nadekspresji QKI-5. (R, S) Analiza Western blot ekspresji białek Bax, Bcl-2, kaspazy-3 oraz rozszczepionej kaspazy-3 po nadekspresji QKI-5. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe; n = 6. ***p < 0,001 w stosunku do grupy kontrolnej; ###p < 0,001 przeciwko sh-lncRNA; &&&p < 0,001 versus sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

YC poprawia indukowaną przez CP dysfunkcję spermatogenezy u myszy
Efekty ochronne YC oceniano u myszy z dysfunkcją spermatogenezy. Jądra i najączki myszy w grupie CP wykazywały wyraźny zanik, zmniejszoną objętość oraz matowy wygląd. Po zastosowaniu różnych dawek YC morfologia, pełność i kolor narządów rozrodczych stopniowo uległy poprawie (Rysunek 6A). Względna masa jąder i najączków znacząco wzrosła, przy czym największy efekt zaobserwowano w grupie otrzymującej 800 mg/kg YC (Rysunek 6B, C).

Wskaźnik deformacji plemników był znacznie wyższy w grupie CP, przy czym często występowały takie nieprawidłowości jak zniekształcenie głowy, zwijanie się ogona oraz uszkodzenia strukturalne. Liczba oraz ruchliwość plemników były również wyraźnie zmniejszone. Po zastosowaniu leczenia YC morfologia plemników uległa poprawie (Rycina 6D), liczba plemników wzrosła (Rycina 6E), a ruchliwość plemników uległa znacznemu zwiększeniu (Rycina 6F). Eksperymenty z kojenia wykazały, że płodność oraz wielkość miotu były znacznie zmniejszone w grupie CP, natomiast leczenie YC poprawiło płodność (Rycina 6G). Poziomy testosteronu w surowicy, hormonu folikulupobudzającego oraz hormonu luteinizującego były również wyraźnie obniżone w grupie CP i wzrosły po leczeniu YC (Rycina 6H-J). Wyniki te wskazują, że YC poprawia zanik organów rozrodczych, jakość plemników, płodność oraz wydzielanie hormonów płciowych u myszy z dysfunkcją spermatogenezy. Dane ilościowe z Ryciny 6G uzyskano dla n = 9, a pozostałe dane ilościowe uzyskano dla n = 6.

figure-results-5
Rycina 6YC poprawia indukowaną przez CP dysfunkcję spermatogenezy u myszy. (A-C) Morfologia narządów rozrodczych w grupie kontrolnej oraz w grupach leczonych cyklofosfamidą (CP) i YC (A), indeks jąder (B), oraz indeks najądrza (C). (D-F) Morfologia plemników (D) (40×; pasek skali, 50 µm), zagęszczenie plemników (E), oraz ruchliwość plemników (F). (G) Ocena płodności samców przeprowadzona za pomocą eksperymentów kojarzenia (n = 9). (H-J) Poziomy hormonu folikulostymulującego (FSH), testosteronu oraz hormonu luteinizującego (LH) w surowicy, zmierzone przy użyciu zestawów do enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA). Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe; n = 6. ***p < 0,001 w porównaniu z grupą kontrolną; #p < 0,05, ##p < 0,01 oraz ###p < 0,001 w stosunku do CP. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

YC zmniejsza uszkodzenia histopatologiczne jąder u myszy z dysfunkcją spermatogenezy
Naprawczy wpływ YC na uszkodzenia tkanki jądra oceniono za pomocą barwienia histologicznego. Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało nienaruszoną strukturę tkanki, wyraźne warstwy komórkowe i odpowiednią liczbę komórek w grupie kontrolnej. W przeciwieństwie do niej, w grupie CP zaobserwowano wyraźny zanik kanalików plemnikowych i dezorganizację strukturalną, zmniejszoną liczbę komórek oraz zapadnięcie światła najądrza. Po zastosowaniu YC uszkodzenia jąder i najądrza uległy zmniejszeniu, struktura kanalików plemnikowych została stopniowo przywrócona, a komórki stały się bardziej uporządkowane i zwiększyły swoją liczbę (Rysunek 7A, B).

Odsetek komórek wykazujących pozytywny wynik testu TUNEL w tkance jąder był znacznie zwiększony w grupie CP i znacząco zmniejszony po zastosowaniu leczenia YC (Rysunek 7C, D). Ekspresja Bax oraz stosunek aktywowanej kaspazy-3 do kaspazy-3 były wyraźnie zwiększone w grupie CP, podczas gdy ekspresja Bcl-2 była zmniejszona. Leczenie YC odwróciło te wzorce ekspresji (Rysunek 7E, F). Analiza immunofluorescencyjna wykazała, że intensywność fluorescencji Ki67 była wyraźnie zmniejszona w grupie CP i znacząco zwiększona po zastosowaniu leczenia YC, co sugeruje przywrócenie proliferacji komórek spermatogennych (Rysunek 7G, H). Wyniki te sugerują, że YC zmniejsza wywołane przez CP uszkodzenia histopatologiczne w jądrach i najądrzach, hamuje nadmierną apoptozę oraz promuje proliferację komórek spermatogennych. Wszystkie ilościowe dane uzyskano dla n = 6.

figure-results-6
Rysunek 7YC łagodzi zmiany histopatologiczne w tkance jąder myszy wywołane przez CP. (A, B) Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) jąder* (A) i najądrza (B) po traktowaniu YC (20×; pasek skali, 100 µm). (C, D) Analiza TUNEL w celu oceny apoptozy w tkance jądra myszy (40×; pasek skali, 50 µm). (E, F) Analiza Western blot ekspresji Bax, Bcl-2, kaspazy-3 oraz rozszczepionej kaspazy-3 w tkance jąder po zastosowaniu YC. (G, H) Analiza immunofluorescencyjna ekspresji Ki67 w tkance jąder myszy (40×; skala, 50 µm). Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe; n = 6. ***p < 0,001 w porównaniu z grupą kontrolną; p < 0,001 w porównaniu do CP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

YC poprawia dysfunkcję spermatogenną i patologiczne uszkodzenia jąder u myszy poprzez szlak lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
Dalszej ocenie poddano udział szlaku lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK w efektach działania YC. Ekspresja lncRNA NONMMUT031883.2 była znacznie obniżona w tkance jąder myszy z grupy CP, podczas gdy ekspresja QKI-5 oraz stosunek p-p38/p38 były wyraźnie zwiększone (Rysunek 8A-D). Po zastosowaniu leczenia YC ekspresja lncRNA NONMMUT031883.2 wzrosła, natomiast ekspresja QKI-5 oraz stosunek p-p38/p38 uległy zmniejszeniu.

Aby dalej ocenić specyficzność szlaku, zastosowano wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 u myszy przy użyciu sh-lncRNA. Poziom ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2 uległ znacznemu obniżeniu, co potwierdziło pomyślne wyciszenie (Ryc. 8E). Po wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2 poziom QKI-5 w tkance jądr nie zmienił się znacząco, natomiast poziom p-p38/p38 uległ istotnemu wzrostowi (Ryc. 8F, G). Leczenie sh-lncRNA osłabiło efekty podania 800 mg/kg YC, co doprowadziło do obniżenia ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2 w tkance jądr (Ryc. 8H) oraz zwiększenia poziomów p-p38/p38 (Ryc. 8I, J). Leczenie YC znacząco zwiększyło liczbę i ruchliwość plemników po indukcji CP, podczas gdy wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 osłabiło te efekty (Ryc. 8K, L). Leczenie YC zwiększyło również poziomy testosteronu, hormonu folikulotropowego oraz hormonu luteinizującego w grupie CP, podczas gdy wyciszenie lncRNA osłabiło te efekty (Ryc. 8M-O).

Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało, że YC łagodzi uszkodzenia jąder indukowane przez CP, w tym zanik kanalików nasiennych i zaburzenia organizacji komórek spermatogennych. Wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 osłabiło te efekty ochronne (Rycyna 8P). Po zastosowaniu YC zmniejszono ekspresję Bax oraz stosunek rozszczepionej kaspazy-3 do kaspazy-3, natomiast zwiększono ekspresję Bcl-2. Wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 odwróciło te efekty w odniesieniu do białek związanych z apoptozą (Rycyna 8Q, R). Wyniki te wskazują, że YC poprawia jakość nasienia i zmniejsza uszkodzenia tkanki jądra po indukcji CP poprzez upregulację lncRNA NONMMUT031883.2, downregulację QKI-5 oraz hamowanie szlaku p38 MAPK. Wszystkie dane ilościowe uzyskano dla n = 6.

figure-results-7
Rysunek 8YC poprawia spermatogenezę i zmniejsza uszkodzenia histopatologiczne jąder poprzez ścieżka sygnałowa lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Analiza qRT-PCR ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2 w tkance jąder myszy. (B-D) Analiza Western blot ekspresji QKI-5, p-p38 i p38 w tkance jąder myszy po zastosowaniu YC. (E) Walidacja qRT-PCR wyciszenia lncRNA NONMMUT031883.2 w tkance jąder myszy po podaniu sh-lncRNA. (F, G) Analiza Western blot poziomów QKI-5 oraz p-p38/p38 w tkance jąder myszy po wyciszeniu lncRNA NONMMUT031883.2. (H) Analiza qRT-PCR ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2 w tkance jądra myszy po zastosowaniu leczenia YC i podaniu sh-lncRNA. (I, J) Analiza Western blot ekspresji p-p38 i p38 w tkance jąder myszy. (K, L) Liczba plemników (K) oraz ruchliwość plemników (L) w różnych grupach badawczych. (M-O) Poziomy FSH, testosteronu i LH w surowicy krwi zmierzono przy użyciu zestawów do enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA). (P) Barwienie HE tkanki jądra u myszy traktowanych CP (20×; pasek skali, 100 µm). (Q, R) Analiza Western blot ekspresji białek Bcl-2, Bax, rozszczepionej kaspazy-3 oraz kaspazy-3 w tkance jądra myszy. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe; n = 6. ***p < 0,001 w porównaniu z grupą kontrolną; p < 0,001 w stosunku do CP; p < 0,001 versus 800 mg/kg YC + sh-NC. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Dostępność danych:
Surowe dane stanowiące podstawę wyników niniejszego badania zostały udostępnione jako Plik uzupełniający 1.

Plik uzupełniający 1: Oryginalne dane. Ten plik Excel zawiera surowe dane numeryczne stanowiące podstawę analiz ilościowych przedstawionych na Rysunkach 2–8. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Nabyta dysfunkcja spermatogenezy indukowana chemioterapią jest istotną przyczyną męskiej niepłodności32,33,34. Jednakże specyficzne mechanizmy molekularne nie są jeszcze w pełni poznane. Wyniki niniejszego badania wykazują, że kapsułki Yangjing (YC) w sposób zależny od dawki poprawiają nieprawidłowości w poziomach hormonów płciowych, uszkodzenia histopatologiczne jąder oraz upośledzenie płodności u samców myszy indukowane cyklofosfamidem (CP). Poprawy te były związane z nadekspresją lncRNA NONMMUT031883.2 oraz inhibicją szlaku QKI-5/p38 MAPK, co sugeruje, że YC może działać poprzez tę oś, aby zredukować nieprawidłową apoptozę spermatogoniów.

Toksyczność rozrodcza CP została szeroko udokumentowana. Jego metabolit, akroleina, może gromadzić się w tkance jądr i indukować apoptozę komórek zarodkowych poprzez stres oksydacyjny, uszkodzenia DNA i inne ścieżki. Spermatogonia, jako komórki początkowe spermatogenezy, są szczególnie wrażliwe na cytotoksyczne działanie CP35,36. Cao et al. stwierdzili, że sygnalizacja punktów kontrolnych uszkodzeń DNA była znacznie wzmocniona w tkance jąder pacjentów z azoospermią po chemioterapii CP, podczas gdy geny związane z rozwojem plemników były znacząco wyciszone, a integralność strukturalna kanalików nasiennych została zaburzona37. Bcl-2 jest białkiem antyapoptotycznym, które działa poprzez utrzymywanie integralności błony mitochondrialnej38. Bax jest białkiem proapoptotycznym, a jego nadekspresja może promować uwalnianie cytochromu c z mitochondriów do cytoplazmy, aktywować kaskadę kaspaz i indukować apoptozę39,40. Saleh et al. wykazali, że ekspozycja na CP spowodowała zanik kanalików nasiennych i obrzęk śródmiąższowy u myszy, czemu towarzyszyło obniżenie poziomu Bcl-2 i wzrost poziomu Bax, co ostatecznie doprowadziło do zmniejszenia liczby i ruchliwości plemników41. Zatem hamowanie nadmiernej apoptozy spermatogonialnej indukowanej przez CP może stanowić istotny cel w ochronie funkcji rozrodczych po chemioterapii. W niniejszym badaniu interwencja z użyciem YC w sposób zależny od dawki zmniejszyła nieprawidłowości w wydzielaniu hormonów płciowych w surowicy indukowane przez CP, naprawiła uszkodzenia kanalików nasiennych oraz poprawiła ruchliwość plemników i płodność samców. YC zwiększył również ekspresję Bcl-2 i zmniejszył ekspresję Bax, stosunek rozszczepionej kaspazy-3 do kaspazy-3 oraz liczbę komórek TUNEL-dodatnich w tkance jąder. In vitro surowica zawierająca YC wyraźnie zmniejszyła apoptozę komórek GC-1 i zwiększyła ich żywotność, co dodatkowo potwierdza hamujący wpływ na apoptozę spermatogonialną.

Długie niekodujące RNA (lncRNA) pełnią istotne role regulacyjne w procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w spermatogenezie oraz apoptozie komórek linii zarodkowej42,43. Nieprawidłowa ekspresja lncRNA może upośledzać funkcję spermatogeniczną jąder poprzez regulację stresu oksydacyjnego i szlaków apoptotycznych, stanowiąc istotny mechanizm molekularny męskiej niepłodności44. Wang et al. wykazali, że lncRNA DNM3OS reguluje oś miR-214-5p/E2F2, co prowadzi do zmniejszenia aktywności komórek spermatogonialnych oraz zwiększenia apoptozy i starzenia się komórek, co ostatecznie przyczynia się do rozwoju azoospermii niezatkowej45. Wcześniejsze badania wykazały również, że wyciszenie lncRNA NONMMUT074098.2 w spermatogoniach indukuje apoptozę25. Badania te wskazują, że lncRNA są ważnymi regulatorami apoptozy spermatogonialnej i spermatogenezy. W niniejszym badaniu wyciszenie lncRNA NONMMUT031883.2 wywołało apoptozę spermatogonialną. Jego ekspresja była znacząco obniżona w tkance jąder myszy po indukcji CP, natomiast interwencja YC częściowo przywróciła jego ekspresję. Dodatkowo interwencja YC złagodziła nieprawidłową apoptozę spermatogonialną wywołaną wyciszeniem lncRNA NONMMUT031883.2, co sugeruje, że ochronny efekt YC może być związany z regulacją tego lncRNA.

QKI-5 jest białkiem wiążącym RNA należącym do rodziny STAR i uczestniczy w kilku procesach fizjologicznych i patologicznych poprzez regulację splicingu, stabilności i wydajności translacji docelowego mRNA46,47. Wcześniejsze badania wykazały, że QKI-5 jest istotnym regulatorem w układzie rozrodczym, a jego nieprawidłowa ekspresja może promować apoptozę komórek linii zarodkowej i upośledzać funkcję plemników poprzez aktywację szlaku p38 MAPK w dół sygnału25. Li et al. stwierdzili, że hamowanie aktywacji szlaku p38 MAPK zmniejszyło uszkodzenia tkanki jawoskrzesieniowej indukowane CP i przywróciło funkcję bariery krew-jądro u szczurów48. Wyniki te sugerują, że oś QKI-5/p38 MAPK może być istotną drogą regulującą apoptozę spermatogoniów i potencjalnym celem leczenia dysfunkcji spermatogenezy. W niniejszym badaniu ekspresja QKI-5 oraz fosforylacja p38 były znacznie zwiększone w tkance jawoskrzesieniowej myszy po indukcji CP, podczas gdy interwencja YC zmniejszyła ekspresję QKI-5 i aktywację szlaku p38 MAPK. LncRNA NONMMUT031883.2 bezpośrednio wiązało się z QKI-5, natomiast ekspresja QKI-5 nie wpływała na stabilność lncRNA, co sugeruje, że lncRNA NONMMUT031883.2 może regulować funkcję QKI-5 poprzez bezpośrednią interakcję. Knockdown QKI-5 złagodził uszkodzenia komórek GC-1 spowodowane knockdownem lncRNA NONMMUT031883.2, podczas gdy nadekspresja QKI-5 zmniejszyła ochronne działanie YC na komórki GC-1. Li et al. zgłosili, że lncRNA NONMMUT074098.2 reguluje apoptozę komórek linii zarodkowej poprzez wiązanie się z QKI-525. Niniejsze wyniki pokazują, że lncRNA NONMMUT031883.2 również wiąże się z QKI-5 i jest zaangażowane w regulację apoptozy spermatogoniów. Podsumowując, dane te sugerują, że YC może zwiększać ekspresję lncRNA NONMMUT031883.2, hamować szlak QKI-5/p38 MAPK, redukować nieprawidłową apoptozę spermatogoniów i łagodzić indukowaną przez CP dysfunkcję spermatogenezy. Należy jednak zauważyć, że YC jest wieloskładnikową formulacją ziołową, która prawdopodobnie działa na wiele celów. Nie można wykluczyć innych mechanizmów, takich jak bezpośrednie działanie antyoksydacyjne składników YC, modulacja innych szlaków sygnałowych lub regulacja epigenetyczna niezależna od osi lncRNA-QKI-5, które mogą przyczyniać się do obserwowanych efektów ochronnych.

Należy przyznać istnienie kilku ograniczeń. Badanie przeprowadzono wyłącznie na modelu mysim oraz na linii komórkowej GC-1, a w pracy zabrakło walidacji z wykorzystaniem próbek klinicznych pobranych od pacjentów z niepłodnością. Spermatogeneza jest procesem złożonym, a pełny cykl spermatogenny u myszy trwa około 35 dni49,50. Zastosowany w niniejszym badaniu 30-dniowy schemat podawania YC nie obejmował pełnego cyklu spermatogennego. Dlatego zasadne jest przeprowadzenie przyszłych badań z wykorzystaniem protokołów interwencyjnych trwających ≥35 dni, aby systematycznie ocenić efekty terapeutyczne YC w obrębie całego cyklu spermatogennego. Ponadto wymagają dalszych badań precyzyjne zdarzenia molekularne następujące po związaniu lncRNA NONMMUT031883.2 z QKI-5, takie jak zmiany w aktywności splicingu QKI-5 i jego lokalizacji subkomórkowej, a także rozpoznawanie i regulacja celów splicingu w dalszej kaskadzie. Co więcej, choć terapia YC zwiększyła ekspresję lncRNA NONMMUT031883.2, czynniki transkrypcyjne działające w górę szlaku oraz mechanizmy epigenetyczne pozostają do wyjaśnienia. Przyszłe badania obejmujące analizę promotora i testy immunoprecypitacji chromatyny są niezbędne do wyjaśnienia podstaw molekularnych indukowanej przez YC ekspresji lncRNA NONMMUT031883.2. Ponadto w przyszłych badaniach należy ocenić efekty działania YC u pacjentów z męską niepłodnością związaną z chemioterapią oraz zbadać ekspresję lncRNA NONMMUT031883.2 w tkance jądr lub nasieniu, aby określić jego potencjalną wartość kliniczną jako marker diagnostyczny lub terapeutyczny.

Podsumowując, YC zwiększa ekspresję lncRNA NONMMUT031883.2 i hamuje aktywację szlaku QKI-5/p38 MAPK, co prowadzi do zmniejszenia apoptozy spermatogonii oraz uszkodzeń jąder, łagodząc dysfunkcję spermatogenezy u myszy. Wyniki te wyjaśniają mechanizm molekularny leżący u podstaw ochronnego działania YC przeciwko dysfunkcji spermatogenezy oraz rozszerzają obecną wiedzę na temat roli lncRNA NONMMUT031883.2 i szlaku QKI-5/p38 MAPK w regulacji spermatogenezy. LncRNA NONMMUT031883.2 oraz QKI-5 mogą stanowić potencjalne cele terapeutyczne w leczeniu męskiej dysfunkcji spermatogenezy.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak finansowych i niefinansowych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana przez National Natural Science Foundation of China (grant nr 82374257), czwartą edycję Peak Academic Talent Training Program of Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine (grant nr k2026yrc74) oraz Projekty Badań Naukowych nad Tradycyjną Medycyną Chińską i Zintegrowaną Medycyną Chińską i Zachodnią w Prowincji Jiangsu (grant nr CYTF2026019).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Actinomycin DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559Inhibitor transkrypcji stosowany w analizach stabilności RNA
AMV odwrotna transkryptazaTakara, Tokyo, Japan2621Enzym do syntezy komplementarnego DNA
Zestaw detekcyjny Annexin V-APC/PIBioLab Technology, Beijing, ChinaKFS191Zestaw do analizy apoptozy metodą cytometrii przepływowej
Medium montażowe AntifadeMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Medium montażowe do zachowania fluorescencji
Przeciwciało pierwotne przeciw BaxAffinity Biosciences, OH, USAAF0120Przeciwciało pierwotne do detekcji Bax
Zestaw BCAMacklin, Shanghai, ChinaB917925Zestaw do oznaczania stężenia białek
Przeciwciało pierwotne przeciw Bcl-2Affinity Biosciences, OH, USAAF0769Przeciwciało pierwotne do detekcji Bcl-2
Swojowa albumina serum (BSA)BioLab Technology, Beijing, ChinaBTN131070Odczynnik blokujący
Zestaw detekcyjny Calcein/PIBeyotime, Shanghai, ChinaC2015MZestaw do barwienia żywych i martwych komórek
Zestaw do oznaczania aktywności kaspazy-3BioLab Technology, Beijing, ChinaQN2866Zestaw do pomiaru aktywności kaspazy-3
Przeciwciało pierwotne przeciw kaspazie-3Abcam, MA, USAab184787Przeciwciało pierwotne do detekcji kaspazy-3
Odczynnik CCK-8MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Odczynnik do oceny żywotności komórek
Przeciwciało pierwotne przeciw ciętej kaspazie-3Abcam, MA, USAab32042Przeciwciało pierwotne do detekcji ciętej kaspazy-3
CykluheksymidMacklin, Shanghai, ChinaH823111Inhibitor syntezy białek stosowany w analizach stabilności białek
CyklofosfamidMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Stosowany do indukowania dysfunkcji spermatogenezy
Odczynnik DAPIBeyotime, Shanghai, ChinaC1006Barwnik przeciwjądrowy
Pożywka DMEMWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNLM-302Pożywka do hodowli komórek GC-1
Gotowy roztwór ECLSolarbio, Beijing, ChinaSW2030Substrat chemiluminescencyjny do detekcji prążków białkowych
EtopozydMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Agent indukujący apoptozę
Cytometr przepływowyBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburUrządzenie do analizy apoptozy
Oprogramowanie FlowJoBD Biosciences, CA, USAv10.8Oprogramowanie do analizy danych z cytometrii przepływowej
Mikroskop fluorescencyjnyLeica, Heidelberg, GermanyDM3000Urządzenie do obrazowania fluorescencyjnego
Fluorescencyjne przeciwciało wtórne IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB22303Przeciwciało wtórne do detekcji immunofluorescencyjnej
Zestaw ELISA do hormonu folikulotropowego (FSH)Huamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E06871mZestaw do pomiaru stężenia hormonu folikulotropowego w surowicy
Przeciwciało pierwotne przeciw GAPDHAffinity Biosciences, OH, USAT0004Przeciwciało kontrolne do Western blottingu
Komórki GC-1Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChinaSNL-302Linia komórkowa spermatogonialna myszy
System obrazowania żeliJinpeng Analysis Instrument, Shanghai, ChinaJP-2880System obrazowania do wizualizacji żeli i blotów
System obrazowania żeliInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500System obrazowania chemiluminescencyjnego dla Western blotów
Kozie przeciwciało anty-królicze IgGServicebio, Wuhan, ChinaGB23303Przeciwciało wtórne do Western blottingu
Roztwór hematoksylinyBioLab Technology, Beijing, ChinaYT165Barwnik jądrowy do analizy histologicznej
Roztwór różnicujący z etanolu i kwasu solnegoBeyotime, Shanghai, ChinaC0163SOdczynnik różnicujący do barwienia hematoksyliną
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of Health, USA1.54hOprogramowanie do kwantyfikacji obrazów
Bufor do lizy komórek IPBeyotime, Shanghai, ChinaP0013Bufor do lizy stosowany w immunoprecypitacji i ekstrakcji białek
Przeciwciało pierwotne przeciw Ki67Affinity Biosciences, OH, USAAF0198Przeciwciało pierwotne do detekcji Ki67
Zestaw do analizy cytotoksyczności LDHBeyotime, Shanghai, ChinaC0016Zestaw do pomiaru uwalniania dehydrogenazy mleczanowej i uszkodzeń komórkowych
Mikroskop świetlnyOlympus, Tokyo, JapanCKX53Stosowany do liczenia plemników i obserwacji morfologicznej
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001Odczynnik do transfekcji
Czytnik mikropłytekMolecular Devices, CA, USASpectraMax MiniUrządzenie do pomiarów absorbancji
Zestaw ELISA do hormonu luteinizującego myszyHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E12770mZestaw do pomiaru stężenia hormonu luteinizującego w surowicy
Zestaw ELISA do testosteronu myszyHuamei Biotech, Wuhan, ChinaCSB-E05101mZestaw do pomiaru stężenia testosteronu w surowicy
Guma neutralnaBioLab Technology, Beijing, ChinaQN1253Medium montażowe do przekrojów histologicznych
Przeciwciało pierwotne przeciw p38Affinity Biosciences, OH, USAAF6456Przeciwciało pierwotne do detekcji całkowitego białka p38
ParaformaldehydMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Utrwalacz do komórek i tkanek
Zestaw PARISInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921Zestaw do frakcjonowania RNA jądrowego i cytoplazmatycznego
System PCRABI, CA, USAABI PRISM 7300Urządzenie do PCR w czasie rzeczywistym
Przeciwciało pierwotne przeciw p-p38Affinity Biosciences, OH, USAAF3455Przeciwciało pierwotne do detekcji fosforylowanego białka p38
Roztwór proteinazy KBeyotime, Shanghai, ChinaST532Odczynnik do permeabilizacji tkanek przed barwieniem TUNEL
Membrany PVDFMillipore, MA, USAISEQ00010Membrany do transferu białek w Western blottingu
Przeciwciało pierwotne przeciw QKI-5Abcam, MA, USAab126742Przeciwciało pierwotne do detekcji QKI-5
Bufor wiążący RNAInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DBufor do reakcji wiązania RNA-białko
Bufor do ładowania SDSBeyotime, Shanghai, ChinaP0286Bufor do ładowania próbek w SDS-PAGE
Magnetyczne kulki streptawidynoweMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Kulki magnetyczne do wychwytywania sond RNA znakowanych biotyną
Zestaw TB Green FAST qPCRTakara, Tokyo, JapanCN830SZestaw odczynników do ilościowego PCR
Triton X-100Macklin, Shanghai, ChinaT824275Odczynnik permeabilizujący
Odczynnik TRIzolInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNOdczynnik do ekstrakcji całkowitego RNA
Roztwór detekcyjny TUNELBeyotime, Shanghai, ChinaC1086Odczynnik do detekcji fragmentacji DNA
KsylenMacklin, Shanghai, ChinaX821391Odczynnik do usuwania parafiny i przejrzystości tkanek

Bibliografia

  1. Bhattacharya I, Sharma SS, Majumdar SS. Etiology of male infertility: an update. Reprod Sci. 2024;31(4):942-965.
  2. Dong S, et al. Testicular aging, male fertility and beyond. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1012119.
  3. Wang X, et al. Decoding the pathogenesis of spermatogenic failure in cryptorchidism through single-cell transcriptomic profiling. Cell Rep Med. 2024;5(9):101709.
  4. Stallmeyer B, et al. Inherited defects of piRNA biogenesis cause transposon de-repression, impaired spermatogenesis, and human male infertility. Nat Commun. 2024;15(1):6637.
  5. Szlachcikowska D, Koszła O, Sołek P, Tabęcka-Łonczyńska A. Non-canonical apoptosis mediates oxaliplatin-induced disruption of spermatogenic cells: implications for male fertility. Chem Biol Interact. 2026;431:112009.
  6. Chi YN, et al. Geniposide attenuates spermatogenic dysfunction via .inhibition of endoplasmic reticulum stress in male mice. Chem Biol Interact. 2022;366:110144.
  7. Guo XB, et al. Protective effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes against the reproductive toxicity of cyclophosphamide is associated with the p38 MAPK/ERK and AKT signaling pathways. Asian J Androl. 2021;23(4):386-391.
  8. Lamb DJ. Chromosome defects and male factor infertility. Fertil Steril. 2025;123(6):933-942.
  9. Kathrins M, Niederberger C. Diagnosis and treatment of infertility-related male hormonal dysfunction. Nat Rev Urol. 2016;13(6):309-323.
  10. Piechka A, et al. Molecular mechanisms of cellular dysfunction in testes from men with non-obstructive azoospermia. Nat Rev Urol. 2024;21(2):67-90.
  11. Li Z, et al. The role of Cistanches Herba and its ingredients in improving reproductive outcomes: a comprehensive review. Phytomedicine. 2024;129:155681.
  12. Jiang X, et al. Shenling Baizhu San improves spermatogenic dysfunction in hyperuricemia mice by regulating Sirt3/Nrf2 to inhibit testicular ferroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;340:119310.
  13. Deng W, Sun D, Cai B, Jin B. Yangjing capsule improves oligoasthenozoospermia by promoting nitric oxide production through the PLCγ1/AKT/eNOS pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1056091.
  14. Zhao H, et al. Yangjing Capsule ameliorates spermatogenesis in male mice exposed to cyclophosphamide. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:980583.
  15. Jin B, et al. Yangjing Capsule improves testicular angiogenesis by activating the VEGFA/eNOS signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:1957267.
  16. Guo W, et al. Chlorocholine chloride exposure induced spermatogenic dysfunction via .iron overload caused by AhR/PERK axis-dependent ferritinophagy activation. Ecotoxicol Environ Saf. 2024;274:116193.
  17. Wang Z, et al. Yangjing Capsule extract promotes proliferation of GC-1 Spg cells. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:640857.
  18. Zhang P, et al. LncRNA-mediated adipogenesis in different adipocytes. Int J Mol Sci. 2022;23(13).
  19. Núñez-Martínez HN, Recillas-Targa F. Emerging functions of lncRNA loci beyond the transcript itself. Int J Mol Sci. 2022;23(11).
  20. Herman AB, Tsitsipatis D, Gorospe M. Integrated lncRNA function upon genomic and epigenomic regulation. Mol Cell. 2022;82(12):2252-2266.
  21. Wang JZ, et al. QKI-5 regulates the alternative splicing of the cytoskeletal gene ADD3 in lung cancer. J Mol Cell Biol. 2021;13(5):347-360.
  22. Zeng Y, et al. Nickel induces blood-testis barrier damage through ROS-mediated p38 MAPK pathways in mice. Redox Biol. 2023;67:102886.
  23. Luo D, He Z, Yu C, Guan Q. Role of p38 MAPK signaling in testis development and male fertility. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6891897.
  24. Xia C, et al. LncRNA CCAT1 enhances chemoresistance in hepatocellular carcinoma by targeting QKI-5. Sci Rep. 2022;12(1):7826.
  25. Li K, et al. A long noncoding RNA binding to QKI-5 regulates germ cell apoptosis via .the p38 MAPK signaling pathway. Cell Death Dis. 2019;10(10):699.
  26. Zhou X, et al. ANKRD49 inhibits etoposide-induced intrinsic apoptosis of GC-1 cells by modulating NF-κB signaling. Mol Cell Biochem. 2019;457(1-2):21-29.
  27. Fang C, et al. Integrative proteomics and metabolomics approach to identify the key roles of icariin-mediated protective effects against cyclophosphamide-induced spermatogenesis dysfunction in mice. Front Pharmacol. 2022;13:1040544.
  28. Li K, et al. Adeno-associated-virus-mediated delivery of CRISPR-CasRx induces efficient RNA knockdown in the mouse testis. Theranostics. 2024;14(10):3827-3842.
  29. Yi H, et al. Retinoic acid mitigates NSC319726-induced spermatogenesis dysfunction through cuproptosis-independent mechanisms. Cell Biol Toxicol. 2024;40(1):26.
  30. Guo Y, Wang A, Liu X, Li E. Effects of resveratrol on reducing spermatogenic dysfunction caused by high-intensity exercise. Reprod Biol Endocrinol. 2019;17(1):42.
  31. Beeraka NM, et al. Ginsenoside Rh4 suppresses Notch3 and PI3K/Akt signaling to inhibit the growth and metastasis of gastric cancer cells. J Cancer Biomol Ther. 2025;2(1):145-156.
  32. Li P, et al. Proteomic analysis of cisplatin-induced spermatogenesis defects in mice. Ann Med. 2026;58(1):2612816.
  33. Wang Z, et al. Melatonin ameliorates paclitaxel-induced spermatogenesis and fertility defects in mice. J Cell Mol Med. 2022;26(4):1219-1228.
  34. Abdi M, et al. Cyclophosphamide-induced infertility and the impact of antioxidants. Am J Reprod Immunol. 2024;92(6):e70014.
  35. Özbilgin MK, Demirören S, Üçöz M, Oztatlici M. Cyclophosphamide suppresses spermatogenesis in the testes of mice through downregulation of miR-34b and miR-34c. Andrologia. 2021;53(7):e14071.
  36. Poojary KK, et al. Curcumin nanocrystals attenuate cyclophosphamide-induced testicular toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 2021;433:115772.
  37. Cao J, et al. Single-cell map of human azoospermic testes caused by cyclophosphamide chemotherapy. Sci Data. 2024;11(1):163.
  38. Dong Y, et al. New insights into polycyclic aromatic hydrocarbons: Phenanthrene targets ribosomes to induce neuronal apoptosis. Aquat. Toxicol. 2026;298:107884.
  39. Wang Y, et al. Interplay between elemental imbalance-related PI3K/Akt/mTOR-regulated apoptosis and autophagy in arsenic (III)-induced jejunum toxicity of chicken. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2018;25(19):18662-18672.
  40. Liu H, et al. Integrating network toxicology, transcriptomics and experimental validation to elucidate the potential mechanisms of fluoride-induced neurotoxicity in zebrafish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2026;306:110549.
  41. Saleh DO, et al. Cyclophosphamide-induced testicular injury: the role of chrysin in mitigating iron overload and ferroptosis. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(5):5475-5489.
  42. Dong S, et al. Loss of lncRNAs 1700101O22Rik and 1700027A15Rik causes sperm malformation and subfertility. Andrology. 2025;13(5):1223-1235.
  43. Liu W, et al. A novel meiosis-related lncRNA, Rbakdn, contributes to spermatogenesis by stabilizing Ptbp2. Front Genet. 2021;12:752495.
  44. Sun TC, et al. LncRNAs induce oxidative stress and spermatogenesis by regulating endoplasmic reticulum genes and pathways. Aging (Albany NY). 2021;13(10):13764-13787.
  45. Hua R, et al. DNM3OS enhances the apoptosis and senescence of spermatogonia associated with nonobstructive azoospermia by providing miR-214-5p and decreasing E2F2 expression. Anal Cell Pathol (Amst). 2023;2023:1477658.
  46. Wang S, et al. Quaking 5 suppresses TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition and cell invasion in lung adenocarcinoma. EMBO Rep. 2021;22(6):e52079.
  47. Chen X, et al. The emerging roles of the RNA-binding protein QKI in cardiovascular development and function. Front Cell Dev Biol. 2021;9:668659.
  48. Li J, et al. Qiangjing tablets repair blood-testis barrier dysfunction in rats by regulating oxidative stress and the p38 MAPK pathway. BMC Complement Med Ther. 2022;22(1):133.
  49. Tang Z, et al. MRE11 is essential for the long-term viability of undifferentiated spermatogonia. Cell Prolif. 2024;57(9):e13685.
  50. Jiao Y, Feng Z, Zhang T, Chen X. Impact of Vitamin D(3) Supplementation on Androgens and Semen Parameters in Infertile Men: A Systematic Review and Meta-Analysis Based on Prospective Randomised Controlled Trials. Arch. Esp. 2025;78(6):772-781.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

BiologyYangjing Capsulesspermatogenic dysfunctionlncRNA NONMMUT031883 2Quaking I 5p38 MAPK pathway

Powiązane artykuły