Artykuł badawczy

Celowanie w ferroptozę i kuproptozę w wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego: wyniki kompleksowej bioinformatyki i walidacji eksperymentalnej

80 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/73656

⸱

25 sierpnia 2026

 ,  ,  , 
1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2The Third Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie identyfikuje pięć biomarkerów związanych z kuproptozą i ferroptozą w colitis ulcerosa poprzez zintegrowane uczenie maszynowe, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek oraz walidację eksperymentalną, dostarczając informacji przydatnych w diagnostyce klinicznej i celowanej immunoterapii.

Streszczenie

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) jest przewlekłą chorobą jelit o nie w pełni zdefiniowanej patogenezie, charakteryzującą się rosnącą zapadalnością i wskaźnikiem hospitalizacji w nowo uprzemysłowionych krajach. W UC nadmierna śmierć komórek nabłonka jelitowego prowadzi do przerwania bariery śluzówkowej i wywołuje odpowiedzi zapalne. Ferroptoza i kuproptoza to dwie niedawno opisane formy regulowanej śmierci komórkowej. Większość badań nad UC analizowała te procesy oddzielnie; jednak ich połączona rola w progresji UC pozostaje niewystarczająco scharakteryzowana. Aby zbadać ich synergistyczną rolę w patogenezie UC, zastosowano podejście etapowe, obejmujące szerokoprofilowe analizy transkrypcyjne w celu identyfikacji potencjalnych celów, a następnie walidację w modelach in vitro. Geny różnicowo wyrażane (DEGs) zestawiono z genami związanymi z ferroptozą (FRGs) oraz genami związanymi z kuproptozą (CRGs). Wspólne cele zostały wyselekcjonowane przy użyciu konsensusu algorytmów uczenia maszynowego oraz analizy sieci współwyrażania genów z wagami (WGCNA). Pięć biomarkerów — LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 i CD274 — było znacząco nadekspresywnych w UC. Analiza jednokomórkowa pozwoliła scharakteryzować ich ekspresję w różnych typach komórek, przy czym LCN2 i NOS2 były przede wszystkim wzbogacone w komórkach nabłonkowych. Znaczenie mechanistyczne tych markerów oceniono dalej za pomocą testów in vitro. Leczenie inhibitorami ferroptozy lub kuproptozy łagodziło zapalenie związane z UC i modulowało ekspresję biomarkerów w modelach komórkowych Caco-2. Wyniki te identyfikują pięć biomarkerów związanych z progresją UC i dostarczają dowodów eksperymentalnych wspierających ich potencjalne zastosowanie w diagnostyce klinicznej i interwencjach terapeutycznych.

Wprowadzenie

Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (WZJG) to nawracająca zapalna choroba jelit, która wiąże się z rosnącym globalnym obciążeniem i znacznymi długoterminowymi kosztami leczenia1,2. Chociaż aminosalicylany, kortykosteroidy, leki biologiczne i terapie małocząsteczkowe poszerzyły opcje terapeutyczne, trwała remisja pozostaje trudna do osiągnięcia u wielu pacjentów3,4. Ta niezaspokojona potrzeba kliniczna podkreśla znaczenie identyfikacji powtarzalnych markerów molekularnych i dostępnych mechanizmów, które mogłyby wspomóc wcześniejszą diagnostykę oraz terapię ukierunkowaną na mechanizm choroby5.

Ferroptoza jest zależną od żelaza formą regulowanej śmierci komórki, indukowaną przez peroksydację lipidów, wyczerpanie glutationu oraz upośledzenie aktywności GPX46. Podwyższone poziomy żelaza i malondialdehydu w UC są zgodne z ferroptotycznym uszkodzeniem nabłonka, podczas gdy eksperymentalna aktywacja osi SLC7A11–GSH–GPX4 lub bezpośrednie hamowanie ferroptozy mogą chronić barierę jelitową7,8.

Kuproptoza, opisana w 2022 roku, jest wywoływana przez wiązanie miedzi z lipoilowanymi białkami mitochondrialnymi, co prowadzi do agregacji białek i stresu proteotoksycznego9. Ponieważ jelito odgrywa centralną rolę w gospodarce miedzią, zaburzenie tej ścieżki może nasilać utleniające i zapalne uszkodzenia nabłonka w UC10.

Ferroptoza i kuproptoza mogą zbiegać się poprzez zaburzenia równowagi jonów metali, metabolizm mitochondrialny, wyczerpanie zapasów glutationu oraz stres oksydacyjny11. Pozostaje jednak niejasne, czy ta interakcja generuje powtarzalną sygnaturę molekularną w UC oraz czy taka sygnatura reaguje na inhibicję specyficzną dla danej ścieżki.

Hipoteza badawcza zakładała, że zaburzony crosstalk między ferroptozą a kuproptozą w UC zbiega się w powtarzalnej sygnaturze biomarkerów, którą można wytypować w zbiorach danych transkrypcyjnych typu bulk i single-cell oraz osłabić poprzez specyficzne dla szlaku hamowanie w modelu uszkodzenia nabłonka jelitowego. W związku z tym zintegrowano bioinformatykę wielokohortową, uczenie maszynowe, analizę pojedynczych komórek oraz celowane eksperymenty na komórkach Caco-2, aby zidentyfikować i funkcjonalnie ocenić potencjalne biomarkery (Rysunek 1).

Schemat zintegrowanego projektu badania; odkrycia transkrypcyjne, ocena biomarkerów, walidacja eksperymentalna.
Rysunek 1: Schemat badania. Zintegrowany przepływ pracy dla wielkohortowego przesiewu transkrypcyjnego, priorytetyzacji biomarkerów w oparciu o uczenie maszynowe i sieci, lokalizacji na poziomie pojedynczych komórek oraz walidacji z użyciem inhibitorów w komórkach Caco-2. UC: colitis ulcerosa (nieswoiste zapalenie jelita grubego); GEO: Gene Expression Omnibus; WGCNA: ważona analiza sieci korelacjii ekspresji genów; PPI: oddziaływanie białko-białko; ROC: charakterystyka operacyjna odbiornika; GSEA: analiza wzbogacenia zestawu genów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

W badaniu wykorzystano publicznie dostępne zestawy danych oraz komercyjnie dostępne ludzkie linie komórkowe. Nie brali w nim udziału uczestnicy będący ludźmi, nie wykorzystano nowo pobranych tkanek ludzkich ani kręgowców; w związku z tym nie wymagano zgody instytucjonalnej komisji etyki. Narzędzia badawcze, oprogramowanie i zasoby online wykorzystane w protokole wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Przetwarzanie danych dla analizy ekspresji różnicowej

W celu stworzenia kohort odkrycia i walidacji transkrypcyjnej przeszukano bazę danych Gene Expression Omnibus (GEO) przy użyciu terminu „ulcerative colitis”. Cztery zbiory danych — GSE87466, GSE92415, GSE107499 oraz GSE75214 — posłużyły jako zestaw treningowy, natomiast GSE47908 zarezerwowano do walidacji zewnętrznej. Zbiory danych treningowych znormalizowano i poddano korekcie efektu serii za pomocą narzędzia ComBat w programie Sangerbox 3.0, natomiast zbiór walidacyjny przetworzono niezależnie.

Łącznie 583 genów związanych z ferroptozą (FRGs) pozyskano z bazy FerrDB, a następnie uzupełniono o geny opisane w literaturze w celu zredukowania błędu wynikającego z korzystania z jednego źródła12. Zbiór 96 genów związanych z kuproptozą (CRGs) zestawiono na podstawie opublikowanych badań12,13,14. Analizę różnicowej ekspresji przeprowadzono przy użyciu pakietu limma, przyjmując progi |log₂ fold change| > 1 oraz wartość P skorygowaną metodą Benjamini-Hochberga < 0,05. Wykresy diagnostyczne normalizacji, korekcji efektu serii, różnicowej ekspresji oraz klasteryzacji przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1. Skład próbek, wykorzystane platformy oraz przydziały kohort podano w Tabeli uzupełniającej 1.

2. Identyfikacja CF-DEG w UC

Analizę korelacji Pearsona przeprowadzono przy zastosowaniu progów |r| > 0,5 i P < 0,05 w celu zidentyfikowania współwyrażonych genów związanych z ferroptozą (FRGs) oraz genów związanych z kuproptozą (CRGs). Otrzymany zestaw genów zestawiono z genami o różnej ekspresji (DEGs), aby zidentyfikować współwyrażone geny o różnej ekspresji związane z kuproptozą i ferroptozą (CF-DEGs).

3. Analiza wzbogaceń

Analizy wzbogacenia według Gene Ontology (GO) oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) przeprowadzono przy użyciu narzędzia clusterProfiler oraz platformy Bioinformatics.com.cn. Jako próg istotności przyjęto wartość P < 0,05 po korekcie metodą Benjamini–Hochberga. Wykresy wzbogacenia przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 2.

4. Ważona analiza sieci koekspresji genów (WGCNA)

Strukturę modularną leżącą u podstaw profili ekspresji genów przeanalizowano za pomocą ważonej analizy sieci współekspresji genów (WGCNA). Próbki nieprawidłowe zidentyfikowano i wykluczono poprzez grupowanie hierarchiczne w połączeniu z funkcją goodSamplesGenes. Następnie wyznaczono odpowiednią wartość potęgi miękkiego progowania (β), aby spełnić kryterium topologii wolnej od skali niezbędne do konstrukcji sieci.

Przetworzone dane dotyczące ekspresji wykorzystano do skonstruowania macierzy nakładania topologicznego (TOM) na potrzeby analizy koekspresji genów. Z zastosowaniem metody dynamicznego cięcia drzewa geny o wysoce spójnych wzorcach ekspresji zorganizowano w moduły genowe, z których każdy zawierał co najmniej 100 genów. Powiązania między eigengenami modułów (ME) a fenotypami przeanalizowano w celu zidentyfikowania modułów związanych z procesem chorobowym i wyodrębnienia odpowiadających im zestawów genów. Diagnostyka przesiewowa WGCNA została przedstawiona na Rysunku uzupełniającym 3.

5. Wybór biomarkerów

Aby wyłonić priorytetowe kandydaty do dalszych badań eksperymentalnych, równolegle zastosowano trzy algorytmy uczenia maszynowego15. Regresja LASSO (least absolute shrinkage and selection operator) została wykorzystana do selekcji cech, las losowy (random forest) z ntree = 500 posłużył do określenia rangi istotności genów, a maszyna wektorów wspierających z rekurencyjną eliminacją cech (SVM-RFE) została użyta do zidentyfikowania podzbioru cech z najniższym błędem walidacji krzyżowej. Pełna diagnostyka przesiewowa znajduje się na Rysunku uzupełniającym 5.

Znaczenie genów oceniano na podstawie wkładu poszczególnych genów w dokładność klasyfikacji, a geny o najwyższej randze zostały wyselekcjonowane w celu stworzenia wstępnego zestawu genów16. Algorytm SVM-RFE przeprowadził przesiewanie cech i optymalizację modelu poprzez iteracyjną eliminację cech, co pozwoliło na identyfikację optymalnego podzbioru cech dla klasyfikacji17. Geny wspólne dla trzech algorytmów uznano za potencjalne biomarkery zidentyfikowane za pomocą uczenia maszynowego.

Wykorzystano CF-DEG do skonstruowania sieci oddziaływań białko-białko (PPI), a następnie użyto narzędzia CytoHubba do rankingowania węzłów kluczowych. Przecięcie kluczowych modułów WGCNA, trzech wyników uczenia maszynowego oraz zestawu rdzeniowego PPI pozwoliło zdefiniować pięć zintegrowanych potencjalnych biomarkerów: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 oraz CD274. Geny te sklasyfikowano jako diagnostyczne kandydatów związanych z UC. W dalszych eksperymentach z inhibitorami LCN2, IDO1, CXCL2 i NOS2 sklasyfikowano jako markery reagujące na hamowanie ferroptozy, natomiast CD274 jako marker reagujący na hamowanie kuproptozy. Geny te nie zostały uznane za udowodnionych regulatorów nadrzędnych żadnej z tych ścieżek.

6. Opracowanie modelu prognostycznego i ewaluacja wielometodowa

Aby ocenić potencjał translacyjny w zastosowaniach klinicznych zidentyfikowanej sygnatury genów, przy użyciu pakietu rms skonstruowano nomogram służący do oceny skuteczności diagnostycznej. Wydajność modelu oceniono za pomocą krzywej kalibracyjnej, testu Hosmera–Lemeshow (HL) oraz indeksu zgodności Harrella (C-index).

Kalibrację modelu oceniono za pomocą testu HL oraz średniego błędu bezwzględnego (MAE). Przyjęto, że wartość P > 0,05 oraz MAE < 0,1 będą odpowiednio progami akceptowalnego dopasowania i dokładności modelu. Wygenerowano krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) oraz obliczono pole pod krzywą (AUC), aby ocenić wydajność prognostyczną nomogramu dla UC. Do oceny generalizacji i stabilności modelu wykorzystano niezależny zbiór danych.

7. Analiza wzbogacenia zbiorów genów (GSEA)

W zbiorze treningowym przeprowadzono analizę korelacji Spearmana pomiędzy każdym biomarkerem a wszystkimi pozostałymi genami. Wyniki korelacji zostały uszeregowane w celu wygenerowania uporządkowanego zbioru genów. Analizę wzbogacenia zbiorów genów (GSEA) przeprowadzono z wykorzystaniem zbioru genów c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols z bazy Molecular Signatures Database (MSigDB) jako referencyjnego. Ścieżki biologiczne z P < 0,05 uznano za istotnie wzbogacone.

8. Analiza krajobrazu immunologicznego

Narzędzie CIBERSORT oraz macierz sygnatur LM22 zostały wykorzystane do przeprowadzenia analizy dekonwolucji danych ekspresyjnych i oszacowania proporcji 22 podtypów komórek odpornościowych. Następnie przeprowadzono analizę korelacji Spearmana w celu oceny powiązań między pięcioma biomarkerami a podtypami komórek odpornościowych.

9. Analiza sieci regulacyjnych

Informacje na temat regulacji przez czynniki transkrypcyjne (TF) oraz mikroRNA (miRNA) powiązane z genami uzyskano z zintegrowanych baz danych ChEA3 i TarBase 9.0 za pośrednictwem platformy NetworkAnalyst. Do sieci regulacyjnej włączono miRNA powiązane z co najmniej dwoma węzłami.

10. Sekwencjonowanie RNA z pojedynczych komórek (Single-cell RNA-seq)

Zintegrowano zbiory danych z pojedynczych komórek dla UC: GSE116222, obejmujący trzy próbki zdrowych i trzy próbki z UC, oraz GSE214695, obejmujący sześć próbek zdrowych i sześć próbek z UC. Zachowano komórki, w których wykryto 200–5 000 genów, >1 000 unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI), < 30% transkryptów mitochondrialnych, < 3% transkryptów hemoglobiny oraz < 50% transkryptów rybosomalnych. Do normalizacji wykorzystano funkcję NormalizeData, a do korekty efektu seryjnego przed klastrowaniem i adnotacją zastosowano narzędzie Harmony.

Po filtrowaniu dane zostały znormalizowane przy użyciu funkcji NormalizeData. Do minimalizacji efektu serii pomiędzy próbkami wykorzystano algorytm Harmony. W celu redukcji wymiarowości i klastrowania komórek, aby scharakteryzować struktury lokalne i globalne w obrębie populacji komórek, zastosowano metodę UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) oraz t-SNE (t-distributed Stochastic Neighbor Embedding). Do dalszych analiz zachowano łącznie 31 712 wysokiej jakości komórek. Typy komórek przypisano na podstawie kanonicznych genów markerowych dla poszczególnych typów komórek.

Analizę czasu pseudoczynnościowego (pseudotime) przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Monocle 2 w celu zbadania zmian w stanach komórek nabłonkowych i mieloidalnych z tkanek UC. Ewaluowano trajektorie rozwoju komórek oraz różnice między grupami, a następnie zwizualizowano wzorce ekspresji biomarkerów wzdłuż trajektorii czasu pseudoczynnościowego.

Do oceny komunikacji międzykomórkowej pomiędzy subpopulacjami komórek nabłonkowych i mieloidalnych wykorzystano narzędzie CellChat. Zintegrowano wzorce ekspresji specyficzne dla poszczególnych subpopulacji, aby wywnioskować prawdopodobieństwa oddziaływań oraz kluczowe szlaki sygnalizacyjne między komórkami nabłonkowymi a mieloidalnymi i scharakteryzować ich potencjalne sieci regulacji międzykomórkowej.

11. Eksperymenty komórkowe

Ludzkie komórki raka gruczołowego jelita grubego Caco-2 hodowano w pożywce Dulbecco’s modified Eagle zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂. Komórki Caco-2 wybrano jako powtarzalny model nabłonkowej monowarstwy do testów bariery jelitowej i uszkodzeń zapalnych; jednak ich nowotworowe pochodzenie ogranicza bezpośrednią generalizację wyników na nienowotworowy nabłonek jelita grubego. Informacje o pasażowaniu nie były dostępne w archiwalnych zapisach eksperymentalnych.

Model stanu zapalnego i uszkodzenia in vitro opracowano poprzez narażenie komórek na 1 µg/mL lipopolisarydu (LPS) przez 24 h. Komórki przydzielono do grupy kontrolnej z nośnikiem w postaci dimetylosulfoksydu, grupy z samym LPS, grupy z LPS + 4 µM ferrostatiny-1 lub grupy z LPS + 40 µM tetratiomolibdanu, przy zachowaniu dopasowanych końcowych stężeń rozpuszczalnika. Grupa z samym LPS służyła jako pozytywna kontrola uszkodzenia/modelu do porównań z grupami z zastosowaniem inhibitorów.

  1. Żywotność komórek
    Żywotność komórek oceniono za pomocą testu żywotności komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez około 2 h zmierzono absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  2. Pomiar poziomów MDA i Fe²⁺
    Wewnątrzkomórkowe poziomy malondialdehydu (MDA) i Fe2⁺ zmierzono przy użyciu odpowiednich zestawów testowych zgodnie z instrukcjami producentów. Całkowite białko oznaczono metodą kwasu bicinchoninowego, a każdy odczyt znormalizowano do zawartości białka w odpowiedniej próbce.
  3. Analiza z użyciem fluorescencyjnej sondy jonów miedzi
    Po usunięciu pożywki hodowlanej dodano specyficzną dla Cu2⁺ sondę fluorescencyjną w końcowym stężeniu 1 µM i inkubowano przez 30 min w temperaturze 37 °C. Obrazy pozyskano natychmiast, bez przemywania, za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 510 i 578 nm. Parametry akwizycji pozostały stałe dla wszystkich grup, a skala obrazu została skalibrowana na 50 µm.
  4. RT-qPCR
    Całkowite RNA wyizolowano przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA opartego na fenolu i guanidynium. Komplementarne DNA zsyntetyzowano z 1 µg RNA przy użyciu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA, natomiast do reakcji PCR w czasie rzeczywistym wykorzystano odczynniki oparte na SYBR Green. Każdą reakcję przeprowadzono w trzech powtórzeniach technicznych. Sekwencje starterów podano w Tabeli uzupełniającej 2, a względną obfitośćt mRNA obliczono metodą 2⁻ΔΔCt.

12. Analiza statystyczna

Normalność rozkładu oraz jednorodność wariancji oceniono odpowiednio za pomocą testów Shapiro–Wilka oraz Levene'a z centrowaniem do mediany. Dane spełniające oba założenia analizowano za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t lub jednoczynnikowej analizy wariancji, a następnie testu Tukey’a (HSD). W przypadku niespełnienia któregokolwiek z założeń stosowano test t Welcha lub analizę wariancji Welcha, a następnie porównania Gamesa–Howella.

Wyniki przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Rzeczywista liczba powtórzeń biologicznych, dokładne dwustronne wartości P oraz weryfikacje założeń zostały zamieszczone w Tabeli uzupełniającej 3. Zarchiwizowane arkusze źródłowe dla Ryciny 13 zawierają mniejszą liczbę powtórzeń kontrolnych dla paneli A (n = 4), C (n = 4) i F (n = 2), podczas gdy wszystkie pozostałe kombinacje paneli/grup obejmują n = 6.

Analizy obliczeniowe przeprowadzono przy użyciu programu R oraz narzędzi limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC, rms, Seurat v4, Harmony, Monocle 2, CellChat oraz Cytoscape/CytoHubba. Wykorzystano zasoby internetowe, takie jak FerrDB, GEO, STRING, ChEA3, TarBase 9.0, NetworkAnalyst, CIBERSORT/LM22, MSigDB, Bioinformatics.com.cn oraz Sangerbox 3.0.

Wyniki

Identyfikacja i adnotacja funkcjonalna genów współwyrażanych w procesach kuproptozy i ferroptozy

Zintegrowano cztery zestawy danych treningowych obejmujące 421 próbek UC oraz 97 zdrowych kontroli. Zidentyfikowano łącznie 551 genów o zróżnicowanej ekspresji, w tym 362 genów o zwiększonej i 189 genów o zmniejszonej ekspresji. Analiza korelacji wykazała 444 genów skorelowanych z ferroptozą i kuproptozą, a ich część wspólna z genami o zróżnicowanej ekspresji pozwoliła wyłonić 32 współwyrażonych genów o zróżnicowanej ekspresji związanych z kuproptozą i ferroptozą (CF-DEGs).

32 CF-DEG były wzbogacone w odpowiedzi na zranienie, jony miedzi, transport kwasów tłuszczowych, lipopolisacharyd, nieswoiste zapalenie jelit, sygnalizację NF-κB, sygnalizację TNF oraz ferroptozę (Tabela uzupełniająca 4).

Priorytetyzacja kluczowych biomarkerów poprzez zintegrowane uczenie maszynowe i WGCNA

Analiza ważonej sieci koekspresji genów (WGCNA) wykazała, że moduły MEpurple, MEbrown i MEblack są najsilniej powiązane z UC. Wybrane moduły zawierały łącznie 1 426 genów (Tabela uzupełniająca 5).

Metody least absolute shrinkage and selection operator (LASSO), support vector machine–recursive feature elimination (SVM-RFE) oraz random forest wyłoniły odpowiednio 21, 32 i 19 cech. Trzynaście genów było wspólnych dla wszystkich trzech modeli. Integracja konsensusu uczenia maszynowego, rdzenia oddziaływań białko-białko uszeregowanego przez CytoHubba oraz wybranych modułów WGCNA pozwoliła wyłonić pięć potencjalnych biomarkerów związanych z UC: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 oraz CD274.

Ocena diagnostyczna i wzbogacenie szlaków sygnatury biomarkerów

Wszystkie pięć kandydackich biomarkerów wykazało dodatnią korelację i podwyższony poziom w przypadku UC w kohorcie treningowej (Rysunek 2A, B). Każdy marker osiągnął pole pod krzywą charakterystyki ROC > 0,80 w kohorcie treningowej oraz > 0,75 w niezależnej kohorcie walidacyjnej GSE47908 (Rysunek 2C–E).

Nomogram oparty na pięciu genach wykazał korzystną kalibrację, z wartością P testu Hosmera–Lemeshow > 0,05 oraz średnim błędem absolutnym < 0,1, a także dobrą dyskryminację w analizowanej kohorcie, z polem pod krzywą i indeksem zgodności wynoszącymi 0,945 oraz 95% przedziałem ufności dla indeksu zgodności wynoszącym 0,922–0,968 (Rysunek 3).

Analiza wzbogacenia zestawów genów powiązała pięć kandydatów ze szlakami sygnalizacyjnymi JAK–STAT, interferon–RIPK1/3 oraz Toll-like receptor–NF-κB (Rysunek 4).

Wykresy analizy ekspresji genów; wykresy kołowe, krzywe ROC i wykresy pudełkowe dla porównania UC z grupą zdrową.
Rycina 2: Ekspresja potencjalnych biomarkerów i ich skuteczność diagnostyczna. (A) Mapa ciepła korelacji. (B, C) Ekspresja biomarkerów i krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) w kohorcie treningowej. (D, E) Ekspresja biomarkerów i krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) w kohorcie walidacyjnej GSE47908. ROC: charakterystyka operacyjna odbiornika; AUC: powierzchnia pod krzywą; UC: wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Diagram nomogramu, krzywa kalibracyjna i analiza ROC dla oceny modelu predykcyjnego.
Rycina 3: Opracowanie i ocena nomogramu UC. (A) Nomogram pięciu genów. (B) Wykres kalibracyjny. (C) Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika. ROC: receiver operating characteristic; UC: ulcerative colitis; AUC: area under the curve; C-index: concordance index. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy wzbogacenia zestawów genów; rangi vs. wyniki wzbogacenia; zestawy danych porównawczych.
Rycina 4: Analiza wzbogacenia zestawów genów dla pięciu potencjalnych biomarkerów. (A–E) Wyniki analizy wzbogacenia zestawów genów odpowiednio dla LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 i CD274. GSEA: analiza wzbogacenia zestawów genów (gene set enrichment analysis). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza krajobrazu mikrośrodowiska immunologicznego i sieci regulacyjnych

W próbkach UC odnotowano zwiększony odsetek neutrofili, aktywowanych komórek T pamięci CD4⁺, makrofagów M1 oraz aktywowanych komórek tucznych, przy jednoczesnym spadku liczby makrofagów M2, spoczynkowych komórek tucznych oraz spoczynkowych komórek dendrytycznych. Wzorce te zostały powtórzone w kohorcie walidacyjnej (Rycina 5A–E).

Pięć kandydatów korelowało dodatnio z neutrofilami, aktywowanymi komórkami T pamięci CD4⁺ oraz makrofagami M1, a odwrotnie z spoczynkowymi komórkami tucznymi i makrofagami M2 (Rysunek 5F–J). Sieć gen-miRNA zawierała 98 węzłów i 146 krawędzi. hsa-miR-34a-5p oraz hsa-miR-16-5p wykazywały najwyższą łączność biomarkerów, natomiast AR i RELA były najlepiej połączonymi czynnikami transkrypcyjnymi (Rysunek 6).

Skład komórek odpornościowych i mapy ciepła korelacji; wykresy analityczne wizualizujące dane dotyczące ekspresji genów.
Rycina 5: Analiza infiltracji immunologicznej. (A) Skład komórek odpornościowych. (B) Różnice w proporcjach komórek odpornościowych między grupami. (C) Mapa ciepła korelacji komórek odpornościowych. (D, E) Infiltracja komórek odpornościowych w kohortach treningowej i walidacyjnej. (F–J) Korelacje między potencjalnymi biomarkerami a populacjami komórek odpornościowych. UC: wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat interakcji sieci genów; podkreśla interakcje białek i analizę szlaków regulacyjnych.
Rycina 6: Przewidywane sieci miRNA i czynników transkrypcyjnych. (A) Sieć gen–miRNA. Koła oznaczają potencjalne biomarkery, a kwadraty oznaczają miRNA. (B) Sieć czynnik transkrypcyjny–gen. Rąby oznaczają potencjalne biomarkery, a odwrócone trójkąty oznaczają czynniki transkrypcyjne. miRNA: mikroRNA; TF: czynnik transkrypcyjny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dynamika ekspresji czasowo-przestrzennej w rozdzielczości pojedynczych komórek

Po kontroli jakości 31 712 komórek utworzyło 22 klastry, które zinterpretowano jako dziewięć głównych populacji komórek (Rysunek 7A–C). Proporcje komórek nabłonkowych i plazmocytów były wyższe w przypadku UC. LCN2 i NOS2 były wzbogacone w komórkach nabłonkowych, natomiast IDO1, CXCL2 i CD274 były wzbogacone w komórkach mieloidalnych (Rysunek 7D–G).

Subklastrowanie komórek nabłonkowych zidentyfikowało 11 podzbiorów, z ekspansją zapalnych kolonocytów oraz wzbogaceniem o LCN2 i NOS2 w tym podzbiorze (Rysunek 8). Subklastrowanie komórek mieloidalnych zidentyfikowało siedem podzbiorów, z zwiększoną liczbą monocytów, zmniejszoną liczbą makrofagów oraz wzbogaceniem o IDO1, CXCL2 i CD274 w monocytach (Rysunek 9).

Zapalnie zmienione kolonocyty gromadziły się w późnej fazie trajektorii nabłonkowej, wykazując zwiększoną ekspresję LCN2 i NOS2 (Rycina 10). Monocyty wykazały odrębną trajektorię związaną z UC, z dynamiczną ekspresją IDO1, CXCL2 i CD274 (Rycina 11).

Kolonocyty zapalne wykazały najsilniejszą sygnalizację wychodzącą i wyraźną komunikację z monocytami. APP–CD74 była główną parą ligand-receptor pomiędzy tymi podgrupami (Rysunek 12).

Diagram klastrowania UMAP i wykres kropkowy przedstawiający rozkład typów komórek i ekspresję genów w próbkach.
Rysunek 7: Ekspresja potencjalnych biomarkerów w populacjach komórek. (A) Klastry komórkowe. (B) Markery adnotacyjne. (C) Dziewięć adnotowanych populacji komórek. (D, E) Rozkłady i proporcje komórek w próbkach zdrowych i z UC. (F, G) Ekspresja potencjalnych biomarkerów zwizualizowana za pomocą UMAP i wykresu pęcherzykowego. UC: colitis ulcerative (wrzodziejące zapalenie jelita grubego); UMAP: uniform manifold approximation and projection. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Klastrowanie t-SNE i analiza typów komórek nabłonkowych; wykres i mapa ciepła przedstawiające wzorce danych.
Rysunek 8: Subklastrowanie komórek nabłonkowych i ekspresja kandydacka. (A) Początkowe klastry komórek nabłonkowych. (B) Markery adnotacji. (C) Adnotowane podzbiory komórek nabłonkowych. (D) Proporcje podzbiorów w próbkach zdrowych i z UC. (E) Ekspresja LCN2 i NOS2 w podzbiorach komórek nabłonkowych. t-SNE: t-distributed stochastic neighbor embedding; UC: ulcerative colitis. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza klastrów t-SNE i wykres słupkowy klastrów mieloidalnych; ekspresja immunologiczna; sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek.
Rysunek 9: Subklasteryzacja komórek mieloidalnych i ekspresja kandydatów. (A) Początkowe klastry komórek mieloidalnych. (B) Markery adnotacji. (C) Adnotowane podgrupy komórek mieloidalnych. (D) Proporcje podgrup w próbkach zdrowych i z UC. (E) Ekspresja IDO1, CXCL2 i CD274 w podgrupach komórek mieloidalnych. t-SNE: t-distributed stochastic neighbor embedding; UC: wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wyniki redukcji wymiarowości i klastrowania, przedstawiające mapowanie komponentów i wykresy analizy pseudoczasu.
Rycina 10: Analiza pseudoczasu komórek nabłonkowych. (A) Trajektoria pseudoczasu i przypisania stanów. (B) Rozkład zdrowych komórek nabłonkowych i komórek nabłonkowych z UC wzdłuż trajektorii. (C) Dynamika ekspresji LCN2 i NOS2 wzdłuż pseudoczasu. UC: wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres dopasowania widma; analiza danych dotycząca zależności między komponentami; wyniki globalnego dopasowania analizy.
Rysunek 11: Analiza pseudoczasu komórek mieloidalnych. (A) Trajektoria pseudoczasu i przypisanie stanów. (B) Rozkład zdrowych komórek mieloidalnych oraz komórek mieloidalnych z UC wzdłuż trajektorii. (C) Dynamika ekspresji IDO1, CXCL2 i CD274 wzdłuż pseudoczasu. UC: wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Sieci oddziaływań białkowych i siła oddziaływań; wyniki danych przedstawione na wykresach rozrzutu i mapach ciepła.
Rycina 12: Komunikacja nabłonkowa–mieloidalna. (A) Liczba i siła oddziaływań. (B) Siła sygnałów wychodzących i przychodzących. (C) Oddziaływania z udziałem zapalnych kolonocytów. (D) Mapa ciepła siły komunikacji. (E) Pary ligand–receptor z udziałem zapalnych kolonocytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

In vitro walidacja eksperymentalna interwencji w procesy ferroptozy i kuproptozy

Ekspozycja na lipopolisacharyd (LPS) zmniejszyła żywotność komórek Caco-2 i zwiększyła ekspresję IL-6 oraz IL-1β w porównaniu do kontroli nośnika (Rysunek 13A–C oraz Rysunek uzupełniający 5).

LPS zwiększył poziom Fe2⁺, malondialdehydu oraz obfitość mRNA LCN2, IDO1, CXCL2 i NOS2, natomiast ferrostatin-1 odwrócił każdą ze zmian powiązanych z LPS (Rysunek 13D–I). W porównaniach LPS versus LPS + ferrostatin-1, dokładne dwustronne wartości P mieściły się w zakresie od 9,45 × 10⁻5 do 0,0027 po uśrednieniu powtórzeń technicznych w obrębie każdego powtórzenia biologicznego.

LPS zmniejszył żywotność oraz zwiększył poziom IL-6, IL-1β, FDX1/DLAT, CD274 i fluorescencję wrażliwą na miedź, podczas gdy tetratiomolibdan odwrócił te zmiany (Rysunek 14 A–E). W przypadku porównań LPS versus LPS + tetratiomolibdan, dokładne dwustronne wartości P mieściły się w zakresie od < 1 × 10⁻15 do 0,0008.

Przeprowadzone analizy pozwoliły na zidentyfikowanie pięciu potencjalnych markerów diagnostycznych związanych z UC, zlokalizowano ich ekspresję w populacjach nabłonkowych i mieloidalnych oraz wykazano, że LCN2, IDO1, CXCL2 i NOS2 reagowały na hamowanie ferroptozy, podczas gdy CD274 reagował na chelację miedzi w komórkach Caco-2.

Schematy żywotności komórek i ekspresji mRNA porównujące grupy kontrolną, LPS oraz LPS+Fer.
Rycina 13: Ferrostatin-1 łagodzi związane z LPS zmiany zapalne i związane z ferroptozą w komórkach Caco-2. (A) Żywotność komórek. (B, C) Ekspresja matrycowego RNA IL-6 i IL-1β. (D, E) Wewnątrzkomórkowe poziomy malondialdehydu i Fe2⁺. (F–I) Ekspresja matrycowego RNA LCN2, IDO1, CXCL2 i NOS2. Średnie z powtórzeń technicznych wyliczono dla każdego niezależnego powtórzenia biologicznego; słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Dostępna liczba powtórzeń biologicznych wynosiła Control n = 4 w panelach A i C, Control n = 2 w panelu F oraz n = 6 dla wszystkich pozostałych kombinacji paneli/grup. Dokładne dwustronne wartości P oraz weryfikacja założeń zostały przedstawione w Tabeli uzupełniającej 5. Fer-1: ferrostatin-1; LPS: lipopolisacharyd; MDA: malondialdehyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe przeżywalności komórek i ekspresji mRNA; mikroskopia ukazująca rozkład sondy miedziowej.
Rysunek 14: Tetratiomolibdat łagodzi zmiany zapalne związane z LPS oraz zmiany związane z kuproptozą w komórkach Caco-2. (A) Przeżywalność komórek. (B, C) Ekspresja matrycowego RNA dla IL-6 i IL-1β. (D) Ekspresja matrycowego RNA dla FDX1 i DLAT. (E) Ekspresja matrycowego RNA dla CD274. (F) Wewnątrzkomórkowa fluorescencja Cu2⁺; pasek skali = 50 µm. Średnie z triplikatów technicznych wyznaczono dla każdego z sześciu niezależnych powtórzeń biologicznych w grupie; słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Dokładne dwustronne wartości P oraz weryfikacja założeń są przedstawione w Tabeli uzupełniającej 5. TTM: tetratiomolibdat; LPS: lipopolisacharyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Surowe i przetworzone dane, skrypty analiz oraz arkusze źródłowe eksperymentów komórkowych są publicznie dostępne pod adresem https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720.

Rysunek uzupełniający 1: Wstępne przetwarzanie danych i diagnostyka ekspresji różnicowej. (A–F) Rozkłady próbek przed (A–C) i po (D–F) korekcie efektu serii. (G) Wykres wulkaniczny genów o różnej ekspresji. (H) Mapa ciepła znormalizowanych wzorców ekspresji. DEGs: geny o różnej ekspresji; GEO: Gene Expression Omnibus.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Analiza wzbogacenia CF-DEGs. (A) Wzbogacenie Gene Ontology. (B) Wzbogacenie Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. CF-DEGs: geny różnicowo wyrażone współwyrażane w procesach kuproptozy i ferroptozy; GO: Gene Ontology; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Diagnostyka przesiewowa WGCNA. (A) Wybór miękkiego progu (soft-threshold). (B) Klasteryzacja eigen-genów modułów. (C) Dendrogram gen-moduł. (D) Powiązania moduł–cecha. (E–G) Relacje znaczenia genu/przynależności do modułu dla modułów fioletowego, brązowego i czarnego. WGCNA: weighted gene co-expression network analysis; UC: ulcerative colitis.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Wieloetapowe przesiewanie biomarkerów. (A, B) Wybór cech metodą LASSO. (C, D) Wybór cech metodą SVM-RFE. (E, F) Ranking cech metodą Random-forest. (G) Konsensus pomiędzy trzema modelami. (H, I) Sieć PPI i węzły kluczowe CytoHubba. (J) Integracja wyników uczenia maszynowego, WGCNA i PPI. (K) Lokalizacja chromosomalna pięciu kandydatów. LASSO: least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE: support vector machine–recursive feature elimination; RF: random forest; PPI: protein–protein interaction; WGCNA: weighted gene co-expression network analysis.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 5: Walidacja modelu LPS w komórkach Caco-2. (A) Żywotność komórek. (B, C) Ekspresja matrycowego RNA dla IL-6 i IL-1β. Średnie z powtórzeń technicznych obliczono dla sześciu niezależnych powtórzeń biologicznych w każdej grupie; słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe. LPS: lipopolisacharyd.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Zbiory danych GEO wykorzystane do odkrycia i walidacji. Numery dostępowe do zbiorów danych, platformy, skład próbek i przypisania do kohort dla zbiorów danych GEO uwzględnionych w analizach odkrycia i walidacji. GEO: Gene Expression Omnibus.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Sekwencje starterów do ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją. Sekwencje starterów użytych do analizy ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją genów ocenianych w niniejszym badaniu.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Szczegóły statystyczne dla Rysunków 13, 14 oraz Rysunku uzupełniającego 1. Liczba powtórzeń biologicznych, weryfikacja założeń, metody analizy statystycznej i dokładne wartości P dla wskazanych porównań eksperymentalnych.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Geny różnicowo eksprymowane współwyrażane w procesach kuproptozy i ferroptozy. Lista CF-DEGów zidentyfikowana poprzez wyznaczenie części wspólnej genów skorelowanych z ferroptozą i kuproptozą oraz genów różnicowo eksprymowanych.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 5: Geny w modułach WGCNA wybrane do przesiewowego badania biomarkerów. Lista genów zawartych w modułach WGCNA wybranych do późniejszego przesiewowego badania biomarkerów. WGCNA: ważona analiza sieci współekspresji genów.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Badanie to zintegrowało transkryptomikę masową, uczenie maszynowe, analizę pojedynczych komórek oraz ukierunkowane eksperymenty komórkowe w celu zbadania interakcji między ferroptozą a kuproptozą w UC. Pięć diagnostycznych kandydatów powiązanych z UC wykazano powtarzalnie w kohortach odkrywczych i walidacyjnych; zlokalizowano je głównie w przedziałach nabłonkowych i mieloidalnych, a w komórkach Caco-2 wykazały one ekspresję reagującą na hamowanie szlaków. Wyniki te wspierają etapowy schemat pracy, w którym priorytetyzacja obliczeniowa kieruje ukierunkowaną walidację biologiczną, unikając jednocześnie zbyt daleko idącego twierdzenia, że pięć tych genów jest uznanymi regulatorami nadrzędnymi ferroptozy lub kuproptozy.

CF-DEGs były wzbogacone w odpowiedzi na lipopolisacharyd, gospodarkę miedzią, transport lipidów, sygnalizację NF-κB/TNF oraz ferroptozę, co wskazuje na spójny związek między zależnym od metali stresem oksydacyjnym a zapaleniem błony śluzowej10,19.

Pięć wybranych kandydatów zajmuje komplementarne konteksty zapalne i stresu metalicznego. LCN2 wiąże sekwestrację żelaza, dysbiozę mikrobiologiczną oraz oś ferroptozy LCN2–ALOX1520,21,22,23; IDO1 łączy metabolizm tryptofanu, zapalenie błon śluzowych i zaburzenia gospodarki żelazem24,25,26; a CXCL2 wiąże sygnalizację IL-17/IL-22, rekrutację neutrofili i peroksydację lipidów27,28,29,30. NOS2 wykazuje efekty zależne od kontekstu, lecz może potęgować uszkodzenia oksydacyjne i podatność na ferroptozę w przypadku nadmiernej indukcji31,32,33,34,35,36. CD274 jest immunoregulacyjnym markerem nabłonkowym, którego zależność od FDX1 i wrażliwość na jonofory miedzi sugerują reaktywność na kuproptozę, a nie kontrolę nad ustalonym szlakiem37,38,39. Eksperymenty z inhibitorami były zgodne z tymi klasyfikacjami: ferrostatin-1 obniżył poziom LCN2, IDO1, CXCL2 i NOS2, natomiast tetrathiomolybdate obniżył poziom CD274.

Analiza immunologiczna dodatkowo powiązała kandydowaną sygnaturę z makrofagami M1, neutrofilami, aktywowanymi komórkami T pamięci CD4⁺ oraz aktywowanymi komórkami tucznymi, z których wszystkie mogą podtrzymywać uszkodzenie nabłonka poprzez cytokiny, reaktywne formy tlenu i sygnalizację zaburzającą barierę40,41,42,43,44. RELA, hsa-miR-34a-5p oraz hsa-miR-16-5p okazały się prawdopodobnymi regulatorami nadrzędnymi, podczas gdy dowody na bezpośrednią rolę receptora androgenowego w UC pozostają ograniczone45,46,47,48,49,50. Wyniki te należy interpretować jako hipotezy na poziomie sieci dla przyszłych eksperymentów perturbacyjnych, a nie jako dowód bezpośredniej regulacji.

Analiza pojedynczych komórek wykazała lokalizację LCN2 i NOS2 w zapalnych kolonocytach, a IDO1, CXCL2 i CD274 w populacjach mieloidalnych bogatych w monocyty. Przewidywano, że zapalne kolonocyty pełnią rolę centrów komunikacyjnych, przy czym APP–CD74 znajduje się wśród głównych par ligand–receptor w interakcjach nabłonkowo-mieloidalnych51,52,53,54,55,56. Taka rozdzielczość typów komórek zawęża kontekst biologiczny, w którym należy przetestować pięć kandydatów, i wskazuje na systemy kokultur lub organoidów z komórkami odpornościowymi jako kolejny krok eksperymentalny.

Interpretację ograniczają pewne zastrzeżenia. Linia komórkowa Caco-2 jest linią gruczolakoraka jelita grubego i nie odzwierciedla w pełni nienowotworowego nabłonka jelita grubego, heterogeniczności pacjentów, interakcji między stromą a układem odpornościowym ani chronicznego UC; w związku z tym konieczna jest walidacja w pierwotnych komórkach nabłonka jelitowego, organoidach pochodzących od pacjentów, systemach kokultur oraz w modelach zapalenia jelit in vivo. W zarchiwizowanym arkuszu źródłowym dla Ryciny 13 brakowało również niektórych rekordów powtórzeń kontrolnych w panelach A, C i F, co obniżyło precyzję tych porównań; wszystkie dostępne liczby powtórzeń i dokładne wartości P podano w Tabeli uzupełniającej 5. Wreszcie wiek, płeć, ekspozycja na leczenie oraz inne współzmienne kliniczne nie były jednolicie dostępne we wszystkich kohortach publicznych. Do ustalenia użyteczności diagnostycznej i ról przyczynowych wymagane będą prospektywne kohorty wieloośrodkowe oraz bezpośrednia perturbacja pięciu kandydatów. W ramach tych ograniczeń badanie dostarcza przejrzystego, zakotwiczonego eksperymentalnie zestawu hipotez łączących zależną od metali śmierć komórek, komunikację mieloidalną nabłonka oraz UC. Porównawcze badania z zakresu farmakologii sieciowej w raku prostaty ilustrują wartość generowania hipotez poprzez komputerową priorytetyzację celów, lecz nie stanowią walidacji specyficznej dla UC57. Podobnie, niedawna dyskusja na temat ferroptozy w chorobie zwyrodnieniowej stawów i degeneracji kości odzwierciedla szersze zainteresowanie terapeutyczne modulacją ferroptozy, choć mechanizmy specyficzne dla danej choroby nie mogą być bezpośrednio ekstrapolowane na UC58. Walidację w kohortach zewnętrznych oraz eksperymenty z inhibitorami wykorzystano zatem w celu wzmocnienia, lecz nie nadmiernego wyolbrzymienia, powiązań bioinformatycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana przez projekt Young Qihuang Scholar National Administration of Traditional Chinese Medicine (Grant nr 2022256). Wyrażamy wdzięczność wszystkim członkom zespołów badawczych z Liaoning University of Traditional Chinese Medicine oraz Third Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine za wsparcie techniczne oraz wkład w opracowanie danych i analizę bioinformatyczną.

Podczas redakcji wykorzystano OpenAI Codex (OpenAI) wyłącznie w celu pomocy w korekcie językowej w języku angielskim, formatowaniu dokumentu oraz weryfikacji jakości rycin. Cała treść naukowa, analizy, cytowania oraz końcowa prezentacja zostały przejrzane i zweryfikowane przez autorów, którzy ponoszą pełną odpowiedzialność za manuskrypt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania białka metodą BCAInstytut Biotechnologii BeyotimeP0010Oznaczanie ilości białka w celu normalizacji.
Bioinformatics.com.cnBioinformatics.com.cnPlatforma internetowa; dostęp w 2026 r.Platforma wizualizacji i analizy GO/KEGG.
linia komórkowa Caco-2ATCCHTB-37Linia komórkowa gruczolakoraka jelita grubego człowieka wykorzystana w modelu uszkodzenia nabłonka.
Zestaw do liczenia komórek Cell Counting Kit-8GLPBioGK10001Test żywotności komórek pomiarowy przy 450 nm.
CIBERSORT z sygnaturą LM22Twórcy CIBERSORTLM22Dekonwolucja 22 frakcji komórek odpornościowych.
ChEA3Laboratorium Ma'ayanPlatforma internetowa; dostęp 2026Wzbogacenie czynników transkrypcyjnych i przewidywanie sieci regulacyjnych.
Tlenek węgla2 inkubatorNie zarejestrowanoNie dotyczyInkubator z nawilżaczem używany do hodowli w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22.
Cu2+ sonda fluorescencyjnaBIOFOUNTCAS 98907-26-7Wewnątrzkomórkowe Cu2+ detekcja fluorescencji.
Cytoscape z wtyczką CytoHubbaKonsorcjum CytoscapeWersja nie została zarejestrowanaWizualizacja PPI i ranking węzłów centralnych.
podłoże Eagle modyfikowane przez DulbeccoGibco11965092Pożywka do hodowli komórek Caco-2.
Dimetylosulfotek*Nie zarejestrowanoZ uwagi na brak tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o dostarczenie treści, którą należy przełożyć na język polski.Kontrola nośnikiem.
Płodowa surowica bydlęcaNie zarejestrowanoKiedy nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, nie mogę wygenerować przekładu. Proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski zgodnie z wytycznymi.Suplement medium w stężeniu 10%.
Fe2+ Zestaw do analizyAbcamab83366Pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu Fe2+.
FerrDBTwórcy FerrDBBaza danych online; dostęp 2026Źródło genów związanych z ferroptozą.
Ferrostatyna-1Sigma-AldrichSML0583Inhibitor ferroptozy; stężenie końcowe 4 µM.
HarmoniaBroad Institute/społecznośćWersja nie została zapisanaKorekcja efektu seryjnego w analizie pojedynczych komórek.
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX71Cu2+ obrazowanie fluorescencyjne przy pobudzeniu/emisji 510/578 nm.
LipopolisacharydNie zarejestrowanoPodaj proszę tekst źródłowy do przetłumaczenia.Bodziec wywołujący uszkodzenie zapalne w 1 µg/mL przez 24 h.
Zestaw do oznaczania malondialdehyduInstytut Biotechnologii BeyotimeS0131SPomiar peroksydacji lipidów.
Czytnik płytek mikrotitracyjnychNie zarejestrowanoZe względu na brak dostarczonego tekstu źródłowego, nie można przeprowadzić tłumaczenia. Proszę o wprowadzenie treści w języku angielskim, którą należy przetłumaczyć na język polski.Pomiar absorbancji przy 450 nm.
MonocleBioconductor/społecznośćWersja 2Analiza pseudoczasu pojedynczych komórek.
Baza Sygnatur MolekularnychBroad Institutec2.cp.kegg_medicus.v2025.1.HsZestaw genów referencyjnych dla GSEA.
NetworkAnalystTwórcy NetworkAnalystPlatforma online; dostęp 2026Integracja sieci czynników transkrypcyjnych i miRNA.
Penicylina–streptomycynaNie zarejestrowanoNie dotyczy100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyna
RR Foundation for Statistical ComputingWersja nie została zarejestrowanaŚrodowisko analizy bioinformatycznej.
Zestaw pakietów RCRAN/BioconductorBrak zapisów budowania pakietówprzepływy pracy limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC oraz rms.
System PCR w czasie rzeczywistymNie zarejestrowanoPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.urządzenie do RT-qPCR z SYBR Green.
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA RevertAidThermo Fisher ScientificK1622Synteza pierwszej nici cDNA z 1 µg RNA
SangerboxDeweloperzy Sangerbox3.0Normalizacja i korekcja efektu serii metodą ComBat.
SeuratLaboratorium Satija/społecznośćWersja 4Kontrola jakości, normalizacja, klasteryzacja i wizualizacja danych z pojedynczych komórek.
Oprogramowanie do analizy statystycznejNie zarejestrowanoPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski zgodnie z wytycznymi.Analiza statystyczna oryginalnych eksperymentów komórkowych.
Proszę podać tekst do przetłumaczenia.Konsorcjum STRINGBaza danych online; dostęp 2026Białko–konstrukcja sieci oddziaływań białkowych
odczynniki do real-time PCR z SYBR GreenTakaraRR820AIlościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR).
TarBaseNarzędzia DIANA9.0Eksperymentalnie potwierdzone miRNA–interakcje genetyczne
TetratiomolibdanSigma-Aldrich323446Chelator miedzi; stężenie końcowe 40 µM.
odczynnik TRIzolTakara9108Izolacja całkowitego RNA.

Bibliografia

  1. Fu M, Wang QW, Liu YR, Chen SJ. The role of the three major intestinal barriers in ulcerative colitis in the elderly. Ageing Res Rev. 2025;108:102752. https://doi.org/10.1016/j.arr.2025.102752.
  2. Le Berre C, Honap S, Peyrin-Biroulet L. Ulcerative colitis. Lancet. 2023;402:571–584.
  3. Wangchuk P, Yeshi K, Loukas A. Ulcerative colitis: Clinical biomarkers, therapeutic targets, and emerging treatments. Trends Pharmacol Sci. 2024;45:892–903.
  4. Kobayashi T, et al. Ulcerative colitis (primer). Nat Rev Dis Primers. 2020;6:74. https://doi.org/10.1038/s41572-020-0205-x.
  5. Huang J, et al. Comprehensive analysis of cuproptosis-related genes in immune infiltration and diagnosis in ulcerative colitis. Front Immunol. 2022;13:1008146. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1008146.
  6. Liu Y, et al. Development and experimental validation of machine learning-based disulfidptosis-related ferroptosis biomarkers in inflammatory bowel disease. Genes. 2025;16:496. https://doi.org/10.3390/genes16050496.
  7. Hu W, et al. HIF-1α alleviates ferroptosis in ulcerative colitis by regulation of GPX4. Cell Death Dis. 2025;16:542. https://doi.org/10.1038/s41419-025-07883-8.
  8. Zhao C, et al. FXR acts as a therapeutic target for ulcerative colitis via suppressing ferroptosis. Mol Med. 2025;31:258. https://doi.org/10.1186/s10020-025-01305-3.
  9. Tsvetkov P, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375:1254–1261.
  10. Liu J, et al. Unveiling the cuproptosis in colitis and colitis-related carcinogenesis: A multifaceted player and immune moderator. Research (Wash D C). 2025;8:0698. https://doi.org/10.34133/research.0698.
  11. Liu N, Chen M. Crosstalk between ferroptosis and cuproptosis: From mechanism to potential clinical application. Biomed Pharmacother. 2024;171:116115. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2023.116115.
  12. Hao S, et al. Development of prognostic model incorporating a ferroptosis/cuproptosis-related signature and mutational landscape analysis in muscle-invasive bladder cancer. BMC Cancer. 2024;24:958. https://doi.org/10.1186/s12885-024-12716-1.
  13. Wang Z, et al. Exosomes secreted by macrophages upon copper ion stimulation can promote angiogenesis. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2021;123:111981. https://doi.org/10.1016/j.msec.2021.111981.
  14. Zou M, Zhang W, Zhu Y, Xu Y. Identification of 6 cuproptosis-related genes for active ulcerative colitis with both diagnostic and therapeutic values. Medicine (Baltimore). 2023;102:e35503. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000035503.
  15. Chen W, Miao J, Chen J, Chen J. Development of machine learning models for diagnostic biomarker identification and immune cell infiltration analysis in PCOS. J Ovarian Res. 2025;18:1. https://doi.org/10.1186/s13048-024-01582-8.
  16. Lv JH, et al. WGCNA combined with machine learning to find potential biomarkers of liver cancer. Medicine (Baltimore). 2023;102:e36536. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000036536.
  17. Wu Q, Yang C, Huang C, Lin Z. Screening key genes for intracranial aneurysm rupture using LASSO regression and the SVM-RFE algorithm. Front Med. 2025;11:1487224. https://doi.org/10.3389/fmed.2024.1487224.
  18. Tang D, Pu B, Liu S, Li H. Identification of cuproptosis-associated subtypes and signature genes for diagnosis and risk prediction of ulcerative colitis based on machine learning. Front Immunol. 2023;14:1142215. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1142215.
  19. Yang C, et al. Identification of cuproptosis hub genes contributing to the immune microenvironment in ulcerative colitis using bioinformatic analysis and experimental verification. Front Immunol. 2023;14:1113385. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1113385.
  20. Yadav SK, et al. Fecal Lcn-2 level is a sensitive biological indicator for gut dysbiosis and intestinal inflammation in multiple sclerosis. Front Immunol. 2022;13:1015372. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1015372.
  21. Luo Q, et al. Bioinformatics analysis reveals potential crosstalk genes and molecular mechanisms between ulcerative colitis and psoriasis. Arch Dermatol Res. 2024;317:118. https://doi.org/10.1007/s00403-024-02856-1.
  22. Nielsen OH, et al. Rectal dialysate and fecal concentrations of neutrophil gelatinase-associated lipocalin, interleukin-8, and tumor necrosis factor-alpha in ulcerative colitis. Am J Gastroenterol. 1999;94:2923–2928.
  23. Sun Y, et al. Natural polyphenol rutin inhibits ferroptosis in ulcerative colitis by regulating lipid metabolism via blocking the LCN2-ALOX15 axis. Food Funct. 2025;16:7169–7186.
  24. Sofia MA, et al. Tryptophan metabolism through the kynurenine pathway is associated with endoscopic inflammation in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 2018;24:1471–1480.
  25. Shon WJ, et al. Severity of DSS-induced colitis is reduced in Ido1-deficient mice with down-regulation of TLR-MyD88-NF-kB transcriptional networks. Sci Rep. 2015;5:17305. https://doi.org/10.1038/srep17305.
  26. Zeng T, et al. Indoleamine 2, 3-dioxygenase 1 enhances hepatocytes ferroptosis in acute immune hepatitis associated with excess nitrative stress. Free Radic Biol Med. 2020;152:668–679.
  27. Pavlidis P, et al. Interleukin-22 regulates neutrophil recruitment in ulcerative colitis and is associated with resistance to ustekinumab therapy. Nat Commun. 2022;13:5820. https://doi.org/10.1038/s41467-022-33333-3.
  28. Urzua U, et al. The ovarian transcriptome of reproductively aged multiparous mice: Candidate genes for ovarian cancer protection. Biomolecules. 2020;10:113. https://doi.org/10.3390/biom10010113.
  29. Zahn A, et al. Transcript levels of different cytokines and chemokines correlate with clinical and endoscopic activity in ulcerative colitis. BMC Gastroenterol. 2009;9:13. https://doi.org/10.1186/1471-230X-9-13.
  30. Yi Q, et al. Application of genomic selection and experimental techniques to predict cell death and immunotherapeutic efficacy of ferroptosis-related CXCL2 in hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 2022;12:998736. https://doi.org/10.3389/fonc.2022.998736.
  31. Kolios G, Valatas V, Ward SG. Nitric oxide in inflammatory bowel disease: A universal messenger in an unsolved puzzle. Immunology. 2004;113:427–437.
  32. Cheng F, et al. Identification of differential intestinal mucosa transcriptomic biomarkers for ulcerative colitis by bioinformatics analysis. Dis Markers. 2020;2020:8876565. https://doi.org/10.1155/2020/8876565.
  33. Tratensek A, et al. Oxidative stress-related biomarkers as promising indicators of inflammatory bowel disease activity: A systematic review and meta-analysis. Redox Biol. 2024;77:103380. https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103380.
  34. Zhang JL, et al. Jatrorrhizine alleviates ulcerative colitis via regulating gut microbiota and NOS2 expression. Gut Pathog. 2022;14:41. https://doi.org/10.1186/s13099-022-00516-7.
  35. Li H, et al. Development of a prognostic model based on ferroptosis-related genes for colorectal cancer patients and exploration of the biological functions of NOS2 in vivo and in vitro. Front Oncol. 2023;13:1133946. https://doi.org/10.3389/fonc.2023.1133946.
  36. Seibt TM, Proneth B, Conrad M. Role of GPX4 in ferroptosis and its pharmacological implication. Free Radic Biol Med. 2019;133:144–152.
  37. Holland T, Mattner J. Intestinal eosinophils: Characterization of elusive granulocytes as anti-bacterial and immunomodulatory effector cells in colitis. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:321. https://doi.org/10.1038/s41392-023-01588-4.
  38. Nguyen J, et al. Overexpression of programmed death ligand 1 in refractory inflammatory bowel disease. Hum Pathol. 2022;126:19–27.
  39. Shen Z, et al. Exploration of a screening model for intrahepatic cholangiocarcinoma patients prone to cuproptosis and mechanisms of the susceptibility of CD274-knockdown intrahepatic cholangiocarcinoma cells to cuproptosis. Cancer Gene Ther. 2023;30:1663–1678.
  40. Niu Y, et al. Platelet activation stimulates macrophages to enhance ulcerative colitis through PF4/CXCR3 signaling. Int J Mol Med. 2025;55:78. https://doi.org/10.3892/ijmm.2025.5499.
  41. Qu F, et al. The role of macrophage polarization in ulcerative colitis and its treatment. Microb Pathog. 2025;199:107227. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2025.107227.
  42. Danne C, Skerniskyte J, Marteyn B, Sokol H. Neutrophils: From IBD to the gut microbiota. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2024;21:184–197.
  43. Zhao Q, et al. CD4+ T cell activation and concomitant mTOR metabolic inhibition can ablate microbiota-specific memory cells and prevent colitis. Sci Immunol. 2020;5:eabc6373. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abc6373.
  44. Chen E, et al. Inflamed ulcerative colitis regions associated with MRGPRX2-mediated mast cell degranulation and cell activation modules, defining a new therapeutic target. Gastroenterology. 2021;160:1709–1724.
  45. Xu H, Wu C, Wang D, Wang H. Alleviating effect of Nexrutine on mucosal inflammation in mice with ulcerative colitis: Involvement of the RELA suppression. Immun Inflamm Dis. 2024;12:e1147. https://doi.org/10.1002/iid3.1147.
  46. Luo Y, et al. Rab27A promotes cellular apoptosis and ROS production by regulating the miRNA-124-3p/STAT3/RelA signalling pathway in ulcerative colitis. J Cell Mol Med. 2020;24:11330–11342.
  47. Pace F, Watnick PI. The interplay of sex steroids, the immune response, and the intestinal microbiota. Trends Microbiol. 2021;29:849–859.
  48. Rodriguez J, Olivares M, Delzenne NM. Implication of the gut microbiota in metabolic inflammation associated with nutritional disorders and obesity. Mol Nutr Food Res. 2021;65:e1900481. https://doi.org/10.1002/mnfr.201900481.
  49. Ojha R, et al. Emerging role of circulating microRNA in the diagnosis of human infectious diseases. J Cell Physiol. 2019;234:1030–1043.
  50. Tian Y, et al. LncRNA CDKN2B-AS1 relieved inflammation of ulcerative colitis via sponging miR-16 and miR-195. Int Immunopharmacol. 2020;88:106970. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2020.106970.
  51. Kulkarni N, Pathak M, Lal G. Role of chemokine receptors and intestinal epithelial cells in the mucosal inflammation and tolerance. J Leukoc Biol. 2017;101:377–394.
  52. Stadnyk AW. Intestinal epithelial cells as a source of inflammatory cytokines and chemokines. Can J Gastroenterol. 2002;16:241–246.
  53. Xu Y, Chen N. DUOX2-mediated innate immune hyperactivation drives macrophage M1 polarization via the APP-CD74 axis in inflammatory bowel disease. Presented at: 19th Congress of the European Crohn’s and Colitis Organisation (ECCO 2026); Stockholm, Sweden; 2026. https://academic.oup.com/ecco-jcc/article/20/Supplement_1/jjaf231.232/8432779.
  54. Shi CL, et al. Single-nucleus transcriptome unveils the role of ferroptosis in ischemic stroke. Heliyon. 2024;10:e32727. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e32727.
  55. Tu H, et al. Integrated single-cell analysis with experimental validation reveals ANXA2 as a therapeutic target for ferroptosis in inflammatory bowel disease. Am J Transl Res. 2026;18:91–111.
  56. Yan C, et al. Exploring the anti-ferroptosis mechanism of Kai-Xin-San against Alzheimer's disease through integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation strategy in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol. 2024;326:117915. https://doi.org/10.1016/j.jep.2024.117915.
  57. Shaik JP, Ahmad A. Pharmacological mechanism of cinnamic acid in the treatment of prostate cancer by network pharmacology. Archives of Medical Reports. 2024;1(2):1–6. https://doi.org/10.26524/amr.2024.2.1.
  58. Nimmagadda S, Patel S, MR Vishwathika. Targeting ferroptosis: A novel therapeutic avenue in osteoarthritis and bone degeneration. Archives of Medical Reports. 2025;2(5):6–9. https://doi.org/10.26524/amr.2025.5.2.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulowana śmierć komórkikomórki nabłonka jelitowegoprofilowanie transkrypcyjnegeny różnicowo eksprymowaneanaliza uczenia maszynowegoanaliza pojedynczych komórekwalidacja biomarkerów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.