Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybki schemat postępowania w modelowaniu deficytów pamięci rozpoznawczej indukowanych deprywacją snu u myszy z wykorzystaniem testu rozpoznawania nowych obiektów oraz biomarkerów hipokampa

132 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/73557

⸱

8 września 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 2Department of Neurology, Hefei Eighth People's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine, Bengbu First People's Hospital, 4Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College and State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia szybki i powtarzalny schemat modelowania deficytów pamięci rozpoznawczej wywołanych deprywacją snu u myszy, łączący łagodną deprywację snu, test rozpoznawania nowych obiektów oraz analizę biomarkerów hipokampa u tych samych zwierząt w ramach 10-dniowego procesu, z ustrukturyzowanym rejestrowaniem interwencji i zdefiniowanymi kryteriami kontroli jakości.

Streszczenie

Niedostateczny sen przyczynia się do pogorszenia funkcji poznawczych i może przyspieszać procesy neurodegeneracyjne. Niniejszy artykuł przedstawia szybki i powtarzalny schemat postępowania służący do modelowania deficytów pamięci rozpoznawczej indukowanych deprywacją snu u myszy, łącząc wyniki behawioralne z molekularnymi zmianami w hipokampie. Protokół wykorzystuje paradygmat 5-godzinnej deprywacji snu metodą łagodnego obchodzenia się (gentle handling), stosowany bezpośrednio po standaryzowanej, 10-minutowej sesji zapoznania z nowym obiektem (NOR). Pamięć rozpoznawcza jest oceniana za pomocą 5-minutowego testu NOR po precyzyjnie określonym, 5-godzinnym odstępie retencji, a następnie następuje natychmiastowy pobór tkanek hipokampa od tych samych zwierząt w celu ilościowego oznaczenia cytokin prozapalnych, w tym interleukiny-1 beta (IL-1β), interleukiny-6 (IL-6) oraz czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α), a także markerów stresu oksydacyjnego, w tym dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GPx) i malondialdehydu (MDA). Główny postęp metodologiczny nie polega na poszczególnych technikach behawioralnych lub biochemicznych, które są dobrze ugruntowane, lecz na ich operacyjnej standaryzacji w ramach jednego, powiązanego schematu pracy. Protokół wymaga ustrukturyzowanego, mierzalnego rejestru interwencji z zakresu łagodnego obchodzenia się, przypisuje trening i deprywację do stałego punktu czasu okołodobowego, zachowuje powiązania na poziomie osobniczym między zapisami NOR a próbkami tkanek oraz precyzyjnie określa kryteria kontroli jakości i analizy. Procedura została zaprojektowana tak, aby zminimalizować fizyczne krępowanie i wymuszony wysiłek fizyczny, może zostać ukończona w krótkim oknie eksperymentalnym i jest proponowana jako referencyjny schemat postępowania, który poszczególne laboratoria mogą wykorzystać do benchmarkingu własnej implementacji deprywacji snu metodą łagodnego obchodzenia się, oczekując na niezależną replikację.

Wprowadzenie

Sen jest fundamentalnym procesem fizjologicznym, niezbędnym dla funkcjonowania mózgu, uczenia się oraz konsolidacji pamięci1. Niedobór snu wiąże się z dysfunkcją poznawczą, zaburzeniami nastroju oraz progresją chorób neurodegeneracyjnych2. Eksperymentalna deprywacja snu (SD) u gryzoni jest powszechnie stosowana do badania neurobiologicznych skutków ostrego braku snu. Hipokamp, obszar mózgu kluczowy dla pamięci deklaratywnej i przestrzennej, jest szczególnie podatny na deprywację snu3.

W celu wywołania deprywacji snu u gryzoni dostępnych jest kilka procedur. Zmodyfikowana metoda wielu platform może skutecznie ograniczyć fazę snu REM, lecz może ona powodować znaczny stres i wyczerpanie fizyczne4. W przeciwieństwie do niej, delikatna stymulacja (GH – gentle handling) podtrzymuje stan czuwania poprzez łagodną stymulację sensoryczną, taką jak opukiwanie klatki, niepokojenie ściółki lub podawanie nowego materiału do budowy gniazda w momencie pojawienia się oznak snu. Krótki okres GH zastosowany bezpośrednio po nauce może zakłócać zależną od hipokampa konsolidację pamięci, unikając jednocześnie wielu czynników zakłócających związanych z długotrwałymi paradygmatami deprywacji5. Ponieważ interwencje w niniejszym protokole są wyzwalane przez postawę ciała i behawioralne oznaki czuwania, a nie przez detekcję fazy REM potwierdzoną za pomocą EEG, GH w tutaj zastosowanej formie stanowi uznaną metodę całkowitej deprywacji snu, a nie technikę specyficzną dla fazy REM, i jest stosowana w tej formie od kilku dekad6.

Test rozpoznawania nowych obiektów (NOR) jest powszechnie stosowanym badaniem pamięci rozpoznawczej. Opiera się on na naturalnej tendencji gryzoni do częstszego eksplorowania nowego obiektu niż obiektu znanego, bez konieczności stosowania nagrody, kary czy rozbudowanego treningu7,8. Wykazano, że ostra deprywacja snu (SD) upośledza rozróżnianie nowych obiektów, zapewniając tym samym efektywny behawioralny wskaźnik zaburzeń konsolidacji pamięci9. Na poziomie molekularnym brak snu może wywołać neurostan zapalny w hipokampie oraz stres oksydacyjny, w tym zwiększenie poziomu cytokin prozapalnych i produktów peroksydacji lipidów, przy jednoczesnym obniżeniu zdolności antyoksydacyjnych10,11.

Wyzwanie w zastosowaniu tego modelu nie polega na dostępności jego poszczególnych elementów, lecz na braku spójności operacyjnej między badaniami. O delikatnym obchodzeniu się ze zwierzętami często wspomina się bez ustrukturyzowanego zapisu intensywności interwencji; punkty końcowe behawioralne i molekularne są często gromadzone w osobnych kohortach, a kryteria kontroli jakości dla zachowań eksploracyjnych oraz planowanie wielkości próby nie zawsze są jasno określone. Ogólnym celem niniejszego artykułu jest przedstawienie zstandaryzowanego schematu postępowania w celu modelowania deficytów pamięci rozpoznawczej wywołanych deprywacją snu, przy jednoczesnym powiązaniu wyników behawioralnych z molekularnymi pomiarami w hipokampie u tych samych zwierząt. Metoda ta niweluje te luki w powtarzalności poprzez połączenie 5-godzinnego okna GH po treningu, dziennika intensywności interwencji, pobierania tkanek i przeprowadzania testów behawioralnych w tej samej kohorcie oraz zdefiniowanych kryteriów analitycznych w ramach jednego 10-dniowego procesu (Rysunek 1). Brak standaryzacji w implementacji GH był wcześniej odnotowany w literaturze dotyczącej metodologii badań nad snem6.

figure-introduction-1
Rycina 1. Schematyczny przebieg procesu eksperymentalnego. Protokół trwa 10 dni i obejmuje obsługę oraz habituację, po których następuje kluczowy dzień testowy obejmujący 10 min fazę zapoznania z NOR, 5 h deprywacji snu GH, 5 min test NOR oraz natychmiastowe pobranie tkanki hipokampa od tych samych zwierząt w celu analizy biomarkerów. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych AILIMO (Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.) na wniosek Szpitala Nanjing Drum Tower (Główny Badacz: Yuan Liu), numer zatwierdzenia AP CODE: ALM202605070, zatwierdzone 7 maja 2026 r. (ważne przez 4 lata), zgodnie z obowiązującymi przepisami instytucjonalnymi i krajowymi. W protokole opisanym poniżej należy wykorzystać dorosłe samce myszy C57BL/6J (w wieku 8–12 tygodni).

1. Przygotowanie i habituacja zwierząt

  1. Utrzymuj myszy domowe w standardowych warunkach laboratoryjnych w temperaturze 22°C ± 1°C i wilgotności 50%–60% przy 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światło zapalone o 07:00, zdefiniowane jako ZT0). Zapewnij dostęp ad libitum do standardowej karmy dla gryzoni i wody.
  2. Oswajaj każdą mysz poprzez manipulację przez 3–5 min dziennie przez co najmniej 7 kolejnych dni przed rozpoczęciem testów.
    UWAGA: Procedura ta minimalizuje stres wywołany manipulacją, który mógłby zaburzyć zachowania eksploracyjne.
  3. Przygotuj kwadratową, nieprzezroczystą arenę NOR o wymiarach 40 cm × 40 cm × 40 cm z nierefleksyjnymi ściankami. Wybierz kolor areny kontrastujący z kolorem futra zwierząt.
  4. Wybierz obiekty NOR, które są wystarczająco ciężkie, aby zapobiec ich przesuwaniu, i wykonane z materiału nieporowatego. Użyj obiektów różniących się kształtem i teksturą, ale o zbliżonej wielkości całkowitej.
    UWAGA: Rysunek 2 przedstawia konfigurację treningową i testową.
  5. W dniach 8 i 9 przenieś myszy do pomieszczenia testowego na 1 h przed habituacją. Umieść każdą mysz w pustej arenie na 10 min, a następnie zwróć ją do klatki macierzystej.
  6. Przecieraj arenę i obiekty 70% etanolem pomiędzy zwierzętami. Pozostaw etanol do wyschnięcia przez około 3–5 min przy normalnej wentylacji laboratoryjnej przed wprowadzeniem kolejnego zwierzęcia.
    OSTRZEŻENIE: Etanol jest wysoce łatwopalny. Zapewnij odpowiednią wentylację i przechowuj go z dala od źródeł zapłonu.

figure-protocol-1
Rysunek 2. Schemat aparatury do testu rozpoznawania nowych obiektów oraz projekt eksperymentu. Podczas fazy zapoznania należy umieścić dwa identyczne obiekty (A i A′) w przeciwległych narożnikach areny. Podczas fazy testowej, po 5 h interwale retencyjnym, jeden z obiektów znanych należy zastąpić nowym obiektem (B). Aby zminimalizować błąd wynikający z preferencji przestrzennych, należy zrównoważyć położenie nowego obiektu (lewe i prawe) pomiędzy zwierzętami, tak aby około połowa zwierząt w każdej grupie otrzymała nowy obiekt w każdej z tych pozycji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Trening NOR (Zapoznanie)

  1. W 10. dniu rozpocząć trening NOR w ZT1 (08:00 zgodnie z określonym harmonogramem oświetlenia). Utrzymać tę godzinę rozpoczęcia we wszystkich kohortach, aby zminimalizować zmienność okołodobową.
  2. Przenieść myszy do pomieszczenia testowego na 1 h przed rozpoczęciem sesji treningowej. Umieścić dwa identyczne obiekty (A i A′) w przeciwległych rogach areny, w odległości około 10 cm od ścian.
  3. W razie potrzeby przymocować obiekty do podłoża.
  4. Umieścić mysz w centrum areny, tyłem do obiektów. Pozostawić mysz do swobodnej eksploracji przez 10 min.
  5. Rejestrować zachowanie za pomocą systemu wideo-trackingu zamontowanego nad areną. Eksplorację aktywną zdefiniować jako kierowanie nosem w stronę obiektu z odległości ≤2 cm, węszenie przy obiekcie lub dotykanie go nosem.
    UWAGA: Siedzenia na obiekcie lub wspinania się na niego bez aktywnego węszenia nie należy zaliczać do eksploracji obiektu.
  6. Rejestrować i oceniać zachowanie NOR za pomocą oprogramowania EthoVision XT wersja 17.5 z kamerą nadzorczą Basler acA1300-60gm. Skonfigurować oprogramowanie do trackingu, ustawiając strefę detekcji punktu nosa w odległości ≤2 cm od każdego obiektu w celu oceny eksploracji aktywnej, zgodnie z kryteriami zdefiniowanymi w kroku 2.5.
  7. Po zakończeniu 10-minutowej sesji zapoznawczej natychmiast usunąć mysz z areny.
  8. Dokładnie oczyścić arenę i obiekty 70% ethanolem przed wprowadzeniem kolejnego zwierzęcia.

3. Deprywacja snu poprzez delikatne manipulowanie

  1. Przed sesją treningową w 10. dniu przypisz każdemu zwierzęciu unikalny kod identyfikacyjny. Używaj tego samego kodu identyfikacyjnego podczas rejestracji zachowań oraz pobierania tkanek.
  2. Przypisz zwierzęta do grup SD i NSD w stosunku 1:1, wykorzystując losowe liczby wygenerowane komputerowo za pomocą funkcji RAND w programie Excel.
  3. Bezpośrednio po treningu NOR należy przenieść myszy NSD do ich klatek macierzystych i pozostawić je w spokoju na 5 h. Zwierzęta SD i NSD należy utrzymywać w identycznych warunkach środowiskowych oraz w tym samym oknie czasu okołodobowego.
  4. Bezpośrednio po treningu NOR należy rozpocząć deprywację snu metodą GH u myszy z grupy SD. Należy utrzymywać stan czuwania przez 5 kolejnych godzin w klatce domowej.
  5. Należy stale monitorować zwierzęta. Należy interweniować, gdy mysz przyjmie postawy związane ze snem, takie jak zwijanie się, zamknięcie oczu lub przedłużający się brak ruchu.
  6. Stymulację należy wprowadzać stopniowo, zaczynając od delikatnego stukania w klatkę. W razie potrzeby można lekko poruszyć ściółkę, wprowadzić nowy, czysty przedmiot, taki jak papierowa rurka, lub delikatnie dotknąć zwierzęcia miękkim pędzlem.
  7. Należy unikać unieruchamiania fizycznego, wymuszania ruchu oraz stymulacji awersyjnej lub bolesnej.
  8. Uzupełnij dziennik interwencji w Tabela 1 dla każdej klatki w ciągu 5-godzinnego okresu GH. Należy odnotować przybliżoną liczbę interwencji na godzinę, dominujący rodzaj interwencji oraz wszelkie odchylenia od protokołu lub zastrzeżenia dotyczące dobrostanu.
  9. Należy stosować ten sam szablon dziennika interwencji we wszystkich kohortach.
    OSTRZEŻENIE: Nie należy stosować unieruchomienia fizycznego, wymuszonego wysiłku ani bodźców bólowych, ponieważ mogą one samodzielnie wpływać na pamięć, stres oraz wyniki stanu zapalnego.
Id klatki/kohortyH1H2H3H4H5Dominujący rodzaj interwencjiOdchylenie lub obserwacja dobrostanu
Id wpisuLiczba wpisów H1Liczba wpisów H2Liczba wpisów H3Liczba wpisów H4Liczba wpisów H5Stukanie / ściółka / nowy obiekt / miękka szczoteczkaZarejestruj w przypadku wystąpienia

Tabela 1: Szablon dziennika interwencji polegających na delikatnym obchodzeniu się ze zwierzętami. Należy zapisywać ID klatki lub kohorty, liczbę interwencji polegających na delikatnym obchodzeniu się w każdej godzinie 5-godzinnego okresu deprywacji snu (H1–H5), dominujące typy interwencji oraz wszelkie odchylenia od protokołu lub obserwacje dotyczące dobrostanu.

4. Faza testu NOR

  1. Dokładnie 5 h po zakończeniu treningu NOR rozpocznij fazę testową NOR, aby zachować stały 5-godzinny odstęp czasu na retencję.
  2. Umieść w arenie jeden znany obiekt (A) i jeden nowy obiekt (B).
  3. Zrównoważ pozycję nowego obiektu pomiędzy zwierzętami, naprzemiennie umieszczając go po lewej i prawej stronie, tak aby około połowa zwierząt w każdej grupie miała nowy obiekt po lewej stronie, a druga połowa po prawej.
  4. Umieść mysz w centrum areny. Pozostaw mysz do swobodnej eksploracji przez 5 min.
  5. Nagraj sesję, używając tego samego systemu wideotrzymania z widokiem z góry, który był stosowany podczas oswajania. Zastosuj definicję eksploracji określoną w kroku 2.5.
  6. Przed każdym zwierzęciem oczyść arenę i obiekty przy użyciu 70% etanolu.

5. Pobieranie tkanek z tej samej kohorty i wycinanie hipokampa

  1. Bezpośrednio po teście NOR zidentyfikuj zwierzę poddane testom behawioralnym w celu pobrania tkanek.
  2. Uśmierć zwierzę poprzez dekapitację bez znieczulenia, zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt, aby uniknąć potencjalnych efektów zakłócających działania środków znieczulających na biomarkery zapalne i zależne od fosforylacji. Pobierz tkankę mózgową natychmiast po uśmierceniu.
  3. Zachowaj unikalny identyfikator rejestracji zachowania zwierzęcia na wszystkich probówkach z próbkami i w dokumentacji, aby zapewnić bezpośredni związek każdej próbki molekularnej z wynikiem testu NOR danego zwierzęcia.
  4. Szybko wyizoluj mózg i umieść go na sterylnej, schłodzonej do temperatury lodu powierzchni do sekcji.
  5. Rozdziel półkule cięciem wzdłużn samym środkiem (mid-sagittal). Wypreparuj hipokamp z każdej półkuli, używając schłodzonych mikrospatułek.
  6. Szybko zamroź wypreparowane hipokampy w ciekłym azocie. Przechowuj próbki w temperaturze −80°C do czasu analizy.
    UWAGA: Ciekły azot może spowodować poważne obrażenia spowodowane zimnem. Należy stosować odpowiedni kriogeniczny sprzęt ochronny.

6. Ilościowe oznaczenie biomarkerów hipokampa

  1. Uzupełnić lodowaty bufor lizujący RIPA koktajlem inhibitorów proteaz i fosfataz w stężeniu roboczym 1× (10 µL na mL buforu lizującego z roztworu zapasowego 100×).
  2. Zhomogenizować tkankę hipokampa w stosunku tkanki do buforu 1:10 (m/v) w uzupełnionym lodowatym buforze lizującym RIPA (10 µL buforu lizującego na mg tkanki). Dla typowej masy tkanki hipokampa wynoszącej około 25–30 mg na półkulę, należy użyć około 250–300 µL buforu lizującego na półkulę lub około 500–600 µL dla około 50–60 mg bilateralnej tkanki hipokampa.
  3. Odwirować homogenat RIPA z prędkością 14 000 × g przez 15 min w temperaturze 4°C i zebrać nadsącz. Nadsączu należy użyć do oznaczania całkowitej zawartości białka oraz do trzech testów ELISA na cytokiny.
    UWAGA: W przypadku testów SOD, GPx i MDA należy stosować bufory do homogenizacji specyficzne dla danego zestawu, zgodnie z zaleceniami producenta w celu zachowania aktywności enzymatycznej.
  4. Przygotować oddzielny 10% (m/v) homogenat hipokampa do pomiarów SOD, GPx i MDA w stosunku tkanki do buforu 1:9, stosując odpowiedni bufor do homogenizacji specyficzny dla zestawu zamiast buforu lizującego RIPA.
  5. Wyznaczyć całkowite stężenie białka za pomocą testu białkowego BCA.
  6. Oznaczyć poziom IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD, GPx oraz MDA, korzystając ze specyficznych dla danego celu zestawów ELISA lub zestawów do analiz biochemicznych wymienionych w Tabeli materiałów. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dla każdego testu.
  7. Przygotować standardy w odpowiednim buforze do analizy. Próbki należy rozcieńczyć tak, aby wartości gęstości optycznej mieściły się w liniowej części krzywej wzorcowej.
  8. Próbki hipokampa do testów ELISA na cytokiny rozcieńczyć około 1:5 w odpowiednim rozcieńczalniku do analizy. W razie potrzeby dostosować rozcieńczenie w zakresie 1:2–1:10, aby uzyskać wartości gęstości optycznej w liniowej części krzywej wzorcowej.
  9. Nadsączów 10% (m/v) homogenatów hipokampa opisanych w kroku 6.4 użyć bezpośrednio do testów SOD, GPx i MDA. W przypadku tych trzech testów nie stosować schematu rozcieńczania dla ELISA na cytokiny opisanego w kroku 6.8.
  10. W testach ELISA na IL-1β, IL-6 i TNF-α dodać 100 µL standardu lub odpowiednio rozcieńczonej próbki hipokampa do każdego dołka w dwóch powtórzeniach i inkubować w temperaturze 37°C przez 90 min. Dodać 100 µL biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego i inkubować w temperaturze 37°C przez 60 min.
  11. Dodać 100 µL koniugatu HRP do każdego dołka testu ELISA na cytokiny i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min. Rozwinąć reakcję z substratem TMB w temperaturze 37°C w ciemności przez około 15 min.
  12. W teście SOD zmieszać 20 µL nadsączu homogenatu hipokampa z 20 µL roboczego roztworu enzymu i 200 µL roztworu substratu. Inkubować w temperaturze 37°C przez 20 min i zmierzyć absorbancję przy 450 nm.
  13. W teście GPx połączyć 200 µL nadsączu homogenatu hipokampa z mieszaniną reakcyjną zawierającą GSH i inkubować w temperaturze 37°C przez 5 min. Przerwać reakcję i odwirować mieszaninę z prędkością 3500 × g przez 10 min w temperaturze 4°C. Poddać nadsącz rozwojowi barwnemu przez około 15 min i zmierzyć absorbancję przy 412 nm, używając 200 µL nadsączu z reakcji.
  14. W teście MDA zmieszać 100 µL nadsączu homogenatu hipokampa z 1,0 mL odczynnika roboczego MDA i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 95°C przez 40 min. Schłodzić i odwirować mieszaninę. Przenieść około 250 µL nadsączu na mikropłytkę i zmierzyć absorbancję przy 532 nm.
  15. W testach ELISA na cytokiny odczytać absorbancję przy długości fali określonej w instrukcji zestawu, zazwyczaj 450 nm, stosując korekcję długością fali referencyjnej, jeśli jest dostępna.
  16. Wygenerować krzywą wzorcową przy użyciu odpowiedniego modelu, np. regresji logistycznej czteroparametrowej. Znormalizować każdy pomiar biomarkera do całkowitej zawartości białka.
  17. Stężenia cytokin podać w pg/mg białka, aktywność enzymów przeciwutleniających w U/mg białka, a MDA w nmol/mg białka, o ile jest to zgodne z wybranym zestawem.

7. Analiza danych i kontrola jakości

  1. Wyznacz czas eksploracji skierowany na znany obiekt (Tznany) oraz nowego obiektu (Tnowy) podczas fazy testu NOR.
  2. Oblicz wskaźnik różnicujący (DI) w następujący sposób:
    figure-protocol-2.
    UWAGA: Wartość DI powyżej 0,5 wskazuje na preferencję nowego obiektu.
  3. Wyklucz zwierzę z analizy NOR, jeżeli całkowity czas eksploracji obiektów (Tnowy + Tznajomy) wynosi mniej niż 10 s. Kryterium to należy zastosować przed analizą na poziomie grupy i zgłosić wszystkie przypadki wykluczenia.
  4. Oceń normalność rozkładu dla każdej grupy za pomocą testu Shapiro-Wilka oraz jednorodność wariancji za pomocą testu Levene’a. Dla każdej grupy oceń DI w stosunku do poziomu przypadkowego 0,5, stosując obustronny jednopróbkowy test t; jeśli założenie o normalności rozkładu nie zostanie spełnione, zastosuj zamiast niego jednopróbkowy test znaków Wilcoxona w stosunku do wartości 0,5.
  5. Przyjmij poziom istotności alfa wynoszący 0,05 dla wszystkich testów statystycznych, chyba że określono inaczej.
  6. Porównaj DI pomiędzy niezależnymi grupami NSD i SD, stosując dwustronny nieparzysty test t w przypadku spełnienia założeń o normalności i jednorodności wariancji. W przeciwnym razie zastosuj test U Manna–Whitneya.
  7. Przeanalizuj czas eksploracji obiektów znanych w porównaniu do nowych, stosując dwuczynnikową analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami, przyjmując Grupę oraz Typ Obiektu jako czynniki. Wykonaj post hoc porównania parzyste z poprawką Sidaka oraz podaj 95-procentowe przedziały ufności dla wszystkich szacunków porównań między grupami.
  8. Porównaj każdy biomarker hipokampa pomiędzy niezależnymi grupami NSD i SD, stosując dwustronny nieparzysty test t w przypadku spełnienia założeń o normalności rozkładu i jednorodności wariancji. W przeciwnym razie zastosuj test U Manna–Whitneya.
  9. Podczas oceny wielu biomarkerów z tej samej kohorty należy kontrolować poziom błędnych odkryć (FDR) dla całego panelu biomarkerów, stosując procedurę Benjamini-Hochberga. Należy raportować zarówno nominalne, jak i skorygowane pod kątem FDR wartości p.
  10. Przeprowadzić analizę mocy a priori przy użyciu programu G*Power w wersji 3.1 dla dwustronnego porównania prób niezależnych, przyjmując indeks dyskryminacji NOR jako główny punkt końcowy. Oczekiwaną wielkość efektu oprzeć na opublikowanych wcześniej badaniach wykazujących wyraźne upośledzenie preferencji nowych obiektów po deprywacji snu następującej po uczeniu się.
  11. Przeprowadzić analizę mocy a priori, wykorzystując ustandaryzowany poziom efektu według Cohena. d = 1,35, dwustronny poziom istotności alfa wynoszący 0,05, moc testu 80% oraz stosunek alokacji 1:1. Parametry te pozwalają obliczyć minimalną wielkość próby wynoszącą 10 zwierząt na grupę.
    UWAGA: Wielkość efektu oszacowano na podstawie wcześniej opublikowanych danych dotyczących rozpoznawania obiektów9Palchykova i wsp. zgłosili istotny efekt grupowy w czasie eksploracji nowego obiektu podczas fazy testowej (F(1,16) = 8.26, p < 0,007) dla myszy poddanych deprywacji snu bezpośrednio po treningu w porównaniu z grupą kontrolną o odpowiadającym czasie badania (n = 9 na grupę), co odpowiada wskaźnikowi Cohena d ≈ 1.36. Znormalizowana wielkość efektu wynosząca d W związku z tym do a priori analizy mocy przyjęto wartość = 1,35.
  12. Zwiększyć planowaną wielkość próby o 20% do 12 zwierząt na grupę (łącznie 24 zwierzęta), aby uwzględnić z góry określone wykluczenia behawioralne lub techniczne. Zdefiniować z góry całkowity czas eksploracji obiektów. <10 s podczas testu NOR, wykluczenia ze względu na dobrostan zwierząt, nieużyteczne nagrania wideo oraz błędy techniczne analiz tkanek/próbek jako kryteria wykluczenia.
  13. Nie należy wykluczać zwierząt na podstawie kierunku lub wielkości zaobserwowanego efektu terapeutycznego.
  14. Analizy statystyczne należy przeprowadzić przy użyciu języka Python w wersji 3.12, biblioteki SciPy w wersji 1.17 do weryfikacji hipotez i obliczeń wielkości efektu oraz biblioteki statsmodels w wersji 0.14 do korekty współczynnika fałszywych odkryć według metody Benjamini-Hochberga.
  15. Podczas stosowania niniejszego protokołu w celu wygenerowania formalnego zbioru danych należy podać wielkości efektu (np. d Cohena) d (do porównań grupowych) wraz z wartościami p dla wszystkich testów statystycznych określonych w krokach 7.4–7.9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowa implementacja niniejszego protokołu powinna przynieść spójny wzorzec wyników behawioralno-molekularnych, nie wymagający interpretacji pojedynczego odczytu w izolacji. Pełna sekwencja eksperymentalna została przedstawiona na Rysunku 1, a aparatura NOR oraz projekt eksperymentalny pokazano na Rysunku 2. W grupie NSD myszy powinny wykazać wyraźną preferencję do nowego obiektu, co odzwierciedla wartość DI powyżej poziomu przypadku 0,5. Myszy poddane proto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy artykuł przedstawia szybkie i powtarzalne ramy badawcze do analizy deficytów pamięci rozpoznawczej oraz molekularnych zmian w hipokampie indukowanych ostrą deprywacją snu. Poprzez zastosowanie 5 h delikatnej manipulacji bezpośrednio po zestandaryzowanej, 10-minutowej fazie uczenia się, procedura ta celuje w określone okno konsolidacji po uczeniu i została zaprojektowana w celu zmniejszenia obciążenia fizycznego związanego z modelami przedłużonej deprywacji lub procedurami opartymi na wymuszonym ruchu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie stwierdzono konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Fundusz Kształcenia Młodzieży Szpitala Nanjing Drum Tower, Narodową Fundację Nauk Naturalnych Chin (Grant nr 82502706) oraz Podstawowy Program Badawczy prowincji Jiangsu (Grant nr BK20250258). Podczas przygotowywania i poprawiania tekstu rękopisu wykorzystano narzędzia wspomagane przez AI, w tym do redagowania i dopracowywania treści oraz tworzenia i udoskonalania schematów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70% etanoldowolny dostawcaN/ACzyszczenie areny i obiektów w teście rozpoznawania nowych obiektów (NOR)
Dorosłe samce myszy C57BL/6J (8–12 tygodni)Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.Brak danychZwierzęta doświadczalne
Zestaw do oznaczania białka metodą BCAThermo Fisher Scientific (Pierce)23225Oznaczanie i normalizacja całkowitej zawartości białka
Oprogramowanie do analizy behawioralnejNoldus Information Technology B.V.EthoVision XT wersja 17.5Punktacja i analiza eksploracji w teście rozpoznawania obiektów (NOR)
Wirówka umożliwiająca osiągnięcie 14 000 g × g at 4 °CEppendorfWirówka 5424 R; Kat. 5404000610Klarowanie homogenatów hipokampa
Czyste probówki papieroweDowolny dostawcaN/AInterwencja z zastosowaniem delikatnego obchodzenia
Kriogeniczne środki ochrony osobistejDowolny dostawcaNie dotyczyBezpieczne obchodzenie się z ciekłym azotem
Zestaw do oznaczania peroksydazy glutationowejAbcamab102530Oznaczanie ilościowe GPx
Homogenizator tkanki hipokampaIKA-Werke GmbH & Co. KGT 10 basic ULTRA-TURRAX; Kat. 0003737000Homogenizacja tkanki hipokampa w buforze lizującym
ciekły azotDowolny dostawcaBrak danychBłyskawiczne zamrażanie wypreparowanych hipokampów
Zestaw do oznaczania MDASigma-AldrichMAK085Oznaczanie ilościowe MDA
Czytnik płytek mikrotitracyjnychAgilent Technologies / BioTekSpektrofotometr do mikropłytek BioTek Epoch 2Pomiar absorbancji przy długościach fal określonych w zestawie
MikroszpatułkiDowolny dostawcaN/AWyobcowanie hipokampa; użyte schłodzone
Mysia IL-1β Zestaw ELISAR&Systemy DMLB00CIL-1β ilościowe oznaczenie
Zestaw ELISA do oznaczania IL-6 u myszyR&Systemy DM6000BOznaczanie ilościowe IL-6
Mysi TNF-α Zestaw ELISAR&Systemy DMTA00BTNF-α ilościowe oznaczenie
Zestawy obiektów A/A′ oraz BDowolny dostawcaN/DFazy zapoznawcze i testowe NOR
Nieprzezroczysta arena NOR (40 cm × 40 cm × 40 cm)Dowolny dostawcaNie dotyczyBadania behawioralne
System nadzorczego nagrywania wideoBasler AGacA1300-60gmNagranie wideo sesji zapoznawczej i testowej w badaniu rozpoznawania nowych obiektów (NOR)
Koktajl inhibitorów proteaz i fosfatazThermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)78440Dodano do buforu lizującego w 1× stężenie robocze (10 µL/mL z 100× roztwór zapasowy)
Bufor do lizy RIPAThermo Fisher Scientific89900Homogenizacja tkanki hipokampa
Probówki do próbek odpowiednie do przechowywania kriogenicznegoThermo Fisher Scientific (Nunc)Nunc CryoTube, 1,8 ml; Kat. 375418Utrzymanie specyficznych dla zwierząt identyfikatorów próbek oraz przechowywanie wypreparowanej tkanki hipokampa
Miękki pędzelDowolny dostawcaN/AInterwencja polegająca na delikatnym obchodzeniu się
Zestaw do oznaczania aktywności SODSigma-Aldrich19160Oznaczanie ilościowe SOD
Oprogramowanie do analizy statystycznej i mocy testówG*Power; Python Software FoundationG*Power wersja 3.1; Python wersja 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)Analiza mocy a priori oraz analizy statystyczne opisane w sekcji 7 protokołu
Standardowa karma dla gryzoniJiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.Dieta utrzymująca dla napromieniowanych szczurów/myszy; XTI01WC-010Karmienie zwierząt ad libitum
−80 °C zamrażarkaHaier BiomedicalDW-86L626Długoterminowe przechowywanie błyskawicznie zamrożonej tkanki hipokampa

Bibliografia

  1. Walker MP, Stickgold R. Sleep, memory, and plasticity. Annual Review of Psychology. 2006;57:139-166.
  2. Musiek ES, Holtzman DM. Mechanisms linking circadian clocks, sleep, and neurodegeneration. Science. 2016;354(6315):1004-1008.
  3. Havekes R, Abel T. The tired hippocampus: the molecular impact of sleep deprivation on learning and memory. Current Opinion in Neurobiology. 2017;44:33-39.
  4. Machado RB, Hipólide DC, Benedito-Silva AA, Tufik S. Sleep deprivation induced by the modified multiple platform technique: quantification of sleep loss and recovery. Brain Research. 2004;1004(1-2):45-51.
  5. Hagewoud R, et al. Sleep deprivation impairs spatial working memory and reduces clearance of hippocampal β-amyloid in rats. Neurobiology of Aging. 2013;34(1):22-30.
  6. Fenzl T, et al. Fully automated sleep deprivation in mice as a tool in sleep research. J Neurosci Methods. 2007;166(2):229-35.
  7. Ennaceur A, Delacour J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 1988;31(1):47-59.
  8. Leger M, et al. Object recognition test in mice. Nature Protocols. 2013;8(12):2531-2537.
  9. Palchykova S, et al. Sleep deprivation impairs object recognition in mice. Neurobiology of Learning and Memory. 2006;85(3):263-271.
  10. Wadhwa M, et al. Sleep deprivation induces spatial memory impairment by altered hippocampus neuroinflammation and microglia activation in rats. Journal of Neuroimmunology. 2011;238(1-2):14-23.
  11. Silva RH, et al. Role of hippocampal oxidative stress in memory deficits induced by sleep deprivation in mice. Neuropharmacology. 2016;104:1-8.
  12. Wang Y, et al. Ellagic acid ameliorates sleep deprivation-induced cognitive impairment and neuroinflammation in mice. Aging. 2020;12(10):10327-10340.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Model mysidelikatne manipulowaniecytokiny prozapalnemarkery stresu oksydacyjnegointerleukina-1 betaczynnik martwicy nowotworu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.