Identyfikacja biomarkerów nadciśnienia płucnego oraz potencjalnych związków terapeutycznych z wykorzystaniem bioinformatyki i uczenia maszynowego

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia powtarzalny schemat bioinformatyczny integrujący publiczne zbiory danych transkrypomicznych, uczenie maszynowe, walidację zewnętrzną, ilościową PCR z odwrotną transkrypcją, przesiew Connectivity Map oraz dokowanie molekularne w celu zidentyfikowania biomarkerów nadciśnienia płucnego i potencjalnych związków terapeutycznych.

Streszczenie

Celem niniejszego badania była identyfikacja molekularnych biomarkerów związanych z nadciśnieniem płucnym (PH) oraz potencjalnych małocząsteczkowych związków leczniczych z wykorzystaniem publicznych danych transkrypcyjnych i niezależnych zasobów walidacyjnych. Trzy zbiory danych z Gene Expression Omnibus (GSE22356, GSE33463 oraz GSE48149) zostały zintegrowane po normalizacji, adnotacji sond i korekcji efektu serii za pomocą metody ComBat. Do identyfikacji kluczowych genów cech wykorzystano analizę różnicowej ekspresji, ważoną analizę sieci koekspresji genów (WGCNA), analizę wzbogacenia funkcjonalnego, analizę sieci oddziaływań białko-białko oraz trzy algorytmy uczenia maszynowego. Wydajność diagnostyczną oceniono za pomocą krzywych charakterystyki ROC. Walidacja zewnętrzna obejmowała niezależną kohortę tkanek płucnych (GSE117261), zbiór danych z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek tętnicy płucnej (GSE210248) oraz walidację za pomocą ilościowej odwrotnej transkrypcji i PCR (qRT-PCR) w niezależnych próbkach tkanek płucnych. Do przesiewania potencjalnych związków wykorzystano repozycjonowanie leków w oparciu o Connectivity Map oraz dokowanie molekularne. Zidentyfikowano siedemdziesiąt osiem genów o różnicowej ekspresji, z czego jako kluczowe geny cech wybrano CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 oraz TLR7. W niezależnej kohorcie tkanek płucnych GSE117261 gen JUN wykazał najsilniejsze wsparcie zewnętrzne, podczas gdy replikacja pozostałych genów była zmienna. Analiza qRT-PCR w 20 biologicznie niezależnych próbkach z nadciśnieniem tętniczym płuc oraz 20 próbkach kontrolnych potwierdziła nadekspresję wszystkich pięciu genów. Pozorny model qRT-PCR oparty na pięciu genach oraz 100 powtórzeń stratyfikowanej pięciokrotnej walidacji krzyżowej dały pole pod krzywą (AUC) wynoszące 1,000, choć niewielka kohorta wymaga ostrożnej interpretacji i niezależnej walidacji prospektywnej. Analiza pojedynczych komórek z zestawu GSE210248 potwierdziła zaburzoną komunikację między komórkami odpornościowymi a strukturalnymi oraz przełączanie fenotypowe komórek mięśni gładkich. Związek BRD-K91900765/VX-745 zajął najwyższą pozycję w przesiewie Connectivity Map. Białko MAPK14/p38α, jego ustalony cel farmakologiczny, zostało uwzględnione jako referencyjne białko dokujące, podczas gdy dokowanie do pięciu białek związanych z biomarkerami miało charakter eksploracyjny. Wyniki te wskazują na pięć genów jako potencjalne biomarkery PH oraz VX-745 jako hipotezę obliczeniowego repozycjonowania leku wymagającą walidacji eksperymentalnej.

Wprowadzenie

Nadciśnienie płucne (PH) to postępujący zespół kardiopulmonalny charakteryzujący się trwale podwyższonym ciśnieniem w tętnicy płucnej, zwiększonym oporem naczyniowym płuc oraz ostatecznie niewydolnością prawej komory serca. Obecne kryteria hemodynamiczne definiują nadciśnienie płucne jako średnie ciśnienie w tętnicy płucnej w spoczynku wynoszące >20 mmHg, zmierzone za pomocą cewnikowania prawego serca¹Wśród różnych podtypów klinicznych nadciśnienie tętnicze płuc (PAH) jest jedną z najcięższych postaci i charakteryzuje się postępującym remodelowaniem naczyń płucnych. Jego cechy patologiczne obejmują dysfunkcję śródbłonka, nieprawidłową proliferację i migrację komórek mięśni gładkich tętnic płucnych, aktywację fibroblastów błony zewnętrznej, odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej, naciekanie komórek zapalnych oraz zwężenie lub obliterację dystalnych tętnic płucnych.²Zmiany te wskazują, że PH/PAH nie jest jedynie zaburzeniem skurczu naczyń, lecz złożoną chorobą przebudowy naczyniowej, napędzaną przez skoordynowane mechanizmy molekularne, komórkowe i immunologiczno-zapalne.

Obecne terapie PAH celują głównie w szlaki prostacykliny, endoteliny, tlenku azotu – rozpuszczalnej cyklazy guanylowej oraz fosfodiesterazy typu 5³˒⁴. Chociaż leczenie to poprawia objawy, wydolność wysiłkową i parametry hemodynamiczne, jego efekty pozostają w dużej mierze naczyniorozszerzające i hemodynamiczne. Zdolność tych terapii do odwracania utrwalonego przebudowy naczyniowej płuc jest ograniczona, a wielu pacjentów nadal doświadcza progresji choroby mimo stosowania terapii skojarzonej. Dlatego identyfikacja nowych biomarkerów molekularnych i kandydatów terapeutycznych odzwierciedlających proces przebudowy stanowi istotną niezaspokojoną potrzebę. W szczególności aktywacja immunologiczno-zapalna, sygnalizacja związana z interferonem, szlaki receptorów Toll-podobnych, rekrutacja immunologiczna pośredniczona przez chemokiny oraz zmiana fenotypowa komórek mięśni gładkich wyłoniły się jako potencjalne czynniki przyczyniające się do progresji PH/PAH⁵˒⁶.

Wysokoprzepustowe zestawy danych transkrypcyjnych stanowią cenne zasoby do identyfikacji sygnatur molekularnych związanych z chorobą w nadciśnieniu płucnym (PH) i nadciśnieniu płucnym z niedoskonalnością serca (PAH). Jednak badania oparte na pojedynczym zestawie danych są często ograniczone przez małą liczebność próby, efekty seryjne, heterogeniczność platform oraz niewystarczającą walidację. Analiza ekspresji różnicowej pozwala zidentyfikować geny o zmienionej ekspresji, ale może nie w pełni oddawać powiązane z chorobą moduły koekspresji lub interakcje na poziomie sieci. Analiza sieci koekspresji genów z wagami (WGCNA) umożliwia identyfikację modułów genów związanych z cechami choroby, podczas gdy analiza sieci oddziaływań białko-białko (PPI) pozwala ujawnić geny o wysokim stopniu połączeń w sieciach biologicznych. Metody uczenia maszynowego mogą również pomóc w priorytetyzacji genów o wartości diagnostycznej lub klasyfikacyjnej. Jednak poleganie na pojedynczym algorytmie może wprowadzić błąd specyficzny dla danego modelu. Zintegrowanie analizy ekspresji różnicowej, WGCNA, analizy sieci PPI oraz wielu algorytmów uczenia maszynowego może zatem zwiększyć wiarygodność procesu odkrywania biomarkerów.

Kolejnym istotnym wyzwaniem w badaniach nad biomarkerami transkrypcyjnymi jest interpretacja biologiczna. Sygnały z tkanek w analizie bulk mogą odzwierciedlać zmiany w ekspresji genów w obrębie komórek naczyniowych, naciekanie komórek odpornościowych lub zmienione proporcje wielu populacji komórkowych. Sekwencjonowanie RNA z pojedynczych komórek (scRNA-seq) stwarza możliwość osadzenia genów kandydatów wyłonionych w analizie bulk w kontekście komórkowym. W przypadku nadciśnienia płucnego (PH/PAH) przebudowa naczyń płucnych obejmuje komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, fibroblasty, monocyty/makrofagi, limfocyty oraz inne komórki odpornościowe lub strukturalne. Progresja choroby wiąże się również ze zmienioną komunikacją międzykomórkową oraz przełączaniem fenotypowym komórek mięśni gładkich. W związku z tym połączenie screeningu transkrypcyjnego bulk z walidacją na poziomie pojedynczych komórek może pomóc w ustaleniu, czy biomarkery kandydackie są związane z aktywacją immunologiczną, strukturalną przebudową naczyń czy zaburzeniem komunikacji wielokomórkowej.

Oprócz odkrywania biomarkerów, sygnatury transkrypcyjne mogą być wykorzystywane do komputerowego repozycjonowania leków. Mapa Połączeń (Connectivity Map, CMap) wiąże profile ekspresji genów związane z chorobą z małymi cząsteczkami, które mogą odwracać lub modulować te sygnatury⁷. W połączeniu z kuratelą związków i dokowaniem molekularnym strategia ta może generować hipotezy terapeutyczne możliwe do przetestowania eksperymentalnie. Chociaż predykcja CMap i dokowanie molekularne nie pozwalają na ustalenie skuteczności leku, mogą one pomóc w priorytetyzacji związków kandydackich do przyszłych testów wiązania z celem, eksperymentów komórkowych oraz walidacji w modelach zwierzęcych.

Opracowano zintegrowany i powtarzalny schemat postępowania w celu zidentyfikowania biomarkerów PH/PAH oraz potencjalnych związków terapeutycznych. Zintegrowano trzy publiczne transcriptomiczne zbiory danych z bazy Gene Expression Omnibus po przeprowadzeniu normalizacji i korekty efektu seryjnego. Do przesiewowej analizy w celu wyłonienia stabilnych genów cech wykorzystano analizę różnicowej ekspresji, WGCNA, analizę wzbogacenia funkcjonalnego, analizę sieci PPI oraz trzy algorytmy uczenia maszynowego. Do dalszej oceny wybranych genów zastosowano analizę charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), niezależną kohortę walidacyjną z tkanki płucnej, dowody z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek tętnicy płucnej oraz walidację za pomocą ilościowej PCR z odwrotną transkrypcją w niezależnych próbkach. Na koniec, w celu zidentyfikowania potencjalnych związków, zastosowano repozycjonowanie leków w oparciu o CMap oraz dokowanie molekularne. Nowatorstwo badania polega na wielowarstwowym modelu walidacji, który łączy odkrycia transcriptomiczne z tkanki objętościowej, priorytetyzację za pomocą uczenia maszynowego, niezależną walidację, eksperymentalne potwierdzenie ilościową PCR z odwrotną transkrypcją, mechaniczną interpretację na poziomie pojedynczych komórek oraz obliczeniowy przesiew związków. Hipoteza badawcza zakładała, że PH/PAH jest napędzane przez skoordynowany program immunologiczno-zapalny i przebudowy naczyniowej, a stabilne geny w ramach tego programu mogą służyć jako potencjalne biomarkery i stwarzać możliwości repozycjonowania leków.

Protokół

Publiczne zbiory danych Gene Expression Omnibus (GEO) analizowane w niniejszym badaniu zawierały zanonimizowane dane transkrypcyjne z wcześniej opublikowanych badań i nie wymagały dodatkowej zgody komisji etycznej. Komisja Etyczna Uniwersytetu w Huaihua zatwierdziła niezależne badanie walidacyjne metodą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) w ludzkiej tkance płucnej (numer zgody 2024(A05112)). Przed pobraniem próbek od wszystkich uczestników lub ich prawnie upoważnionych przedstawicieli uzyskano pisemną świadomą zgodę. Procedury zatwierdzenia i zgody zastosowano do wszystkich 20 próbek tkanki płucnej od pacjentów z nadciśnieniem płucnym (PAH) oraz 20 próbek kontrolnych wykorzystanych w walidacji qRT-PCR. Narzędzia badawcze użyte w niniejszym protokole wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Gromadzenie i wstępne przetwarzanie publicznych zbiorów danych transkryptomicznych

Zbiory danych z mikromacierzy GSE22356, GSE33463 i GSE48149 powiązane z nadciśnieniem płucnym (PH) pobrano z bazy danych GEO. Próbki z PH/nadciśnieniem tętniczym płuc (PAH) oraz próbki kontrolne wyodrębniono zgodnie z oryginalnymi adnotacjami fenotypowymi. Macierze ekspresji oraz pliki adnotacji platform pobrano za pomocą powtarzalnych skryptów R oraz pakietu GEOquery.

Adnotacja sond oraz mapowanie symboli genów przeprowadzono w sposób spójny dla wszystkich zbiorów danych. W przypadku, gdy wiele sond mapowało na ten sam gen, obliczano średnią wartość ekspresji. Zastosowano normalizację kwantylową, a geny o niskiej ekspresji lub niskiej wariancji zostały usunięte. Zbiory danych połączono, a efekty serii skorygowano za pomocą algorytmu ComBat z pakietu sva⁸. Korekcję oceniono za pomocą wykresów pudełkowych oraz analizy głównych składowych.

2. Identyfikacja genów o różnym poziomie ekspresji

Do porównania poziomów ekspresji między próbkami PH a kontrolnymi w macierzy ekspresji skorygowanej o efekt serii wykorzystano pakiet limma⁹. Zastosowano dopasowany model liniowy oraz statystykę empirycznego Bayesa. Geny różnicowo wyrażone zdefiniowano przy użyciu skorygowanej wartości P <0,05 oraz bezwzględnej zmiany log2 fold change > 0,585. Wyniki zwizualizowano za pomocą wykresów wulkanicznych (volcano plots) i map ciepła (heatmaps).

3. Konstrukcja ważonej sieci koekspresji genów

Ważoną sieć koekspresji genów skonstruowano przy użyciu pakietu WGCNA¹⁰. W celu wykrycia wartości odstających przeprowadzono klastrowanie próbek. Moc miękkiego progowania (soft-thresholding power) wybrano na podstawie indeksu dopasowania topologii wolnej od skali. Moduły genowe zidentyfikowano za pomocą algorytmu dynamicznego przycinania drzewa. Korelację eigengenów modułów analizowano w odniesieniu do fenotypu PH, a następnie wybrano moduł związany z chorobą o najsilniejszej korelacji. Geny z kluczowego modułu zestawiono z genami różnicowo eksponowanymi w celu wyłonienia genów konsensusowych.

4. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego

Kategorie procesów biologicznych, komponentów komórkowych i funkcji molekularnych Gene Ontology zostały przeanalizowane przy użyciu oprogramowania clusterProfiler¹¹. W celu zidentyfikowania szlaków sygnalizacyjnych przeprowadzono analizę wzbogacenia szlaków Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes¹². Jako progi wzbogacenia przyjęto wartość P < 0,05 oraz wartość q < 0,2, a wzbogacone terminy przedstawiono za pomocą wykresów bąbelkowych¹¹.

5. Konstrukcja sieci oddziaływań białko-białko i identyfikacja genów hubowych

Konsensusowa lista genów została wprowadzona do bazy danych STRING, z wybranym gatunkiem Homo sapiens oraz progiem ufności dla oddziaływań > 0,4¹³. Plik oddziaływań zaimportowano do programu Cytoscape, a wtyczkę CytoHubba wykorzystano do rankingowania genów według stopnia węzła. Geny o wysokim stopniu połączeń zdefiniowano jako geny hubowe.

6. Wybór genów cech diagnostycznych przy użyciu uczenia maszynowego

Zastosowano trzy niezależne algorytmy selekcji cech. Po pierwsze, przeprowadzono regresję logistyczną z wykorzystaniem metody LASSO (least absolute shrinkage and selection operator) przy użyciu pakietu glmnet i 10-krotnej walidacji krzyżowej w celu zidentyfikowania genów o niezerowych współczynnikach¹⁴. Po drugie, zastosowano rekurencyjną eliminację cech (recursive feature elimination) z wykorzystaniem maszyn wektorowych wsparcia (support vector machines), aby usunąć redundantne cechy i wybrać podzbiór cech, który osiągnął najwyższą dokładność w walidacji krzyżowej¹⁵. Po trzecie, skonstruowano model lasu losowego, a cechy uszeregowano według średniego spadku zanieczyszczenia Gini¹⁶. Przecięcie zbiorów genów uzyskanych z trzech algorytmów posłużyło do zdefiniowania końcowego zestawu kluczowych genów cech. Pakiet pROC został wykorzystany do wygenerowania krzywych charakterystyki ROC (receiver operating characteristic) oraz obliczenia wartości powierzchni pod krzywą (AUC)¹⁷.

7. Walidacja genów kluczowych z wykorzystaniem niezależnych zbiorów danych bulk oraz single-cell

Zestaw danych GSE117261 został wykorzystany jako niezależna zewnętrzna kohorta walidacyjna dla tkanki płucnej, zawierająca 58 próbek z PAH oraz 25 próbek kontrolnych od dawców niezakwalifikowanych¹⁸. Zestaw ten nie był używany w analizie odkrywczej różnicowej ekspresji, konstrukcji ważonej sieci koekspresji genów ani w selekcji cech za pomocą uczenia maszynowego. Macierz ekspresji została znormalizowana i adnotowana, a różnicową ekspresję przeanalizowano przy użyciu pakietu limma v3.68.0. Korekcja stopy fałszywych odkryć metodą Benjamini-Hochberga została zastosowana dla całego adnotowanego transkrypтому. Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla pojedynczych genów obliczono przy użyciu pakietu pROC v1.19.0.1, 95% przedziałów ufności DeLonga oraz punktów odcięcia wskaźnika Youdena. W ramach GSE117261 dopasowano eksploracyjny model regresji logistycznej dla pięciu genów, a jego wewnętrzną wydajność dodatkowo oceniono za pomocą wielokrotnej zagnieżdżonej walidacji krzyżowej.

Zbiór danych GSE210248 (Tabela 1) został wykorzystany jako zewnętrzny zestaw walidacyjny dla pojedynczych komórek tętnicy płucnej, zawierający próbki od trzech pacjentów z PAH oraz trzech zdrowych dawców¹⁹. Dane zostały przetworzone przy użyciu oprogramowania Seurat v5.5.1 w celu kontroli jakości, normalizacji, redukcji wymiarowości, klastrowania i adnotacji komórek²⁰. Zidentyfikowano główne populacje komórek, w tym komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, fibroblasty, monocyty/makrofagi oraz komórki T/natural killer. Komunikację międzykomórkową przeanalizowano za pomocą CellChat v2.1.2 oraz bazy danych ligandów i receptorów CellChatDB.human²¹. Obiekt CellChat utworzono na podstawie znormalizowanej macierzy ekspresji Seurat oraz metadanych dotyczących typów komórek. Zidentyfikowano geny nadekspresjonowane oraz interakcje ligand-receptor, obliczono prawdopodobieństwa komunikacji, usunięto interakcje obejmujące grupy komórek liczące mniej niż 10 komórek, a następnie wywnioskowano i zagregowano sieci komunikacyjne na poziomie szlaków. Zbiór danych ten został wykorzystany wyłącznie do zewnętrznej walidacji mechanistycznej, a nie do trenowania modelu.

Element	Opis
Zbiór danych	GSE210248
Typ danych	sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek metodą kroplową 10x Genomics; wysokoprzepustowe profilowanie transkryktomiczne
Próbki ludzkie	trzy próbki tętnicy płucnej z PAH oraz trzy próbki tętnicy płucnej od zdrowych dawców
Źródło tkanki	tkanka tętnicy płucnej ex vivo, odzwierciedlająca głównie ekologię komórkową ściany naczyniowej płuc oraz proces przebudowy naczyniowej
Główny cel analityczny	lokalizacja typów komórek, przełączanie fenotypowe komórek mięśni gładkich, komunikacja między komórkami odpornościowymi a strukturalnymi oraz walidacja spójności mechanistycznej genów kandydackich

Tabela 1: Podstawowe informacje dotyczące zbioru danych do walidacji jednokomórkowej GSE210248. Tabela podsumowuje numer dostępu do zbioru danych, platformę sekwencjonowania, źródło tkanki, skład próbek oraz cel analityczny walidacji jednokomórkowej tętnicy płucnej.

8. Walidacja ekspresji genów metodą qRT-PCR

Walidacja metodą qRT-PCR objęła 20 biologicznie niezależnych próbek tkanki płucnej PAH od pacjentów z PH/PAH oraz 20 biologicznie niezależnych kontrolnych próbek tkanki płucnej. Całkowity RNA wyekstrahowano przy użyciu zestawu Total RNA Extraction Kit. Stężenie i czystość RNA oceniono za pomocą spektrofotometru, a integralność RNA oceniono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Do analizy włączono wyłącznie próbki RNA o wartościach A260/280 między 1,8 a 2,1 i bez widocznej degradacji.

Równe ilości RNA poddano odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA przy użyciu zestawu Solarbio Universal RT-PCR Kit (AMV; nr katalogowy RP1200). Ilościową PCR dla CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7 przeprowadzono z użyciem SYBR Green PCR Master Mix w systemie Real-Time PCR. Każda próbka biologiczna była analizowana w trzech powtórzeniach technicznych, wraz z kontrolami bez matrycy (no-template) i bez odwrotnej transkrypcji (no-reverse-transcription). Do dalszych analiz wykorzystano średnią wartość Ct z trzech powtórzeń technicznych; powtórzenia techniczne nie były traktowane jako niezależne obserwacje. Zastosowano startery obejmujące złącza ekson-ekson, generujące amplikony o długości 80–200 bp (Tabela 2). Specyficzność starterów zweryfikowano za pomocą NCBI Primer-BLAST oraz analizy krzywej topnienia²².

β-actin (ACTB) wykorzystano jako wewnętrzny gen referencyjny do normalizacji poziomów ekspresji genów docelowych. Ekspresję względną obliczono metodą 2^-ΔΔCt23. Do porównań międzygrupowych, w zależności od rozkładu danych, zastosowano dwustronne testy U Manna-Whitneya, a dla pięciu genów wprowadzono korektę stopy odkryć fałszywych metodą Benjamini-Hochberga. Krzywe ROC dla pojedynczych genów wygenerowano z 95% przedziałami ufności DeLonga, a optymalne punkty odcięcia wybrano za pomocą indeksu Youdena. Model regresji logistycznej dla pięciu genów został wstępnie dopasowany i oceniony na tych samych 40 próbkach biologicznych; szacunek ten zdefiniowano zatem jako pozorną wydajność wewnątrzpróbkową. Aby ocenić potencjalne przeuczenie, przeprowadzono 100 powtórzeń stratyfikowanej pięciokrotnej walidacji krzyżowej z wykorzystaniem modelu regresji logistycznej z regularyzacją L2, a następnie obliczono zbiorczą wydajność ROC dla danych spoza próby walidacyjnej.

Gen	Numer akcesyjny RefSeq	Starter przedni (5′–3′)	Starter odwrotny (5′–3′)	Rozmiar produktu (bp)	Tm (°C)	Przecinający ekson
CXCL10	NM_001565.4	GTCAAGCCAT AATTGTTC	ATAGTGCCAG GGTAGAGT	141	46.1	Tak
JUN	NM_002228.4	ACAAGTGGCA GAGTCCCG	CGCCCAAGTT CAACAACC	152	54.5	Tak
IFIH1	NM_022168	GCACAGAGCG GTAGACCCT	GCCCTGAAGC ACGAGATG	182	54.7	Tak
MX1	NM_002462.5	TTAGCCGTGG TGATTTAGC	CAAGGTGGAG CGATTCTG	156	52.3	Tak
TLR7	NM_016562.4	ATTGCCCTCGT TGTTATA	TTCCTGGAGTT TGTTGAT	179	48.1	Tak
ACTB	NM_001101.3	CTCACCATGGAT GATGATATCGC	AGGAATCCTTCT GACCCATGC	194	56.2	Tak

Tabela 2: Sekwencje starterów użytych do ilościowej PCR z odwrotną transkrypcją. Tabela zawiera geny docelowe, numery dostępowe RefSeq, sekwencje starterów w przód i w tył, wielkości produktów, temperatury topnienia oraz status obejmowania eksonów przez startery użyte do qRT-PCR.

9. Przesiewanie związków kandydackich i dokowanie molekularne

Sygnatury genów rdzeniowych o zwiększonej i zmniejszonej ekspresji zostały wprowadzone do bazy danych Connectivity Map w celu zidentyfikowania małych cząsteczek, które według prognoz odwracają profil ekspresji związany z PH⁷. Kandydaci zostali uszeregowani według wyniku Logit oraz prawdopodobieństwa predykcji.

Struktura trójwymiarowa BRD-K91900765/VX-745 została pobrana z bazy PubChem pod numerem CID 3038525²⁴. Informacje farmakologiczne dotyczące związku opracowano na podstawie publicznych baz danych leków, a deskryptory strukturalne obliczono przy użyciu DrugBank oraz SwissADME^25,26. Struktury białek pobrano z RCSB Protein Data Bank, korzystając z następujących identyfikatorów PDB: CXCL10, 1LV9; JUN, 1JUN; IFIH1, 3B6E; MX1, 5GTM; TLR7, 7CYN oraz MAPK14/p38α, 1OUK²⁷. Wykrywanie ślepych kawern oraz dokowanie molekularne przeprowadzono za pomocą programu CB-Dock2 v2.0 z silnikiem oceniającym AutoDock Vina v1.2.0^28,29. Pliki białek i ligandów przesłano do CB-Dock2, automatycznie wykryto potencjalne kawerny, a dokowanie wykonano w obrębie specyficznych dla kawern obszarów (docking-box) wygenerowanych przez serwer. Dla każdego białka zapisano identyfikator kawerny, wynik Vina, objętość kawerny, środek obszaru dokowania, wymiary obszaru dokowania oraz plik kompleksu białko-ligand. Poza z najbardziej ujemnym wynikiem Vina wybrano jako najwyżej ocenioną przewidywaną konformację. Białko MAPK14/p38α zostało uwzględnione jako ustalony cel farmakologiczny i pozytywny punkt odniesienia dla dokowania VX-745. Dokowanie względem CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7 miało charakter eksploracyjny i nie było interpretowane jako dowód bezpośredniego celowania farmakologicznego, wiązania, inhibicji ani skuteczności.

10. Analiza statystyczna i kontrola powtarzalności

Wszystkie analizy statystyczne wykonano w programie R, chyba że zaznaczono inaczej. Dwustronne wartości P < 0,05 uznano za statystycznie istotne. Korektę dla wielokrotnych testów zastosowano w analizach różnicowej ekspresji, wzbogacenia, walidacji zewnętrznej oraz qRT-PCR, zgodnie z powyższym opisem. W celu oceny stabilności modeli uczenia maszynowego i połączonych modeli qRT-PCR zastosowano walidację krzyżową.

Wyniki

Przetwarzanie wstępne publicznych danych transkryptomicznych i identyfikacja genów różnicowo wyrażonych

Integracja i korekcja metodą ComBat zbiorów GSE22356, GSE33463 oraz GSE48149 zredukowały systematyczne różnice między zestawami danych. Wykresy pudełkowe wykazały, że rozkłady ekspresji próbek stały się bardziej spójne po korekcie. Analiza głównych składowych wskazała, że przed korekcją próbki grupowały się głównie według źródła pochodzenia zestawu danych, natomiast po korekcie uległy większemu wymieszaniu, co świadczy o skutecznej redukcji efektu seryjnego (Rysunek 1).

Przy zastosowaniu progów wartości bezwzględnej log2 fold change >0,585 oraz skorygowanej wartości P < 0,05 zidentyfikowano 78 genów o różnej ekspresji, w tym 44 geny o nadekspresji oraz 34 geny o obniżonej ekspresji (Rycina 2A). Mapa ciepła wykazała, że geny związane z interferonami, w tym XAF1, MX1, IFI44L, EPSTI1, PARP9, IFIH1, CXCL10, GBP1, STAT1, SAMHD1, TNFSF10 oraz TLR7, były ogólnie nadeksponowane w próbkach związanych z PH. W przeciwieństwie do nich, geny związane z linią erytroidalną, w tym HBG1, HBD, ALAS2, CA1 oraz SLC4A1, wykazywały tendencję do obniżonej ekspresji (Rycina 2B).

Rysunek 1: Korekcja efektu serii. (A) Wykresy pudełkowe połączonej macierzy ekspresji przed i po korekcji metodą ComBat. (B) Wykresy analizy głównych składowych (PCA) przedstawiające rozkład próbek przed i po korekcji efektu serii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2: Geny o różnicowej ekspresji. (A) Wykres wulkaniczny przedstawiający geny o zwiększonej i zmniejszonej ekspresji w próbkach związanych z PH. (B) Mapa ciepła przedstawiająca geny o różnicowej ekspresji pomiędzy grupą kontrolną a grupą chorobową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Konstrukcja ważonej sieci koekspresji genów i wzbogacenie funkcjonalne

Klastrowanie próbek wykazało stabilne ogólne grupowanie bez oczywistych wartości odstających (Rysunek 3A). Wskaźnik dopasowania topologii bezskalowej zbliżył się do 0,8 przy potędze 9, w związku z czym do konstrukcji sieci wybrano β = 9 (Rysunek 3B). Klastrowanie genów i identyfikacja modułów dynamicznych pozwoliły na wyodrębnienie wielu modułów koekspresji (Rysunek 3C). Moduł niebieski wykazał najsilniejszy związek ze stanem PH (r = 0,55, P = 1 × 10⁻¹⁹), natomiast moduły turkusowy i szary również wykazały korelacje z PH (Rysunek 3D).

Geny konsensusowe, uzyskane poprzez przecięcie genów modułów kluczowej ważonej analizy sieci koekspresji genów z genami różnicowo eksponowanymi, były wzbogacone w obszarach obrony immunologicznej przeciwwirusowej, regulacji NF-κB i JAK-STAT, odpowiedzi na czynniki zapalne, wiązania receptorów cytokin i chemokin oraz regulacji transkrypcyjnej (Rysunek 4A). Analiza wzbogacenia w Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes zidentyfikowała interakcje cytokina-receptor cytokinowy, sygnalizację chemokin, sygnalizację receptorów NOD-like, sygnalizację receptorów Toll-like, sygnalizację czynnika martwicy nowotworu oraz sygnalizację interleukiny-17 (Rysunek 4B), co potwierdza, że dysregulacja immunologiczno-zapalna stanowi molekularną podstawę przebudowy naczyniowej płuc.

Rycina 3: Analiza ważonej sieci koekspresji genów. (A) Drzewo klastrowania próbek i mapa ciepła cech. (B) Wykres wyboru miękkiego progu. (C) Dendrogram genów i kolory modułów. (D) Mapa ciepła relacji moduł-cecha. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Analiza wzbogacenia funkcjonalnego. (A) Wyniki wzbogacenia Gene Ontology dla genów konsensusowych. (B) Wyniki wzbogacenia szlaków Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes dla genów konsensusowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Sieć oddziaływań białko-białko oraz screening genów węzłowych

Sieć oddziaływań białko-białko STRING skonstruowana na podstawie genów konsensusowych ujawniła powiązaną sieć immunozapalną (Rycyna 5A). Ranking CytoHubba oparty na stopniu węzła wykazał, że FN1, CD44, JUN, TGFB1, CXCL8 oraz BCL2 charakteryzują się wysoką łącznością (Rycyna 5B). Te geny hubowe mogą uczestniczyć w sygnalizacji zapalnej, adhezji komórkowej, przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej oraz strukturalnej przebudowie naczyń płucnych.

Rycina 5: Sieć oddziaływań białko-białko i geny hubowe. (A) Sieć oddziaływań białko-białko genów konsensusowych utworzona w programie STRING. (B) Geny hubowe uszeregowane według stopnia łączności, zidentyfikowane za pomocą wtyczki CytoHubba. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Selekcja cech w uczeniu maszynowym i wydajność diagnostyczna

Regresja metodą LASSO (least absolute shrinkage and selection operator) zidentyfikowała sześć genów kandydackich z niezerowymi współczynnikami po walidacji krzyżowej (Rysunek 6A, B). Metoda SVM-RFE (support vector machine-recursive feature elimination) zachowała osiem genów, dając dokładność walidacji krzyżowej na poziomie 0,883 i błąd wynoszący 0,117 (Rysunek 7A). Błąd out-of-bag w analizie lasów losowych ustabilizował się, gdy liczba drzew była ≥100, a geny IFIH1, JUN oraz TLR7 znalazły się wśród najważniejszych genów według wyniku istotności (Rysunek 7B).

Analiza przecięcia wyników metod LASSO (least absolute shrinkage and selection operator), SVM-RFE (support vector machine-recursive feature elimination) oraz lasów losowych (random forest) pozwoliła zidentyfikować pięć kluczowych genów: CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 oraz TLR7 (Rycina 8A). Analiza krzywej ROC (receiver operating characteristic) dla pojedynczych genów wykazała umiarkowaną do dobrej rozdzielczość diagnostyczną, przy wartościach pola pod krzywą (AUC) wynoszących odpowiednio 0,842 dla IFIH1, 0,833 dla JUN, 0,827 dla TLR7, 0,814 dla CXCL10 oraz 0,759 dla MX1 (Rycina 8B).

Rysunek 6: Analiza regresji Lasso (least absolute shrinkage and selection operator). (A) Ścieżka współczynników wygenerowana przez regresję Lasso. (B) Wykres błędu walidacji krzyżowej. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rysunek 7: Analizy z wykorzystaniem maszyny wektorów nośnych z rekurencyjną eliminacją cech oraz lasów losowych. (A) Wykres selekcji cech metodą maszyny wektorów nośnych z rekurencyjną eliminacją cech. (B) Model lasów losowych i ranking istotności genów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Podsumowanie uczenia maszynowego. (A) Diagram Venna przedstawiający część wspólną trzech algorytmów wyboru cech. (B) Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) dla pięciu kluczowych genów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Walidacja zewnętrzna w GSE117261

Zbiór GSE117261 został wykorzystany jako niezależna kohorta walidacyjna tkanki płucnej i nie był uwzględniony w analizie różnicowej ekspresji, konstrukcji ważonej sieci koekspresji genów ani w wyborze cech metodami uczenia maszynowego (Tabela 3). Wyniki przeprowadzonej walidacji wykazały niejednorodną replikację w obrębie pięciu genów (Tabela 4). Poziom CXCL10 był podwyższony (log₂ fold change = 0.677; P = 0.0410; FDR = 0.144) i uzyskał AUC wynoszące 0.639 (95% CI, 0.491–0.786), przy wartości odcięcia 6.245, czułości 0.724 i swoistości 0.600. Poziom JUN był podwyższony (log₂ fold change = 0.463; P = 0.00248; FDR = 0.0194) i uzyskał AUC wynoszące 0.714 (95% CI, 0.593–0.835), przy wartości odcięcia 8.708, czułości 0.707 i swoistości 0.720.

IFIH1 (log2 fold change = 0.107; P = 0.371; FDR = 0.591; AUC = 0.543, 95% CI, 0.398–0.687), MX1 (log2 fold change = 0.109; P = 0.488; FDR = 0.690; AUC = 0.475, 95% CI, 0.337–0.614) oraz TLR7 (log2 fold change = -0.050; P = 0.543; FDR = 0.733; AUC = 0.546, 95% CI, 0.414–0.679) nie spełniły wcześniej określonych kryteriów wsparcia zewnętrznego. TLR7 wykazał również kierunek przeciwny do wyniku qRT-PCR. Eksploracyjny model pięciogenowy dopasowany i oceniony w ramach GSE117261 dał pozorną wartość AUC wynoszącą 0,740, podczas gdy powtarzalna walidacja krzyżowa zagnieżdżona (nested cross-validation) dała AUC wynoszącą 0,656. Zatem JUN otrzymał najsilniejsze niezależne wsparcie, CXCL10 wykazał ograniczony, spójny kierunkowo dowód, a replikacja IFIH1, MX1 i TLR7 była słaba lub niespójna.

Pozycja	Opis
Numer dostępu do zbioru danych	GSE117261
Źródło danych	Gene Expression Omnibus (GEO)
Typ próbki	Dane z mikromacierzy transkrypcyjnych tkanki płuc człowieka
Wielkość próby	58 próbek PAH i 25 kontrolnych próbek od dawców niezakwalifikowanych
Platforma	GPL6244 / Matryca Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array
Cel walidacji	Różnice w ekspresji, analiza ROC dla pojedynczych genów oraz eksploracyjne modelowanie łączone ROC dla pięciu genów: CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7
Rola w niniejszym badaniu	Niezależny zewnętrzny zbiór danych walidacyjnych; nieujęty w pierwotnej analizie treningowej, WGCNA ani analizach selekcji cech

Tabela 3: Podstawowe informacje dotyczące niezależnego zewnętrznego zbioru walidacyjnego GSE117261. Tabela podsumowuje źródło zbioru danych, rodzaj próbek, wielkość próby, platformę, cele walidacji oraz rolę GSE117261 w badaniu.

Gen/model	PAH n	Kontrola n	log2 fold change	Wartość P	FDR	AUC	95% CI AUC	Próg Youdena	Czułość	Swoistość
CXCL10	58	25	0.677	0.041	0.144	0.639	0.491–0.786	6.245	0.724	0.6
JUN	58	25	0.463	0.00248	0.019	0.714	0.593–0.835	8.708	0.707	0.72
IFIH1	58	25	0.107	0.371	0.591	0.543	0.398–0.687	5.3	0.759	0.44
MX1	58	25	0.109	0.488	0.69	0.475	0.337–0.614	6.833	0.724	0.4
TLR7	58	25	-0.05	0.543	0.733	0.546	0.414–0.679	4.065	0.138	1
Model pięciogenowy (pozorny/wewnątrzpróbkowy)	58	25	/	/	/	0.74	0.621–0.859	0.613	0.845	0.6
Model pięciogenowy (powtórzona zagnieżdżona walidacja krzyżowa)	58	25	/	/	/	0.656	0.517–0.795	0.655	0.845	0.52

Tabela 4: Rzeczywiste różnice w ekspresji i wyniki walidacji ROC dla GSE117261. Tabela przedstawia wielkość prób PAH i kontrolnych, log₂-krotność zmiany (log₂ fold change), wartości P, wartości skorygowane o stopień fałszywych odkryć (FDR), wartości AUC, 95% przedziały ufności, punkty odcięcia indeksu Youdena, czułość, swoistość oraz interpretacje dla pięciu genów i eksploracyjnych modeli łączonych.

Walidacja ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją

Walidacja za pomocą ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją objęła 20 biologicznie niezależnych próbek tkanki płucnej od pacjentów z PAH oraz 20 biologicznie niezależnych próbek kontrolnych, przy czym dla każdej próbki biologicznej wyciągnięto średnią z trzech powtórzeń technicznych. Odnotowano istotny wzrost ekspresji genów CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 oraz TLR7 w grupie PAH (Tabela 5; Rysunek 9A). Średnie wartości ekspresji względnej wynosiły odpowiednio około 3,470 dla CXCL10, 2,560 dla JUN, 2,760 dla IFIH1, 2,650 dla MX1 i 2,580 dla TLR7. Odpowiadające im wartości P/FDR wynosiły odpowiednio 1,43 × 10⁻⁷/7,15 × 10⁻⁷, 4,17 × 10⁻⁵/4,17 × 10⁻⁵, 1,10 × 10⁻⁵/1,38 × 10⁻⁵, 1,58 × 10⁻⁶/2,63 × 10⁻⁶ oraz 1,37 × 10⁻⁶/2,63 × 10⁻⁶.

Analiza ROC dla pojedynczych genów w oparciu o ekspresję qRT-PCR wykazała wartości AUC wynoszące odpowiednio 0,988 dla CXCL10 (95% CI, 0,961–1,000), 0,880 dla JUN (95% CI, 0,758–1,000), 0,908 dla IFIH1 (95% CI, 0,820–0,995), 0,945 dla MX1 (95% CI, 0,874–1,000) oraz 0,948 dla TLR7 (95% CI, 0,886–1,000) (Rysunek 9B; Tabela 5). Model regresji logistycznej obejmujący pięć genów osiągnął pozorną wartość AUC równą 1,000 (DeLong 95% CI: 1,000–1,000), przy czułości i swoistości na poziomie 1,000 (Rysunek 9C). Spójność kierunku ekspresji pomiędzy walidacją za pomocą ilościowej RT-PCR a zbiorem GSE117261 została przedstawiona za pomocą mapy ciepła (Rysunek 9D). Ponieważ do dopasowania i oceny wykorzystano te same 40 próbek, odzwierciedlało to pozorną wydajność wewnątrzpróbkową. W 100 powtórzeniach stratyfikowanej pięciokrotnej walidacji krzyżowej z użyciem modelu regresji logistycznej z regularyzacją L2, skumulowana wartość AUC poza próbą (out-of-fold AUC) również pozostała na poziomie 1,000 (95% CI, 1,000–1,000), a każde powtórzenie dało AUC równą 1,000. Pomimo tej wewnętrznej stabilności, kohorta była mała i nadal konieczna jest niezależna walidacja prospektywna. Porównanie kierunkowe z GSE117261 wykazało zgodne wzrosty dla CXCL10, JUN, IFIH1 i MX1, ale rozbieżny kierunek dla TLR7 (Rysunek 9D).

Rycina 9: Walidacja za pomocą ilościowej RT-PCR. (A) Wykresy pudełkowe przedstawiające względną ekspresję CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7 w 20 biologicznie niezależnych próbkach tkanki płucnej PAH oraz 20 biologicznie niezależnych próbkach kontrolnych. Każda próbka biologiczna była mierzona w trzech powtórzeniach technicznych, a do analizy wykorzystano średnią wartość Ct. Na każdym wykresie pudełkowym linia środkowa reprezentuje medianę, pudełko reprezentuje rozstęp międzykwartylowy, wąsy sięgają 1,5 raza rozstępu międzykwartylowego, a poszczególne punkty poza wąsami reprezentują wartości odstające. (B) Krzywe ROC dla pojedynczych genów na podstawie wartości ekspresji z qRT-PCR; przedstawiono wartości AUC oraz 95% przedziały ufności DeLonga. (C) Krzywe ROC dla modelu regresji logistycznej obejmującego pięć genów, pokazujące zarówno wydajność pozorną/wewnątrzpróbkową, jak i zbiorczą wydajność poza zakresem (out-of-fold) z 100 powtórzonych analiz stratyfikowanej pięciokrotnej walidacji krzyżowej. (D) Mapa ciepła pokazująca spójność kierunku ekspresji między qRT-PCR a GSE117261; CXCL10, JUN, IFIH1 i MX1 wykazały zgodny wzrost, natomiast TLR7 był niezgodny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Gen/model

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA)

Kontrola n

Kontrola 2^-ΔΔCt, średnia ± SD

PAH 2^-ΔΔCt, średnia ± SD

Kierunek

wartość p

FDR (korekta stopnia fałszywych odkryć)

AUC

AUC 95% CI

punkt odcięcia Youdena

Sensi- aktywność

Specyficzne miasto

Typ walidacji

CXCL10

20

20

1.099 ± 0.502

3.470 ± 1.043

Zwiększona ekspresja

1,43E-07

7,15E-07

0.987

0.961–1.000

2.028

1

0.95

Analiza qRT-PCR pojedynczego genu

JUN

20

20

1.158 ± 0.738

2.560 ± 1.609

Zwiększona ekspresja

4,17E-05

4,17E-05

0.88

0.758–1.000

1.423

0.85

0.9

Analiza qRT-PCR dla pojedynczego genu

IFIH1

20

20

1.091 ± 0.440

2.760 ± 1.398

Zwiększona ekspresja

1,10E-05

1,38E-05

0.908

0.820–0.995

1.579

0.8

0.85

Analiza qRT-PCR dla pojedynczego genu

MX1

20

20

1.132 ± 0.582

2.650 ± 1.085

Zwiększona ekspresja

1,58E-06

2,63E-06

0.945

0.874–1.000

1.779

0.9

0.9

Analiza qRT-PCR pojedynczego genu

TLR7

20

20

1.080 ± 0.444

2.580 ± 1.284

Podwyższona ekspresja

1,37E-06

2,63E-06

0.947

0.886–1.000

1.764

0.85

0.9

Analiza qRT-PCR pojedynczego genu

Model pięciogenowy (pozorny/wewnątrzpróbkowy)

20

20

Nie dotyczy przewód

Nie dotyczy przewód

Nie dotyczy

/

/

1

1.000–1.000

0.998

1

1

Te same 40 próbek biologicznych wykorzystanych do dopasowania i ewaluacji modelu

Model pięciogenowy (100-krotna 5-krotna walidacja krzyżowa)

20

20

Nie dotyczy przewód

Nie dotyczy kabel

Nie dotyczy

/

/

1

1.000–1.000

0.716

1

1

Wewnętrzna walidacja krzyżowa z wykorzystaniem regresji logistycznej z regularyzacją L2

Tabela 5: Pełne wyniki ekspresji qRT-PCR i analizy ROC dla CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 oraz TLR7, w tym analizy połączonego modelu pięciu genów. Tabela przedstawia wielkość próby dla PAH i grupy kontrolnej, wartości ekspresji względnej, kierunki ekspresji, wartości P, wartości skorygowane o wskaźnik fałszywych odkryć (FDR), AUC, 95% przedziały ufności, punkty odcięcia według indeksu Youdena, czułość, swoistość oraz typy walidacji dla poszczególnych genów i modeli połączonych.

Walidacja transkryptomiczna pojedynczych komórek w GSE210248

Zbiór GSE210248 dostarczył mechanistycznego wsparcia na poziomie komórkowym, wykazując, że przebudowa tętnic płucnych w PAH towarzyszy zaburzona komunikacja między komórkami odpornościowymi a komórkami strukturalnymi naczyń. Obserwacja ta była zgodna z wynikami analizy wzbogacenia transkryptomicznego typu bulk, która wykazała nasilenie odpowiedzi zapalnych, sygnalizacji chemokin, sygnalizacji receptorów Toll-podobnych oraz sygnalizacji czynnika martwicy nowotworu.

Dowody z analizy pojedynczych komórek sugerują, że sieć sygnalizacyjna tętnicy płucnej w PAH przesunęła się w stronę komórek strukturalnych, w tym komórek mięśni gładkich i fibroblastów. Komórki mięśni gładkich wykazywały wiele stanów, w tym podobny do perycyta/wykrywający tlen, kurczliwy, syntetyczny oraz podobny do fibroblasta. Wyniki te wspierają model choroby, w którym immunologiczna aktywacja zapalna oraz przebudowa strukturalnych komórek naczyniowych wspólnie napędzają progresję PH/PAH.

Przesiewanie związków kandydackich i dokowanie molekularne

Przesiewanie Connectivity Map zidentyfikowało BRD-K91900765 jako najlepiej oceniony związek kandydacki spośród 10 najlepszych wyników, z wynikiem Logit wynoszącym 10,13 i przewidywanym prawdopodobieństwem 0,085 (Rycina 10). Kurasja związków wykazała, że BRD-K91900765 odpowiada VX-745/neflamapimodowi, selektywnemu inhibitorowi p38α/MAPK14 o identyfikatorze związku PubChem 3038525 i masie cząsteczkowej 436,27 g/mol (Tabela 6).

Eksploracyjne dokowanie BRD-K91900765/VX-745 z pięcioma białkami związanymi z biomarkerami przyniosło najwyższe wyniki Vina wynoszące odpowiednio: -7,5 kcal/mol dla CXCL10, -7,6 kcal/mol dla JUN, -7,5 kcal/mol dla IFIH1, -8,7 kcal/mol dla MX1 oraz -8,1 kcal/mol dla TLR7 (Tabele 7–11; Rysunek 11A–E). Wyniki te wskazywały jedynie na przewidywaną kompatybilność strukturalną i nie potwierdziły, że pięć tych białek stanowi bezpośrednie cele farmakologiczne. Wstępne przewidywania dotyczące wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu, wydalania i toksyczności sugerowały, że związek posiada kilka właściwości charakterystycznych dla leków, choć stosunkowo wysoka obliczona wartość cLogP wymaga dalszej oceny (Tabela 12). Jako pozytywną analizę referencyjną włączono dokowanie względem ustalonego celu VX-745, MAPK14/p38α (PDB ID: 1OUK). Najlepsza kawerna MAPK14, C1, uzyskała wynik Vina wynoszący -7,9 kcal/mol, objętość kawerny 3560 ų, środek pola dokowania (docking-box center) o współrzędnych (2, 22, 34) oraz wymiary (22, 31, 31) (Tabela 13; Rysunek 11F).

Rycina 10: Ranking związków kandydackich z Connectivity Map. Ranking związków kandydackich zidentyfikowanych w wyniku przesiewania Connectivity Map. Związek BRD-K91900765 uzyskał najwyższą pozycję w rankingu, z wynikiem Logit równym 10.13 i przewidywanym prawdopodobieństwem 0.085. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 11: Trójwymiarowe diagramy dokowania molekularnego dla BRD-K91900765/VX-745. (A) Dokowanie eksploracyjne z CXCL10. (B) Dokowanie eksploracyjne z JUN. (C) Dokowanie eksploracyjne z IFIH1. (D) Dokowanie eksploracyjne z MX1. (E) Dokowanie eksploracyjne z TLR7. (F) Dokowanie z referencją pozytywną dla ustalonego celu farmakologicznego MAPK14/p38α (PDB ID: 1OUK). Panele A–E wskazują na przewidywaną kompatybilność strukturalną i nie potwierdzają bezpośredniego celowania farmakologicznego. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Element	Opis
CMap/Broad ID	BRD-K91900765 (typowy format partii: BRD-K91900765-001-xx-x)
Nazwa zwyczajna/aliasy	VX-745; neflamapimod; VRT-031745; VD-31745
Nazwa chemiczna	5-(2,6-dichlorofenyl)-2-(2,4-difluorofenylosulfanylo)pyrimido[1,6-b]pyridazin-6-on
PubChem CID	3038525
numer CAS	209410-46-8
Wzór sumaryczny / względna masa cząsteczkowa	C19H9Cl2F2N3OS; 436,27 g/mol
Kanoniczne SMILES	C1=CC(=C(C(=C1)Cl)C2=C3C=CC(=NN3C=NC2=O)SC4=C(C=C(C=C4)F)F)Cl
InChIKey	VEPKQEUBKLEPRA-UHFFFAOYSA-N
Uznany główny cel farmakologiczny	Odnotowano również hamowanie MAPK14/p38α; p38β wykazywało jednak niższą selektywność niż p38α

Tabela 6: Informacje chemiczne i farmakologiczne dla BRD-K91900765/VX-745. Tabela zawiera podsumowanie identyfikatorów związku, nazw alternatywnych, nazwy chemicznej, wzoru cząsteczkowego, masy cząsteczkowej, deskryptorów strukturalnych oraz ustalonego celu farmakologicznego BRD-K91900765/VX-745.

Identyfikacja CurPocket	Wynik Vina (kcal/mol)	Objętość kawerny (ų)	Środek (x, y, z)	Rozmiar obszaru dokowania (x, y, z)
C1	-7.5	7568	49, 15, 4	34, 33, 35
C4	-7	160	46, 0, 4	22, 22, 22
C3	-6	208	34, 15, 9	22, 22, 22
C2	-5.8	465	45, -6, 19	22, 22, 22
C5	-5.1	150	63, 0, 20	22, 22, 22

Tabela 7: Przewidywane kieszenie dokowania dla BRD-K91900765/VX-745 z CXCL10 (PDB ID: 1LV9). Tabela przedstawia uszeregowane identyfikatory wnęk, wyniki Vina, objętości wnęk, środki pól dokowania oraz wymiary pól dokowania wygenerowane przez CB-Dock2.

Identyfikator CurPocket	Wynik Vina (kcal/mol)	Objętość kawerny (ų)	Środek (x, y, z)	Rozmiar obszaru dokowania (x, y, z)
C3	-7.6	1593	26, 35, 70	22, 22, 22
C2	-7.5	1927	25, 21, 60	35, 22, 22
C1	-7.4	5420	32, 37, 48	35, 22, 31
C5	-6	464	26, 5, 48	22, 22, 22
C4	-5.3	683	59, 32, 39	22, 22, 22

Tabela 8: Przewidywane kieszenie dokowania dla BRD-K91900765/VX-745 z JUN (PDB ID: 1JUN). Tabela przedstawia uszeregowane identyfikatory wnęk, wyniki Vina, objętości wnęk, środki pudełek dokowania oraz wymiary pudełek dokowania wygenerowane przez CB-Dock2.

CurPocket ID	Wynik Vina (kcal/mol)	Objętość kawerny (ų)	Środek (x, y, z)	Rozmiar obszaru dokowania (x, y, z)
C1	-7.5	583	15, 4, 17	22, 22, 22
C3	-7.2	146	19, 21, 24	22, 22, 22
C4	-6.6	141	31, 19, 15	22, 22, 22
C2	-6.2	273	38, 9, 24	22, 22, 22
C5	-6.2	125	27, -7, 10	22, 22, 22

Tabela 9: Przewidywane kieszenie dokowania dla BRD-K91900765/VX-745 z IFIH1 (PDB ID: 3B6E). Tabela zawiera ranking identyfikatorów wnęk, wyniki Vina, objętości wnęk, środki pudełek dokujących oraz wymiary pudełek dokujących wygenerowane przez CB-Dock2.

CurPocket ID	Wynik Vina (kcal/mol)	Objętość kawerny (ų)	Środek (x, y, z)	Rozmiar obszaru dokowania (x, y, z)
C1	-8.7	523	-18, -14, -5	22, 22, 22
C4	-7.3	262	-13, -6, -9	22, 22, 22
C3	-7	306	12, 12, -7	22, 22, 22
C2	-6.9	408	-3, 1, -12	22, 22, 22
C5	-6.2	179	24, 25, 13	22, 22, 22

Tabela 10: Przewidywane kieszenie dokowania dla BRD-K91900765/VX-745 z MX1 (PDB ID: 5GTM). Tabela przedstawia ranking identyfikatorów wnęk, wyniki Vina, objętości wnęk, środki pudełek dokujących oraz wymiary pudełek dokujących wygenerowane przez CB-Dock2.

ID CurPocket	Wynik Vina (kcal/mol)	Objętość kawerny (ų)	Centrum (x, y, z)	Rozmiar dokowania (x, y, z)
C2	-8.1	7347	112, 137, 148	33, 28, 35
C3	-8.1	2604	124, 124, 176	30, 22, 22
C1	-8	7676	137, 112, 148	34, 29, 35
C5	-6.9	1976	117, 157, 88	22, 22, 22
C4	-6.6	2040	132, 92, 91	22, 22, 22

Tabela 11: Przewidywane kieszenie dokowania dla BRD-K91900765/VX-745 z TLR7 (PDB ID: 7CYN). W tabeli przedstawiono uporządkowane identyfikatory wnęk, wyniki Vina, objętości wnęk, środki pudełek dokowania oraz wymiary pudełek dokowania wygenerowane przez CB-Dock2.

Kategoria	Parametr	Wynik	Interpretacja
Właściwości fizykochemiczne	Masa cząsteczkowa	436,27 g/mol	Poniżej 500 Da, spełniając próg masy cząsteczkowej Lipinskiego
Właściwość fizykochemiczna	cLogP	Około 5,49	Nieco powyżej 5, co sugeruje wysoką lipofilność oraz konieczność uwzględnienia rozpuszczalności i wiązania niespecyficznego
Właściwości fizykochemiczne	TPSA (całkowita polarna powierzchnia cząsteczki)	Około 47,26 Ų	Niska polarna powierzchnia cząsteczkowa, co jest zgodne z potencjalnie korzystną przepuszczalnością przez błony
Podobieństwo do leku	HBA/HBD	Maj-00	Spełnia kryteria Lipińskiego w odniesieniu do akceptorów i donorów wiązań wodorowych
Podobieństwo do leku	Wiązania rotowalne	3	Niska elastyczność konformacyjna, sprzyjająca stabilnym konformacjom wiązania
Alerty strukturalne	ostrzeżenia PAINS/Brenk	Nie wykryto	Nie wykryto powszechnych interferencji typu pan-assay ani reaktywnych ostrzeżeń strukturalnych
Przewidywanie toksyczności	mutagenność w teście Amesa	Przewidywana toksyczność nie-Amesowskia	Sugeruje niskie przewidywane ryzyko mutagenne; wymagana jest wciąż walidacja eksperymentalna
Przewidywanie toksyczności	Karcynogenność	Przewidywany brak właściwości rakotwórczych	Sugeruje stosunkowo niskie przewidywane długoterminowe ryzyko kancerogenne; nadal wymagana jest walidacja eksperymentalna
Notatka farmakokinetyczna	Dostępność doustna/przenikalność do mózgu	Literatura oraz bazy danych wskazują na dostępną doustnie, przenikającą przez barierę krew-mózg małą cząsteczkę	Zgodnie z tłem jego opracowania jako inhibitora p38α; wciąż wymagana jest ponowna ocena w odniesieniu do wskazań w nadciśnieniu płucnym

Tabela 12: Wstępne przewidywania fizykochemiczne, pod kątem podobieństwa do leku, ADMET oraz toksyczności dla BRD-K91900765/VX-745. Tabela podsumowuje przewidywane właściwości fizykochemiczne, miary podobieństwa do leku, alerty strukturalne, punkty końcowe toksyczności oraz charakterystyki farmakokinetyczne. Te obliczeniowe przewidywania są wstępne i nie zastępują eksperymentalnej walidacji farmakokinetycznej lub toksykologicznej.

Id CurPocket	Wynik Vina (kcal/mol)	Objętość kawerny (ų)	Środek (x, y, z)	Rozmiar dokowania (x, y, z)
C1	-7.9	3560	2, 22, 34	22, 31, 31
C5	-7.5	254	-9, 28, 60	22, 22, 22
C3	-7.4	351	12, 7, 37	22, 22, 22
C2	-6.3	827	18, 5, 28	22, 22, 22
C4	-6.3	334	-16, 17, 38	22, 22, 22

Tabela 13: Przewidywane kieszenie dokujące dla BRD-K91900765/VX-745 z jego ustalonym celem farmakologicznym MAPK14/p38α (PDB ID: 1OUK), dołączone jako analiza referencyjna pozytywna. Tabela przedstawia rankingowe identyfikatory wnęk, wyniki Vina, objętości wnęk, środki obszarów dokowania oraz wymiary obszarów dokowania wygenerowane przy użyciu tego samego schematu dokowania, który zastosowano do pięciu białek związanych z biomarkerami.

Wspólnie analizy odkrywcze i wyniki qRT-PCR wskazują na CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 oraz TLR7 jako potencjalne biomarkery PH/PAH związane z dysregulacją immunologiczną i zapalną oraz przebudową naczyniową płuc, choć niezależna replikacja w zbiorze GSE117261 była najsilniejsza dla JUN i zmienna dla pozostałych genów. BRD-K91900765/VX-745 jest kandydatem do repozycjonowania leku, wyłonionym metodami obliczeniowymi, z prawdopodobnym mechanizmem hamowania MAPK14/p38α; przed interpretacją terapeutyczną wymagana jest walidacja wiązania z celem, badania komórkowe, farmakokinetyczne, toksykologiczne oraz w modelach zwierzęcych.

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:

Wszystkie publiczne zbiory danych transkrypomicznych wykorzystane w niniejszym badaniu są dostępne w bazie danych Gene Expression Omnibus pod numerami dostępu GSE22356, GSE33463, GSE48149, GSE117261 oraz GSE210248. Wszystkie pliki z kodem, przetworzone zbiory danych, zanonimizowane surowe i przeanalizowane dane qRT-PCR, wyniki modeli oraz pliki wejściowe i wyjściowe dokowania molekularnego zostały zgromadzone w ustrukturyzowanym repozytorium Zenodo. Repozytorium zawiera plik README, który opisuje każdy plik, wersje oprogramowania i pakietów, kolejność uruchamiania skryptów oraz pełne kroki reprodukcji – https://zenodo.org/records/21682282

Dyskusja

Opracowano zintegrowany i powtarzalny schemat postępowania w celu zidentyfikowania biomarkerów molekularnych związanych z PH/PAH oraz potencjalnych związków terapeutycznych, łącząc publiczne dane transkryptomiczne, analizę ważonych sieci koekspresji genów, wzbogacenie funkcjonalne, analizę sieci oddziaływań białko-białko, trzy algorytmy uczenia maszynowego, walidację zewnętrzną, interpretację transkryptomiczną w pojedynczych komórkach, potwierdzenie za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w łańcuchu z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR), przesiew Connectivity Map oraz dokowanie molekularne. Geny CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7 były konsekwentnie priorytetyzowane jako kluczowe geny cech i wspólnie przypisane do immunozapalnej i związanej z interferonem osi molekularnej. Wyniki te wspierają koncepcję, że PH/PAH nie jest jedynie zaburzeniem hemodynamicznym, ale także złożoną chorobą przebudowy naczyniowej obejmującą aktywację immunologiczną, sygnalizację zapalną, wrodzone rozpoznawanie kwasów nukleinowych oraz strukturalne i komórkowe zmiany fenotypowe^2,5,6.

Potencjał diagnostyczny pięciu genów został potwierdzony za pomocą wieloalgorytmicznej selekcji cech oraz analizy ROC w kohorcie odkrywczej. Niezależna walidacja w zbiorze GSE117261 była niejednorodna, a nie jednolita: JUN spełnił wcześniej określone kryteria FDR i AUC, CXCL10 wykazał zgodny kierunkowo nominalny wzrost bez znaczenia FDR w obrębie całego transkryptomu, IFIH1 oraz MX1 wykazały ograniczoną replikację, a TLR7 wykazał kierunek rozbieżny. Wyniki te nie potwierdzają tezy, jakoby wszystkie pięć genów zostało niezależnie zwalidowanych, i wskazują na możliwy wpływ składu kohorty, heterogeniczności tkanek, różnic platform oraz stopnia zaawansowania choroby. W przeciwieństwie do tego, analiza qRT-PCR w 20 próbkach tkanki płucnej od osób z PAH oraz 20 próbkach kontrolnych potwierdziła istotną nadekspresję wszystkich pięciu genów oraz korzystne parametry analizy ROC dla pojedynczych genów.

Logistyczny model qRT-PCR obejmujący pięć genów osiągnął pozorną wartość AUC wynoszącą 1,000 (95% CI, 1,000–1,000), a jego zagregowana wartość AUC z walidacji zewnętrznej (out-of-fold) pozostała na poziomie 1,000 w 100 powtórzeniach stratyfikowanej pięciokrotnej walidacji krzyżowej. Niemniej jednak model opracowano na podstawie zaledwie 40 próbek biologicznych, a całkowita separacja w małej kohorcie retrospektywnej może prowadzić do optymistycznych i niestabilnych szacunków wydajności. Panel ten należy zatem traktować jako eksploracyjną sygnaturę molekularną, a nie klinicznie zwalidowane narzędzie diagnostyczne. Przed wdrożeniem klinicznym niezbędne są badania na większych kohortach wieloośrodkowych, z predefiniowanymi stałymi współczynnikami modelu, walidacja na poziomie białek, immunohistochemia oraz testy prospektywne.

Wśród pięciu kluczowych genów, CXCL10 może promować rekrutację komórek odpornościowych i lokalną amplifikację stanu zapalnego w mikrośrodowisku naczyń płucnych. IFIH1 i TLR7 uczestniczą w wrodzonym rozpoznawaniu kwasów nukleinowych i mogą odzwierciedlać aktywację przeciwirusowych szlaków zapalnych. MX1 jest klasycznym genem stymulowanym przez interferon i może stanowić marker wewnątrzkomórkowy aktywacji szlaku interferonu typu I. JUN jest czynnikiem transkrypcyjnym reagującym na stres, który łączy stymulację zapalną z proliferacją komórek, apoptozą i przebudową tkanki. Razem geny te sugerują biologicznie spójny model, w którym aktywacja odporności wrodzonej i sygnalizacja związana z interferonem oddziałują na procesy przebudowy naczyniowej w PH/PAH. Ta interpretacja jest zgodna z wcześniejszymi dowodami, że zapalenie, odporność i szlaki związane z interferonem przyczyniają się do patobiologii PAH^2,5,6.

Walidacja na poziomie pojedynczych komórek dostarczyła kontekstu mechanistycznego dla wyników uzyskanych z analizy bulk. Dane GSE210248 sugerowały, że przebudowie tętnic płucnych w PAH towarzyszyła zaburzona komunikacja między komórkami odpornościowymi a strukturalnymi komórkami naczyniowymi, w tym komórkami mięśni gładkich, fibroblastami, komórkami śródbłonka oraz monocytami/makrofagami. Obecność wielu stanów fenotypowych komórek mięśni gładkich, w tym kurczliwego, syntetycznego, czułego na tlen/perycyto-podobnego oraz fibroblastopodobnego, wspiera model choroby, w którym aktywacja immunologiczna i strukturalna przebudowa komórek zachodzą równocześnie. Te dowody komórkowe są istotne, ponieważ sygnały transkryptomiczne z analizy bulk mogą wynikać ze zmienionych proporcji komórek, nacieku komórek odpornościowych lub zmian transkrypcyjnych w rezydentnych komórkach naczyniowych. Analiza pojedynczych komórek plasuje zatem CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7 w ramach wielokomórkowego ekosystemu przebudowy naczyń płucnych, a nie w procesie ograniczonym do jednego typu komórek^18,19,20,21.

Analiza repozycjonowania leków zidentyfikowała związek BRD-K91900765, odpowiadający VX-745/neflamapimodowi, jako najwyżej ocenionego kandydata obliczeniowego. VX-745 jest selektywnym inhibitorem p38α/MAPK14, a jego powiązanie z szlakami stresu zapalnego sprawia, że jest on mechanistycznie prawdopodobny w kontekście stanu zapalnego związanego z PH/PAH³⁰. Dlatego też dokowanie do MAPK14/p38α zostało włączone jako mechanistycznie istotna analiza referencyjna dodatnia. W przeciwieństwie do tego, dokowanie do CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7 miało charakter eksploracyjny i wskazywało jedynie na przewidywaną kompatybilność strukturalną; nie wykazało ono, że białka te, powiązane z biomarkerami, są bezpośrednimi celami VX-745, ani nie ustanowiło bezpośredniego wiązania, inhibicji celu lub skuteczności terapeutycznej. Bardziej biologicznie prawdopodobna hipoteza zakłada, że VX-745 może pośrednio modulować zidentyfikowaną sygnaturę transkrypcyjną związaną z odpornością-zapaleniem i interferonem poprzez inhibicję MAPK14. Przewidywania Connectivity Map, wyniki dokowania oraz szacunki ADMET pozostają dowodami obliczeniowymi. Dalsze prace powinny obejmować biochemiczne testy wiązania z celem, eksperymenty na komórkach śródbłonka i mięśni gładkich tętnic płucnych, modele stymulacji zapalnej, oceny farmakokinetyczne i toksykologiczne oraz walidację na modelach zwierzęcych.

Niedawne badania eksperymentalne nad hipoksyjnym nadciśnieniem płucnym podkreśliły również znaczenie komunikacji między neutrofilami a komórkami naczyniowymi płuc. Wykazano, że interakcje między neutrofilami a komórkami mięśni gładkich tętnic płucnych zapośredniczone przez HCK, a także interakcje między neutrofilami a komórkami śródbłonka zapośredniczone przez SERPINB3, przyczyniają się do przebudowy naczyniowej płuc³¹˒³². Oś SERPINB3–STAT1/3 jest szczególnie istotna w kontekście niniejszych wyników, ponieważ w analizach transkrypcyjnych zidentyfikowano sygnały związane z interferonem, STAT1 oraz JAK–STAT. Wspólnie obserwacje te wspierają interpretację, według której aktywacja komórek odpornościowych i ich komunikacja z komórkami strukturalnymi naczyń mogą przyczyniać się do progresji PH/PAH.

Badanie to posiada kilka mocnych stron. Wykorzystano wiele publicznych zbiorów danych oraz korekcję efektu serii, aby zredukować błąd specyficzny dla konkretnych zbiorów danych. Analizę ekspresji różnicowej, ważoną analizę sieci koekspresji genów, analizę oddziaływań białko-białko oraz trzy algorytmy uczenia maszynowego połączono w celu zwiększenia odporności cech. Niezależna walidacja bulk, potwierdzenie metodą qRT-PCR oraz dowody z poziomu pojedynczych komórek dostarczyły uzupełniających, choć nieidentycznych warstw dowodowych. Heterogeniczne wyniki GSE117261 oraz mała kohorta qRT-PCR wskazują również na istotne ograniczenia, w tym niepełną replikację zewnętrzną, potencjalne efekty specyficzne dla tkanki i platformy oraz ryzyko przeuczenia modelu. Odkrywanie biomarkerów rozszerzono także o przesiewowe badanie związków kandydackich, jednak analizy dokowania pozostają na etapie generowania hipotez. Przyszłe badania powinny zwalidować pięć genów w większych niezależnych kohortach z wykorzystaniem transkryptomiki przestrzennej, proteomiki, immunohistochemii oraz modeli organoidowych lub układów vascular-on-chip. Podsumowując, CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7 pozostają kandydatami na biomarkery PH/PAH powiązane z immunologiczno-zapalnym i interferonowym przebudową naczyniową, podczas gdy BRD-K91900765/VX-745 jest kandydatem do repozycjonowania leków wyłonionym obliczeniowo, którego znaczenie terapeutyczne wymaga walidacji eksperymentalnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2× SYBR Green PCR Mastermix	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Nr katalogowy SR1110	Ilościowa amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem barwników oraz detekcja fluorescencyjna
AI21.msvmRFE.R oraz e1071	Własny skrypt R z pakietem e1071 z repozytorium CRAN	AI21.msvmRFE.R; e1071 v1.7-17	Rekurencyjna eliminacja cech z wykorzystaniem maszyny wektorów nośnych
Agaroza	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Nr katalogowy A8201; CAS 9012-36-6	Ocena integralności całkowitego RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym
Aparatura do elektroforezy w żelu agarozowym	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	Model DYCZ-24DN	Elektroforetyczna ocena integralności RNA
Silnik oceniający AutoDock Vina	Centrum Biologii Strukturalnej Obliczeniowej, Scripps Research	v1.2.0; RRID: SCR_011958	Punktacja póz białko-ligand w ramach procedury CB-Dock2
CB-Dock2	Laboratorium Cao, serwer WWW CB-Dock2	v2.0; dostęp w lipcu 2026 r.	Wykrywanie pustych wnęk oraz dokowanie molekularne związku VX-745 z wybranymi strukturami białek
CellChat	Pakiet R CellChat	v2.1.2	Wnioskowanie i wizualizacja komunikacji międzykomórkowej na podstawie macierzy ekspresji pojedynczych komórek
CellChatDB.human	Dystrybuowane z pakietem R CellChat	CellChatDB.human; podzbiór sygnalizacji wydzielniczej; minimalny próg komórek = 10	Baza danych interakcji ligand-receptor u ludzi dla CellChat
clusterProfiler	Pakiet R Bioconductor	v4.20.0; wersja Bioconductor 3.23	Analizy wzbogacenia w oparciu o ontologię genów (Gene Ontology) oraz Kioto encyklopedię genów i genomów (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)
Mapa Połączeń (CMap/CLUE)	Broad Institute	zasób L1000/CLUE; RRID: SCR_016204; dostęp w lipcu 2026 r.	Obliczeniowa analiza repozycjonowania leków
Dedykowane primery oligonukleotydowe	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Synteza na zamówienie; sekwencje starterów podano w tabeli 2	Amplifikacja ACTB, CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 i TLR7
cytoHubba	Sklep z aplikacjami Cytoscape	v0.1	Ranking genów typu hub w sieci oddziaływań białko-białko w oparciu o stopień węzła
Cytoscape	Konsorcjum Cytoscape	v3.10.4; RRID: SCR_003032	Wizualizacja i analiza sieci oddziaływań białko-białko
DrugBank	Baza Wiedzy DrugBank	v6.0; RRID: SCR_002700	Identyfikacja związków i kuratela informacji farmakologicznych
System do dokumentacji żeli	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	Model WO-9413B	Wizualizacja i rejestracja wyników analizy integralności RNA w żelu agarozowym
Gene Expression Omnibus (GEO)	Krajowe Centrum Biotehnologii Informacyjnej	GSE22356, GSE33463, GSE48149, GSE117261 oraz GSE210248; RRID: SCR_005012	Pobieranie zbiorów danych transkrypomicznych z pojedynczych komórek oraz z całych populacji komórek
GEOquery	pakiet R Bioconductor	v2.80.0; wydanie Bioconductor 3.23	Programowe pobieranie i import danych ekspresji oraz fenotypowych z GEO
glmnet	pakiet R z repozytorium CRAN	v5.0	Regresja logistyczna metodą LASSO (least absolute shrinkage and selection operator) oraz regularyzowane modelowanie logistyczne
limma	pakiet R z projektu Bioconductor	v3.68.0; wersja Bioconductor 3.23; RRID: SCR_010943	Analiza ekspresji różnicowej i statystyka empirycznego Bayesa
spektrofotometr NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop ND-1000; oprogramowanie v3.8	Pomiar stężenia RNA oraz wskaźników czystości A260/280 i A260/230
NCBI Primer-BLAST	Krajowe Centrum Biotechnologii Informacyjnej	Narzędzie internetowe; RRID: SCR_003095; dostęp w lipcu 2026 r.	Weryfikacja specyficzności starterów
pROC	pakiet R z repozytorium CRAN	v1.19.0.1; RRID: SCR_024286	Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika, przedziały ufności DeLonga oraz punkty odcięcia indeksu Youdena
Protein Data Bank (PDB)	RCSB Protein Data Bank	CXCL10: 1LV9; JUN: 1JUN; IFIH1: 3B6E; MX1: 5GTM; TLR7: 7CYN; MAPK14/p38α: 1OUK; RRID: SCR_012820	Pobieranie eksperymentalnie wyznaczonych struktur białek do dokowania molekularnego
PubChem	Krajowe Centrum Biotechnologiczne (NCBI)	PubChem CID 3038525; RRID: SCR_004284	Pozyskiwanie struktury trójwymiarowej i identyfikatorów chemicznych BRD-K91900765/VX-745
R	R Foundation for Statistical Computing	v4.6.1; RRID: SCR_001905	Obliczenia statystyczne, przetwarzanie danych, uczenie maszynowe i wizualizacja
lasy losowe	pakiet R z repozytorium CRAN	v4.7-1.2	Wybór cech i ranking istotności zmiennych metodą lasów losowych
System PCR w czasie rzeczywistym	Stratagene, obecnie Agilent Technologies	System do analizy PCR w czasie rzeczywistym Mx3000P	amplifikacja qRT-PCR, detekcja fluorescencji, analiza krzywej topnienia oraz eksport wartości Ct
Seurat	pakiet R z repozytorium CRAN; Satija Laboratory	v5.5.1; RRID: SCR_016341	Kontrola jakości, normalizacja, redukcja wymiarowości, klasteryzacja i adnotacja w sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek
Proszę podać tekst do tłumaczenia.	Konsorcjum STRING	v12.0; RRID: SCR_005223	Konstrukcja sieci oddziaływań białko-białko
sva (ComBat)	pakiet R Bioconductor	v3.60.0; wydanie Bioconductor 3.23	Korekcja efektów seryjnych między zestawami danych
SwissADME	Szwajcarski Instytut Bioinformatyki	Serwer WWW; dostęp w lipcu 2026 r.	Wstępna analiza właściwości lekopodobnych, fizykochemicznych oraz parametrów ADME
Zestaw do izolacji całkowitego RNA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Nr katalogowy R1200	Ekstrakcja i oczyszczanie całkowitego RNA z próbek tkanki płucnej
Uniwersalny zestaw RT-PCR (AMV)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Nr katalogowy RP1200	Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA do komplementarnego DNA
WGCNA (Analiza sieci współwyrażania genów ważonej)	pakiet R z repozytorium CRAN	v1.74	Konstrukcja ważonej sieci współekspresji genów oraz analiza modułów i cech