Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i zastosowanie mikropłytki 32-dołkowej z wbudowanymi diodami LED do optogenetycznej kontroli dynamicznej

23 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/73445

⸱

22 września 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Texas A&M University, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób wykonania, zaprogramowania i obsługi 32-dołkowej mikropłytki z wbudowanymi diodami elektroluminescencyjnymi (LED) do badań optogenetycznych (LEMOS 2.0) w czytniku mikropłytek, aby umożliwić wysokoprzepustową stymulację optogenetyczną oraz ilościowe pomiary ekspresji genów w kulturach drobnoustrojów.

Streszczenie

Kontrola optogenetyczna umożliwia regulację ekspresji genów za pomocą światła i zapewnia programowalny interfejs pomiędzy żywymi komórkami a systemami elektronicznymi. Jednak rutynowe prototypowanie konstruktów optogenetycznych pozostaje ograniczone przez dostępną infrastrukturę. Istniejące platformy w pętli zamkniętej często wymagają zastosowania chemostatów, mikroprzepływów, obsługi robotycznej lub niestandardowych czujników optycznych, co może zwiększyć koszty, ograniczyć dostępność lub wpłynąć negatywnie na wydajność pomiarów.

W niniejszej pracy przedstawiono LEMOS 2.0, zaktualizowaną płytkę mikrotitracyjną z wbudowanymi diodami emitującymi światło (LED) do badań optogenetycznych – niskokosztowe urządzenie do stymulacji optogenetycznej i charakteryzacji obwodów genetycznych w standardowych czytnikach płytek. LEMOS 2.0 rozwija oryginalną platformę LEMOS, zwiększając przepustowość z 16 do 32 mikrododatków oraz redukując wycieki światła między sąsiadującymi mikrododatkami, co umożliwia zastosowanie warunków ciemności jako dodatkowego stanu oświetlenia. Urządzenie składa się z ramy wydrukowanej w technologii trójwymiarowej (3D), indywidualnie adresowalnych diod LED umieszczonych obok każdego mikrododatku, akumulatora oraz wbudowanego mikrokontrolera do bezprzewodowej komunikacji opartej na protokole Bluetooth. Biokompatybilne mikrododatki z polidimetylosiloksanu (PDMS) są odlewane bezpośrednio w urządzeniu metodą formowania replikacyjnego, co umożliwia stymulację kultur bakteryjnych przezroczystą formę. Urządzenie pasuje do standardowych czytników płytek, umożliwiając pomiar gęstości optycznej i fluorescencji.

Niniejszy protokół opisuje pełny przepływ pracy LEMOS 2.0, obejmujący wykonanie urządzenia, montaż obwodu, programowanie Arduino, odlewanie mikrodofków z PDMS, konfigurację czytnika płytek, przygotowanie szczepów i kultur, automatyczną realizację eksperymentu, czyszczenie urządzenia oraz analizę danych fluorescencji/OD60. W ramach demonstracji protokół wykorzystuje optogenetyczny system CcaSR, w którym ekspresja sfGFP jest aktywowana światłem zielonym i hamowana światłem czerwonym. LEMOS 2.0 ma na celu zwiększenie dostępności perturbacji optogenetycznych i charakterystyki ekspresji genów dla użytkowników laboratoriów mokrych, umożliwiając szybsze cykle projektowania, budowy, testowania i uczenia się (design-build-test-learn) bez konieczności posiadania specjalistycznej infrastruktury bioreaktorowej lub mikrofluidycznej.

Wprowadzenie

Optogenetyka zapewnia programowalny interfejs między żywymi komórkami a elektronicznymi systemami sterowania. Dzięki wykorzystaniu światła do regulacji ekspresji genów, zachowanie komórkowe może być aktywowane z precyzją czasową, odwracalnością i minimalnym zakłóceniem środowiska hodowlanego1. W połączeniu z reporterami fluorescencyjnymi lub luminescencyjnymi, systemy optogenetyczne umożliwiają elektroniczny pomiar stanów biologicznych oraz ich regulację poprzez sprzężenie zwrotne1. Ten dwukierunkowy interfejs optyczny umożliwił cybergenetyczną kontrolę procesów komórkowych, w tym ekspresji genów, wzrostu komórek i składu populacji2,3,4. Jednak wiele skutecznych optogenetycznych systemów zamkniętej pętli wymaga specjalistycznych chemostatów5, urządzeń mikroprzepływowych4,6,7 lub robotycznego próbkowania2,3,8, co może ograniczać dostępność i utrudniać rutynowe cykle projektowania, budowy, testowania i uczenia się (design-build-test-learn).

Czytniki mikropłytek należą do najpowszechniej stosowanych instrumentów do pomiaru wzrostu mikroorganizmów i dynamiki ekspresji genów. Zapewniają one niezawodne pomiary gęstości optycznej i fluorescencji dla wielu próbek, umożliwiają kontrolę warunków środowiskowych i są już zintegrowane ze standardowymi procesami biologii syntetycznej9. Jednak ścieżki oświetlenia w standardowych komercyjnych czytnikach płytek są zaprojektowane do pomiarów optycznych, a nie do programowalnej, precyzyjnie ukierunkowanej aktywacji optogenetycznej podczas wzrostu kultur. W rezultacie eksperymenty optogenetyczne często wymagają oddzielnych urządzeń do oświetlania10,1,12,13,14, robotycznego przenoszenia próbek między platformą stymulacji a platformą pomiarową8,15 lub specjalistycznego sprzętu do odczytu5,16,17. Te dodatkowe etapy zmniejszają rozdzielczość czasową, wprowadzają zmienność wynikającą z manipulacji próbkami i komplikują sterowanie w pętli zamkniętej.

Mikropłytka z wbudowanymi diodami LED do badań optogenetycznych, znana jako LEMOS, została opracowana wcześniej, aby wypełnić tę lukę18. LEMOS to urządzenie kompatybilne z czytnikami mikropłytek, zawierające indywidualnie adresowalne diody LED rozmieszczone wokół mikrowyrobisk hodowlanych. Urządzenie pozostaje wewnątrz komercyjnego czytnika mikropłytek przez cały czas trwania eksperymentu, co umożliwia jednoczesne przeprowadzanie stymulacji optycznej oraz pomiarów fluorescencji i gęstości optycznej przy 60 nm (OD60) na tej samej platformie. W pierwotnej implementacji LEMOS obsługiwał 16 mikrowyrobisk hodowlanych i został wykorzystany do zademonstrowania optogenetycznej stymulacji w pętli otwartej oraz sprzężenia zwrotnego w pętli zamkniętej w celu kontroli ekspresji genów w hodowli okresowej18. Urządzenie było zsynchronizowane z zewnętrznym komputerem w taki sposób, aby oświetlenie LED mogło zostać wyłączone podczas okien pomiarowych, co minimalizowało bezpośrednie zakłócenia odczytów fluorescencji i gęstości optycznej.

Niniejszy protokół opisuje zaktualizowaną wersję urządzenia, LEMOS 2.0, oraz jego zastosowanie w eksperymentach optogenetycznych w kulturach drobnoustrojów. Konstrukcja LEMOS 2.0 została zmodyfikowana w celu zwiększenia liczby niezależnie adresowalnych mikrodołków hodowlanych z 16 do 32, co zwiększyło przepustowość eksperymentalną i pozwoliło na przetestowanie większej liczby warunków, powtórzeń lub projektów kontrolerów w jednym cyklu. Zmieniono również konstrukcję urządzenia, aby ograniczyć wyciek światła między oświetlonymi mikrodołkami a sąsiednimi mikrodołkami ciemnymi, co poprawiło wiarygodność kontroli ciemnych oraz eksperymentów z przestrzennie wzorcowaną stymulacją. Modyfikacje te sprawiają, że platforma jest lepiej dostosowana do porównawczej charakterystyki optogenetycznej, testowania kontrolerów w wielu warunkach oraz rutynowego wdrożenia protokołu w laboratoriach korzystających już z czytników mikropłytek.

System LEMOS 2.0 został zaprojektowany do eksperymentów z hodowlami mikrobiologicznymi w systemie okresowym, które wymagają powtarzalnych pomiarów OD60 oraz fluorescencji przy programowalnym oświetleniu w stanie czerwonym, zielonym, niebieskim lub ciemnym. Czytnik płytek musi obsługiwać kinetyczne pomiary OD60 i fluorescencji, kontrolę temperatury, wstrząsanie, definiowanie niestandardowego układu płytek dla 32 mikrodołków LEMOS oraz automatyczny eksport plików z pomiarami do folderu monitorowanego przez skrypt sterujący w języku Python. Obecna implementacja została zwalidowana przy użyciu czytnika mikropłytek BioTek Synergy H1 z oprogramowaniem BioTek Gen5 v3.14; implementacja z innym oprogramowaniem czytnika płytek wymaga odpowiednich modyfikacji formatu eksportu, parsera plików oraz kroków automatyzacji ekranu. Ponieważ urządzenie wykorzystuje diody LED z szczytami emisji przy 620–630 nm, 515–525 nm i 465–475 nm, użytkownicy powinni dobrać aktywatory optogenetyczne i reportery fluorescencyjne, których widma aktywacji i odczytu są kompatybilne z tymi kanałami19,20. Nowe szczepy gospodarzy, reportery, systemy optogenetyczne, pożywki, temperatury wzrostu, odstępy między próbkowaniami lub konstrukcje kontrolerów prawdopodobnie będą wymagały ponownej kalibracji intensywności LED, zakresu cyklu pracy, korekty tła, normalizacji fluorescencji oraz parametrów kontrolera.

Protokół obejmuje pełny proces pracy z systemem LEMOS 2.0: wykonanie urządzenia, montaż obwodu, programowanie Arduino, odlewanie mikrowybrań z polidimetylosiloksanu (PDMS), konfigurację czytnika płytek, przygotowanie szczepów i kultur, zautomatyzowane wykonanie eksperymentu, czyszczenie urządzenia oraz analizę danych fluorescencji/OD60. Chociaż przykładowy proces koncentruje się na optogenetycznej kontroli ekspresji genów u bakterii, ten sam schemat można dostosować do innych szczepów drobnoustrojów, reporterów fluorescencyjnych, systemów aktuatorów optogenetycznych oraz algorytmów sterowania. Poprzez połączenie programowalnego oświetlenia ze standardowymi pomiarami z czytnika płytek, zaktualizowana platforma LEMOS 2.0 zapewnia dostępną metodę prowadzenia wysokoprzepustowych eksperymentów optogenetycznej perturbacji i sterowania z sprzężeniem zwrotnym w kulturach okresowych.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne związane z Escherichia coli szczep MG1655  przeprowadzono w wyznaczonych laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) na Texas A&Uniwersytet M. Kultury bakteryjne i manipulacje nimi przeprowadzano w certyfikowanych szafach bezpieczństwa biologicznego klasy II zgodnie z wytycznymi standardowego zawężenia. Procedury wykonano w określonych warunkach izolacji, przejrzanych i zatwierdzonych przez Texas A&M Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Instytucji (IBC) na podstawie pozwolenia numer IBC2023-044.

1. Wytwarzanie ramy LEMOS 2.0 i matrycy LED

UWAGA: Rozpocznij produkcję LEMOS 2.0, drukując trójwymiarowo ramek LEMOS 2.0 i umieszczając taśmy LED w korpusie urządzenia. Celem jest uzyskanie mechanicznie stabilnej konstrukcji, w której każdy dioda LED znajduje się bezpośrednio obok odpowiadającej mu mikrowydrążki. Poprawne rozmieszczenie diod LED na tym etapie jest istotne, ponieważ nieprawidłowe ustawienie może zmniejszyć jednolitość stymulacji i zwiększyć optyczne zakłócenia między mikrowydrążkami.

  1. Wydrukuj trójwymiarowo wewnętrzną ramę LEMOS 2.0 oraz formę odlewniczą do mikrowłości PDMS, wykorzystując dostarczone pliki STL z repozytorium GitHub (github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0). Po wydrukowaniu usuń cały materiał nośny.
    UWAGA: Zaleca się użycie filamentu z kwasu polimlekowego (PLA) oraz drukarki wykorzystującej technologię modelowania metodą napładania (FDM) z następującymi parametrami drukowania: wysokość warstwy 0,2 mm, wypełnienie na poziomie 20% dla ramy LEMOS 2.0 oraz 40% dla formy odlewniczej.
  2. Przecinaj taśmy LED przez środek pól lutowniczych, uzyskując dwa zestawy po 16 diod. Upewnij się, że na każdym końcu taśmy znajdują się trzy pola lutownicze przeznaczone do lutowania, jak omówiono szczegółowo w sekcji 2.
  3. Złóż każdą taśmę LED na pół, tak aby diody świeciły na zewnątrz (Dodatkowy rysunek 1A, Dodatkowe wideo 1).
  4. Ręcznie dopasuj taśmę LED do geometrii urządzenia i wsuń ją między mikrowybrzuszenia, tak aby płytki lutownicze +5 V były skierowane w dół, zwracając uwagę na strzałkę na taśmie LEDDodatkowy rysunek 1A, Dodatkowe wideo 1). Koryguj położenie paska iteracyjnie, aż każdy diodowy element świecący będzie poprawnie umieszczony w swoim gnieździe, zanim przejdziesz dalej.

2. Montaż i weryfikacja obwodu elektrycznego

UWAGA: Zmontuj połączenia zasilania, ładowania, mikrokontrolera, przełącznika oraz diod LED wymagane do działania urządzenia bezprzewodowego. Po złożeniu urządzenie LEMOS 2.0 powinno działać na zasilaniu z wbudowanego akumulatora, ładować się poprzez moduł ładowania oraz odbierać polecenia sterujące diodami LED z peryferyjnej płytki Arduino. Przed podłączeniem taśm LED sprawdź każde połączenie zasilające, ponieważ nieprawidłowe doprowadzenie napięcia może uszkodzić mikrokontroler lub diody LED.

UWAGA: Protokół wymaga wcześniejszej biegłości w lutowaniu, w tym stosowania odpowiednich zasad bezpieczeństwa (np. użycie absorbera dymu, ochrony oczu oraz metod zapobiegania oparzeniom), konserwacji lutownicy oraz podstawowych technik lutowania przewodów i elementów przelotowych. Użytkownicy nieposiadający takiego doświadczenia powinni udać się na szkolenie przed podjęciem kroków opisanych w tej sekcji.

  1. Zbierz wszystkie wymienione w zestawieniu komponenty elektroniczne Spis materiałów i sprawdź pod kątem widocznych uszkodzeń fizycznych. Przejrzyj schemat połączeń (Plik uzupełniający 1).
  2. Skonfiguruj przetwornicę napięcia tak, aby wyjście wynosiło 5 V zamiast domyślnych 12 V. Zgodnie z instrukcją konfiguracji znajdującą się na odwrocie płytki, odłącz pad A i B, stosując lutownicę w celu usunięcia połączenia.
  3. Przygotuj zasilanie: przypajaj pin VIN płytki Arduino Nano BLE Rev2 (dalej zwanej BLE Nano) do pinu OUT+ przetwornicy podwyższającej napięcie, a pin GND płytki BLE Nano do pinu OUT- przetwornicy podwyższającej napięcie (Dodatkowy rysunek 1B).
  4. Solderuj przetwornicę podwyższającą IN– do pinu ujemnego (-) modułu ładowania baterii
  5. Oddziel dwa przewody 'Kabel JST 2-pinowy – Złącze żeńskie, 100 mm' odłączając końcówki podłączenia baterii od białego uchwytu. Skróć każdą do około 70 mm, aby lepiej dopasować do urządzenia, przycinając je od strony przeciwnej do końcówek podłączanych do baterii (Dodatkowy rysunek 1C).
  6. Zmodyfikuj przełącznik. Najpierw usuń szpilki montażowe w każdym rogu. Następnie skróć wszystkie szpilki do 30% ich długości. Następnie całkowicie usuń T1, T3 i B3 (Oznaczenie: T = górna, B = dolna, numerowane od lewej do prawej od 1 do 4, patrząc bezpośrednio na szpilki, przy czym przełącznik znajduje się u góry)Dodatkowy rysunek 1D).
  7. Przyłącz czerwony kabel JST do zacisku B2, pozostawiając wolny koniec do podłączenia baterii odkryty w celu połączenia z baterią’z męskim złączem późniejDodatkowy rysunek 1D).
  8. Złącz przewód połączeniowy między B1 a B4.
  9. Przygotuj moduł ładowania baterii, lutować pin B+ do B1, zachowując ostrożność, aby pozostawić przewód łączący z poprzedniego kroku również dolutowany do B1 (Dodatkowy rysunek 1E).
  10. Przyłącz pin IN+ przetwornicy podwyższającej do T4.
  11. Przyłącz dodatni pin (+) modułu ładowania baterii do T2.
  12. Solderuj czarny kabel JST do modułu ładowania baterii B– przypnij. Zostaw koniec przeznaczony na połączenie z baterią luzem, aby później podłączyć baterię’z męskim złączem
  13. Sprawdź połączenia w warunkach normalnego trybu pracy urządzenia. Podłącz baterię litowo-jonową do obwodu za pomocą przewodów dołączonych do baterii, pozostawionych luzem w trakcie etapów lutowania, z przełącznikiem ustawionym w środkowej pozycji (wyłączony)Dodatkowy rysunek 1E).
  14. Przełącz przełącznik w lewo/do pozycji włączonej (strona z tylko dwoma zajętymi pinezkami).
  15. Sprawdź zasilanie urządzenia BLE Nano za pomocą wbudowanego diodowego wskaźnika zasilania (oznaczonego ‘WŁĄCZONY’, obok portu USB), który powinien zmienić kolor na zielony (Dodatkowy rysunek 1E, Dodatkowe wideo 1).
  16. Sprawdź, czy do przetwornicy podwyższającej doprowadzono zasilanie, poprzez diodę LED umieszczoną na płytce, która powinna świecić na niebiesko.
    UWAGA: Jeśli wskaźniki LED nie zapalają się, przed kontynuowaniem sprawdź wszystkie połączenia multimetrem.
  17. Usuń pierwszą taśmę LED (włożoną w kroku 1.4) i przygraj przewody do obu zestawów pól VIN, DIN oraz GND. Włóż ponownie taśmę LED, przeprowadzając przewody przez otwór w bocznej części ramy (Dodatkowy rysunek 1F, Dodatkowe wideo 1).
  18. Powtórz z drugą taśmą LED zgodnie z Dodatkowe wideo 1.
  19. Przygotuj pierwszą taśmę LED, lutowując ją do pinu GND, pinu D13 oraz pinu VIN modułu BLE Nano.
    UWAGA: Lutowanie do pinu VIN wymaga przyłączenia dwóch przewodów do tego samego pinu na Arduino. Wylutuj jeden przewód wewnątrz otworu pinu, a drugi na zewnątrz otworu od strony wcięcia na płycie Nano
  20. Połącz lutowniczo dwie taśmy LED.
  21. Sprawdź połączenia miernikiem cyfrowym w trybie ciągłości, dotykając pinu VIN na module BLE Nano oraz pola +5 V na ostatnim nieprzylutowanym padzie diody LED. Powtórz czynność dla masy (GND).
  22. Umocuj taśmy LED za pomocą pistoletu do kleju termoplastycznego (Dodatkowy rysunek 1F, Dodatkowe wideo 1). Poruszać się powoli, sklejając tylko jedną lub dwie pary LED na raz, pozwalając klejowi ostygnąć między aplikacjami. W razie potrzeby używać pęsety, aby utrzymać diody w odpowiednim miejscu.

3. Programowanie centralnej i peryferyjnej płytki Arduino

UWAGA: Zaprogramuj dwie płytki Arduino wykorzystywane do komunikacji bezprzewodowej i sterowania diodami LED. Centralna płyta Arduino (Arduino Nano IOT 33) jest podłączona do komputera podczas eksperymentu i przekazuje polecenia ze skryptu Pythona. Płyta obwodowa (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) znajduje się w urządzeniu LEMOS 2.0 i steruje matrycą diod LED. Przed rozpoczęciem eksperymentu obie płytki muszą zostać załadowane odpowiednimi szkicami. Wskazania wizualne udanego połączenia z drugim urządzeniem są dostępne po odkomentowaniu wymienionych linii w skryptach Arduino: Centralna – Linie 34–37, Migające żółte światło LED; Peryferyjny – Linie 99–106, Zielona dioda LED miga. Po zaobserwowaniu pomyślnych połączeń między urządzeniami ponownie zakomentuj te linie. W przeciwnym razie migające diody LED mogą się włączyć, gdy urządzenie znajduje się wewnątrz czytnika płytek, co potencjalnie może naruszyć pomiary.

  1. Pobierz pliki Arduino z repozytorium GitHub: LEMOS_Central.ino, LEMOS_Peripheral.ino. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję zintegrowanego środowiska programistycznego Arduino (IDE) ze strony http://www.arduino.cc/en/software.
  2. Zainstaluj najnowszą wersję pakietu płytki za pomocą Menedżera Płyt (Narzędzia > Plansza > Menedżer tablic) (Dodatkowy rysunek 2A).
    Centrala: płytki Arduino SAMD
    Peryferyjne: płytki Arduino Mbed OS Nano
  3. Zainstaluj następujące biblioteki Arduino w Menedżerze Bibliotek (Narzędzia > Zarządzaj bibliotekami) (Dodatkowy rysunek 2B): 'ArduinoBLE’ do komunikacji za pomocą Bluetooth Low Energy między urządzeniami peryferyjnymi i centralnymi oraz ‘Adafruit_NeoPixel’ do programowania LED
  4. Otwórz plik Arduino LEMOS_Central.ino w środowisku Arduino IDE.
  5. Podłącz odpowiednie urządzenie do komputera za pomocą kabla danych USB.
  6. Wybierz odpowiedni port COM dla podłączonego urządzenia (Narzędzia > Port). Jeśli port COM jest niejasny, obserwuj, który port pojawia się i znika podczas podłączania i odłączania urządzenia.
  7. Wybierz płytę Arduino Nano 33 IoT z menu płytek (Narzędzia > Płyta).
  8. Prześlij skrypt na urządzenie.
  9. Powtórz dla pliku LEMOS_Peripheral.ino i urządzenia peryferyjnego (Arduino Nano 33 BLE Rev 2).

4. Formowanie mikrowłości PDMS metodą odwzorowania

UWAGA: Odlej przezroczyste optycznie mikrowyboje z PDMS bezpośrednio w ramce LEMOS 2.0 metodą formowania przez replikację21Mikrowydrążenia PDMS zawierają kultury bakteryjne podczas eksperymentów z użyciem czytnika płytek i muszą mieć przezroczyste, pozbawione pęcherzyków dna, aby uzyskać wiarygodne wartości OD600 i pomiary fluorescencji. Pył, pęcherzyki powietrza lub niepełne utwardzenie mogą powodować zmienność między dołkami i powinny być unikane podczas odlewania. Przed odlewaniem należy upewnić się, że powierzchnia wyciągu wentylacyjnego jest czysta, ponieważ obecność pyłu lub zanieczyszczeń w PDMS naruszy jego przejrzystość optyczną i spowoduje niestabilne wartości gęstości optycznej (OD)600 odczyty z mikrowłości

UWAGA: Pracuj pod wyciągiem, gdy masz do czynienia z nieutwardzonym PDMS. Unikaj kontaktu środka utwardzającego z powierzchnią skóry.

  1. Zdezynfekuj wnętrze ramy LEMOS 2.0, w której wylewane są mikrowłożki, poprzez opryskanie 70% etanolem, unikając bezpośredniego kontaktu z elementami elektrycznymi, z wyjątkiem diod LED. Pozwól ramie LEMOS 2.0 całkowicie wyschnąć przed wylewaniem mikrowłożków z PDMS.
    UWAGA: Eksponowanie diod LED na etanol jest bezpieczne, ale uszkodzi wszystkie inne komponenty elektryczne.
  2. Spryskaj formę odlewniczą do mikrowłości PDMS środkiem antyprzywierającym i odczekaj 10 minut, aby aerozol osiadł na powierzchni plastikowej. Powtórne naniesienie po kolejnych 10 minutach może poprawić odprowadzenie formy, ale jest opcjonalne.
    UWAGA: środek antyprzywierający (np. Ease Release 200) sprawia, że forma odlewnicza staje się hydrofobowa, ułatwiając usunięcie formy odlewniczej z utwardzonych mikrowłości PDMS.
  3. Odważ i zmieszaj utwardzacz oraz podstawę silikonowego elastomeru 184 w stosunku masowym 10:1 (podstawa do utwardzacza) w jednorazowym plastikowym kubku.
    UWAGA: Zaleca się użycie 2,5 g środka utwardzającego i 25 g podstawy, co daje łącznie 27,5 g mieszanki na jedno urządzenie LEMOS 2.0; w przypadku jednoczesnego formowania wielu urządzeń należy odpowiednio zwiększyć ilości składników w sposób proporcjonalny.
  4. Mieszaj intensywnie przez co najmniej 5 minut za pomocą jednorazowej szpatułki lub patyka drewnianego, scierając zawartość ze ścianek i dna kubka, aby zapewnić pełne wymieszanie.
    UWAGA: Dokładne wymieszanie jest krytyczne. Niedostatecznie wymieszany PDMS nie utwardzi się jednolicie i spowoduje niestabilne wartości wyjściowe OD600 odczyty z mikrowłości
  5. Umieść naczynie zawierające mieszaninę PDMS w desykatorze próżniowym. Aplikuj próżnię (co najmniej 65 cmHg / 25 inHg) przez 45–60 min, aż do usunięcia wszystkich widocznych pęcherzyków powietrza z mieszaniny. Mieszanina PDMS będzie się rozszerzać w miarę, jak pęcherzyki powietrza będą wypływać na powierzchnię, co może spowodować przelanie się jej poza pojemnik. Użyj pojemnika o pojemności co najmniej 3× objętość mieszaniny
    UWAGA: pozostałe pęcherzyki powietrza w utwardzonym PDMS zmienią przenikanie światła przez dna mikrowłości, prowadząc do niestabilnego sygnału podstawowego gęstości optycznej600 pomiary
  6. Umocuj ramę LEMOS 2.0 do zewnętrznej osłony za pomocą zszywaczy papierowych odpowiedniego rozmiaru przytwierdzonych do wszystkich czterech boków.
    UWAGA: Spinacze biurowe minimalizują ilość PDMS, który przedostaje się do szczeliny między zewnętrzną obudową a ramą LEMOS 2.0. Nadmiar PDMS w tej szczelinie może zwiększyć całkowitą wysokość urządzenia i uniemożliwić równomierne osadzenie ramy LEMOS 2.0 we wnętrzu obudowy. Umieszczenie taśmy Kapton wzdłuż dolnego obwodu ramy LEMOS 2.0, w pobliżu mikrowłości, może dodatkowo ograniczyć przedostawanie się PDMS.
  7. Wlej starannie odgazowane PDMS do ramki LEMOS 2.0. Za pomocą strzykawki dodaj PDMS do każdej mikrowłości w ramce, aby zapewnić ich pełne wypełnienie przy minimalnej liczbie pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Powstawanie drobnych pęcherzyków jest nieuniknione; w końcu wypłyną na powierzchnię i znikną. Należy natychmiast po odgazowaniu wlać odgazowane PDMS, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie pęcherzyków podczas manipulacji.
  8. Włóż formę odlewniczą wydrukowaną w technologii 3D do ramki wypełnionej PDMS. Delikatnie i równomiernie naciśnij formę, upewniając się, że okrągłe wypusty w formie odlewniczej wchodzą w otwory ramki LEMOS 2.0. Forma wyznacza kwadratowe studzienki ułożone obok diod LED. Usuń nadmiar PDMS wyciekający z krawędzi za pomocą czystego, bezwłosnego ściereczka.
  9. Pozostaw PDMS do stwardnienia w temperaturze pokojowej (25 °C) °C) na powierzchni poziomej przez co najmniej 30 h. W razie potrzeby przyśpieszyć utwardzanie, umieszczając urządzenie w temperaturze 37 °przez 4 h, ale dopiero po usunięciu wszystkich widocznych pęcherzyków powietrza z PDMS
    UWAGA: Nie narażaj urządzenia LEMOS na temperatury powyżej 37 °C, ponieważ może to spowodować przegrzanie i pęknięcie wbudowanego akumulatora litowo-jonowego.
  10. Usuń formę odlewniczą po utwardzeniu mikrowłości PDMS, chwytając ją za krawędzie i podnosząc jednostajnym ruchem. Upewnij się, że mikrowłóżki PDMS pozostają w ramce.
  11. Sprawdź każdy mikrowłożek, aby upewnić się, że ścianki są optycznie przezroczyste, a dno nie zawiera pęcherzyków powietrza. Urządzenie LEMOS 2.0 z nowymi mikrowłożkami z PDMS jest teraz gotowe do użycia.

5. Konfigurowanie czytnika mikropłytek i przepływu danych eksportowanych

UWAGA: Skonfiguruj czytnik mikropłytek w celu uzyskania kinetycznych pomiarów kompatybilnych z LEMOS 2.0 oraz automatyzacji eksportu danych. Czytnik musi rozpoznawać niestandardowy układ dołków mikropłytki LEMOS 2.0, odczytywać wartości OD600 oraz pomiary fluorescencji w ustalonych odstępach czasu i eksportuj pliki danych do folderu monitorowanego przez skrypt kontrolny w języku Python. Przed rozpoczęciem eksperymentów biologicznych wykonaj pomiar punktu odniesienia (baseline) za pomocą sterylnego medium, aby potwierdzić, że mikrowłościa PDMS oraz ustawienia czytnika płytek zapewniają spójne odczyty. W niniejszym protokole stosowano czytnik mikropłytek BioTek Synergy H1, którym zarządza oprogramowanie BioTek Gen5 w wersji 3.14.

  1. Uruchom Gen5.
  2. Przejdź do Typy płytek i zaimportuj LEMOS 2.0.xml z GitHub lub alternatywnie skonfigurować niestandardowy układ płytki dla LEMOS 2.0 w Gen5, odwołując się do Dodatkowy plik 2 (Sekcja 1)  i Dodatkowy plik 3.
  3. Wykonaj pomiar podstawowy za pomocą urządzenia LEMOS 2.0 (mikrowydrążenia wypełnione 200 µL sterylnego medium M9CA, przykryte folią uszczelniającą medycznego stopnia [np. folia Breathe-Easy]). Zanotuj wartość OD600 oraz wartości fluorescencyjne wyjściowe dla wszystkich 32 mikrowłości i porównaj te wartości z wartościami uzyskanymi z użyciem standardowej mikropłytki 96-ściennej. Jeśli zaobserwuje się dużą rozbieżność, należy ponownie odlacować mikrowłóżki PDMS, ponieważ najprawdopodobniejszą przyczyną są pęcherzyki powietrza lub zanieczyszczenia w utwardzonym PDMS.
    UWAGA: Folia Breathe-Easy przepuszcza gazy, utrzymując warunki aerobowe niezbędne do wzrostu komórek, jednocześnie pozostając przezroczysta, aby nie zakłócać pomiarów fluorescencji i wartości OD600 pomiary
  4. Otwórz protokół eksperymentu closed_loop_protocol.prt z repozytorium GitHub w Gen5.
    UWAGA: Dla wygody w repozytorium GitHub znajduje się przygotowany plik eksperymentu template.xpt. Jednakże ustawienia są szczegółowo opisane w Dodatkowy plik 2 (Sekcja 2) i Dodatkowy plik 3 aby zapewnić punkt odniesienia do usuwania problemów dla użytkowników korzystających z różnych wersji Gen5.

6. Przygotowanie kultur bakteryjnych do eksperymentów LEMOS 2.0

UWAGA: Przygotuj kultury bakteryjne do eksperymentu kinetycznego z zastosowaniem optyki genetycznej LEMOS 2.0. Ostrożne podejście do przygotowania kultur jest istotne, ponieważ początkowa gęstość inokulum oraz ekspozycja na światło przed rozpoczęciem eksperymentu mogą wpływać na mierzone dynamiki ekspresji genów. Szykunkiem demonstracyjnym jest Escherichia coli (E. coli) MG1655 z nosicielstwem pSR58.6 i pNO286-322. pSR58.6 zawiera białko zielonej fluorescencji typu superfolder (sfgfp) pod PcpcG2 oraz konstytutywny CcaR, oporność na chloramfenikol i początek replikacji pColE1. Plazmid pNO286-3 zawiera konstytutywny CcaS, oporność na spektinomycynę i początek replikacji p15A. Razem te plazmidy odtwarzają system ekspresji genów indukowalny światłem zielonym i represyjny światłem czerwonym. Plazmidy pSR58.6 i pNO286-3 wprowadzono do komórek chemicznie kompetentnych E. coli MG1655 metodą transformacji za pomocą uderzenia cieplnego23Płytki umieszczono w pudełku, aby chronić komórki przed światłem otoczenia i zapobiec przedwczesnej aktywacji obwodu optogenetycznego.

  1. Zaszczep pojedynczą kolonię szczepu optykogenetycznego CcaSR oraz szczepu kontrolnego bez fluorescencji do oddzielnych probówek hodowlanych o pojemności 14 mL z dnem okrągłym, każda zawierająca 2 mL bulionu M9CA uzupełnionego o 50 µg/mL spektynomycyny i 25 µg/mL chloramfenikolu. Używaj tego składu pożywki we wszystkich kolejnych krokach hodowli w całym doświadczeniu.
  2. Przykryj każdą probówkę folią aluminiową i inkubuj całą noc (14–16 h) w 37 °C z wstrząsaniem przy 220 rpm.
    UWAGA: Owiniecie folią zapewnia warunki ciemne i zapobiega niezamierzonemu aktywowaniu systemu CcaSR. Alternatywnie, hodowle można inkubować w warunkach ciągłego naświetlania światłem czerwonym, umieszczając probówki w obudowie LED podłączonej do tego samego układu elektrycznego, jak opisano w sekcji 2, co w większym stopniu naśladuje stan represji systemu przed rozpoczęciem eksperymentu.
  3. Przenieś 100 µL każdej kultury hodowanej całą noc do 2 mL świeżej pożywki w nowej probówce do hodowli owrapowanej folią aluminiową. Inkubuj przez 4 h w 37°C °C z mieszaniem przy 220 rpm.
  4. Zmierz wartość OD600 każdej podkultury po 4 godzinach za pomocą czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Kultury powinny osiągnąć wartość OD600 0,4–0.6.
  5. Rozcieńcz każdą hodowlę do wartości OD600 = 0,1 w świeżej pożywce, pipetuj 200 µL do każdej mikropłytki urządzenia LEMOS 2.0, zachowując ostrożność podczas pipetowania, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, a następnie zamknij urządzenie filmem uszczelniającym przeznaczonym do zastosowań medycznych.

7. Rozpoczęcie eksperymentu optylogenicznego LEMOS 2.0 w układzie czasowym

UWAGA: Rozpocznij automatyczny eksperyment LEMOS 2.0, koordynując czytnik mikropłytek, centralny układ Arduino oraz skrypt sterujący w języku Python. Podczas trwania eksperymentu komputer koordynuje pomiary za pomocą czytnika płytek, eksport danych, komunikację Bluetooth oraz aktywację diod LED. Istotne jest, aby okno programu Gen5 pozostawało widoczne, ponieważ skrypt w języku Python wykorzystuje automatyzację opartą na ekranie do interakcji z oprogramowaniem czytnika mikropłytek. Pomyślne uruchomienie sygnalizowane jest przez pojawienie się plików danych w oczekiwanym folderze, komunikaty w terminalu potwierdzające komunikację Bluetooth oraz aktualizację poleceń diodom LED w każdym interwale sterowania.

  1. Przesuń przełącznik w lewo, aby włączyć urządzenie LEMOS 2.0. Pierwszy dioda LED na taśmie LED w urządzeniu LEMOS 2.0 zaświeci się na zielono.
  2. Podłącz centralny Arduino do komputera za pomocą kabla USB i wybierz go w środowisku Arduino IDE z rozwijanej listy (Narzędzia > Plansza).
  3. Otwórz Monitor szeregowy i podłącz Arduino peryferyjne umieszczone w LEMOS 2.0 do Arduino centralnego.
  4. Wyłącz diodę wskaźnika na taśmie LED, wprowadzając literę 'o' do monitora szeregowego.
  5. Otwórz plik z eksperymentem LEMOS-start-data.xpt w Gen5 i wykonaj odczyt wyjściowy kultur w urządzeniu, zapewniając, że wartość OD600 a wartości fluorescencji są zgodne z oczekiwaniami. Zamknij plik eksperymentu.
  6. Otwórz plik protokołu zapisany w kroku 5.4 w programie Gen5 i zapisz go jako eksperyment, odnosząc się do Dodatkowy plik 2 (Część 3) i Dodatkowy plik 3.
  7. Upewnij się, że w systemie zainstalowana jest wersja Pythona 3.10 lub nowsza, a następnie zainstaluj wymagane pakiety za pomocą dostarczonego pliku requirements.txt.
  8. Otwórz control_duty_cyle.py (dla eksperymentów z cyklem pracy) lub control_pid.py (dla eksperymentów PID) w dowolnym odpowiednim środowisku IDE, takim jak Visual Studio Code lub Spyder.
    UWAGA: Upewnij się, że katalog roboczy jest ustawiony na folder zawierający wszystkie skrypty Pythona, aby można je było zaimportować podczas wykonywania skryptu. Wybór środowiska IDE nie ma istotnego znaczenia.
  9. W Główna sekcja skryptu w języku Python, zmodyfikuj plik zmienna odpowiadająca nazwie pliku eksperymentu Gen5 wybranej w kroku 7.6.
  10. Ustaw plik eksperymentu i skrypt w języku Python jeden obok drugiego (Rysunek 1).
  11. Kliknij Uruchom w eksperymencie Gen5, a następnie przerwij go, gdy rozpocznie się etap kinetyczny.
    UWAGA: Skrypt Python szuka Kontynuuj przycisk po kliknięciu UruchomJednak w nowym pliku eksperymentalnym przycisk ten nie jest wyświetlany, dopóki nie zostanie wykonane drugie odczytanie lub nie zostanie przerwany pomiar kinetyczny.
  12. Uruchom skrypt w języku Python. Nie minimalizuj i nie zakrywaj okna Gen5 podczas wykonywania skryptu.
    UWAGA: Skrypt Python wykorzystuje automatyzację opartą na ekranie i musi co około 20 minut odnaleźć okno Gen5, aby obsłużyć eksport danych po każdym cyklu kinetycznym. Przesłonięcie lub zminimalizowanie okna w tym czasie może zakłócić przebieg eksperymentu.

8. Czyszczenie urządzenia, usuwanie PDMS i ładowanie baterii

UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu oczyść i zresetuj urządzenie LEMOS 2.0. Usuń hodowle bakteryjne oraz zużyte mikrowelliki z PDMS, zdezynfekuj wielokrotnie używaną ramę i obudowę oraz naładuj baterię przed kolejnym uruchomieniem. Unikaj narażania niebędących diodami LED komponentów elektronicznych na działanie etanolu lub nadmiernego obciążenia mechanicznego podczas czyszczenia.

  1. Delikatnie zdjęcie folię uszczelniającą medycznego stopnia z góry urządzenia LEMOS 2.0 i wyrzuć ją.
  2. Odsącz i odrzuć całą ciecz zawiesiny komórkowej z każdej mikodłuczki za pomocą pipety zgodnie z procedurami utylizacji odpadów biologicznych.
  3. Oddziel zewnętrzną obudowę od ramy LEMOS 2.0, stosując równomierny i stały nacisk. Unikaj nadmiernego wyginania lub skręcania ramy z PLA, ponieważ może to spowodować pęknięcia lub trwałe odkształcenie.
  4. Odłóż grubą warstwę PDMS od zewnętrznej części ramki i za pomocą pęsety ostrożnie usuń mikrowellki PDMS z ramki LEMOS 2.0.
  5. Zdezynfekuj ramę i osłonę zewnętrzną urządzenia LEMOS 2.0 za pomocą 70% etanolu, unikając bezpośredniego kontaktu z elementami elektrycznymi, z wyjątkiem diod LED, zgodnie z opisem w kroku 4.1.
  6. Naładuj ponownie baterię litowo-jonową przed kolejnym eksperymentem:
    1. Przesuń przełącznik w prawo/do położenia ładowania.
    2. Podłącz kabel USB do modułu ładowania.
    3. Potwierdź ładowanie za pomocą wbudowanego diody LED, która będzie migać podczas ładowania (Dodatkowy rysunek 1E).

9. Analiza dynamiki fluorescencji i wzrostu

UWAGA: Przetwórz fluorescencję i OD600 dane wygenerowane podczas eksperymentu LEMOS 2.0. Notatnik analityczny importuje wyeksportowane dane z czytnika płytek, stosuje korekty pustego odczytu i ujemnej kontroli, oblicza znormalizowaną fluorescencję oraz generuje wykresy przebiegu czasowego. Przed uruchomieniem notatnika upewnij się, że przyporządkowania do dołków mikropłytki oraz oznaczenia warunków odpowiadają układowi eksperymentalnemu.

  1. Otwórz jedno z dwóch FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb lub FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
    UWAGA: Użyto danych fluorescencji (FL) i gęstości optycznej (OD), które są przechowywane w plikach wygenerowanych podczas przebiegu eksperymentu: Plik danych/fl.csv i Datafile/od.csv. Arkusz analizy PID wykorzystuje również błędy ekspresji względem wartości zadanej, które są przechowywane w Datafile/errors.csv.
  2. Ustaw zmienną warunków z nazwami warunków i dołkami.
  3. Ustawienie studnie_negatywne równa nawiasowej liście nazw mikrowell kontrolnych ujemnych
  4. Ustawienie od_blank i fl_blank do średnich z pól kontrolnych, lub do znanych wartości, jeśli nie przeprowadzono pomiaru kontrolnego.
  5. Ustawienie kolory_4_rysunki na żądane kolory (pełna lista nazwanych kolorów dostępna pod adresem https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
  6. Ustaw figsize na żądaną szerokość i wysokość wynikowych rysunków w calach.
  7. Potwierdź nazwy plików wymienione w Stałe.
  8. Uruchom notatnik, wykresy zostaną wygenerowane jako pliki .png.

10. Rozwiązywanie problemów

  1. Podczas wykonywania połączeń LED, jeśli pola lutownicze diody LED odczepią się, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
    1. Zgiń narożnik taśmy LED, aby łatwiej przeprowadzić przewody przez otwór kablowy.
    2. Jeśli użyto sztywnego (pełnego) przewodu, należy przełączyć się na bardziej giętki (skręcony) przewód.
  2. Jeśli przełącznik jest włączony, a BLE Nano'Jeśli dioda LED zasilania nie świeci, rozważ następujące możliwości:
    1. Najpierw sprawdź, czy bateria jest naładowana. Ustaw przełącznik w tryb ładowania i podłącz moduł ładowania do zasilania. Jeśli bateria jest naładowana, dioda wskaźnika powinna przestać migać i świecić się stałym zielonym światłem po kilku minutach. Jeśli bateria była wyładowana, należy ją całkowicie naładować przed ponowną próbą.
    2. Jeśli bateria jest naładowana, a dioda LED nadal się nie świeci, zmierz miernikiem uniwersalnym napięcie na BLE Nano'szpilki VIN i GND
      1. 0 V: Połączenie przewodowe jest przerwane. Sprawdź każde połączenie lutownicze wzdłuż baterii > przełącznik > konwerter podwyższający > Nanoś ponownie ścieżkę i przepływ solder na każdy złącze, który wygląda na zimny lub niekompletny.
      2. 5 V: Zasilanie poprawnie dociera do płytki Nano, co oznacza, że sama płytka może być uszkodzona. Aby to potwierdzić, spróbuj zasilić płytkę Nano za pomocą kabla. Jeśli dioda zasilania nadal się nie świeci, przylutuj nową płytkę Nano, aby zastąpić uszkodzoną.
      3. Więcej niż 5 V: Konwerter podwyższający napięcie nie został skonfigurowany do wyjścia 5 V. Upewnij się, że styki A i B zostały odłączone na konwerterze podwyższającym, zgodnie z opisem w sekcji montażu urządzenia.
  3. Jeśli skrypt w języku Python nie uruchamia się, rozważ następujące kwestie:
    1. Sprawdź, czy skrypt Pythona jest otwierany z poziomu pełnego folderu projektu, a nie jako samodzielny plik; zarówno control_duty_cycle.py, jak i control_pid.py zależą od innych lokalnych modułów i nie będą działać, jeśli zostaną otwarte niezależnie.
    2. Upewnij się, że środowisko Arduino IDE jest zamknięte, ponieważ Arduino może mieć tylko jedno aktywne połączenie w danym czasie. System operacyjny udziela dostępu programowi, który pierwszy otworzy port.
    3. Upewnij się, że protokół Gen5 został poprawnie skonfigurowany, szczególnie w przypadku korzystania z innego oprogramowania. Odniesienie do Dodatkowy plik 2 (Sekcja 2).
    4. Upewnij się, że wymagane pakiety są zainstalowane. Utwórz środowisko wirtualne i zainstaluj pakiety wymienione w pliku requirements.txt.
  4. Jeśli eksperyment zatrzyma się nieoczekiwanie, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
    1. Zatrzymuje się po pierwszym cyklu: ścieżka eksportu danych w programie Gen5 jest prawdopodobnie nieprawidłowo skonfigurowana. Upewnij się, że miejsce eksportu odpowiada folderowi, z którego skrypt Pythona oczekuje odczytu danych plik zmienna
    2. Zatrzymuje się po kilku cyklach: PyAutoGUI czasami nie rozpoznaje elementów na ekranie, szczególnie po zmianie rozdzielczości ekranu, skalowaniu wyświetlania lub rozmiaru okna. Powtórnie wykonaj zrzuty ekranu używane jako odniesienia przez skrypt i utrzymuj okno Gen5 aktywne i na pierwszym planie przez cały czas działania skryptu; okno środowiska IDE Pythona może być zminimalizowane.
    3. W przypadku, gdy program Gen5 zgłasza, że temperatura komory znajduje się poza zakresem docelowym, należy pozwolić czytnikowi osiągnąć równowagę przed kontynuacją. Nie ignoruj ostrzeżenia o temperaturze, ponieważ może to spowodować wyświetlenie okna raportu audytowego, które trzeba zamknąć ręcznie i które może przerwać automatyzację.
  5. Jeśli wartość OD jest niezwykle wysoka lub niestabilna600jeśli zaobserwuje się różne wartości wyjściowe fluorescencji w poszczególnych dołkach mikropłytki, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
    1. Sprawdź mikrowyboje z PDMS pod kątem obecności uwięzionego pyłu lub zanieczyszczeń, które rozpraszają światło i zawyżają odczyty.
    2. Unikaj pozostawiania PDMS odkrytego i narażonego na powietrze otoczenia przez dłuższy czas przed odlewaniem lub użyciem.
  6. Jeśli mimo przeprowadzenia eksperymentu komórki nie wykazują wykrywalnej odpowiedzi na światło, rozważ następujące czynniki:
    1. Potwierdź diodę LED "na" polecenia są wydawane poprzez sprawdzanie zarówno wyników terminala IDE, jak i dziennika komunikacji BLE
    2. Jeśli polecenia są wysyłane, ale nie widać światła, sprawdź połączenia lutownicze diody LED za pomocą miernika.

Wyniki

LEMOS 2.0 to kompatybilna z czytnikiem mikropłytek platforma z 32 dołkami24 do programowalnej stymulacji optogenetycznej i ilościowego pomiaru ekspresji genów (Rysunek 2A,B). Każdy mikrodołek jest sparowany z indywidualnie adresowalną diodą emitującą światło (LED) WS2812B, sterowaną przez Arduino Nano 3 BLE Sense Rev2 za pomocą biblioteki Adafruit_NeoPixel. Urządzenie komunikuje się z zewnętrznym komputerem poprzez Bluetooth, co pozwala na aktualizację poleceń oświetlenia w trakcie eksperymentu. Przed użyciem w urządzeniu odlewa się świeże mikrodołki z PDMS metodą odlewania replikacyjnego (Rysunek 2C,D). Kultury E. coli hodowane w systemie LEMOS 2.0 w temperaturze 30 °C przy stałym oświetleniu LED wykazały powtarzalny wzrost we wszystkich mikrodołkach, co wskazuje, że urządzenie umożliwia hodowlę bakterii i pomiary czytnikiem płytek w trakcie przebiegu eksperymentu18 (Rysunek 2E). Ponadto krzywe wzrostu były podobne dla różnych warunków oświetlenia, co oznacza, że ekspozycja na światło LED nie wpłynęła w mierzalny sposób na wzrost komórek przy tych ustawieniach.

Aby zademonstrować optogenetyczną kontrolę ekspresji genów, zastosowano system CcaSR v3.02, będący dwuskładnikowym systemem aktywowanym światłem zielonym i represowanym światłem czerwonym, który kontroluje ekspresję sfGFP (Rysunek 3A). Pod wpływem światła zielonego CcaS ulega autofosforylacji i przenosi grupę fosforanową na regulator odpowiedzi CcaR, który dimeryzuje, aby aktywować zależną od promotora PcpcG2 ekspresję sfGFP. Pod wpływem światła czerwonego CcaS ulega defosforylacji, co zmniejsza aktywność PcpcG2 i represuje ekspresję sfGFP. Plazmidy CcaSR wprowadzono do szczepu E. coli MG165 i wykorzystano w eksperymentach opisanych w niniejszym protokole (Rysunek 3B). Podczas eksperymentu czytnik mikropłytek pomiar OD60 oraz fluorescencję co 10 min. Aby zapobiec zakłócaniu pomiarów optycznych przez oświetlenie LED, zaprogramowano diody LED tak, aby wyłączały się w oknach pomiarowych na początku i na końcu każdego 10-minutowego odstępu (Rysunek 3C).

Przenikanie sygnału między dołkami (crosstalk) oceniono początkowo poprzez rozmieszczenie mikrodołków w warunkach ciemności w pionowym lub poziomym sąsiedztwie mikrodołków poddawanych stałemu naświetlaniu zielonym światłem (Rysunek 3D). Mikrodołki w ciemności sąsiadujące z mikrodołkami o stałym naświetlaniu zielonym światłem nie wykazywały istotnego wzrostu ekspresji w porównaniu z mikrodołkami w ciemności bez oświetlonych sąsiednich mikrodołków, co wskazuje na minimalny wyciek światła między mikrodołkami. Na podstawie tych wyników w kolejnych eksperymentach zastosowano wartość modulacji szerokości impulsu (PWM) wynoszącą 1 z 25, aby zapewnić wystarczającą stymulację optyczną przy jednoczesnym zminimalizowaniu przenikania sygnału między dołkami.

Następnie zastosowano stymulację w pętli otwartej w celu zdefiniowania parametru sterującego dla kontroli optogenetycznej opartej na systemie LEMOS. Parametrem sterującym był cykl pracy światła zielonego, zdefiniowany jako ułamek każdego aktywnego okna oświetlenia przypisany do światła zielonego, podczas gdy pozostały czas oświetlenia przypisano do światła czerwonego. Każdy interwał kontrolny trwał 10 min, przy czym diody LED były aktywne przez 8 min i wyłączone przez pozostałe 2 min, aby uniknąć zakłóceń w pomiarach za pomocą czytnika płytek. Cykle pracy światła zielonego od 5% do 80% spowodowały stopniową ekspresję sfGFP, co wykazało, że cykl pracy może służyć jako regulowany sygnał wejściowy do regulacji optogenetycznej (Rycina 3E). Szybkość ekspresji wzrastała wraz ze wzrostem cyklu pracy od 5% do 40%, przy braku istotnego dalszego wzrostu przy wyższych cyklach pracy (Rycina 3F), co sugeruje, że system zbliża się do nasycenia podczas dłuższej stymulacji światłem zielonym.

Na koniec zaimplementowano regulację sprzężenia zwrotnego w pętli zamkniętej, aby przetestować, czy system LEMOS 2.0 jest w stanie dynamicznie regulować ekspresję genów w kierunku określonej wartości zadanej25 (Rysunek 4A). Elementy systemu sterowania przypisano w następujący sposób: element wykonawczy — diody LED, regulator — zewnętrzny komputer uruchamiający skrypt PID oraz mierzona wartość wyjściowa — fluorescencja sfGFP znormalizowana względem OD600Kontroler porównał zmierzoną wartość FL/OD600 wartość z przypisaną wartością zadaną i zaktualizowano cykl pracy zielonego światła dla następnego 10-minutowego odstępu czasu. Zastosowano regulację proporcjonalno-całkująco-różniczkującą (PID), w której czas ekspozycji na zielone światło w każdym cyklu, tzielonyobliczono jako:
figure-results-1

Tutaj e(t) to błąd pomiędzy zmierzonym sygnałem FL/OD60 a wartością zadaną w czasie t. K to wzmocnienie proporcjonalne, τI  to całkowa stała czasowa, a τD to różniczkująca stała czasowa. Parametry sterowania w pętli zamkniętej wybrano przy użyciu modelu ekspresji genów w różnych stadiach wzrostu (GEAGS), który został opisany we wcześniejszej publikacji26. Przy zastosowaniu tych parametrów zmierzony sygnał zbliżył się do docelowej wartości zadanej FL/OD60 i śledził ją (Rysunek 4B).

Odpowiednie polecenia cyklu pracy przedstawiono na Rysunku 4C. Wysokość słupka reprezentuje ułamek światła zielonego dostarczanego podczas każdego 8-minutowego okna naświetlania. Polecenie cyklu pracy zmieniało się w dyskretnych krokach, ponieważ kontroler aktualizował wejście raz na 10 min. W miarę gdy ekspresja sfGFP zbliżała się do wartości zadanej, ekspozycja na światło zielone malała, a ekspozycja na światło czerwone rosła. Po osiągnięciu wartości zadanej przez zmierzony sygnał, nadal obserwowano niski poziom wejściowy światła zielonego. Ten pozostałościowy sygnał sterujący prawdopodobnie odzwierciedla człon różniczkujący reagujący na gwałtowną zmianę szybkości ekspresji w pobliżu wartości zadanej. Wyniki te pokazują, że system LEMOS 2.0 może implementować sterowanie sprzężeniem zwrotnym PID kierowane modelem w optogenetycznej ekspresji genów w kulturze okresowej.

figure-results-2
Rysunek 1Konfiguracja oprogramowania LEMOS 2.0 podczas eksperymentuPrzykładowy zrzut ekranu przedstawiający działający w programie VS Code skrypt sterujący w języku Python (po lewej), w którym w terminalu pojawiają się polecenia dla diod LED przesyłane do mikrokontrolera Arduino. W panelu eksploratora plików widoczny jest katalog projektu zawierający główny skrypt oraz powiązane moduły funkcji. Po prawej stronie oprogramowanie czytnika płytek pokazuje trwający cykl pomiaru kinetycznego; po zakończeniu każdego cyklu skrypt Pythona automatycznie uruchamia kolejny pomiar za pośrednictwem interfejsu Gen5 i odpowiednio aktualizuje polecenia dotyczące cyklu pracy diod LED. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 2Konstrukcja urządzenia LEMOS i charakterystyka wzrostu komórek. (A) Schemat rozstrzelony urządzenia LEMOS przedstawiający mikrodoodki z PDMS, diody LED do stymulacji, baterię, przełącznik, mikrokontroler, moduł ładowania, ramę urządzenia oraz obudowę zewnętrzną. (B) Zmontowane urządzenie z mikrootworami z PDMS wypełnionymi wodą dejonizowaną. (C) mikrootwór PDMS odlany w urządzeniu LEMOS. Reprodukcja z Namboothiri et al. (2026)18, na licencji CC BY 4.0. (D) Formuła wydrukowana w technologii 3D do odlewania mikrootworów (E) Krzywe wzrostu E. coli w LEMOS w 30 °C (N = 3 powtórzenia techniczne dla każdej z dołek poddanych ciągłej iluminacji światłem zielonym lub czerwonym, a także utrzymywanych w ciemności). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.

figure-results-4
Rycina 3Charakterystyka układu optogenetycznego w LEMOS i dynamika sterowania w pętli otwartej. (A) Mapa plazmidu optogenicznego systemu dwuskładnikowego CcaSR: światło zielone (52 nm) aktywuje CcaS/CcaR, co zwiększa ekspresję sfGFP, natomiast światło czerwone (620 nm) zmniejsza tę ekspresję. (B) Protokół przeprowadzania eksperymentów optogenetycznych z wykorzystaniem systemu optogenetycznego CcaSR. (C) Schemat działania systemu LEMOS. W ciągu 12-godzinnego przebiegu procesu urządzenie pozostaje w czytniku mikropłytek. Czytnik mierzy fluorescencję sfGFP oraz OD600, następnie przesyła dane do komputera, który zarządza pomiarem czasu i uruchamia szkice Arduino. Szkice Arduino wydają polecenia pokładowemu mikrokontrolerowi, aby tymczasowo wyłączyć oświetlenie LED podczas każdego pomiaru. Adaptacja na podstawie Namboothiri i wsp. (2026)18, na licencji CC BY 4.0. (D) Wpływ interferencji światła zielonego na komórki niestymulowane w warunkach ciemności. Na schemacie płytki zielone pola oznaczają mikroszczeliny z oświetleniem zielonym (N = 9), szare pola oznaczają mikroszczeliny w warunkach ciemności, w których w sąsiednich mikroszczelinach nie występuje interferencja światła (N = 6), fioletowe pola oznaczają ciemne mikroszczeliny (N = 3) sąsiadujące pionowo z mikroszczelinami z oświetleniem zielonym, żółte pola oznaczają ciemne mikroszczeliny (N = 3) sąsiadujące poziomo z mikroszczelinami z oświetleniem zielonym, a niebieskie pola oznaczają mikroszczeliny z oświetleniem zielonym (N = 2) zawierające szczep kontrolny do pomiaru autofluorescencji. (E) Odpowiedzi w pętli otwartej w systemie LEMOS na zmienne cykle pracy światła zielonego (5–80%, N = 3) jako parametr sterujący. Linie ciągłe oznaczają wartości średnie; zacieniowane obszary oznaczają odchylenia standardowe. (F) Średnia szybkość ekspresji podczas fazy wykładniczej wzrostu przy zmiennym cyklu pracy. N oznacza liczbę powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 4sprzężenie zwrotne w pętli zamkniętej w systemie LEMOS 2.0. (A) Schemat działania w pętli zamkniętej: czytnik mikropłytek pełni funkcję czujnika mierzącego stosunek FL/OD600komputer pełni funkcję kontrolera, a urządzenie LEMOS 2.0 aktywuje diody LED w celu regulacji ekspresji genów. Procesem tym jest ekspresja genów w żywych komórkach bakteryjnych. Adaptacja na podstawie Namboothiri i wsp. (2026)18, licencjonowane na mocy CC BY 4.0. (B) Sterowanie z regulatorem proporcjonalno-całkująco-różniczkującym (PID) w celu śledzenia FL/OD600 wartość zadana (SP = 18,5 × 105 (a.u.). Referencje dla stałego oświetlenia są zaznaczone kolorem zielonym i czerwonym (N = 3). Przebiegi śledzenia wartości zadanej opisano liniami pomarańczowymi (N = 3). Linie ciągłe wskazują średnią wartość FL/OD600; zacieniowane pasma oznaczają odchylenia standardowe. Linia przerywana wyznacza punkt nastawy. (C) Reprezentatywne polecenia cyklu pracy wygenerowane przez regulator PID podczas śledzenia wartości zadanej w pętli zamkniętej. Wysokość słupka wskazuje ułamek światła zielonego dostarczonego podczas każdego przedziału oświetlania. N oznacza liczbę powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

PlatformaFormat hodowliOdczytWykazana kontrola sprzężenia zwrotnegoFormat wzrostuOgraniczenie rozwiązane przez LEMOS 2.0
LEMOS 2.032 mikrododatków PDMS w czytniku płytekKomercyjny czytnik płytekŚledzenie wartości zadanej PID sterowane modelemHodowla okresowa z wytrząsaniemNiniejsze badanieNiniejsze badanie
LEMOS 1.016 mikrododatków PDMS w czytniku płytekKomercyjny czytnik płytekŚledzenie wartości zadanej PI i PID sterowane modelemHodowla okresowa z wytrząsaniemNiższa przepustowość; ograniczona kompatybilność z warunkami ciemności18
Zautomatyzowany turbidostat + pobieranie próbek robotycznieTurbidostatCytometria przepływowa + czujnik ODŚledzenie wartości zadanej PI, PID, MPCHodowla ciągłaWymaga robotycznego pobierania próbek; opóźnienie między pomiarem a działaniem2, 3
Mikroskopia typu Mother-machineMikrofluidyka jednokomórkowaMikroskopia żywych komórekSprzężenie zwrotne jednokomórkowe / MPCPerfuzja ciągłaWymaga specjalistycznej mikrofluidyki i mikroskopii4, 6, 7
Chi.BioZminiaturyzowany turbidostatWbudowane czujniki OD/FLŚledzenie wartości zadanej PIHodowla ciągłaZakres dynamiczny wbudowanego czujnika ogranicza wydajność sprzężenia zwrotnego fluorescencji5
Light Tube ArrayProbówki hodowlaneZewnętrzny OD/cytometria przepływowaTylko pętla otwartaHodowla okresowa z wytrząsaniemRęczne pobieranie próbek; ograniczony odczyt wzrostu online10
LAVA / LITOS / RainbowCap / DiyaUrządzenia do oświetlania wielodołkowegoKomercyjny czytnik płytekTylko pętla otwartaHodowla okresowaOddzielna stymulacja/odczyt; ograniczona automatyzacja12, 13, 14, 15
LustroOświetlanie płytek 96-dołkowychKomercyjny czytnik płytekTylko pętla otwartaHodowla okresowaWymaga robotycznego transferu między stymulacją a odczytem8
RT-OGENEStolik kompatybilny z wielodołkowymi/mikrofluidycznymiOD/FL oparty na kamerzePróba pętli zamkniętej; ograniczona przez odczytStatyczna hodowla okresowaOdczyt oparty na kamerze i statyczna hodowla ograniczają wydajność sterowania16
optoPlateReaderNiestandardowy czytnik/stymulator 96-dołkowyWbudowane fotodiodyŚledzenie wartości zadanej typu bang-bangHodowla okresowa z wytrząsaniemZależność od reportera/filtra oraz niższa czułość fluorescencji ograniczają elastyczność odczytu1,17

Tabela 1: Porównanie LEMOS 2.0 z istniejącymi platformami optogenetycznymi2,3,4,5,6,7,8,10,1,12,13,14,15,16,17,18.

Rycina uzupełniająca 1: Zdjęcia montażowe. (A) Wygięta taśma LED oraz formowana taśma wewnątrz urządzenia. (B) Nano BLE Sense Rev 2 przylutowany do przetwornicy step-up, która jest przylutowana do modułu ładowania akumulatora. (C) Oryginalna i zmodyfikowana wersja kabla „JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 10mm”. (D) Przełącznik oryginalny, przełącznik zmodyfikowany, przylutowany czerwony kabel JST PH oraz krótka zworka przylutowana pomiędzy dwoma pinami po obu stronach dolnego rzędu. (E) Włączenie przełącznika do montażu obwodu i zasilenie obwodu. (F) Widok z boku diod LED i pasków LED przymocowanych za pomocą kleju na gorąco. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Zrzuty ekranu z konfiguracji Arduino IDE. (A) Zrzut ekranu z Menedżera Płytek (Boards Manager), przedstawiający wyszukiwanie jednej z wymaganych płytek. (Bzrzut ekranu z okna Library Manager, przedstawiający dwie z wymaganych bibliotek. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1. Schemat połączeń LEMOS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Protokół konfiguracji niestandardowego układu płytki dla LEMOS 2.0 w oprogramowaniu Gen5. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Zrzuty ekranu kroków w oprogramowaniu opisanych w pliku uzupełniającym 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 1: Film z montażem obejmujący następujące etapy. Umieszczanie paska LED w ramie, mocowanie paska LED klejem na gorąco, rozmieszczenie przewodów prowadzących do pasków LED i pomiędzy nimi oraz końcowy montaż z układem elektronicznym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje konstrukcję i zasady działania LEMOS 2.0, 32-dołkowej mikropłytki z wbudowanymi diodami LED do eksperymentów z optogenetyczną stymulacją i sprzężeniem zwrotnym w standardowym czytniku mikropłytek. Reprezentatywne eksperymenty wykazują, że LEMOS 2.0 umożliwia wzrost mikroorganizmów (Ryc. 2E), przy czym pod wpływem naświetlania nie zaobserwowano istotnej fototoksyczności. Ponadto LEMOS 2.0 ogranicza wyciek światła do sąsiednich mikrodofków w warunkach ciemności (Ryc. 3D), co poprawia wiarygodność kontroli ciemnej oraz eksperymentów ze stymulacją o wzorcu przestrzennym. Co więcej, LEMOS 2.0 umożliwia optogenetyczną aktywację opartą na cyklu pracy (Ryc. 3E) i implementuje zamkniętą pętlę sterowania PID ekspresją genów w hodowlach okresowych (Ryc. 4B).

Fotoblaknięcie jest istotnym zagadnieniem w eksperymentach optogenetycznych, ponieważ ten sam tor optyczny jest wykorzystywany zarówno do aktywacji, jak i do odczytu fluorescencji27. Urządzenie LEMOS 2.0 wykorzystuje komercyjne diody LED RGB zawierające trzy diody z pikami emisji przy 620–630 nm (czerwony), 515–525 nm (zielony) i 465–475 nm (niebieski)19. Z tego powodu dobór reportera oraz natężenie pracy diod LED powinny być tak dobrane, aby zminimalizować nakładanie się widm między długościami fal aktywacyjnych a widmem wzbudzenia reportera fluorescencyjnego, przy jednoczesnym zachowaniu wystarczającej ilości światła niezbędnej do regulacji optogenetycznej. W niniejszym protokole zastosowano system CcaSR, którego odpowiedzi na światło zielone i czerwone mieszczą się w szerokich pasmach aktywacji i dezaktywacji opisanych dla tego systemu22, oraz mierzono fluorescencję sfGFP przy wzbudzeniu 485 nm. Ponieważ zielona i czerwona długość fali aktywacyjnej używanej do sterowania CcaSR są oddalone od długości fali wzbudzenia sfGFP, a moc wyjściowa LED została zminimalizowana do natężenia PWM wynoszącego 1 z 25, przy jednoczesnym zachowaniu silnej regulacji optogenetycznej, oczekuje się, że fotoblaknięcie wynikające z aktywacji LED będzie ograniczone. Podczas długich eksperymentów czasowych może nadal dochodzić do pewnego fotoblaknięcia; jednak w zastosowanych tutaj warunkach nie było ono na tyle duże, aby zamazać pomiar indukcję optogenetyczną, odpowiedź na cykl pracy lub dynamikę śledzenia w pętli zamkniętej20.

Kilka etapów jest kluczowych dla niezawodnego działania urządzenia. Podczas produkcji każda dioda LED musi zostać wyrównana z odpowiadającym jej mikrodopalnikiem, aby zachować jednorodność stymulacji i zredukować przesłuchy optyczne. Podczas montażu obwodu przetwornica step-up musi zostać skonfigurowana na 5 V przed podłączeniem mikrokontrolera i pasków LED. Odlewanie PDMS również wymaga szczególnej staranności, ponieważ pęcherzyki powietrza, kurz, zanieczyszczenia lub niepełne utwardzenie mogą zmienić transmisję optyczną przez dna mikrodopalników i spowodować niespójne wartości bazowe OD60 lub fluorescencji28. Dlatego przed eksperymentami biologicznymi należy przeprowadzić pomiar bazowy z użyciem sterylnego medium. Jeśli w poszczególnych dołkach zaobserwowane zostaną duże rozbieżności w odczytach OD60 w stosunku do reszty płytki, należy sprawdzić, czy w dotkniętych dołkach nie wystąpiły wspomniane wcześniej problemy produkcyjne. W zależności od stopnia nasilenia, takie mikrodopalniki należy albo wykluczyć z analizy, albo całkowicie odlać ponownie.

Konfiguracja oprogramowania jest kolejnym częstym źródłem nieudanych eksperymentów. Obecny schemat postępowania opiera się na skoordynowanym działaniu metody odczytu z czytnika płytek, eksportu danych z programu Gen5, skryptu sterującego w języku Python oraz komunikacji Bluetooth między główną a peryferyjną płytką Arduino. Ścieżka eksportu i format pliku muszą być zgodne ze strukturą oczekiwaną przez skrypt Python, a okno programu Gen5 musi pozostać widoczne podczas pomiaru, ponieważ automatyzacja wykorzystuje interakcje oparte na obrazie ekranu. Przed rozpoczęciem eksperymentu urządzenie LEMOS powinno zostać podłączone do głównej płytki Arduino, a następnie należy uruchomić rutynę testową, aby zweryfikować, czy wszystkie diody LED świecą prawidłowo; wszelkie niedziałające diody należy zidentyfikować i naprawić przed załadowaniem kultur bakteryjnych, ponieważ niewykryte awarie doprowadziłyby do niekontrolowanych warunków oświetlenia podczas eksperymentu. Użytkownicy dostosowujący schemat postępowania do innego modelu czytnika płytek lub innego pakietu oprogramowania powinni zachować tę samą logikę czasową, pomiarową, eksportu i parsowania, modyfikując warstwę automatyzacji zgodnie z potrzebami.

System LEMOS zamyka pętlę, umożliwiając zautomatyzowane sterowanie zsynchronizowane z odstępami czasu pomiarów18. W tym przypadku pierwotne urządzenie LEMOS zostało zaktualizowane poprzez dwukrotne zwiększenie liczby dołków w celu zwiększenia przepustowości. Ponadto zmodyfikowana geometria mikrodołków minimalizuje wyciek światła między nimi, co pozwala na testowanie obwodów optogenetycznych w warunkach ciemności obok warunków oświetlonych w tym samym eksperymencie. LEMOS 2.0 obecnie obsługuje eksperymenty w hodowli okresowej. Ponieważ szybkość wzrostu, dostępność zasobów oraz dynamika ekspresji genów zmieniają się podczas hodowli okresowej, parametry takie jak intensywność LED, zakres cyklu pracy, odstęp próbkowania oraz parametry kontrolera mogą wymagać ponownej kalibracji dla innych szczepów, reporterów, systemów optogenetycznych lub warunków wzrostu20. Szczegółowe porównanie systemu LEMOS 2.0 z wcześniej opracowanymi platformami do prowadzenia badań optogenetycznych przedstawiono w Tabeli 1. Przyszłe wersje mogłyby zawierać kanały wewnątrzpłytkowe lub zbiorniki do kontrolowanej wymiany i rozcieńczania pożywki, co umożliwiłoby prowadzenie dłuższych eksperymentów przy zachowaniu bardziej spójnych warunków wzrostu. Dodatkowe konstrukcje mogłyby również obsługiwać alternatywne długości fal LED lub zmniejszyć zależność od oprogramowania automatyzującego opartego na ekranie.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy B.J., T.S.B. i H.R.N. byli wspierani przez uniwersytet Texas A&M Engineering Experiment Station

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Spleciony przewód połączeniowy 2 AWG AmazonASIN: B089CQ2N69Niedrogi przewód do połączenia obwodu elektrycznego. Dopuszczalny jest przewód jednowątkowy lub wielowątkowy.
Przełącznik suwakowy 8-pinowy 3-pozycyjny 2P3T DP3T z pokrętłem bocznymAmazonASIN: B07Q9Y8YCPrzełącznik i piny powinny znajdować się na sąsiednich stronach, a nie przeciwległych, co jest bardziej powszechne.
Arduino Nano 3 BLE Rev 2ArduinoABX071Mikrokontroler – Płaski profil i obsługa BLE odpowiadają potrzebom urządzenia peryferyjnego.
Arduino Nano 3 IoTArduinoABX027Mikrokontroler – Stosowany jako urządzenie centralne.
Czytnik mikropłytek BioTek Synergy H1Agilent (BioTek)—Lub kompatybilny czytnik płytek z trybem kinetycznym
Folia uszczelniająca Breathe-EasyUSA Scientific9123-6100Folia uszczelniająca klasy medycznej; przepuszczalna dla gazów uszczelka do mikropłytek
Chloramfenikol (roztwór stokowy 25 mg/mL w etanolu)Różne—Stężenie robocze 25 µg/mL
E. coli MG165
Ease Release 200Mann Release TechnologiesŚrodek rozdzielający
Taśma KaptonAmazonASIN: B07F8TZZ4N
Płytki z agarem LB i odpowiednie antybiotykiWłasne—Zakłada się, że są one już dostępne.
Bateria Li-ion 3,7 V, 30 mAh (11,1 Wh), rozmiar 104060UfineUFX0391-03 Powinna być wyposażona w męski kabel 2-pinowy JST PH. Wyprodukowana przez Liter Energy, sprzedawana przez różnych detalistów.
Moduł ładowania i rozładowania baterii Li-ion z USB Typ-C (5V 1A)AmazonASIN: B0CTMJMRKZWyszukaj „Replaces TP4056” na Amazon. Przewiń poza standardowe moduły TP4056. Zatrzymaj się na dowolnej ofercie prezentującej mniejsze, czarne moduły z napisem „Replaces TP4056” w tytule.
Kabel Li-ion JST PH 2-pinowy – z łącznikiem żeńskim 10 mmRóżneASIN: B07NWNPB7Musi być kompatybilny z łącznikiem JST baterii’s.
Mini moduł Boost 3,7 V do 5 V/8 V/9 V/12 V Step Up z wskaźnikiem LEDAmazon (Teyleten Robot)ASIN: B0B4TB9QNY[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
Płytka jednodobnkowa Nunc OmniTrayThermo Scientific24281Obudowa zewnętrzna
pNO286-3AddgenePlazmid #10746Koduje konstytutywną ekspresję CcaS
pSR58.6AddgenePlazmid #63176Koduje konstytutywną ekspresję CcaR oraz sfGFP pod promotorem PcpcG2
Lutownica i spoiwo lutowniczeRóżne—Zalecenia: cienki grot, spoiwo z topnikiem lub rdzeniem kalafonii.
Spektynomycyna (roztwór stokowy 50 mg/mL)Różne—Stężenie robocze 50 µg/mL
Sterylne probówki do hodowli (14 mL z okrągłym dnem)Różne—
Elastomer silikonowy SYLGARD 184 (baza + utwardzacz)SYLGARD 184Stosunek utwardzacza do bazy 1:10 masowo
Kabel USB-A do Micro USBRóżne—Do łączenia płytek Arduino z komputerem PC. Musi to być przewód do transferu danych, a nie tylko kabel ładujący.
Kabel ładujący USB-A do USB-CRóżne—Łączy z modułem ładowania baterii
Deskryptor próżniowy i pompaRóżne—Do odgazowywania PDMS
Taśma LED RGB Pixel WS2812B IC SPI, 10LED/m, DC5V, IP30, czarnaAmazon (BTF-LIGHTING)ASIN: B08B8G8LD ; BTF-LIGHTING nr kat.: WS2812B1M10LB30Taśma LED z indywidualnym dostępem do diod. 10 LED/m. Napięcie: 5 V. IP30 odnosi się do wodoodporności. Preferowany kolor czarny zamiast białego, aby mniej odbijał światło.

Bibliografia

  1. Kumar S, Khammash M. Platforms for optogenetic stimulation and feedback control. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:918917.
  2. Milias-Argeitis A, et al. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nat Commun. 2016;7:12546.
  3. Gutierrez Mena J, Kumar S, Khammash M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nat Commun. 2022;13(1):4808.
  4. Lugagne JB, Blassick CM, Dunlop MJ. Deep model predictive control of gene expression in thousands of single cells. Nat Commun. 2024;15(1):2148.
  5. Steel H, Habgood R, Kelly CL, Papachristodoulou A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biol. 2020;18(7):e3000794.
  6. Lugagne JB, et al. Balancing a genetic toggle switch by real-time feedback control and periodic forcing. Nat Commun. 2017;8(1):1671.
  7. Chait R, et al. Shaping bacterial population behavior through computer-interfaced control of individual cells. Nat Commun. 2017;8(1):1535.
  8. Harmer ZP, McClean MN. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit (vol 12, pg 1943, 2023). ACS Synth Biol. 2023;12(11):3505.
  9. Abkar L, et al. Enhanced reproducibility and precision of high-throughput quantification of bacterial growth data using a microplate reader. J Vis Exp. 2022;185:63849.
  10. Olson EJ, et al. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nat Methods. 2014;11(4):449-456.
  11. Bugaj LJ, Lim WA. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 2019;14(7):2205-2228.
  12. Repina NA, et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 2020;31(10):107737.
  13. Höhener TC, et al. LITOS: A versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Sci Rep. 2022;12(1):13139.
  14. Vogt A, et al. Simultaneous spectral illumination of microplates for high-throughput optogenetics and photobiology. Biol Chem. 2024;405(11-12):751-763.
  15. Kumar S, et al. Diya: A universal light illumination platform for multiwell plate cultures. iScience. 2023;26(10):107862.
  16. Soffer G, Perry JM, Shih SCC. Real-time optogenetics system for controlling gene expression using a model-based design. Anal Chem. 2021;93(6):3181-3188.
  17. Benman W, et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. Commun Biol. 2023;6(1):1192.
  18. Namboothiri HR, et al. Closed-loop optogenetic control in a microplate reader. ACS Synth Biol. 2026;15(6):2356-2365.
  19. Worldsemi. WS2812B intelligent control LED integrated light source. 2026: https://cdn-shop.adafruit.com/datasheets/WS2812B.pdf
  20. Lambert TJ. FPbase: A community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 2019;16(4):277-278.
  21. Xia YN, et al. Replica molding using polymeric materials: A practical step toward nanomanufacturing. Adv Mater. 1997;9(2):147-149.
  22. Ong NT, Tabor JJ. A miniaturized Escherichia coli green light sensor with high dynamic range. ChemBioChem. 2018;19(12):1255-1258.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol. 1991;204:63-113.
  24. ANSI SLAS 1-2004 (R2012). Footprint dimensions. At https://www.slas.org/SLAS/assets/File/public/standards/ANSI_SLAS_1-2004_FootprintDimensions.pdf.
  25. Åström KJ, Murray RM. Feedback systems: An introduction for scientists and engineers. Princeton University Press; Princeton, NJ; 2008.
  26. Namboothiri HR, Pandey A, Hu CY. Resolving emergent transient oscillations in gene circuits with a growth-coupled model. Sci Adv. 2026;12(6):eadz2310.
  27. Song LL, Hennink EJ, Young IT, Tanke HJ. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophys J. 1995;68(6):2588-2600.
  28. Campbell DJ, et al. Replication and compression of bulk and surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J Chem Educ. 1999;76(4):537-541.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sterowanie optogenetycznemikropłytka LEDekspresja genówdynamiczna stymulacja światłemczytnik mikropłytekmikrowydzielenia PDMSmontaż obwodówprogramowanie Arduinopomiar fluorescencjikultury bakteryjne

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.