Znormalizowany schemat pobierania próbek kału od ludzi oraz zautomatyzowanej ekstrakcji kwasu dezoksyrybonukleinowego z wykorzystaniem procesora z cząstkami magnetycznymi

Podsumowanie

Celem niniejszego protokołu jest standaryzacja pobierania próbek kału od ludzi oraz zautomatyzowana ekstrakcja kwasu deinoksyrybonukleinowego przy użyciu procesora cząstek magnetycznych.

Streszczenie

Sekwencjonowanie mikrobiomu jelitowego stało się istotnym podejściem do badania dynamiki społeczności drobnoustrojów w stanach zdrowych i chorobowych. Zmiany w składzie mikrobiologicznym powiązano z wieloma zaburzeniami związanymi ze stylem życia i wiekiem, w tym z cukrzycą, białaczką i chorobami neurodegeneracyjnymi. Ponieważ różne mikroorganizmy wykazują odmienne cechy fizjologiczne i wymagania środowiskowe, standaryzacja pobierania, transportu i przetwarzania próbek kału jest niezbędna dla zachowania integralności próbek i zminimalizowania zmienności technicznej. Różnice wprowadzone podczas etapu preanalitycznego i ekstrakcji kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) mogą wpływać na późniejsze analizy mikrobiomu oraz interpretację danych. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie zestandaryzowanego schematu postępowania w zakresie pobierania ludzkich próbek kału oraz zautomatyzowanej ekstrakcji DNA przy użyciu zestawu MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (zestaw do izolacji kwasów nukleinowych) oraz systemu KingFisher Flex System (zautomatyzowany procesor cząstek magnetycznych). Schemat ten integruje kontrolowane obchodzenie się z próbkami zautomatyzowaną ekstrakcją kwasów nukleinowych, aby zmniejszyć zmienność manualną i poprawić spójność procedury. Protokół obejmuje standaryzowane pobieranie, przechowywanie i przygotowanie próbek kału, zautomatyzowaną ekstrakcję oraz odzysk kwasów nukleinowych ze złożonych matryc kału. Reprezentatywne wyniki wykazują pomyślny odzysk DNA odpowiedniego do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania genu 16S rybosomalnego kwasu rybonukleinowego (rRNA) oraz sekwencjonowania metagenomicznego typu shotgun. Zestandaryzowany schemat postępowania umożliwia powtarzalne przetwarzanie próbek, ułatwia skalowalność badań nad mikrobiomem i sprzyja większej spójności między eksperymentami. Demonstracja wizualna zapewnia praktyczne wytyczne dotyczące wdrażania standaryzowanego przetwarzania próbek kału i zautomatyzowanej ekstrakcji kwasów nukleinowych w badaniach nad mikrobiomem jelitowym.

Wprowadzenie

Mikrobiom jelitowy to złożony ekosystem mikrobiologiczny, który wpływa na metabolizm, odporność i funkcje neurologiczne gospodarza i jest coraz częściej wiązany z różnymi schorzeniami, w tym z zaburzeniami metabolicznymi, chorobą Parkinsona, nowotworami i neurodegeneracją^1,2. Odgrywa on istotną rolę w utrzymaniu fizjologii gospodarza poprzez wpływ na metabolizm, funkcje odpornościowe, wchłanianie składników odżywczych oraz odporność na mikroorganizmy patogenne^3,4. Niezawodne i powtarzalne pomiary mikrobiomu są niezbędne do przekształcenia tych korelacji w wiedzę o mechanizmach oraz zastosowania kliniczne. Postępy w technologiach sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zrewolucjonizowały nasze rozumienie złożonych społeczności mikrobiologicznych bytujących w przewodzie pokarmowym. Jednak zmienne przedanalityczne, takie jak procedury pobierania próbek kału, warunki przechowywania, obchodzenie się z próbkami, transport oraz metody ekstrakcji kwasu deinoksyrybonukleinowego (DNA), mogą selektywnie zmieniać strukturę społeczności mikrobiologicznej, wydajność DNA i wyniki sekwencjonowania^5,6. Takie niespójności metodologiczne często utrudniają porównywanie wyników między różnymi badaniami.

Wśród krytycznych etapów przedanalitycznych ekstrakcja DNA stanowi jeden z najistotniejszych czynników determinujących jakość danych mikrobiomu^7,8. Idealny protokół ekstrakcji powinien w sposób powtarzalny dostarczać wysokiej jakości DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z minimalnym stopniem zanieczyszczeń w przypadku dużej liczby próbek. Zautomatyzowane platformy do ekstrakcji kwasów nukleinowych mogą poprawić odtwarzalność, zmniejszyć liczbę błędów wynikających z ręcznej obsługi, obniżyć ryzyko kontaminacji oraz zwiększyć przepustowość. Wydajność tych zautomatyzowanych platform ekstrakcyjnych zależy w znacznym stopniu od parametrów protokołu, w tym od homogenizacji próbek, warunków rozbijania kuleczkami (bead-beating), chemii lizy, warunków inkubacji oraz sposobu manipulowania kuleczkami magnetycznymi^9,10. Dlatego ustanowienie zestandaryzowanego przepływu pracy, który integruje jednolity pobór próbek kału zautomatyzowaną ekstrakcją DNA, jest niezbędne do generowania wiarygodnych i odtwarzalnych zbiorów danych mikrobiomu.

W niniejszej pracy przedstawiamy ustandaryzowany schemat postępowania w zakresie pobierania i przygotowania ludzkich próbek kału oraz zautomatyzowanej ekstrakcji DNA z wykorzystaniem opisanego powyżej zestawu do izolacji kwasów nukleinowych i zautomatyzowanego procesora z cząsteczkami magnetycznymi. Protokół kładzie nacisk na kontrolowane obchodzenie się z próbkami, skuteczną lizę mechaniczną i chemiczną, usuwanie inhibitorów oraz środki kontroli jakości odpowiednie dla dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania amplikonów genu 16S rybosomalnego kwasu rybonukleinowego (rRNA), sekwencjonowania całego genomu, ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej (PCR) oraz metagenomicznego sekwencjonowania shotgun. Prezentacja wizualna dostarcza praktycznych wskazówek dotyczących ustandaryzowanego przetwarzania próbek kału i zautomatyzowanej ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu wsparcia powtarzalnych i skalowalnych badań nad mikrobiomem jelitowym.

Protokół

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Etycznej SKAN Research Trust i zostało zatwierdzone przez tę komisję (numer zatwierdzenia SKAN/IEC/2025/04). Przed pobraniem próbek od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę.

UWAGA: Wszystkie odczynniki, materiały zużywalne i sprzęt zostały wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie zestawu do pobierania próbek kału

1. Przygotuj zestaw do pobierania próbek kału zawierający sterylny zbieracz kału, sterylną probówkę do pobierania z nakrętką (pojemność 30–50 mL) z dołączoną szpatułką, probówkę do pobierania wypełnioną wcześniej buforem stabilizującym, jednorazowe rękawiczki, materiał chłonny, szczelną torbę transportową z oznaczeniem zagrożenia biologicznego oraz arkusz instrukcji (Ryc. 1).
2. Oznacz każdą probówkę do pobierania unikalnym identyfikatorem próbki, datą i godziną pobrania, używając niezmywalnego markera lub wydrukowanej etykiety.
3. Dołącz arkusz instrukcji opisujący procedurę pobierania próbek, środki ostrożności podczas postępowania z próbkami, warunki przechowywania oraz wymagania dotyczące transportu.
   ​UWAGA: Bufor stabilizujący jest dostarczany wstępnie wypełniony w probówce do pobierania kału jako element zestawu do pobierania. Producent nie ujawnia składu ani objętości buforu stabilizującego. Pobierz około 2–5 g materiału kałowego bezpośrednio do wypełnionej probówki zgodnie z instrukcjami producenta.

Rycina 1. Elementy zestawu do pobierania próbek kału. 
Zestaw do pobierania próbek kału zawiera jednorazowe rękawiczki, sterylny kolektor do kału, sterylną probówkę do pobierania kału z zakrętką i dołączoną szpatułką, szczelny worek transportowy z oznakowaniem zagrożenia biologicznego oraz broszurę instruktażną przekazaną uczestnikom w celu prawidłowego pobrania, obchodzenia się, przechowywania i transportu próbek kału. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

2. Przygotowanie uczestnika do pobrania próbek

1. Poinstruuj uczestnika, aby umył ręce przed pobraniem próbki.
2. Poinstruuj uczestnika, aby opróżnił pęcherz przed wypróżnieniem, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki kału moczem.

3. Pobierz próbkę kału za pomocą łapacza kału

1. Umieść sterylną tackę do zbierania kału nadeszcie toalety, aby zapobiec kontaktowi próbki z wodą w muszli.
2. W przypadku samoprzylepnych tacek do zbierania kału, ostrożnie rozłóż urządzenie wzdłuż wskazanych krawędzi, uważając, aby go nie rozerwać. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dołączonymi do tacki i bezpiecznie przymocuj urządzenie do tylnej części deski sedesowej, aby stworzyć stabilną powierzchnię do zbierania.
3. W przypadku tacek do zbierania kału bez warstwy klejącej, umieść urządzenie w poprzek muszli toalety zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapewnić stabilne podparcie.
4. Upewnij się, że tacka do zbierania kału nie ma kontaktu z wodą w toalecie podczas pobierania próbki.
5. Poleć uczestnikowi wypróżnienie się bezpośrednio na tackę do zbierania kału.
6. Przed kontaktem z próbką załóż jednorazowe rękawiczki dołączone do zestawu do pobierania.
7. Otwórz sterylną probówkę do pobierania i za pomocą dołączonej szpatułki pobierz materiał kałowy z co najmniej czterech do pięciu różnych obszarów stolca, w tym z powierzchni zewnętrznej i rdzenia wewnętrznego. Takie podejście pozwala zazwyczaj uzyskać około 2–5 g materiału kałowego, co jest wystarczające do ekstrakcji DNA.
8. Unikaj pobierania materiału kałowego, który miał kontakt z krawędziami tacki do zbierania kału lub jakimikolwiek powierzchniami zewnętrznymi.
9. Niezwłocznie po pobraniu próbki szczelnie zamknij probówkę.
10. Dokładnie wymieszaj próbkę kału z buforem stabilizującym, energicznie potrząsając zamkniętą probówką do momentu uzyskania jednorodnej zawiesiny i całkowitego rozbicia dużych grudek.
11. Umieść szczelnie zamkniętą probówkę w szczelnym worku transportowym z oznaczeniem biohazard, zawierającym materiał absorbujący.
12. Ostrożnie zrzuć tackę do zbierania kału wraz ze stolcem do toalety, dbając o to, aby zawartość nie rozlała się na zewnątrz. Spuść wodę, aby zutylizować tackę i stolec razem.

4. Przechowywanie i transport próbek kału

1. Przechowywać próbki zgodnie ze specyfikacją zastosowanego buforu stabilizującego.
2. Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej, jeśli bufor stabilizujący umożliwia konserwację w tych warunkach. Alternatywnie, przechowywać próbki w temperaturze 4°C w przypadku przechowywania krótkoterminowego (≤24–48 h) lub w temperaturze od −20°C do −80°C w przypadku przechowywania długoterminowego.
3. Przechowywać próbki zgodnie z zaleceniami producenta. Próbki pobrane przy użyciu buforu stabilizującego zastosowanego w niniejszym badaniu są stabilne do 2 lat w temperaturze pokojowej.
4. Transportować próbki w szczelnych workach na odpady biologiczne zawierających materiał chłonny, aby zapobiec wyciekom i kontaminacji.
5. Podczas transportu utrzymywać próbki w zalecanych warunkach temperaturowych. W razie potrzeby stosować pojemniki izolacyjne i wkłady chłodzące.
6. Zapewnić zgodność z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego oraz obowiązującymi lokalnymi przepisami dotyczącymi transportu materiału biologicznego.

5. Przyjmowanie i rejestracja próbek

1. Po otrzymaniu próbek w laboratorium należy sprawdzić każdą z nich pod kątem prawidłowego oznakowania, szczelności probówek oraz ewentualnych wycieków.
2. Jeśli jest to wymagane, należy przypisać próbkom identyfikatory laboratoryjne oraz zapisać datę i godzinę pobrania, warunki przechowywania oraz czas transportu.
3. Należy odrzucić próbki wykazujące wycieki, nieprawidłowe oznakowanie lub naruszoną szczelność.

6. Przygotowanie płytek

UWAGA: Wszystkie płytki należy przygotować przed rozpoczęciem procedury ekstrakcji. Wszystkie etapy z wykorzystaniem odczynników i próbek biologicznych należy przeprowadzać w czystym środowisku, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawiczki oraz ochronę oczu. Rycina 2 przedstawia zautomatyzowany procesor cząstek magnetycznych (Rycina 2A), pozycje ładowania płytek (Rysunek 2B), adapter do płytek głębokich (Rysunek 2C), wirówkę kompatybilną z płytkami (Rycina 2D), homogenizator kulkowy (Rycina 2E), wsparcie amortyzujące (Rysunek 2F), uchwyt do płytek (Rycina 2G), płytka z koralikami 96-dołkowa (Rysunek 2H), płytka głębokodołkowa (Rycina 2I), oraz płyta do elucji (Rycina 2J).

Rysunek 2. Sprzęt i materiały eksploatacyjne wykorzystywane do zautomatyzowanej ekstrakcji kwasu deoxyrybonukleinowego (DNA) z kału. 
(A) Zautomatyzowany procesor cząstek magnetycznych. (B) Pozycja ładowania płytek w zautomatyzowanym procesorze cząstek magnetycznych. (C) Adapter do płytek głębokookowych do wirowania. (D) Wirówka kompatybilna z płytkami. (E) Homogenizator kulowy. (F) Podkładka amortyzująca stosowana podczas homogenizacji kulowej. (G) Uchwyt (adapter) do płytek głębokookowych do homogenizacji kulowej. (H) Płytka kulkowa 96-dołkowa dołączona do zestawu do ekstrakcji kwasów nukleinowych. (I) Płytka głębokookowa 96-dołkowa. (J) Płytka do elucji 96-dołkowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

1. Wyjmij płytkę z grzebieniem do końcówek z opakowania i przygotuj ją do załadowania do urządzenia.
2. Przygotuj płytkę elucyjną (Rysunek 2J), dodając 200 µL buforu do elucji dołączonego do zestawu do ekstrakcji kwasów nukleinowych do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Uszczelnij płytkę przezroczystą folią klejącą, aby zapobiec kontaminacji. Przechowuj płytkę w szczelnym zamknięciu aż do momentu załadowania jej do automatycznego procesora cząsteczek magnetycznych. Oznacz płytkę jako płytka elucyjna.
3. Przygotuj płytkę do przemywania 4, dodając 1 mL 80% etanolu do każdego dołka płytki głębokodołkowej. Uszczelnij płytkę folią klejącą, aby zapobiec parowaniu i kontaminacji.
4. Przygotuj płytkę do przemywania 3, dodając 1 mL świeżo przygotowanego 80% etanolu do każdego dołka oddzielnej płytki głębokodołkowej. Uszczelnij płytkę folią klejącą.
5. Przygotuj płytkę do przemywania 2, dodając 1 mL buforu do przemywania do każdego dołka płytki głębokodołkowej. Uszczelnij płytkę folią klejącą.
6. Przygotuj płytkę do przemywania 1, dodając 1 mL buforu do przemywania do każdego dołka płytki głębokodołkowej. Uszczelnij płytkę folią klejącą.

7. Konfiguracja automatycznego procesora cząstek magnetycznych

1. Włącz automatyczny procesor cząstek magnetycznych. Upewnij się, że zainstalowano odpowiednią głowicę magnetyczną do płytek 96-dołkowych o głębokich dołkach oraz blok grzejny do płytek 96-dołkowych o głębokich dołkach.
2. Przed przetwarzaniem próbek uruchom odpowiedni protokół sprawdzania instrumentu (na przykład protokół Check_96dw_tip), używając czystego grzebienia do końcówek oraz pustej, kompatybilnej płytki dołkowej.
3. Potwierdź, że wymagany program ekstrakcji jest dostępny w automatycznym procesorze cząstek magnetycznych.
   UWAGA: Użycie nieprawidłowej głowicy magnetycznej lub bloku grzejnego może zmniejszyć wydajność kwasów nukleinowych i uszkodzić instrument.

8. Przeprowadzenie lizy próbek

1. Przygotuj mapę płytki, aby odnotować położenie każdej próbki w płytce 96-dołkowej.
2. Wirowaj płytkę z koralikami 96-dołkową (Rycina 2H) przy 2 750 × g przez 10 s, używając wirówki kompatybilnej z płytkami (Rycina 2D) oraz adaptera (Rycina 2C), aby osadzić koraliki na dnie każdego dołka.
   UWAGA: Ten krok zapobiega utracie koralików podczas usuwania uszczelnienia płytki.
3. Ostrożnie usuń uszczelnienie płytki, nie naruszając koralików.
4. Dodaj 800 µL buforu lizującego do każdego dołka płytki z koralikami.
5. Podczas pipetowania unikaj zasysania koralików.
6. Rozmroź zamrożone próbki kałowe w temperaturze pokojowej aż do całkowitego rozmrożenia. Delikatnie wymieszaj próbki w celu ich homogenizacji i niezwłocznie przystąp do ekstrakcji DNA. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i odmrażania, ponieważ mogą one obniżyć jakość i wydajność DNA.
   UWAGA: W przypadku świeżych próbek, każdą probówkę z próbką kałową zawierającą roztwór stabilizujący mieszaj w wirówce typu vortex przez 5–10 s, aby zapewnić homogenizację próbki.
7. Przenieś 200 µL każdej zhomogenizowanej próbki do odpowiedniego dołka płytki z koralikami.
8. Do przenoszenia próbek użyj pipety jednokanałowej z jałowymi, filtrowanymi końcówkami o szerokim otworze (uciętymi). Unikaj wielokrotnego pipetowania, aby zminimalizować utratę koralików i wynikający z tego spadek wydajności DNA.
9. Szczelnie zamknij płytkę folią przylepną, upewniając się, że wszystkie dołki i krawędzie płytki są całkowicie uszczelnione.

9. Przeprowadzenie lizy mechanicznej (homogenizacja kulkowa)

1. Zabeziecz zamkniętą płytkę w homogenizatorze kuleczkowym (Ryc. 2E), używając odpowiedniego uchwytu na płytkę (Ryc. 2G) oraz wspornika amortyzującego (Ryc. 2F).
2. Zrównoważ urządzenie, umieszczając płytkę o tej samej wadze naprzeciwko płytki z próbkami.
3. Ustaw urządzenie na 30 Hz przez 2 min i uruchom proces.
4. Pozostaw proces do zakończenia bez przerywania.
5. Po zakończeniu procesu ostrożnie wyjmij płytkę, nie naruszając uszczelnienia.
   UWAGA: Użyj wspornika amortyzującego, aby zapobiec uszkodzeniu płytki podczas homogenizacji kuleczkowej.

10. Przeprowadź obróbkę po lizie

1. Odwiruj płytkę przy 2 750 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej, zachowując odpowiedni balans wirówki.
2. Ostrożnie przenieś 400 µL supernatantu z każdej studni do nowej głębokiej płytki wielostudzienkowej, oznaczonej jako Płytka z Próbkami.
3. Unikaj przenoszenia kulek podczas tego etapu.
   UWAGA: Płytka z Próbkami nie zawiera kulek i nie wymaga wstępnego wirowania.
4. Zamknij szczelnie Płytkę z Próbkami, jeśli nie przechodzisz niezwłocznie do kolejnego kroku.
   UWAGA: W razie potrzeby przechowuj szczelnie zamkniętą płytkę z lizatem w temperaturze 4°C przez noc. Alternatywnie przechowuj szczelnie zamkniętą Płytkę z Próbkami w temperaturze −20°C do 3 miesięcy. Przed dalszą obróbką rozmroź próbki do temperatury pokojowej.

11. Przygotowanie mieszaniny kulek wiążących

1. Przygotować mieszaninę kulek wiążących bezpośrednio przed użyciem, łącząc 500 µL buforu do wiązania kwasów nukleinowych z 20 µL kulek magnetycznych na każdą próbkę. Mieszać dokładnie do uzyskania homogenicznej zawiesiny.
2. Obliczyć całkowitą objętość wymaganej mieszaniny kulek wiążących na podstawie liczby próbek.
3. W przypadku pełnej płyty 96-dołkowej przygotować mieszaninę kulek wiążących, dodając 48,00 mL buforu do wiązania kwasów nukleinowych oraz 1,92 mL kulek magnetycznych do sterylnej probówki stożkowej. Mieszać dokładnie do uzyskania objętości końcowej 49,92 mL (520 µL na dołek).
   UWAGA: Przygotować objętość wystarczającą dla jednego lub dwóch dodatkowych dołków, aby zrekompensować zmienność podczas pipetowania.
4. Łagodnie mieszać zawiesinę kulek wiążących poprzez odwracanie probówki do momentu uzyskania jednorodności.
5. Przenieść mieszaninę kulek wiążących do czystego zbiornika na odczynniki.
6. Bezpośrednio przed dozowaniem resuspender kulki magnetyczne, pipetując zawiesinę w górę i w dół trzy do czterech razy, aby zapobiec sedymentacji kulek.
7. Dozować 520 µL mieszaniny kulek wiążących do każdego dołka przygotowanej Płyty z Próbkami za pomocą pipety wielokanałowej.
8. Pipetować powoli ze względu na lepkość roztworu i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Przed każdym etapem dozowania delikatnie resuspender mieszaninę kulek wiążących w zbiorniku na odczynniki, aby zachować jednolity rozkład kulek we wszystkich dołkach.

12. Modyfikacja programu instrumentu MagMAX_Microbiome_Stool_Flex (zmodyfikowany program ekstrakcji)

1. Pobrać i zainstalować oprogramowanie BindIt (oprogramowanie do edycji protokołów) zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Pobrać program urządzenia ze strony internetowej producenta.
3. Uruchomić oprogramowanie do edycji protokołów i poczekać na jego inicjalizację.
4. Kliknąć Open i wybrać pobrany program urządzenia.
5. Zmodyfikować parametry protokołu zgodnie z opisem w Tabeli 1.
6. Zapisać zmodyfikowany protokół i zamknąć oprogramowanie.
7. Podłączyć komputer do automatycznego procesora cząstek magnetycznych za pomocą kabla szeregowego USB lub RS-232C.
   UWAGA: Przed podłączeniem komputera należy upewnić się, że automatyczny procesor cząstek magnetycznych jest wyłączony.
8. Włączyć automatyczny procesor cząstek magnetycznych i poczekać na zakończenie jego inicjalizacji.
9. Uruchomić oprogramowanie do edycji protokołów i potwierdzić, że wykryło ono automatyczny procesor cząstek magnetycznych.
10. Przesłać zmodyfikowany program ekstrakcji do automatycznego procesora cząstek magnetycznych.
11. Potwierdzić pomyślne przesłanie zmodyfikowanego programu ekstrakcji, a następnie wyłączyć automatyczny procesor cząstek magnetycznych.

Krok	Działanie	Parametry
1	Wiązanie	Wymieszać; 5 cykli zbierania; 37°C
2	Zabierz kuleczki	5 cykli zbierania magnetycznego
3	Płukanie 1	Mieszać przez 20 s × 3 cykle; 37°C
4	Płukanie 2	Mieszać przez 20 s × 3 cykle; 37°C
5	Płukanie 3	Mieszaj przez 20 s × 2 cykle; 37°C
6	Płukanie 4	Wymieszać; 1 cykl; 37°C
7	Suchy	Suszyć na powietrzu przez 2 min.
8	Elucja	75°C; 6 cykli mieszania; wstępne podgrzewanie włączone
9	Zebrać kuleczki	3 cykle zbierania magnetycznego
10	Przenieś eluat	Przenieś oczyszczony kwas nukleinowy na płytkę do elucji

Tabela 1: Zautomatyzowany program ekstrakcji dla procesora cząstek magnetycznych.
Podsumowanie zautomatyzowanego programu ekstrakcji wykonywanego przez zautomatyzowany procesor cząstek magnetycznych podczas ekstrakcji kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA). Program obejmuje wiązanie kwasów nukleinowych, zbieranie kulek magnetycznych, sekwencyjne etapy płukania, suszenie powietrzem, elucję oraz przeniesienie oczyszczonego DNA na płytkę elucyjną. Wymieniono parametry operacyjne dla każdego zautomatyzowanego kroku.

13. Przeprowadzenie zautomatyzowanej ekstrakcji kwasów nukleinowych

1. Włącz zautomatyzowany procesor cząstek magnetycznych (Rycina 2A), włączając główne zasilanie, a następnie przycisk zasilania urządzenia. Poczekaj, aż system zakończy inicjalizację.
2. Za pomocą panelu sterowania instrumentu wybierz zmodyfikowany program ekstrakcji i uruchom proces.
3. Po wyświetleniu komunikatu umieść płytkę z grzebieniem końcówek w pozycji 7 i naciśnij Start, aby kontynuować. Pozycje ładowania płytek przedstawiono w Tabeli 2 (Rycina 2B).
4. Usuń folię uszczelniającą z płytek do elucji i umieść ją w pozycji 6, dbając o prawidłową orientację (dołek A1 wyrównany z wyznaczoną pozycją). Naciśnij Start, aby kontynuować.
5. Usuń folię uszczelniającą z Płytki do przemywania 4 zawierającej 80% etanol, umieść płytkę w pozycji 5 z prawidłową orientacją i naciśnij Start.
6. Usuń folię uszczelniającą z Płytki do przemywania 3 zawierającej 80% etanol, umieść płytkę w pozycji 4 i naciśnij Start.
7. Usuń folię uszczelniającą z Płytki do przemywania 2, umieść płytkę w pozycji 3 i naciśnij Start.
8. Usuń folię uszczelniającą z Płytki do przemywania 1, umieść płytkę w pozycji 2 i naciśnij Start.
9. Po wyświetleniu komunikatu umieść płytkę z próbkami w pozycji 1, dbając o prawidłową orientację.
10. Zamknij pokrywę instrumentu i naciśnij Start, aby rozpocząć zautomatyzowany proces ekstrakcji.
11. Pozostaw program do czasu jego zakończenia bez przerywania (około 35–40 min).
    UWAGA: Tabela 1 zawiera podsumowanie zautomatyzowanego programu ekstrakcji wykonywanego przez instrument.

Płytka	Pozycja	Typ płytki	Odczynnik	Objętość na dołek
Płytka z próbką	1	Płytka 96-dołkowa głęboka	Lizat próbki + mieszanina kulek wiążących	920 µL
Płytka płucząca 1	2	Płytka 96-dołkowa głęboka	Bufor płuczący	1,000 µL
Płytka płucząca 2	3	Płytka 96-dołkowa głęboka	Bufor płuczący	1,000 µL
Płytka płucząca 3	4	Płytka 96-dołkowa głęboka	80% etanol	1,000 µL
Płytka płucząca 4	5	Płytka 96-dołkowa głęboka	80% etanol	1,000 µL
Płytka do elucji	6	Płytka 96-dołkowa	Bufor do elucji	200 µL
Płytka z grzebieniem końcówek	7	Standardowa płytka głęboko-dołkowa	Grzebień końcówek do płytki 96-dołkowej głębokiej	N/D

Tabela 2: Konfiguracja ładowania płytek dla zautomatyzowanej ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Pozycje ładowania płytek, typy płytek, odczynniki i objętości odczynników stosowane podczas zautomatyzowanej ekstrakcji DNA przy użyciu procesora cząstek magnetycznych. Płytka z próbkami zawiera lizat próbki i mieszaninę kulek wiążących. N/A oznacza, że do płytki z grzebieniem końcówek nie dodano żadnego płynnego odczynnika.

​14. Elucja i przechowywanie kwasów nukleinowych

1. Po zakończeniu procesu otwórz urządzenie i ostrożnie wyjmij płytkę do elucji, aby uniknąć rozlania eluatów.
   UWAGA: Jeśli w płytce do elucji widoczne jest przeniesienie kulek magnetycznych, przenieś eluaty do standardowej płytki 96-dołkowej i pozostaw ją na statywie magnetycznym przez 5–10 min. Przenieś oczyszczony nadsącz do nowej płytki 96-dołkowej lub odpowiednio oznakowanych probówek za pomocą pipety wielokanałowej.
2. Przenieś wyelucjowane DNA do odpowiednio oznakowanych probówek lub płytek do przechowywania.
3. Przechowuj wyelucjowane DNA w temperaturze 4°C do krótkotrwałego użytku, w −20°C w celu przechowywania do 6 miesięcy lub w −80°C do długotrwałego przechowywania.

15. Przeprowadź czyszczenie po zakończeniu pracy

1. Usuń wszystkie zużyte płytki i grzebienie z końcówkami z automatycznego procesora cząstek magnetycznych.
2. Zutylizuj wszystkie materiały eksploatacyjne zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i utylizacji odpadów chemicznych.
3. Wyczyść wszelkie rozlane substancje, używając odpowiedniego laboratoryjnego środka dezynfekcyjnego.
4. Wyłącz automatyczny procesor cząstek magnetycznych, a następnie główne zasilanie.

Wyniki

Próbki kału od siedmiu uczestników zostały pomyślnie pobrane zgodnie z opisanym schematem pobierania, co pozwoliło na uzyskanie materiałów o wystarczającej masie i odpowiedniej konsystencji do dalszej obróbki. Po pobraniu próbki przechowywano w temperaturze pokojowej. Większość próbek charakteryzowała się jednorodną teksturą i zabarwieniem, co jest zgodne z odpowiednimi warunkami pobierania i przechowywania, natomiast niewielka część wykazała niewielką zmienność konsystencji, co może odzwierciedlać różnice biologiczne między uczestnikami. Podczas transportu nie zaobserwowano widocznego zanieczyszczenia ani wycieków, a wszystkie próbki zostały przetworzone w ramach zwalidowanego okna stabilności zestawu do pobierania (do 2 lat w temperaturze pokojowej), co potwierdza solidność i niezawodność schematu pobierania (Rysunek 1).

Zautomatyzowany proces ekstrakcji DNA przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanego procesora cząstek magnetycznych (Rycina 2A), konfiguracji ładowania płytek (Rycina 2B), adaptera do płytek głębokich (Rycina 2C), wirówki kompatybilnej z płytkami (Rycina 2D), homogenizatora kulowego (Rycina 2E), wspornika amortyzującego (Rycina 2F), uchwytu do płytek (Rycina 2G), płytki z kulkami (Rycina 2H), płytki głębokiej (Rycina 2I) oraz płytki do elucji (Rycina 2J), zgodnie z zautomatyzowanym programem ekstrakcji podsumowanym w Tabeli 1 oraz konfiguracją ładowania płytek przedstawioną w Tabeli 2. Stężenie i czystość DNA oceniono dla reprezentatywnych próbek kału, a wyniki podsumowano w Tabeli 3. Stężenie DNA zmierzono za pomocą testu Qubit double-stranded DNA High Sensitivity (fluorometryczny test ilościowego oznaczania DNA) na fluorometrze Qubit (instrument do fluorometrycznego ilościowego oznaczania DNA) zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki zmieszano z roztworem roboczym, inkubowano przez 2 min w temperaturze pokojowej, a następnie zmierzono wraz z dwoma standardami testowymi. Stosunki absorbancji A₂₆₀/A₂₈₀ i A₂₆₀/A₂₃₀ określono przy użyciu spektrofotometru NanoDrop (spektrofotometr mikrowolumenowy). Stężenia DNA mieściły się w zakresie od 36 do 87 ng/µL, przy czym wszystkie próbki eluowano w stałej objętości 200 µL, co umożliwiło bezpośrednie porównanie całkowitego odzysku DNA w różnych preparatach (Tabela 3).

Próbka	Stężenie DNA (ng/µL)	A260/A280	A260/A230	Objętość elucji (µL)	Całkowita wydajność DNA (ng)
Próbka A	62	1.83	1.71	200	12,400
Próbka B	36	1.89	1.51	200	7,200
Próbka C	87	1.92	1.85	200	17,400
Próbka D	50	2.03	1.87	200	10,000
Próbka E	55	1.97	1.81	200	11,000
Próbka F	85	1.99	1.88	200	17,000
Próbka G	44	2.01	1.51	200	8,800
Próba ślepa ekstrakcji	0	—	—	200	0

Tabela 3: Reprezentatywna odzyskowalność i czystość DNA po zautomatyzowanej ekstrakcji z ludzkich próbek kału.
Reprezentatywne stężenie DNA, czystość (stosunki absorbancji A₂₆₀/A₂₈₀ oraz A₂₆₀/A₂₃₀), objętość elucji oraz całkowita wydajność DNA zmierzone po zautomatyzowanej ekstrakcji DNA z ludzkich próbek kału. Stężenie DNA określono za pomocą analizy fluorometrycznej. Próba ślepa ekstrakcji służyła jako kontrola negatywna i nie wykazano w niej obecności DNA.

Reprezentatywne wyniki wykazały zmienność w odzysku DNA pomiędzy próbkami. Wyższe stężenia DNA uzyskano dla próbki A (62 ng/µL), próbki F (85 ng/µL) i próbki C (87 ng/µL), natomiast stężenia pośrednie zaobserwowano dla próbki D (50 ng/µL) i próbki E (55 ng/µL). Próbka B i próbka G dały najniższe stężenia DNA (odpowiednio 36 ng/µL i 44 ng/µL). Stosunki absorbancji A₂₆₀/A₂₈₀ mieściły się w zakresie od 1,83 do 2,03, natomiast stosunki absorbancji A₂₆₀/A₂₃₀ mieściły się w zakresie od 1,51 do 1,88 (Tabela 3). Taka zmienność jest spodziewana w przypadku próbek kału i może odzwierciedlać różnice w składzie próbek oraz zmienność biologiczną, a także zmienność techniczną związaną z przetwarzaniem materiału. Próba ślepa ekstrakcji nie wykazała obecności wykrywalnego DNA, co wskazuje na brak wykrywalnego zanieczyszczenia podczas procedury ekstrakcji. Reprezentatywna amplifikacja niemal pełnej długości bakteryjnego genu 16S rRNA rRNA wygenerowała spodziewany amplikon PCR o długości około 1,5 kb w próbkach DNA z kału, podczas gdy kontrola bez matrycy nie wykazała amplifikacji (Rycina 3).

Rysunek 3Elektroforeza żelowa w agarozie amplikonów produktu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) genu 16S rybosomalnego kwasu rybonukleotowego (rRNA) bakterii. 
Reprezentatywny żel agarozowy obrazujący amplifikację niemal pełnej długości (~1,5 kb) bakteryjnego genu 16S rRNA z wykorzystaniem uniwersalnych starterów 27F i 1525R po ekstrakcji DNA z ludzkich próbek kału. Ścieżka M: drabina DNA 100 par zasad (bp); ścieżka 1: kontrola bez matrycy (blank); ścieżki 2–8: reprezentatywne próbki DNA z kału wykazujące oczekiwany amplikon PCR o wielkości ~1,5 kb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Pomyślną realizację niniejszego protokołu potwierdza odzyskanie mierzalnej ilości DNA odpowiedniego do dalszych zastosowań molekularnych, w tym analiz opartych na PCR, sekwencjonowania genu 16S rRNA, sekwencjonowania metagenomicznego (shotgun metagenomic sequencing) oraz przygotowania bibliotek. Wspólnie te reprezentatywne wyniki wykazują, że protokół umożliwia spójne odzyskiwanie DNA z ludzkich próbek kału, ilustrując jednocześnie zakres zmienności, z jaką można napotkać w próbkach biologicznych.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół zapewnia zstandaryzowany schemat postępowania w zakresie pobierania próbek kału od ludzi i zautomatyzowanej ekstrakcji DNA na potrzeby badań mikrobiomu. Krytyczne etapy obejmują reprezentatywne pobieranie próbek kału z wielu obszarów stolca, dokładną homogenizację z buforem stabilizującym, właściwe przechowywanie i transport w zalecanych warunkach, wydajną lizę mechaniczną oraz ostrożną obsługę podczas zautomatyzowanej ekstrakcji. Konsekwentne przestrzeganie tych kroków minimalizuje zmienność techniczną i wspiera powtarzalność odzysku DNA. Wcześniejsze badania w podobny sposób zidentyfikowały pobieranie próbek, warunki przechowywania, homogenizację oraz ekstrakcję DNA jako główne źródła zmienności w analizach mikrobiomu i podkreśliły znaczenie zstandaryzowanych schematów postępowania dla uzyskania powtarzalnych wyników^5,6,7,8. Reprezentatywne wyniki wykazują pomyślne pobranie próbek bez widocznego zanieczyszczenia lub wycieku oraz mierzalny odzysk DNA we wszystkich badanych próbkach.

Na odzysk DNA może wpływać kilka czynników proceduralnych, które należy uwzględnić podczas wdrażania metody. Niewystarczająca liza mechaniczna lub chemiczna, niepełna homogenizacja, nieefektywne wiązanie kwasów nukleinowych lub strata próbki podczas etapów przenoszenia i przemywania mogą obniżyć wydajność DNA. Różnice w składzie kału, biomasie mikrobowej i konsystencji próbki mogą również przyczyniać się do zróżnicowania odzysku DNA pomiędzy poszczególnymi okazami. Dlatego staranne wykonanie protokołu, w szczególności podczas homogenizacji próbki, rozbijania kuleczkami (bead beating) oraz automatycznej ekstrakcji, jest istotne dla uzyskania spójnych wyników. Rozwiązywanie problemów powinno koncentrować się na weryfikacji przygotowania odczynników, konfiguracji aparatury, załadowaniu płytek oraz wykonaniu programu automatycznej ekstrakcji przed rozpoczęciem przetwarzania próbek. Podobne zalecenia pojawiły się w badaniach oceniających przepływy analityczne mikrobiomu oraz metodologie ekstrakcji DNA^5,6,7,8,1.

Głównym ograniczeniem tej metody jest obserwowalna zmienność wydajności izolacji DNA pomiędzy próbkami biologicznymi. Jak pokazują reprezentatywne wyniki, różnice w stężeniu DNA mogą odzwierciedlać wrodzoną zmienność biologiczną próbek kału, a także zmienność techniczną wprowadzoną podczas przetwarzania materiału. W związku z tym stężenie DNA nie powinno być uważane za jedyny wskaźnik wydajności ekstrakcji. W zależności od planowanego zastosowania może być wymagane wprowadzenie dodatkowych pomiarów jakości i przydatności DNA. Aby dalej ocenić jakość DNA i jego przydatność do późniejszych analiz molekularnych, bakteryjny gen 16S rRNA został powielony metodą PCR przy użyciu uniwersalnych starterów 27F i 1525R. Pomyślną amplifikację oczekiwanego fragmentu genu 16S rRNA o wielkości około 1,5 kb potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rysunek 3), co wykazało, że wyekstrahowane DNA posiadało wystarczającą jakość do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania i innych analiz molekularnych. Wcześniejsze badania porównawcze wykazały analogicznie, że wydajność izolacji DNA nie musi korelować z wydajnością późniejszego sekwencjonowania ani z dokładnością profilowania mikrobiomu^8,1.

W porównaniu z manualnymi procedurami ekstrakcji, zautomatyzowane procesory oparte na cząstkach magnetycznych ograniczają czas pracy manualnej, standaryzują warunki ekstrakcji i umożliwiają wysokoprzepustowe przetwarzanie próbek, minimalizując jednocześnie zmienność zależną od operatora^9,10. Jednakże różnice w konsystencji kału oraz biomasie mikrobowej mogą wpływać na wydajność lizy i uzysk DNA. Ponadto mikroorganizmy o wytrzymałych ścianach komórkowych mogą nie ulec całkowitej lizie, co potencjalnie wpływa na reprezentację niektórych taksonów. Pomimo tych ograniczeń, zautomatyzowana ekstrakcja zapewnia niezawodne i wydajne podejście do wielkoskalowych badań mikrobiomu jelitowego^5,6,7,8,9,10. Niniejszy protokół łączy standaryzowany pobór próbek kału zautomatyzowanym procesem ekstrakcji DNA, zapewniając praktyczne i powtarzalne podejście do badań mikrobiomu wymagających spójnego przetwarzania dużej liczby próbek. Standaryzowane metodologie, takie jak ta, ułatwiają powtarzalność między badaniami i są dobrze dostosowane do dalszych zastosowań molekularnych, w tym do profilowania mikrobiomu, sekwencjonowania metagenomicznego oraz innych analiz opartych na sekwencjonowaniu^5,6,7,8,9,10.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
80% etanol (przygotowany z etanolu absolutnego)	Merck	ET01610	Przygotować na świeżo z etanolu bezwodnego zgodnie z opisem w protokole.
Materiał absorbujący	Kimtech	34256	Zawarte w torbie transportowej.
Samoprzylepna folia uszczelniająca do płytek	Applied Biosystems	4306311	Przezroczysta folia przylepna MicroAmp.
Automatyczny procesor cząstek magnetycznych (system oczyszczania KingFisher Flex z głowicą 96-dołkową)	Thermo Fisher Scientific	5400630	Zautomatyzowany system ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Zamykana torba transportowa z oznakowaniem zagrożenia biologicznego	Zymo Research	R180	Szczelna torba transportowa do transportu próbek.
oprogramowanie BindIt	Thermo Fisher Scientific	5189009	Oprogramowanie wykorzystane do modyfikacji i przenoszenia zautomatyzowanego protokołu ekstrakcji.
Probówka do pobierania próbek z dołączoną szpatułką (30–50 ml)	Zymo Research	R180	Sterylna probówka do pobierania z nakrętką.
Podparcie amortyzujące	QIAGEN	69984	Zestaw adapterów TissueLyser (stosowany jako podkładka amortyzująca podczas rozbijania kuleczkami).
Płytka głęboko dołkowa (96-dołkowa)	Thermo Fisher Scientific	95040460	Płytka głębokookowa KingFisher 96.
Rękawiczki jednorazowe	Zymo Research	R180	Zaleca się stosowanie rękawiczek bezpudrowych.
Bufor elucyjny	Applied Biosystems	A42357	Dostarczany w zestawie MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Zbieracz kału	Zymo Research	R180	Sterylne urządzenie do pobierania próbek.
Blok grzejny (96-dołkowy, głęboki)	Thermo Fisher Scientific	Dostarczono z instrumentem	Komponent systemu oczyszczania KingFisher Flex.
Fartuch laboratoryjny	Lokalny dostawca	Nie dotyczy	Środki ochrony indywidualnej.
Bufor do lizy	Applied Biosystems	A42357	Dostarczone w zestawie MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Kuleczki magnetyczne	Applied Biosystems	A42357	Dostarczany w zestawie MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Głowica magnetyczna (96-dołkowa)	Thermo Fisher Scientific	Dołączone do zestawu 540630	96-dołkowa głowica magnetyczna dostarczana z systemem KingFisher Flex.
Statyw magnetyczny (96-dołkowy)	Thermo Fisher Scientific	1232D	Wymagane tylko w przypadku zaobserwowania przeniesienia kulek magnetycznych.
Pipeta wielokanałowa	Eppendorf	3125000052	Kompatybilne z płytkami 96-dołkowymi.
spektrofotometr NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Stosowane do wyznaczania stosunków A260/280 oraz A260/230.
Bufor wiążący kwasy nukleinowe	Applied Biosystems	A42357	Dostarczany w zestawie MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Marker permanentny	Sharpie	3002	Alternatywnie można zastosować etykiety wydrukowane wcześniej.
końcówki do pipet, sterylnie filtrowane (10 µL)	Tarsons	528100	Sterylne skalowane końcówki z filtrem.
końcówki do pipet, sterylne z filtrem (200 µL)	Tarsons	528104	Sterylne skalibrowane końcówki z filtrem.
Końcówki do pipet, sterylne z filtrem (1,000 µL)	Tarsons	529106	Sterylne końcówki z filtrem; w miejscach wskazanych w protokole odciąć końcówki, aby przygotować końcówki o szerokim otworze.
Adapter do płytek do wirówki	Eppendorf	5820710004	Adapter do płytek głębokich do rotora A-2-DWP-AT.
Wirówka kompatybilna z płytkami	Eppendorf	5810	Kompatybilny z adapterem Rotor A-2-DWP-AT.
Uchwyt do płytek do homogenizacji kulkowej	QIAGEN	69984	Zestaw adapterów TissueLyser 2 × 96.
Wstępnie wydrukowane etykiety (opcjonalnie)	Brady	BBP12	Alternatywa dla markera permanentnego.
Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HS Assay	Thermo Fisher Scientific	Q3231	Analiza fluorometryczna stosowana do ilościowego oznaczania DNA.
Fluorometr Qubit	Thermo Fisher Scientific	Q327	Instrument używany do fluorometrycznego oznaczania ilości DNA.
Zbiornik na odczynniki	Thermo Fisher Scientific	8093	Zbiornik na odczynnik macierzy.
Bufor stabilizujący próbkę	Zymo Research	R180	Zestaw do pobierania kału DNA/RNA Shield.
Sterylna probówka stożkowa	HiMedia	TCP106H	Stosowane do przygotowania mieszaniny kulek wiążących.
homogenizator kulowy TissueLyser III	QIAGEN	9003240	Urządzenie do lizy mechanicznej.
Płytka z grzebieniem do końcówek	Thermo Fisher Scientific	97002534	Grzebień końcówek KingFisher 96 do magnesów do płytek głębokich.
Bufor płuczący	Applied Biosystems	A42357	Dostarczone w zestawie MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.