Wykorzystaliśmy synchrotronową tomografię rentgenowską w Europejskiej Instalacji Promieniowania Synchrotronowego (ESRF), aby nieinwazyjnie uzyskać trójwymiarowe zbiory danych tomograficznych o rozdzielczości piksela 0.7µm. Dzięki zastosowaniu oprogramowania do renderowania objętościowego możliwe jest zrekonstruowanie struktur wewnętrznych w ich stanie naturalnym, bez artefaktów powstających podczas sekcjonowania histologicznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nieinwazyjna wizualizacja 3D z rozdzielczością submikronową z wykorzystaniem synchrotronowej tomografii rentgenowskiej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mało wiadomo o organizacji wewnętrznej wielu mikroartropod o rozmiarach ciała poniżej 1 mm. Przyczynami tego są niewielkie rozmiary oraz twarda kutykula, która utrudnia stosowanie protokołów klasycznej histologii. Ponadto sekcjonowanie histologiczne niszczy próbkę, przez co nie może być stosowane w przypadku materiałów unikalnych. Z tego względu pożądana jest metoda nieniszcząca, która pozwala na wgląd do wnętrza małych próbek bez konieczności ich sekcjonowania.
Wykorzystaliśmy tomografię rentgenowską synchrotronową w Europejskiej Placówce Promieniowania Synchrotronowego (ESRF) w Grenoble (Francja) w celu nieinwazyjnego uzyskania trójwymiarowych zbiorów danych tomograficznych o rozdzielczości piksela 0.7µm. Dzięki zastosowaniu oprogramowania do renderowania objętościowego możliwe jest zrekonstruowanie wewnętrznej organizacji w stanie naturalnym, bez artefaktów powstających podczas sekcjonowania histologicznego. Dane te mogą być wykorzystywane do morfologii ilościowej, wyznaczania punktów orientacyjnych lub do tworzenia wizualizacji w formie animacji w celu zrozumienia struktury ukrytych części ciała oraz śledzenia całych układów organów lub tkanek w próbkach.
Protokół
Zwierzęta wykorzystane w tym badaniu
Okazy partenogenetycznego roztocza z rzędu Oribatida, *Archegozetes longisetosus* (Acari, Oribatida), pobrano z hodowli laboratoryjnej. Hodowla jest utrzymywana na mieszance gipsu paryskiego i węgla drzewnego (9:1) w plastikowych słoikach, w stałej ciemności, w temperaturze 20-23°C i przy wilgotności powietrza wynoszącej około 90%.
Przygotowanie próbek
- Okazy pobrano z hodowli, oczyszczono za pomocą pędzelka i umieszczono na 24 godziny w mieszaninie 80% etanolu, 35% formaldehydu i 100% kwasu octowego w proporcjach 6:3:1.
- Następnie okazy odwodniono w szeregu roztworów etanolu o stężeniach 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% i 100%, wymieniając roztwór 3 razy przy każdym stężeniu, z 10 min odstępu między poszczególnymi etapami.
- Na koniec próbki pozostawiono na noc w świeżym 100% etanolu i poddano suszeniu w punkcie krytycznym w CO2 (CPD 020, Balzers). Wysuszone okazy przymocowano do końcówek plastikowych szpilek (długość 1,2 cm; średnica 3,0 mm).
Synchrotronowa tomografia rentgenowska
Tomografię rentgenowską przeprowadzono na linii wiązki ID19 (ESRF, Grenoble, Francja, eksperyment SC-2127).
- Próbki zamontowano w uchwycie i ustawiono w centralnej pozycji w wiązce.
- Pomiary próbek przeprowadzono przy energii 20.5 keV. Radiogramy rejestrowano za pomocą chłodzonego detektora CCD (kamera ESRF FReLoN) o 14-bitowej rozpiętości dynamicznej, rozdzielczości 2048×2048 pikseli i efektywnym rozmiarze piksela 0.7 μm. Podczas obrotu próbki o 180° zarejestrowano 1500 projekcji, przy czasie ekspozycji 0.35 s dla każdej projekcji. Odległość od detektora do próbki wynosiła 20 mm.
Zastosowanie określonej odległości między próbką a detektorem umożliwia obrazowanie różnicowe materiałów o niskich współczynnikach tłumienia promieni rentgenowskich (Cloetens, et al. 1996), które w obrazowaniu absorpcyjnym (gdzie próbka znajduje się bezpośrednio przed detektorem) dawałyby niewystarczający kontrast. Większość materii biologicznej to obiekty fazowe, składające się z materiałów o niskiej absorpcji i/lub niewielkich różnicach w liczbie atomowej (Betz, et al. 2007). Jednakże tomografia wzmocniona fazowo wymaga wysokiej spójności przestrzennej jednorodnej wiązki promieni rentgenowskich. Dlatego promieniowanie synchrotronowe jest lepiej dostosowane do tego rodzaju pomiarów niż skanery desktopowe.
Analiza danych
- Otrzymane radiogramy 2D przekształcono w trójwymiarowe dane wokselowe (8-bitowe wartości szarości) przy użyciu algorytmu filtrowanej projekcji wstecznej (Cloetens, et al., 1997)
- Dane wokselowe przeanalizowano za pomocą oprogramowania VGStudio Max 1.2.1. (Volume Graphics, Heidelberg, Niemcy).
- W celu wizualizacji 3D z histogramu usunięto wartości szarości odpowiadające tłu.
- Do generowania animacji obrotowych oraz animowanych płaszczyzn przekroju wykorzystano zdefiniowane wcześniej ścieżki kamery.
- Wygenerowano zdefiniowaną przez użytkownika ścieżkę kamery, aby śledzić układ pokarmowy A. longisetosus.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej prezentacji skupiliśmy się na wizualizacji 3D wewnętrznej anatomii cheliceratowego mikrostawonoga. Pomiary synchrotronowym promieniowaniem rentgenowskim pozwalają na uzyskanie rozdzielczości piksela do 0,3µm, w zależności od wielkości próbki. Tutaj przedstawiliśmy dane z rozdzielczością piksela 0,7µm. Generalnie synchrotronowa tomografia rentgenowska może być użyteczna do analizy niewielkich materiałów biologicznych (lub tkanek) o niskim tłumieniu promieniowania rentgenowskiego. Rozdzielczość piksela niemal ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Paavo Bergmannowi, Michaelowi Laumannowi i Sebastianowi Schmelzle za pomoc w ESRF. Praca ta była wspierana przez projekt European Synchrotron Radiation Facility SC-2127 poprzez przydzielenie czasu wiązki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
